HU227859B1 - Real-time 3d nonlinear microscope measuring system and its application - Google Patents
Real-time 3d nonlinear microscope measuring system and its application Download PDFInfo
- Publication number
- HU227859B1 HU227859B1 HU0500143A HUP0500143A HU227859B1 HU 227859 B1 HU227859 B1 HU 227859B1 HU 0500143 A HU0500143 A HU 0500143A HU P0500143 A HUP0500143 A HU P0500143A HU 227859 B1 HU227859 B1 HU 227859B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- optical
- measuring system
- microscope
- microscope measuring
- optical fibers
- Prior art date
Links
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 claims abstract description 73
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 53
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000009021 linear effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 33
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 30
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 27
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 18
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 17
- 230000010287 polarization Effects 0.000 claims description 14
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 claims description 13
- 230000009022 nonlinear effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 12
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 claims description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 claims description 4
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims description 3
- 239000004038 photonic crystal Substances 0.000 claims description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 2
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 claims description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010304 firing Methods 0.000 claims 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims 3
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 claims 1
- 241000219122 Cucurbita Species 0.000 claims 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 claims 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 claims 1
- 238000013527 convolutional neural network Methods 0.000 claims 1
- 238000013461 design Methods 0.000 claims 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims 1
- 239000013308 plastic optical fiber Substances 0.000 claims 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 claims 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 13
- SBIBMFFZSBJNJF-UHFFFAOYSA-N selenium;zinc Chemical compound [Se]=[Zn] SBIBMFFZSBJNJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 5
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 5
- 238000005311 autocorrelation function Methods 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 4
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 2
- 231100000760 phototoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 241000194293 Apopestes spectrum Species 0.000 description 1
- 101100310222 Caenorhabditis briggsae she-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910003069 TeO2 Inorganic materials 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000001700 effect on tissue Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 1
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000000382 optic material Substances 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001176 projection neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- LAJZODKXOMJMPK-UHFFFAOYSA-N tellurium dioxide Chemical compound O=[Te]=O LAJZODKXOMJMPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0052—Optical details of the image generation
- G02B21/0068—Optical details of the image generation arrangements using polarisation
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0036—Scanning details, e.g. scanning stages
- G02B21/0048—Scanning details, e.g. scanning stages scanning mirrors, e.g. rotating or galvanomirrors, MEMS mirrors
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0052—Optical details of the image generation
- G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/18—Arrangements with more than one light path, e.g. for comparing two specimens
- G02B21/20—Binocular arrangements
- G02B21/22—Stereoscopic arrangements
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Microscoopes, Condenser (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Length Measuring Devices By Optical Means (AREA)
- Stereoscopic And Panoramic Photography (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
Description
A találmány tárgya berendezés valósidejű 3D (három dimenziós), nemlineáris mikroszkóp mérőrendszer, több képsíkban elhelyezkedő, mikroszkopikus kiterjedésű képpontok halmazának vizsgálatára, ahol a különböző képsíkokban lévő vizsgálandó képpontok száma legalább kettő, és amely rendszernek egy vizsgáló optikai jelet előállító impulzus üzemű lézer vagy parametrikus oszcillátor fényforrása van, amely a .mérésre vonalak mentén vagy tetszőlegesen elrendezésben előre kiválasztott pontok lényegében egy adott ídőíráervallumon belüli mérésére es/vagy fotokémiai síimulálasára van kialakítva. A. mérőrendszernek vizsgáló optikai jelekként piko- és femtoszekundumos időtartamú fenyimpulzusokat előállító fényforrása van. A vizsgált optikai jel a képtérben leképezett femtoszekundumos fonyimpulzus által kiváltott nemlineáris hatás következtében előállított fluoreszcens vagy egyéb optikai jel.
A találmány tárgya továbbá a fenti berendezést alkalmazó eljárás és alkalmazás neuronhálózatok iármaholőgíai vizsgálatára, melyben a vizsgálandó gyógykészítmény hatását az egyes ídegsejtek logikai válaszfiiggvényének vizsgálatával, vagy az idegsej(hálózat aktivitási mintázatának vizsgálatával objektív módon mérjük.
A jelen találmány tárgya végül a fentiek szerinti nemlineáris 31) mikroszkóp rendszer alkalmazása neuronok fiziológiás vizsgálatában..
A technika jelenlegi állása szerint ismert, hogy az agy idegsejt hálózata több mil lió igen gyors működésű idegsejt együttese, működésének megértéséhez elengedhetetlen olyan technológiák megjelenése, amelyek képesek több idegsejt, illetve az igen bonyolult idegsejtek több alkotórészének (dendrit, sejttest, axon, vagy pl. dcndrikus tüskék) egyidejű megfigyelésére. Jelenleg a világon kifejlesztett sokcsatornás vizsgálati módszerek nem biztosítják a kellő időbeli és térbeli felbontást a neuronok és hálózataik igen komplex viselkedésének megismerésére. Két fő megközelítés létezik a sejtek aktivitásainak rögzítésére: az eiektrofizioiőgiaí módszerek valamilyen, elektródákat helyeznek a sejtek, közelébe vagy a belsejébe, míg az optikai módszerek esetén a sejtbe valamilyen Indikátor anyagot juttatunk, és ennek optikai tulajdonságait regisztráljuk. Az ilyen indikátor anyagok érzékenyek lehetnek a sejt belsejében található ionok, szabad gyökök koncentrációjára, pB-ra, a sejt membrán-feszültségére, stb. Ezen hatások következtében indikátor anyagok legtöbbjénél a ·>
fluoreszcencia intenzitás változik, de léteznek olyanok, ahol a spektrum tolódik el, vagy a fluoreszcencia élettartam. módosuk
Elefctrofíziológiai módszerek közöl legfontosabb ajtócM»/? muhpíudgfe, mely nagy .részletességgel biztosít elektromos jeleket egy sejt belsejéből, de sajnos csak igen kevés (rutinszerűén csupán 2~4 db) összefüggő sejt vizsgálatára alkalmas, mivel az elektródok a sejtbe juttatása lassú és körülményes manuális munka. ,4 sokcsőíomds efefcvws e/vezeíAveá során, sok elektródát döfünk egyszerre a szövetbe, és így egy nagyobb területről érkező elektromos jeleket vizsgálhatunk. Hátránya,, hogy az általuk, adott jel igen egyszerű, kevés információt hordoz, nem biztosítanak kellő pontos térbeli pozicionálást, és használatuk kiterjedt roncsolással jár.
A hagyományos CCD kamerás rendszerekkel nagyszámú sejt tanulmányozható a felbontástól függő, néhányszor 10 Hz képfrissitési Idővel, de ezzel a módszerrel, csupán a felső néhányszor lögm-es tartományban tudunk felvételeket készíteni a felbontás felszíntől mért gyors romlása miatt. Másrészt a nagy területen, történő folyamatos gerjesztés miatt, létrejövő fototoxikus károsodás miatt a minta gyorsan tönkremegy, a jelet hordozó fluoreszcens festék pedig .lebomlik. A CCD kamerás rendszerek jelenleg nem alkalmasak neuronhálózatok vizsgálatára.
A. konfokális mikroszkópok háromdimenziós· felbontással bíró fluoreszcensmikroszkópok, Működésük során a gerjesztett fluoreszcens térfogatot egy kellően nagy felbontást biztosító koílimáló optika segítségével egy tűszerű apertúrára képezzük, ami mögött helyezkedik el a fluoreszcencia intenzitás mérésére alkalmas fotodetektor. Az apertúrán csak az a fluoreszcens fény tud jó hatásfokkal átjutni, amely abban a pontban keletkezik, melyet a leképező rendszer (pl. objektív) pontosan az apertúrára képez le, így az apertóra mozgatásával letapogathatjuk a háromdimenziós teret. A konfokális mikroszkópok igen elterjedtek, jő felbontásuk, könnyen (a szurok cserélgetésével) változtatható működési hullámhosszuk és relatív olcsóságuk miatt.
1990-ben Denk és munkatársai kimutatták (Denk, W,, J. H, Strickler, et al. (1990) Ml\vo-photon laser scanmng Suorescence microscopy.” Science 248(4951): 73~ó), hogy az ultrarövid impidzusú (iémtoszekundumos) lézerek fokuszálásakor fellépő nemlineáris hatások, mint pl. a két- vagy többfoton abszorpció, másodharmóníkus-keltés, stb. előnyösen használható, a 3 dimenziós (3D), nagyfelbontású képalkotásban. Ezt a módszert biológiai minták, azon belül is neuronhálózatok vizsgálatára fejlesztették ki. .Az elmúlt 15 év intenzív kutatóra unkája ellenére továbbra, is nyitott kérdés, hogy az egyes neuronok milyen logikai műveleteket végeznek, el működésük közben, illetve az, hogy az őket leíró logikai függvények hogyan változnak külső (un. .nemszmaptikus) behatásokra, mint például különböző drogok (alkohol, nikotin, stb.) vagy természetes illetve mesterséges gyógyszerkészítmények hatására. Ennek elsődleges oka, hogy a Denk és munkatársai által kifejlesztett képalkotó módszer a képpontok .az objektív fókuszsíkjában történő pásztázásán alapul (Id, a US5Ö34613 számú szabadalmat), érmék következtében több percet is igénybe vesz, míg a vizsgált térfogatról szub-mikronos felbontással 3D képet készítünk (az objektív mozgatása segítségével mozogva a 3. dimenzióban), A hagyományos, kétfoton abszorpciós fluoreszcencia mikroszkóp működését az 1. ábrán mutatjuk be,
A mikroszkóp működése nemlineáris optikai hatáson (pl két- vagy többfoton abszorpció, másodharmómkus keltés, stb.) alapul, ami szemléletesen olyan másod- vagy magasabb rendű fizikai folyamat, amelyben a válaszfnggvény, pb a kétfoton abszorpció a fényintenzitás másod- vagy magasabb rendű függvénye. Ezt szemléltetjük a később részletesen Is bemutatandó 2. ábrám Itt egy fluoreszcens festéket hagyományos, egyfotonos módon (jelen esetben kék) fénnyel gerjesztve a festék gyakorlatilag a teljes megvilágított térfogatban (tipikusan zöld, sárga, piros) fénnyel fluoreszkál ami csak optikai berendezéssel használható 3 dimenziós képalkotásra (let konfokáhs mikroszkópia). A vörös 111, infravörös tartományban működé fomloszekundumos impulzusokat előállító lézer fényét mikroszkóp objektívvei a festékbe (vagy a festékkel kezeit biológiai mintába) fókuszálva viszont gerjesztést csak a íökuszfolt közvetlen környezetében (tipikusan egy köbmikronos, vagy annál kisebb térfogatban) tapasztalunk. Ebben a kis térfogatban, olyan, nagy fénysűrűség alakul ki, hogy - szemléletesen fogalmazva - egyszerre két fénykvantum (fotón) is elnyelődhet egy festékmolekulábau. A festékmolekula alatt jelen esetben, egy fluoreszcensen, gerjeszthetö molekulát értünk, melyei a minta mérhetősége végett a sejtbe/szövetbe juttatunk. A kétfoton mikroszkópia során e molekulának a fluoreszcenciáját mérjük. E molekula esetleges indikátor tulajdonságain keresztül lehet a sejt más tulajdonságát, pl a lokális Cá^ ion szintet menü. Egy ilyen esemény valószínűsége általában igen alacsony, ára ez a valószínűség a foíonsűrűség (vagy intenzitás) négyzetével arányos. Ahhoz, hogy a nemlineáris mikroszkóp működéséhez szükséges fényintenzitásokat elérjük, viszont a mintára kerülő átlagteljesítmény ne a haladja meg a minta roncsolását (pl. felforrását) eredményező küszöbértéket, a minta getjesztésehez tipikusa» a közeli infravörös tartományban, működő .temtoszekundumos lézereket, használunk. Ilyen lézerekben a tipikusan 0,1 ps-os időtartamú lézerirapulzusok kh.
ns-ofrként követik egymást ahol .az egyes lézetimpulzusok energiája tipikusan az 1-10 nJos tartományba esik, így a lézer átlagteljesítménye tipikusan 1 W alatti. Megjegyzendő, hogy a fénnoszekundumos lézerek fejlődésében jelentős szerepet játszott az egyik jelen bejelentő, Szipöcs Róbert és társa által korábban, OS 5,734,503 számé szabadalmukban feltárt dielektrikum tükör technológia elterjedése, valamint az. ennek segítségével diszperzió kompenzált femfoszekundutnos lézeroszcíllátorok megjelenése a gyakorlatban.
zl hagyományos kérfeton mikroszkópban (Denk, W. 1990,. ÜS5,034,613; L ábra) a fókuszált infravörös lézerimpulzus gyújtópontjában akkora fényintenzitást állítunk elő, hogy festékünket tipikusan vörös tartományban gerjeszteni tudjuk, aminek következtében az (néhány ns-al később) a látható (tipikusan, zöld, sárga) hullámhossz tartományba eső fluoreszcens- fényt bocsát ki. £ fluoreszcens fény erősségét (bullámhossz-sxelektív tükrökkel és szinszürökkel kiszűrve a getjesztö fényt) fétoelektron-sokszorozökkal vagy lavina fótodetektorral mérjük. Olyan fluoreszcens festéket használunk, amelynek abszorpciós hatáskeresztmetszete változik a biológiai folyamatok során (indikátor), azaz például kalcium jelenlétében nagyobb, így a sejtet? végigfutó ingerületek a mikroszkópban a fluoreszcens jel növekedését eredményezik. A nemlineáris hatás mértéke (pl, kétfoton fluoreszcencia nagysága) adott fényimpulzus energia esetén két tényezőtől függ: egyrészt a mintában mórt impulzushossztól, másrészt a térbeli fókuszálás jóságától. Rövid gejjesztöimpulzusok és fókuszálás esetén a festék csak. a fókuszfolt kis forgási ellipszoid alakú környezetében gerjesztődik. Ez lehetővé teszi a mikroszkóp Igen jő,: báromdimeuzfós térbeli felbontását.
Megjegyzendő, hogy a fényitnpulzusok időbeli alakja és frekvenciaspektruma között fennálló Ifeurier-transzformácíós kapcsolat következtében, a femtoszekundumos lézerek spektrális sávszélessége több nanométer, esetenként akár néhányszor 10 am nagyságrendű is lehet, arni az optikai elemeken történő áthaladáskor fellépő diszperzió következtében jelentős időbeli alakváltozást okozhat, (pl, jelentősen megnőhet a lézerímpulzus hossza) and a fókuszfoltban mért fényintenzitás, így a fluoreszcens jel jelentős csökkenését eredményezheti. Másik fontos tényező, hogy a lézernyalábok fókuszálna lósága elsősorban a lézernyaláb terjedési irányára merőleges térbeli intenzitás-eloszlásának a függvénye, ezért, hogy a szub~ mikronos térbeli felbontást a képalkotás során elérjük, arra kell törekednünk, hogy a lézernyaláb térbeli torzulását elkerüljük miközben lézerből kilépő fény a biológiai mintáig elint.
A Denk féle elrendezésben (Id. 1. ábra) kétdimenziós képet pásztázó eljárással készíthetünk, azaz a kis gerjesztő féuyfolíot eltérítő tükrökkel igen gyorsan mozgatjuk a fókuszsíkban, letapogatva a mintát, és ebbé? számítógép segítségével állítjuk össze a sejt adott metszetének képét. Háromdimenziós adatokat több különböző mélységben készített ilyen kép felvételével gyűjthetünk össze.
A hagyományos pásztázó kétfoton mikroszkópok előnyös tulajdonságait az alábbiakban foglalhatjuk össze, összevetve a szintén háromdimenziós képalkotásra alkalmas, egyíoton gerjesztésen alapuló konfokális mikroszkópokkal szemben:
Nagyobb behatolási mélység
A gerjesztéshez használt infravörös fény a kisebb szórási és abszorpciós veszteségek következtében mélyebben képes behatolni a biológiai szövetekbe, ezért a felszíntől távol eső, egészségesebb sejteket is kellő Intenzitással eléri, így akár kOÖ gm .mélyen is végezhetőnk méréseket (Helmeben, F., K, Svoboda, et ah (1999), In vivő dendritté ealetum dynantics in deep-layer eortical pyraahdal neurons, Nat Neorosei 2:( .1 Γ): 989-96.).
Az abszorpció éles íntenzitásfüggése eredményezi a kétfoton mikroszkóp diffrakciós határnál nagyobb felbontó képességét, mert a fluoreszcencia csak a fókuszpont azon kis környezetében keletkezik (tipikusan 0,3 x 0,3 x 1 pro), ahol. az intenzitás egy küszöbértéket meghalad. Ez a fóltméret határozza meg a mikroszkóp felbontását, amellyel akár az egyes un, dendritikus tüskék szerkezete is tanulmányozható. Ezen kívül rendkívül fontos, hogy a fókuszfolton kívül nem jön létre gerjesztés, ami alacsonyabb hátteret, és a fototoxikus· elváltozások csökkenését okozza, mint ez pl.. Denk említett írásából (1990) kitűnik.
Nagy detektálási látószög
Ellentétben a konfokális mikroszkópokkal, ahol a fluoreszcens fénynek egy kicsire választod apertárán keresztül kell a detektorra eljutni (hiszen ez választja ki a térbeli pozíciót), a kétfoton mikroszkópokban gyakorlatilag a teljes fluoreszcens fényt detektálni lehet, még akkor is, .ha az szóródott a szövetben. A hatékonyabb detektálás, következtében kisebb gerjesztő fényerősség is elegendő, ami a biológiai minta károsodását csökkenti, és hosszabb idejű mérést tesz lehetővé.
Egy ilyen, hagyományos, pásztázó kétfoton. mikroszkóppal készített képet matatunk be a
3. ábrán, ami egy fluoreszcens festékkel kezelt intemeuron rekonstruált képét mutatja. Az· ábra felvételéhez több száz, a fény terjedési irányára merőleges síkban felvett kétdimenziós képei Használtok. A felvétek a feltalálók által tervezett és épített hagyományos pásztázó kétíóton mikroszkóppal készítettük, a felvétel elkészítse több percet vett igénybe.
A hagyományos pásztázó kétíóton mikroszkóp hátrányos tulajdonsága, hogy egy háromdimenziós felvétel elkészítéséhez szükséges idő (kb. 3(10 sec) több nagyságrenddel nagyobb, mint az egyes idegsebeken átfutó elektromos jel (tranziens) időtartama, ami a 1 msos időtartományba esik.
A probléma részleges megoldására, vagyis a nagyobb pásztázási sebességek elérése érdekében már születtek elképzelések, de ezek még mindig nem megfelelőek, ahogy ezt az alábbiakban ismertetjük,
A forgótárcsás (Nípkow) konfokális pásztázó mikroszkópok legnagyobb hátránya amellett, hogy hordozzák a konfokális mikroszkópok korábban felsorolt hátrányait az, hogy nagy feuyintenziíást igényeinek és csak két dimenzióban műkődnek. Abban az esetben, ha esetleg valamilyen háromdimenziós „tárcsa” alkalmazásával lehetséges volna az egyes pontok gyors mérése, a minta terheltsége csak nagyon rövid időtartamú mérést tenne lehetővé. (Id. pl. Tanaami, T.„ S, ötsukk eí ah (2002). Higb-speed l-íiame/'ms seanníng cottfoeal nticroseope wiíh a mlcrolens and Nlpkow disks. Appi Opt 41(22): 4704-8,). Ezen kívül a jelenlegi megoldásoknál csak lassú, akár több ms-os beállási tranzienssel lehet z-tengeiy mentén a képsíkot változtatók mert ez szintén mechanikus útón történik,
Az akuszto-öpíikai oltéritós kétíóton mikroszkópok jelenleg csak bétáim enzíóban miikődnek (lyer, V., B, E. Losavio, et al. (20(13). Compensation of spatial and tempóra! dispersíon for acoosío-optic mnlíiphoton laser-scannlng mieroseopy. 3 Biomed Opt 8(3): 4ŐÖ-71-), de mint jelen találmányunkban: is megmutatjuk, lehetséges a háromdimenziós kifeíjesztés bizonyos korlátok mellett, Hátrányuk, hogy megfelelően nagy (kb. 0,8 x 0,8 mm2) területek pásztázásához szükséges felbontás csak nagyméretű kristályokkal valósítható meg, amelyben a piezo-elekiromos átalakító által az akuszm-optikai anyagban Bragg reflexiót eredményező akusztikus rács csak lassan alakul ki. Másik jelentős korlátozó tényező a Bragg rácson fellépő szögdiszperziő, ennek kompenzálásának nehézségei miatt nem megfelelő a főkuszfolt alakja.
Egy másik megoldás lehet a korábban vázolt sebességbeli problémára egy hullánrirost módosító elem használata. Ilyet Ismertet többek között például az ÜS 20Ő42Ö1S85 számú szabadalmi leírás. Jelenleg azonban nem ismert olyan gyors és jó minőségben működő Ilyen, elektromosan vezérelhető hallám.íront módosító elexn (pl- folyadék kristályos fázismaszk, vagy deformálható tükör), ami az igényeknek. megfelelne..
A párhuzamos 'szimultán szkexmelö fényforrásokkal dolgozó pásztázó kéifoton mikroszkópok hátránya, hogy a párhuzamos gerjesztések szükségszerű következményeként megjelenő sokcsatornás detektorok térbeli szűrése miatt csökken a detektálásra kerülő fotonok száma, romlik a jel-zaj viszony. Másik hátrányuk, hogy csak adott geometriai mintázat (példáéi vonal mentén lerakott pontsor) mentén tudnak mérni, ami a biológiai minták esetében gyakorlatilag semmilyen előnyt nem jelem.
A fenti rendszerek általános hátrányos tulajdonsága, hogy a felvétel elkészítéséhez szükséges idő dacára a fejlesztéseknek, nagyságrendekkel nagyobb, mint az. egyes idegsejteken átfutó elektromos jel (tranziens) időtartama, ami a 1 ms-os időtartományba esik. Ahhoz viszont, hogy az egyes Idegsejtek működését mérni tudjuk, gyakorlatilag olyan „pillanatfelvételek” elkészítésére lesne szükségünk, amelyek ezen elektromos tranziensek időtartamán belük egy időben képesek leimi az. elektromos aktivitást (potenciált)· azokban a pontokban, melyeket korábban, a neurális „áramkörök” bemenetelként illetve kimenetelként (pl dendrikus tüskék) azonosítottak. Ezek a pontok viszont véletlenszerűen helyezkednek el a háromdimenziós térben, ezért a hagyományos kéifoton mikroszkóppal ezek a mintázatok gyakorlatilag nem vizsgálhatóak.
Találmányunk célja a fenti problémákra adott technikai megoldás.
A találmány alapja az a felismerés, hogy lehetséges olyan optikai, berendezés elkészítése, mely képes a neuronhálózatok működésének leírásához szükséges adatokat (képpontokat) a szükséges képpontok egymás utáni sxegctmzésével (ahol az egyes képpontok közötti kapcsolási idő praktikusan a 10 ns ··· 1 ps időtartományba esik) gyakorlatilag egy időben (az 1 ms-os elektromos tranziens időtartományon beiül) begyűjteni, míg a működés szempontjából lényegtelen képpontok mérésére nem vesztegetünk időt. További lényeges felismerés, hogy vizsgált 31) térfogatban a vizsgálni kívánt pontokat gyakorlatilag tetszőlegesen kijelölhetjük n db (2-lÖÖáb) optikai .szálból álló szálköfeg végpontjainak pQ'Zicionálásávai. A szálakból kilépő fényt egy leképező rendszerrel a mintába képezzük, így hozva létre a mintában tetszőlegesen elhelyezhető gerjesztő foltokat.
A jelenleg használt hét-foton, mikroszkópok nagy hiányossága - legalábbis ami az idegtudoxnányokban való alkalmazásukat illeti hogy csak a fókuszsíkba eső sejteken.
sejtrészleteken terjedő jelek valós idejű vizsgálatára alkalmasak. Az idegsejtek aritmetikai függvényeinek, neuronhálózatok aktivitásának vizsgálatához, két feltételnek kell teljesülnie;
(a) mivel az idegsejtek és nyúlványaik, valamint a. sejtek közötti kapcsolódások szempontjából a legjellemzőbb pontok, a dendritikns tüskék véletlenszerűen helyezkednek el a három dimenziós (3D) térben, biztosítanunk kell azt, hogy egy adott, térfogat tetszőleges kijelölt pontjaiban méréseket tudjunk végezni;
(b) a méréseket 1 ms-nál rövidebb időintervallumon belül az összes· pontra el keli végeznünk, mert az idegsejtek váfoszföggvesye a potenciál terjedése során kb. ennyi idő alatt cseng le.
A jelenleg használatos kétfoton mikroszkóp rendszerekben a minta teljes 30 feltérképezéséhez számos 20 síkot kell végigpásztázni, ez azonban perceket Is igénybe vehet a szükséges felbontás eléréséhez. Ezt a problémát kívánja megoldani a jelen találmány tárgyát képező valós idejű, 3D két-foton mikroszkóp rendszerünk.
Á jelen, találmány többek között azon alapul, hogy a minta különböző síkjainak hagyományos pásztázásival kapott két-foton mikroszkópos 2D képekből rekonstruálva a 3D térfogatot, további mérések céljából kiválasztunk a mintában olyan pontokat, melyek jól jellemzik a nenrális aktivitást. Ezeket a pontokat egyenként megcímezzük optikai szálak és egy leképező rendszer segítségévek ahol minden egyes pontba külön optikai szálon vezetjük a fényt. Ezt szemlélteti például a későbbiekben részletezett 5. ábra, ahol a minta mérendő pontjait, P'(xj,yi,zó-t, az optikai szálak végeinek, a Είχ,,νί,ζρ pontoknak a leképezésével kapjuk. A mérés során egy előre meghatározod' sorrendben kapcsolgatjuk a lényt a szálak közöd egy számítógéppel vezéreit optikai (pl. akasztó- vagy elektro-optikaí) kapcsolóval. A szálakhoz tartozó mérendő pontokban a lézerirupnlzusok kétfoton fluoreszcenciát gerjesztenek, amely a lézer hullámhosszához képest eltérő hullámhossz tartományon van, ezáltal dikroikus tükör segítségével a fluoreszcencia jel szétválasztható a gerjesztéstől.
Ebben az elképzelésben a vizsgálni kívánt pontok mérése mechanikai mozgás nélkül jön létre. így a jelenlegi rendszereknél több nagyságrenddel gyorsabban lehet vizsgálni a különböző síkokban elhelyezkedő képpontokat (pl. akuszto-optikai kapcsolónál a kapcsolási idő kisebb, mint 10 gs), hiszen megtakarítjuk az objektív (ül. tárgyasztal) új fékuszsíkba történő beállításához szükséges időt (tipikusan néhány tus), illetve a vízszintes síkban (x,y) pásztázó tükröket mozgató motorok beállási idejét.
Mindezek értelmében a bevezető bekezdés szerinti valósidejű, 30, nemlineáris mikroszkóp mérőrendszer legáltalánosabb értelmében olyan, hogy a vizsgálandó képpontok pozícióját kijelölő üveg vagy műanyag optikai szálakból vagy egyéb hullámvezetőkből álló szálkofege van, ahol az egyes képpontokhoz egy-egy optikai szál van rendelve, és a képpontok koordináta) attak kiválasztása a hozzá rendelt optikai szál végének pozicionálásával tönémk egy több képsíkból álló képtérben. A vizsgálandó képpontok időben egymás utáni címzésére gyors optikai kapcsolója van, A tárgytérben levő, az optikai szálak végei által biztosított pontszerű fényforrások és a vizsgálandó képpontok között elhelyezkedő, szögnagyűással rendelkező, és azok között egy-egyértelmü kapcsolatot létesítő leképező rendszere van; A vizsgáló optikai jelek időben és térben történő alakhű átvitelére alkalmas optikai szálakat vagy egyéb hullámvezetőt tartalmazó optikai rendszere van, amelyben az optikai szálban vagy egyéb hullámvezetőben fellepő nemlineáris hatások előre meghatározott küszöbérték alatt vannak.
Az eljárás értelmében a. mikroszkóp segítségével több a 3D mintatérben kiválasztott, vizsgálandó pontban fotokémiailag vagy csuk ténnyel stimuláljuk egy vagy több kiválasztod idegsejt sejírészleíeit, és valós időben, mérünk, ezeken a helyeken fiziológiai paramétereket. A technika jelenlegi állásához tartozó mikroszkópos eljárások, ezt csak a. minta egy síkjában, az. objektív fókuszsíkjában képesek megtenni.
A találmány számos további előnyös változata a csatolt aligényponípk szerint megoldásokként van kialakítva,
A fentiek szerinti nemlineáris 3.D mikroszkóp rendszer alkalmazása, neuronok fiziológiás vizsgálatában különös előnyöket kínál.
A találmány egyes vonásait és kiviteleit bemutató ábrákon a következők láthatók.
1, ábra: A hagyományos, kétfoton. abszorpciós fluoreszcencia mikroszkóp működésének vázlata.
2. ábra: Az egy- és a kétfoton abszorpciós fluoreszcencia fizikai folyamatának ős szehasonlí fása.
3. ábra: Hagyományos szkermelő kéi-fotos mikroszkópiával készített 2D felvételekből rekonstruált 3D kép egy idegsejtröl.
4. ábra: Egy hagyományos eljárással készíted 3D kép xy síkra vetíted megjelenítése.
5. ábra.: A találmány alapgondolatának, szemléltető vázlata.
6. ábra: A találmány egy kivitelének felépítési blokksémája..
7. ábra: Elrendezés a találmány egy kiviteli alakjához.
8a á-bm; Egy titán-zafír lézeren és a kimenetén mért spektrum,
8b ábra: A kimenetén mért iaterferometrikus autokorrelációs függvény a 8a ábrához,
9, ábra; Illusztráló képek a 3D szkennelés működéséhez,
10. ábra; Egy fínoreszcens gyöngy vonal menti intenzitás eloszlás.
la ábra: 3D száimozgaíáshoz rugalmas vezetékekből álló manipulátor egy részlete.
11b ábra: A 1 l a ábra szerinti manipulátor egy teljes kiépítése.
Az I. ábrán a hagyományos, kétfoton abszorpciós fluoreszcencia mikroszkóp működésének vázlatát látjuk, A modusszinkronizált I lézer forrás tényét gatvano-motorokkai mozgatott 2 tükrök térítik el. Az eltérített nyalábot a 3 „szken-lencse’* képezi a 4 objektív hátsó apermrájára, A 4 objektív az 5 mintába fókuszálja a fényt, ezáltal létrehozva a kétfoton gerjesztéshez szükséges fényintenzitást, csak a fókuszpontban. A fluoreszcens fényt összegyűjti az objektív, majd 6 dikroíkus tükörrel választjuk le a gerjesztő fényútbők A gerjesztett fényt a 7 lenesével 8 szinszürő üvegen keresztül egy 9 fotoelektron-sokszorozóra képezve detektáljuk.
A 2. ábrán az egy- és a kétfoton abszorpciós .fluoreszcencia fizikai folyamatait hasonlítjuk össze. Egy küvettában lévő festék hullámhosszának megfelelő .lézerfényt fókuszálunk egy folyadékba, és ekkor az. egyfotonos gerjesztés- az egész fénykúp mentén létrejön. Jobb oldalról kétszeres hullámhosszá mődusszinkronízált fényt fókuszálunk a folyadékba kétfoton. gerjesztést hozva létre, mely csak a fókuszpontban egy kis térfogatot gerjeszt. A 2. ábrán a gerjesztések energiadiagramját szemléltetjük, hagyományos 19 gerjesztés során létrehozott gerjesztett állapot a gerjesztő- foton hullámhosszánál néhány nanométerrel hosszabb hullámhosszú 11 fluoreszcens foton kibocsátásával bomlik el. Kétfoton. 12 gerjesztés során körülbelül fele energiájú fotonokkal is képesek vagyunk gerjeszteni a. festékünk átmenetét,
A 3. ábra egy hagyományos szkenneió két-íoton mikroszkópiával készített 2D felvételekből rekonstruált 3D kép egy idegsejtröl. A 4. ábra egy hagyományos eljárással készített 3D kép xy síkra vetített megjelenítése. A vizsgálni kívánt P}-P4 dendrikus. tüskéket nyilakkal jelöltük meg. Ezek .a Pi-P4 dendríkus tüskék természetesen különböző mélységekben helyezkednek el.
II
Az 5. ábra lényegében a találmány alapgondolatának szemléltetése. A 13 optikai kapcsolókkal a 14 optikai szálak -· vagy más egyéb optikai hullámvezetők. - között mikroszekundumos idő alatt váltogathatjuk, hogy melyikbe csatoljuk be a gerjesztő fényt. Az. optikai szálak végpontjait egy két objektívból álló afékáíis 15, 16 leképező rendszerrel képezzük a 17 mintába. A minta PdCxkyyz'l képpontjainak koordinátáihoz a 14 optikai szálak végeinek P;(x,y,z) koordinátáit rendelhetjük hozzá.
A találmány egy kivitelét a 7. ábrát· látható, gyakorlatban már kipróbált kiviteli példa, kapcsán mutatjuk be, azonban ez. nem korlátozza találmányunk érvényességét egyéb,, hasonló elven működd megoldások esetében. Az általános koncepció megértését segíti továbbá a ő. ábra.
A 6. ábrán a találmány megvalósításának blokksémája látható, Módusszlnkronizált fényforrásunk egy Titán-zafír 18 lézer, amely helyett alkalmazhatunk parametrikus oszcillátor fényforrást is. Ennek fényét egy negyprixmás 19 P&W elrendezésre vezetjük, mellyel széthúzzuk az impulzusokat, hogy a későbbi üvegszálakban fellépő nemlineáris hatásokat minimalizáljuk (diszperziós elem). Gyors fenykapesoíő és becsatoló 2Ö rendszerrel (amely kísérleteinkben akuszíö-optikai eltérítő volt) a 2.1 optikai szálakba csatoljuk a fényt. A szálak másik vegét egy összetett 22 manipulátorral mikrotuéleresnéi nagyobb pontossággal állítjuk be a kívánt helyre. Az optikai szálak végét egy 23 leképező rendszerrel képezzük a 25 mintába, ezen optikai rendszer tartalmazza az impulzusok újbóli összenyomásához szükséges nagy diszperziója elemet ís 24, A korábbi úttól jórészt független hagyományos 26 „referencia szkennerrel” készíthetünk áttekintő képekor a minta egészéről, Megjegyezzük, hogy a 21 optikai szálak közötti kapcsolást végrehajtó gyors fénykapesolő elem lehet elektrooptikai modulátor, galvanoszfcenner, vagy akuszío-optikai cella is. Az itt bemutatott áttekintő ábrán szereplő elemeket a 7. ábrán a konkrét megvalósításunknak megfelelően további elemekre bontottuk.
A 7, ábra szerinti kivitel nem tartalmazza a rendszer működtetéséhez szükséges vezérlő elektronikát, és szoftveres felületet. Egy Ti:S típusú 2? lézer fényét egy első 28 tükörrel egy négyprizntás 19 P&W elrendezésbe vezetjük, ahol a négy 29 prizmán odafelé, majd a 30 végtükörről visszaverődve visszafele is végighaladva az impulzusok diszperziós tulajdonságai beállíthatók, A függőlegesen (a rajz síkjára merőlegesen) eltolt 31 klcsatoló tükör után. a fényt 32 Faraday izolátoron keresztül vezetjük a fénykapcsoló és becsatoló rendszerbe. A prizmarendszeren a nyaláb a vízszintestől a lehető legkevésbé eltérő szögben halad keresztül, így a 28 tükör alsó szélén, az alul elhelyezett 31 tükör felső szélén vezetjük át azt, a két tükröt egymáshoz a lehető legközelebb helyezzük el. A nyalábot a 34 és 36 akuszto-opííkai cellák térítik el, melyek szög-diszperzióját 35 és 37 prizmákkal kompenzáljuk. Az eltérített nyalábot egy 38 doubiet lenesével képezzük a becsatolást végző 41 lencsékre. A 42 optikai szálak, másik végét el vékonyodó 44 taríőkarok pozícionálják, melyek, szub-ntíkronfóíeres felbontású 43 manipulátorok rendszeréhez csatlakoznak. A 42 optikai szálak végén kilépő lényt egy 45 nyalábtolő szkennerrel períurbáljuk. Ez után. következik a fényárban a két 46,48 objektívbői álló leképező rendszer, mely közrefogja a ZnSe anyagú 47 osztókoekát, mely egyben polarizációs vagy dlkroikus osztó szerepét is betölti, A. két 46 és 48 objektív helyett egyéb akromáí .lencséből álló afokális leképező rendszert Is alkalmazhatunk. A 49 mintába fókuszált lézerfény nyomán gerjesztett fluoreszcens fényt bárom helyen detektálhatjuk: A 49 minta alatt elhelyezett 50 koudenzor által összegyűjtve, az alsó 52 detektoron; a: 47 osztókoekán a referencia ágba visszavert fényt 54 dtkroikns tükörrel elválasztva a felső 55 fotoelektronsokszorozón; végöl a szálakba visszacsatolt fluoreszcens fényt egy harmadik 39 dlkroikus tükörrel kicsatolva egy „konfokális 40 detektoron. A 26 referencia szkenner ágba célszerű az impnizusformálás után kksafoltn a lényt billenőtükörrel vagy 33 nyaláboszióvai. A referencia ág a hagyományos kéttbtoo mikroszkóp optikai elemeiből áll, a szkennelo 56 tükör párból és az 57 szken-lencséből. Rendszerünk képes lesz hagyományos Infravörös Í'IR) mikroszkóp üzemmódban is dolgozni, ehhez szükséges egy 53IR lámpa (infravörös lámpa, ez teszi szükségessé az alsó detektorhoz az 51. dlkroikus tükör beiktatását), és a referencia ágba kicsaíolt fénybe betolható kamera,
A mérések első lépéseként hagyományos lézer-szkenneiő mikroszkóppal (továbbiakban 26 referencia szkenner, 6. ábra) vegigpásziázznk a minta számos 2D síkját, melyekből egy 3D térrészt rekonstruálunk a mintában. A kép alapján kiválasztjuk a vizsgálandó pontokat, majd úgy állítjuk be a 21. optikai, szálak kimeneti végeit (mikro-pozícíonáiás), hogy a szálakon kilépő fény a 23 leképező rendszer segítségével éppen, a kiválasztod pontokra képezodjön. Mérést ezután csak ezeken, az információt hordozó területeken végzünk,
A 6. ábra szerinti elrendezés 22 manipulátorával végzett mikro-pozícionálás során a 25 minta P'fxiyyi’.zf) pontjainak koordinátáihoz a 21 optikai szálak végeinek 22 manipulátorral beállított P(xí,y.i,zi) koordinátáit (n > i > 1) - előzetes kalibráció alapján. ~ úgy állítjuk he, hogy egy 21 optikai szálból kilépő fénykúp éppen a. P’ pontba fókuszálödjon. A fökuszsík beállítása (z íránybeli pásztázási a 21 optikai szál optikái főtengellyel gyakorlatilag párhuzamos mozgatásával jön létre, míg az optikai tengelyre merőleges pásztázási főtengelyre merőleges irányú síkban (x,y) végzett száivég-mozgeíás adja.
A kísérleti elrendezésünkben a íerati elgondolás megvalósítására hagyományos egymódusú 21 optikai szálat alkalmaztunk. Az egymódusú szál biztosítja, hogy a méréshez használt lézernyaláb ideális, közelítőleg Gauss-függveny alakú TEMiW (transzverzális elektromágnes módus. (körszimmetrikus)) transzverzális eloszlása a terjedés során ne
időbeli alakja viszont jelentősen változhat a szál anyagi valamint a szálba» fellépő nemkívánatos nemlineáris hatások (pl. önfázis moduláció) következtébe». Ezeknek olyan lézerimpulzusoknál van nagy jelentősége, melyeknek időbeli szelessége rövid, vagyis a Fourierómnszíőrmáeiös kapcsolat miatt nagy a -sávszélessége. A nemlineáris mikroszkópiában éppen ilyen impulzusokra van szükség, hiszen ezeknek nagy a csucsintenzitása. (nagy az energiasürösége), miközben az átlagteljesítmény alacsony, így a minta roncsolása mérsékelhető. Az impulzusok sávszélességét azonban korlátozza a fluoreszcens molekulák (általában néhányszor lő nm-es) abszorpciós sávszélessége, amit a festékanyag és a lézer sávszélességének megválasztásánál figyelembe kell venni.
A nemlineáris hatások minimálisra, csökkenthetők hagyományos egymódusú optikai szálak esetén a „cső-rpölt” impulzusok erősítésénél bevált hm CPA („chirped pulse amplifieatíoró) módszer alkalmazásával. Ennek lényege, hogy a rövid lézerimpulzusokat a rendszer elején időbe» széthúzzuk, majd az optikai szálon való terjedés után újra összenyomjuk, így az optikai szálakban az impulzusok spektrumának változásához vezető nemlineáris hatás az alacsony energiasürűség miau elhanyagolható lesz. Az impulzus széthúzása nagy másodrendű diszperzióval, majd az újbóli összenyomás megközelítőleg ugyanekkora, ellentétes előjelű diszperzióval érhető el. Nagy negatív másodrendű diszperziót egy prizmából álló 19 P&W (Procter & Wise) elrendezéssel viszünk a rendszerbe, a 6. ábrának megfelelően. Ez az elrendezés alkalmas arra is, hogy a harmadrendű diszperziót alacsony értéken tartsak, ami azért fontos, mert a magas harmadrendű diszperziós járulék az impulzusok időalakjának jelentős torzulásához vezet, ami a szálon való terjedés után ez már nem korrigálható. Mivel a 19 P & W elrendezés nagy helyigényű, a 21 optikai szál után a 23 leképező rendszerbe nem építhetjük be, tehát a negatív diszperziót a 21 optikai szál előtt alkalmazzuk, majd a 21 optikai szál utáni impulzus összenyomást {„antidiszperziót'') a 23 leképező rendszerbe- épített nagy anyagi diszperzióval rendelkező anyagú alkatrésszel, így például ZnSe kristállyal valósítottuk meg, 24 antidíszperziös elemként szerepel. (A ZnSe kristály további szerepéről a leképezésnél lesz sző.) Ennek köszönhetően a 25 mintába lefökuszált nyaláb mind térben, mind időben nagy energíasűrű-séggel rendelkező lézerimpulzusokat tartalmaz, -ami a nemlineáris (kétfotón abszorpciós) gerjesztéshez elengedhetetlen. Elmondható· ezek érteimében, hogy az optikai hullámvezető a femtoszekundumos lézerimpulzusok térbeli eloszlását megőrző egymódusú típusú, valamint a lézerimpűlzusok időbeli alakjának megőrzése, a. nemlineáris hatások csökkentése érdekében a lézer és az optikai hullámvezetők belépési pontja között egy az impulzusokat időben széthúzó diszperziós elem, és az optikai hullámvezetők kilépést pontja után az impulzusokat inverz módon összenyomó aníidiszperziős -elem van elhelyezve,
A hagyományos egymódusú 21 optikai szálakat alternatív megoldásként fotonikus kristály szerkezetű .21 optikai szálakra (P'CR photonic erystal Éber) cserélhetjük. Ezzel a .fent leírt impulzus széthúzás és összenyomás feleslegessé válik, így a 19 F & W elrendezés helyett egy két-prizmás elrendezés .is használható a rendszerben továbbra is jelenlevő kis pozitív diszperzió kompenzálására, továbbá, a nagy pozitív dxszperziójú ZnSe kristály elhagyható. Ennek azért van jelentősége, mert nagy pozitív diszperzió elérésének hátránya az alkalmazott kristály látható fénytartománybeli abszorpciója, ami a detektált fotonok számának csökkenéséhez vezet. Fotonikus kristály szál esetén a prizma hagyományos, a látható tartományban is nagy transzmissziós hatásfokú nyaiábosztóval helyettesíthető.
A kísérleti elrendezés a 7. ábrán, látható, valójában hasonló- elrendezésre több változatot dolgoztunk ki, melyek között a különbség az alkalmazott nyalábosztók és temlőtökrök használatában rejlik. A két lényegében különböző rendszer egyikében a nagy diszperziójú ZnSe kristály díkroikus osztóként viselkedik, míg a másikban polarizációs oszíókockaként. Az előbbi elvén mutatjuk be a kísérleti elrendezés lényegét, az utóbbi elrendezést a „Polarizációs változat leírásban tárgyaljuk.
Egy példaként, felhozott rendszer fényforrásaként szolgáló Ti-zaflr lézer oszcillátorból, mint 27 lézerből kilépő Impulzusok alapvetően két úton haladhatnak, melyek közül egy biilenőtükörrel választhatjuk ki az alkalmazásnak megfelelő utat, vagy nyáláhoszté· segítségével egyszerre juttathatunk fényt a két 33 ágba. Az egyik út a hagyományos lézer szkennelö 2-foton mikroszkóp ág, a „referencia ág, a másik a „valós idejű, véletlen címzésű. 2-fofon mikroszkóp ág.
„A valós idejű, véletlen címzésű, két-foton mikroszkóp ág”' a 27 lézerből kilépő impulzusok először egy Froctor & Wise típusú, négyprizmás rendszeren haladnak keresztül, amelynek diszperziója kb, GÖD = -15000 fs‘? (Group Delay Dispersion), amelynek a végén elhelyezkedő 30 végtükör visszaveri a fényt négy darab 29 prizmán úgy, hogy függőleges irányban néhány milliméter eltérés legyen az oda- és a. visszafelé haladó nyalábok között. A visszavert nyaláb így a bejövő nyalábnál néhány milliméterrel alacsonyabban elhelyezkedő 31 tükörről verődik tovább, Á nyalábot átvisszök egy 32 Faraday izolátoron,, hogy az. esetleges későbbi visszaverődések ne okozzák .a lézer mödusszinkroifizáit állapotának leállását.
Ezután, jutnak az impulzusok a. 20 optikai kapcsolóhoz, Az optikai szálak címzését ezen gyors eltérítő elemek végzik x és y irányokban, számítógépes vezérel essek A. találmány szerinti elrendezésben olyan fénykapcsoió van, melyben ténylegesen két 34, 36 akusztooptikai cella felelős az eltérítésért. Ez a megvalósítás tipikusan 1 ps nagyságrendbe eső kapcsolási idővel rendelkezik két eltérő x,y koordinátája pont között. Az aknszto-optikaí eltérítő kísérleteinkben két piezoelektromos tulajdonságú TeO;> kristályból áll, ezekre nagyfrekvenciás váltófeszültséget kapcsolva a kristályban egy akusztikus hullám alakul ki, e hullám optikai rácsként funkcionálva téríti el lézernyalábunkat. Az akuszío-optíkai elemeket (esetleg tagonként) a szög-diszperzió kompenzáló elemek, SF11 üvegből készült 35, 37 prizmák követik, amelyek a nyalábminőség helyreállításával lehetővé teszik a becsatolást az optikai szálakba, Áz optikai kapcsolók után a lézerfényt becsatoljuk a 42 optikai szálakba. Kísérleteinkben az akuszto-opíikai eltérítő által eltérített fényt egy olyan „doublet” 38 lencse vetíti a mátrixszerüen elrendezett optikai szálakba, amely szférikus és kromatikus aberrációtól mentes, A becsatolást egy 41 lencsemátríx, vagy akár egyetlen becsatoló lenese is végezheti.
Az optikai szálak végeit a mikrométeres pontossággal beállított pozicionálás után egy 10:1 arányban kicsinyítő leképző rendszer képezi a mintára (46 és 48 objektívekből kialakítva). A pozicionálást a 26 referencia szkenner által készített kép alapján számítógépes vezérlésű mikro-poziclonálö mechanika (43 manipulátorok és 44 tartókarjaik) végzi. Nagy beállási pontosság és rendkívül olcsó sorozatgyártási költség érhető el a találmány szerinti rugalmas vezetékek alkalmazásával, Nem követelmény az egyes manipulátorok egymáshoz képesti nagy gyártási pontossága, sem a mozgások ihteamása, hiszen a manipulátorok abszolút pozíciója később kalibrálható..
A 10:1 arányú kicsinyítő leképezésnek két fontos előnye van: (a) A 2-toton gerjesztésekhez alkalmas egymódusú Gauss intenzitás-eloszlást adó szálak magáíméróje tipikusan 5-10 pm-es tartományba van, az általánosan használt 800 nm körüli hullámhosszak esetében, azaz althoz, hogy az ideálisan kicsi gerjesztőfolt alakot megkapjuk ezt méretet egy teleszkóppal 800 nm-alá kell csökkenteni, (b) Ez teszi lehetővé, hogy a minta terében kiválasztott gerjesztő-pontokat a tárgytérben optikai szálak mechanikus pozicionálásával realizálhassuk, Az egymáshoz közeli pontok megexmzését még így is akadályozhatja, hogy a leképezés tárgyterében az optikai szálakat fizikai méretük miatt nem lehet egymáshoz túl közel tenni. Ezen segíthet a szálak mögé becsúszhatott két plánparalell 45 üveglemez, vagy tükör melyeknek a dőlésszöge állítható. E lehetőség alkalmazásakor az optikai szálak képeit programozhatóan eltoljuk a 49 minta terében, az ily módon létrehozott szkennelést szinkronba hozva a szálakon átvitt gerjesztő tény kapcsolgatásával elérhető a szálak közötti „holt terek’* bejárása is. Nem mellékes szempont, hogy ezáltal lehetővé válik a minta mozgási artefaktjainak monitorozása, kiküszöbölése. A száiakt tartó karok utolsó .szakasza célszerűen el van vékonyítva, hogy a karok ne ütközzenek a szálakba és egymásba, illetve a szálakból kilépő kb. 0,1. numerikus apertúrajú (NA) nyalábokba. Célszerű: megoldás a kar utolsó szakaszát szintén üvegszálból készíteni, és a két szálat T alakban egymáshoz rögzíteni. A karok rugalmas elhajlásából adódó hiba az. említett kalibráció során kiejthető,
A 23 leképző rendszer tipikusan több leneséből áll, mint például a kollimálö 46 objektív, a fókuszáló 48 objektív, köztük szabad optikai úthosszák A szabad úrhosszon lehet elhelyezni a 24 .antidiszperziős elemként használatos nagy pozitív diszperziójú anyagot (pl. ZnSe kristályt), mely az impulzusok kompresszióját végzi. A ZnSe kristály egyben egy 47 oszíókocka szerepét is betölti, mely két szembeállítod derékszögű prizmából áll, ezek közé egy dikroikns tükör réteg van felhelyezve.. Az osztókockán a szálak felöl érkező gerjesztő impulzusok változatlanul áthaladnak, ás a 49 mintában keletkező kismértékű szórt sugárzás visszafele is áthalad rajta, azonban s 49 mintában keletkező .fluoreszcencia jel az eltérő hullámhossza miatt az 51 dikroíkus tükrön visszaverődik.
Biológiai mérések során a fluoreszcens molekulákkal feltöltött sejtekben az erősen lefóknszált, fómfoszekundumos impulzusokkal gerjesztett pontban létrejön a két-foton abszorpció és hatására a fluoreszcencia. A iefőknszáiáshoz és a fluoreszcens fotonok nagy hatásfokú begyűjtéséhez nagy numerikus apertúrajú (NA-0,8) objektíve! használunk, hogy minél kisebb legyen az a térszög, ahol el veszhetnek a fotonok. Ezért a 49 minta alsó felén is található egy 50 objektív és egy 52 detektor, például fotoelektron-sokszorozö, melyre egy 51 dikroikns tőkor segítségével jut a fény. Az ilyen 52 detektorok, például fotóéiektronsokszorozók elé célszerű mindig szinsz&ö üveget tenni. A fluoreszcencia jel másik része visszafelé, a felső objektív felé lép ki a mintából,, és ugyanazon az útvonalon indul vissza, nűnf amin a mintára jutott. Az első 48 obj ékítvén áthaladva eljut a ZnSe anyagú 4? osztókockához, és a dikroíkus tükrön 9öö-ban eltérői, majd a 26 referencia szkenner ágán található 54 dikroikns tükörről az 55 fotoelektron-sokszorozón detektálódik.
Most a 26 referencia szkenner ágának leírását ismertetjük. Erre a mérési üzemmódra azért van szükség, hogy a 49 minta egészéről képet alkothassunk, felismerjük és beállíthassak a valós idejű mérések -célpontjait, A valós idejű mérésekkel egyszerre futtatva ellenőrizhetjük vele a 49 minta elmozdulásait is.
A 27 lézer oszcillátorából kilépő impulzusok a 19 Procter & Wise elrendezés és a 32 Faraday izolátor után felállított 3.3 billenő-tükrön térülnek el a „valósidejű, véletlen címzésű két-foton mikroszkóp- ágtól''. A 49 minta. 2D szkennelésebez két tükröt használunk, melyek mozgatását az egymásra merőleges tengely körül forgó- gaJvano-mötorok végzik (galvauomotoros 56 tükör pár). A tükröket egy 57 teleszkóp lencserendszerrel képezzük a mintára fókuszáló 48 objektív bemeneti apcrtúrájára. Ehhez olyan ZnSe 47 osztókockára van szükség az előbbi helyett, melynek reflexiója magas a két-tbton gerjesztési spektrumon és alacsony a fluoreszcencia spektrumon. Ekkor a 47 osztőkockán való reflexióval jut a mintára a gerjesztő- fény, majd a keletkező fluoreszcencia részben megint a. 49 minta alatti 52 fotoeietem-sokszotozón detektáiodiL részben pedig, a fókuszáló 48 objektívról visszajut a. 47 osztókockára» amin -átjut. Á jel így a 42 szálakon keresztül a 42 szál előtti 39 díkroíkusfükörről verődik egy 40 detektorra, pl. egy íotoeieteon-sokszomzóra.
A referencia ágban használt ZnSe 47 osztókocka helyett célszerű a „valósidejű ágban'' használt ZnSe 47 osziókockát egyszerű dikroikus tükörre cserélni, ekkor azonban a lézerfényt nem a 32 Faraday izolátor után található 33 nyalábo-szíórók azaz billenő-tükörről kell a referencia ágba csatolni, hanem a 19 Procter & Wise elrendezés elé kell egy billenó-tűkröt behelyezni. A referencia ágba ekkor célszerű egy újabb Faraday izolátort berakni. A billenőtükör áthelyezésének -oka az, hogy a 19 Procter & Wise elrendezéssel csak akkor szabad megnyűjtaní az impulzusokat, ha a 49 minta előtt nagy pozitív diszperzióval újra összenyomjuk őket
Á 49: minta alatt található továbbá az 51 dikroikns tükör alá behelyezett 53 ÍR. lámpa. Az 53 ÍR lámpával megvilágított 49 mintáról a lény a 48 objektiven keresztül az 47 osztókocka helyére behelyezett 51 díkroíkus tükörről verődik, a referencia -ágban, található 54 dikroik.ua tükörre, majd onnan- az 55 fotoelektron-sokszoroző helyett Ideiglenesen behelyezett CCD kamerán detektáiödik. Ennek a képnek pl. egy biológiai 49 minta fluoreszcens festékkel való féltő Hőséhez szükséges paích-pipetía pozicionálásánál és a sejt megszórásánál van szerepe. Az ÍR képen ugyanis jól kivehetőek a nagyobb sejtek és követhető a pipetta mozgása.
A 3D szkennelés középsfkjának beállításához illetve a 2D 26 referencia szkenner számára a mélységi szkennelés végzéséhez az alsó 48 objektivet néhány 100 pm-es mozgástarfományű piezoákíuátorral érdemes beállítok de alkdmazhatunk folyadékkristály, vagy elektrooptikai modulátort is ezen célra. Durva beállításhoz egyszerűbb a 49 mintát (és az alsó detektor rendszert) mozgatni, de a nagy tömegű felső rész is mozgatható.
Az ón. „Polarizációs változat5' esetében a kísérleti elrendezés: hasonló a díkroikus tükröket alkalmazó elrendezéshez. A ZnSe anyagú 4? osztókocka két fele között ezúttal dikroikns tükör réteg helyett polarizációs tükör található, mely a vízszintes polarizáctöjú fényt reflektálja, a függőlegeset átengedi.
A lézerből kilépő impulzusok polarizációja vízszintes, a 19 Froctor & Wise elrendezés után a 32 Faraday izolátoron való áthaladással függőlegessé válik. 33 nyaláboszíóként a billenőriükör helyett polarizációs osztókockát alkalmazunk, melyen a függőleges polarizációjú fény halad tovább a „valósidejű, véletlen címzésű ágba’5 és a vízszintes polarizációjú fény reflektálódik a referencia ágba. Az elŐbbin polarizáciőváltozás· nélkül jutnak az impulzusok a 49 mintára, azonban a referencia ágon szükséges még egy polarizáció forgatás, hogy a vízszintes polarizáció kerüljön a ZnSe 4? osztőkoekához, Íriszen a szkenneléshez használt öö tükör pár elforgatja a polarizációt btF-kal. A szükséges polarlzáelófergatásf λ/2 lemez használatával érhetjük el a szkenaelés előtt. A 49 mintában keletkező fluoreszcencia véletlenszerű polarizációval rendelkezik, a jelet ezáltal mind a 40 és 52 detektorokon, mind az 55 fotoeléktron-sokszoroizón ís detektálni fehet, de mindenképpen használni kell a szmszürő üvegeket a gerjesztő fény kiszűréséhez,
A rendszer térbeli és időbeli paramétereit mérésekkel ellenőriztük. Az időbeli paraméterek jellemzésére megmértük a spektrumot és interférometrikus autokorrelációs függvényt a rendszer elején, a lézer kimenetén, és a leképező rendszer vegén. A. .spektrum kezdetben kh. 20 nm széles volt, a közép hullámhossza 795 tan. Á kimenetre a spektrum beszűkült a szálban való terjedés során bekövetkező nemlineáris effektus és a negatív csörp hatására, a félérték-szélesség a rendszeren átvitt energiától függ. A 8a ábrán látható a titánzafír lézeren és a kimeneten méri spektrum 40 mW átvitt teljesítmény esetén. Az ídőalak szélessége és a csörp becslésére megmértük az impulzusok mterferometrikus autokorrelációs függvényét. Ez a kezdetben kb. 50 fs íélérték-szélességű csőrpölt impulzust, és a kimenetén is löö fs alatti kissé csőrpölt” impulzust adott, ami a 8b ábrán látható. A 8a ábrán látható az optikai szálak kimenetén, a mintába való fokuszálás előtt kialakuló impulzusok <22mW átlagos teljesítmény esetén) mért spektruma (folytonos vonallal) összehasonlítva a lézerből kilépő kezdeti spektrumával (szaggatottal), A spektrum még ilyen viszonylag nagy teljesítmények esetén is jól megtartott. A 8 b ábrán a kimeneten méri interferontetrikus autokorreláciős függvény látható az impulzusok időbeli szélességének becsléséhez.
Foíonlkus kristály szerkezetű optikai szálaknál 150 fe-os GDB::::1000 fs2-tel rendelkező impulzusok akkhü átvitelét oldottuk meg kb. 0,5 nJ energiák esetén, ami szintén alkalmas nemlineáris mikroszkópiái mérésekre.
Egycsatornás prototípusunkban a berendezés magját alkotó· két objektives leképező rendszerünk tulajdonságait -vizsgálhattuk. A mődusszinkroaizált lézerfényt egymódnsú optikai szálba csatoltuk, a szál végét az objektívrendszer fölött nagyfelbontású motorizált manipulátorokkal mozgattuk, és tótod ektion-sokszorozőval mértük a mintaként alkalmazott fluoreszcens- gyöngyökben kétfóton effektussal gerjesztett fényt. A 9. és 10. ábrákon e mérések eredményen mutatjuk be, vizsgáltuk a képalkotás felbontását rontó hatását az optikai tengelytől és a íokuszsíkiól való eltávolodásnak.
A 9, ábra egy reprezentatív példa a 3B szkenneíés működéséről. Különböző mélységekben (z:::0, 5, 10, 15 mm) a szálak pozicionálásával 58-61 képeket készítettünk a mintáról egycsatornás prototípusunkban.. A minta ez esetben 10 gm átmérőjű fluoreszcens gyöngyökből állt. A mintabeli pozíciók 1:10-es leképezésünkből következően z2~Ő, 50, 100, 150 um voltak. Az kísérlet jól demonstrálja, hogy változatlan objektív pozíció mdleíi Is lehetséges pozíciók kiválasztása, „szkeonelés”' az optikai szál mozgatásával.
A 1.0, ábrán az egycsatornás prototípusunk által készített 59 kép esetében láthatunk, egy fluoreszcens gyöngy vonal merni intenzitás eloszlást, a felbontás becsléséhez. A következő táblázatban különböző mélységbeli és térbeli pozíciók esetén a becsüli felbontást tüntettük tói.
| Mélységi pozíció (mm) | Vízszintes pozíció (mm) | Felbontás (ura) |
| 0 | 0 | 0,6 |
| ö | 1 | 0,6 |
| 0 | 3 | 0,6 |
| -5 | 3 | Lő |
| -5 | 0 | 1,2 |
| -10 | 3 | 0,9 |
| -1.0 | 0 | 0,6 |
| 5 | 3 | 1.0 |
| 5 | 0 | 1,0 |
A lő. ábra szerint fluoreszcens gömbök képeit vettük lel egy 3D látómező különböző pontjaiban az optikai szálak mozgatásával (lásd meg 9. ábra). A képek alapján meghatározott síkbeli felbontás a látómező különböző pontjaiban, azaz a szálak különböző (szélső) pozíciói mellett értelmezhető. Felül a. gömb képének keresztmetszeti profiba látható, melyet a felbontás meghatározáshoz használtunk. A. táblázatbeli adatok a felbontás tolerálható leromlását mutatják a szélső pozíciókban, ami elméleti megfontolások alapján várható volt.
A 1 la ábra a 31) szálmozgatáshoz szükséges rugalmas vezetékekből (szervomotorokből, piezo aktuátorokből) felépítsd szub-mikrométer felbontású manipulátor tervrajza. Az 62 optikai szálakat egy-egy hozzájuk ragasztod 63 üvegszál tartja. E szálak, vastagabb 64 fémrúd közvetítésével rögzülnek, a manipulátorokhoz. A függőleges mozgatást 65 piezo motorok végzik. A radiális mozgatást 66 rugalmas vezetékekkel oldjuk meg, ezt 67 szervomotorok hajtják meg. Tangeneiálís irányba a manipulátorok 68 rugalmas csuklók körül fordulhatnak el, melyeket szintén 69 szervomotorok hajtanak. A 11b ábrán a teljes manipulátor-rendszer látványtervét mutatjuk.
A találmány tehát egy olyan valósidejű nemlineáris mikroszkóp rendszer, amely három dimenzióban (legalább 8ŐÖ um x 800 μηι x 2(10 pm térfogatban) elhelyezkedő pontokban nagy sebességgel (kHz-es „képftisshésí idővel”) képes mérést és/vagy fotokémiai stimulációt végezni /«-vívó illetve fo-vzmo alkalmazásban. A. felbontás (300 nm x 200 nm x 1000 na) megközelíti a pásztázó kétfoton abszorpciós fluoreszcencia mikroszkópiára jellemző nagy térbeli felbontást, és a mérési pontok száma nagyobb, mint 2, tipikusan eléri a lÖÖ-at. Egy célszerű kivitelben a centrális részen legalább 0,3 pm, és a szélső tartományokban legalább 0,5 unt az optikai feloldás,
A 21 optikai szál ~ vagy egyéb optikai hullámvezető - lehet a lézerimpulzusok térbeli eloszlását és időbeli lefutását megőrző, fotonikus kristály szerkezetű, egymódusú optikai szál. Ez célszerűen lehet egy olyan hullámvezető, amelynek gáznemü vagy vákuum magja van, vagy egy olyan egymódusú LM A optikai hullámvezető szál, amelyben az optikai szál magja üvegből van, és ezen mag átmérője elegendően, nagy a nemlineáris hatások alacsony szinten tartásához, és a szálhói kilépő fény numerikus apertúrája elegendően kiesi a dfffiakció-limitált leképezés biztosításához,
A fent ismertetett parantéferekkel rendelkező gyors háromdimenziós fénypozicionálásf lehetővé tevő mikroszkóp különösen alkalmas agy fiziológiájának kutatására. Napiatokban az agy működésének megértése az. élvonalbeli kutatások fókuszában van. Ennek egyik igen fejlett eszköze a kétfoton mikroszkópia, különösen ennek alkalmazása €a“' ion szintek mérésére. Ezekben a mérésekben a sejtekbe juttatott indikátor tulajdonságú festék molekulák fluoreszcencia szintjének változásán keresztül mérhetjük a. sejt működését, A jelenlegi, rendszerek ezeket e méréseket csak. a. fókuszaikon belül képesek nagy sebességgel elvégezni, így igen. komoly technikai előrelépést jeleik az. itt bemutatott gyors 3D mérésekre képes berendezés az agy kutatás bán használata. Itt ugyanis a eél minél több- természetesen nem egy síkban elhelyezkedő -- sejt vagy sejtrészlet aktivitásának egyidejű mérése nagy térfogatból'. A mérendő sejtek h? vfrro akut szövetpreparátumokban, tenyészetekben vagy akár ?>? vivő élő állatokban, emberben is elhelyezkedhetnek.
A használt festéfcmoleknlákat tekintve legelterjedtebb a sejt Ca~r ion koncentrációjának mérésére szolgáló festékek használata, ezek adják ugyanis a legjobb jel-zaj tulajdonságú méréseket, ugyanakkor más belső ion vagy egyéb hírvivő molekulák mérésére is kifejlesztettek festékeket, sőt intenziven fejlesztik azokat a festékeket is, melyek fluoreszcencia tulajdonságain keresztül közvetlenül a sejt lokális membránpotenciálját lehet megmérni.. A (csak két dimenzióban gyors) kétfoton mikroszkópia (neuro)blolőgiai használatáról lásd még: Fhoton Upmanship: Why Muhiphotou Imaging & More than a GImmiek W. Denkv K. Svoboda, Neuron, Vöt 18, 351-357, Mareh, 1997
A referenciaszkenner alkalmasabb háromdimenziós tömb felvételek készítésére, mely alapjául szolgálhat a nagysebességű 3D méréseket is lehetővé fevő üvegszálak pozíciójának kijelölésére. Megfelelő vezérlés eseten a két pásztázó egység egyidejűleg is üzemelhet, Így a 26 referencia szkennerrel a 3D mérések közben is lehetséges vonal.men.tl pászíázás, a 26 referencia szkenner síkjában elhelyezkedő sejtek gyors mérése a 3D mérések kiegészítéséként, vagy a 3D méröponíok pozíciójának korrigálásához szükséges mérések elvégzése.
Az itt ismertetett berendezés és a vele elvégezhető mérési eljárások lehetővé teszik sok sejtrészlet vagy sejt egyidejű, nagysebességű mérését, ezáltal a vizsgált sejtek vagy sejtháiőzatok működésének feltérképezését. Ezekre a működési információkra az alapkutatás mellett nagy szükség van. az alkalmazott vagy klinikai vizsgálatokban is. Ilyen igény lehet a különböző implantátumok működésének vagy gyógyszermoíekulák hatásának, a nyomon követése, hatásuk vizsgálata a szövet sejtjeire vagy a hálózat egészére.
A jelen találmány szerinti megoldás lehetőséget biztosit arra, hogy olyan mikroszkőpiás vizsgálatokat folytathassanak, amely azonos időben - és valós időben különböző mélységi helyzetben levő objektumok, például sejt alkotó elemek jó minőségű, ·>·?
éles megjelenítését nyújtja, nyaláb és az általuk szolgá nem megismerhető új eljár
Ez tulajdonképpen 3D vizsgálatot jelent. A megoldás a fényvezető titatott képpontok speciális feldolgozása révén a technika állásából ást és elrendezést képvisel.
Claims (41)
- h Valósidejű, 3D, nemlineáris mikroszkóp mérőrendszer, több képsíkban elhelyezkedő, mikroszkopikus kiterjedésű képpontok. halmazának vizsgálatára, ahol a különböző képsíkokban lévő vizsgálandó képpontok száma legalább keltő, és amely rendszernek egy vizsgáló optikai jelei előállító impulzus üzemű, lézer vagy parametrikus oszcillátor -fényforrása van, amely a mérésre vonalak mentén vagy tetszőlegesen elrendezésben előre kiválasztott pontok lényegében egy adott időintervallumon belük mérésére és/vagy fotokémiai stimulálására van. kialakítva;a mérőrendszernek vizsgáló optikai jelekként piko- és femtoszekundumos időtartamú .fényimpulzusokat előállító fényforrása van:a vizsgáló optikai jel a képtérben leképezett, femtoszekundumos fényimpulzus- által kiváltott nemlineáris hatás következtében előállított fluoreszcens vagy egyéb· optikai jel·, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó képpontok pozícióját kijelölő üveg vagy műanyag optikai szálakból (14) vagy egyéb hullámvezetőkből álló szálkötege van, ahol az egyes képpontokhoz -egy-egy optikai szál (14) van rendelve, és a képpontok koordinátájának kiválasztása a hozzá .rendelt optikai szál (14) végének pozicionálásával történik egy több képsíkból álló képtérben;a vizsgálandó képpontok időben egymás utáni címzésére optikai kapcsolója (13) van;a tárgytérben lévő, az optikai szálak (14) végei által biztosított pontszerű fényforrások és a vizsgálandó képpontok. között elhelyezkedő, szögnagyííással rendelkező, és azok között egy-egyértelmű kapcsolatot létesítő leképező rendszere (15,16) van;a vizsgáló opdkaí jelek időben és térben történő alakhűen átvivő, optikai szálakat (14) vagy egyéb hullámvezetőt tartalmazó optikai rendszere van, amelyben az optikai szálban. (14) vagy egyéb tol lám vezetőben fellépő nemlineáris hatások előre meghatározott küszöbérték alatt varrnak.
- 2. Az L Igénypont szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó képpontok egy hagyományos 3D pásztázó nemlineáris mikroszkóp, referencia szkenner (2ő), vagy egyéb mikroszkóp által felvett kép felhasználásával meghatározott képpontok.
- 3. Az I. vagy 2. igénypont szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a vizsgáló optikai jel kétfóton abszorpciót, vagy másodharmőnikuri keltő jel.
- 4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy az optikai szál (21) vagy egyéb optikai hullámvezető a fémioszekundumos 'lézerimpulzusok térbeli eloszlását megőrző egymódusó típusú, valamint a lézerimpulzusok időbeli alakját megőrző, a nemlineáris- hatásokat csökkentő eszköz párként a lézer (27) és az optikai szálak (21) belépési pontja között egy az. impulzusokat időben széthúzó diszperziós elem, és az optikai szálak (21) kilépési pontja, után az impulzusokat inverz módon összenyomó aníidiszperziós elem (24) van elhelyezve,
- 5. Az 1-3. igénypontok, bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy az. optikai szál (14,21) vagy egyéb optikai hullámvezető a lézerimpulzusok térbeli eloszlását és időbeli lefutását megőrző, fötomkus kristály szerkezetű, egymódusó optikai szál.
- 6. Az 5. igénypont szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a fotonikus kristály szál egy olyan hullámvezető, amelynek gáznemü vagy vákuum magja van, vagy egy olyan egymódusú LMA optikai szál (42), ahol annak nemlineáris- hatásokat alacsony szinten iartóan nagy -átmérőj-ö belső magja üvegből van, és a szálból kilépő fény numerikus apertórája a mintában (49) dirirakció-íimitáit leképezést biz-tosítóan kiesi.
- 7. Az előző igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal, jellemezve, hogy az optikai szálak (42) kilépési pontjai és a vizsgálandó képpontok között egy két objektívhői (46,48), vagy egyéb aktomat leneséből álló afokális leképező rendszer van.
- 8. Az. előző igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó képpontok száma a tárgy térben legalább öt.
- 9. Az előző igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó képpontok a tárgytérben egy olyan mintatérfogaton belül, vannak, amelynek mérete legalább 80ö nm x 8ÖÖ pm x 2íK) um, a centrális részen legalább 0,3 gm, és a szélső tartományokban legalább 0,5 pm optikai feloldással
- 10. Az előző igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy az optikai szálak (42) képei egy önmagában Ismeri 3D pásztázó mikroszkóp, mint referencia szkenner (26), képe alapján varrnak pozícionálva, amelynek lézersugara és az optikai szálak (42) kilépési pontjain kilépő, és az első lenese vagy mikroszkóp objektív által kollimált lézersugár egy optikai osztókoekával (47) van egyesítve egy a sugarak fókuszálását biztosító második lencse vagy mikroszkóp objektív előtt.
- 11. AH), igénypont, szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a referencia szkenner (26) és a mikroszkóp mérőrendszer mikroszkópjának optikai tengelyei a második, lenese vagy mikroszkóp objektív után elhelyezett nyalábosztó (33) által vannak fedésbe hozva.
- 12. A Hl. vagy 11. igénypont szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy polarizációs nyalábosztót (33) tartalmaz.
- 13. A 1. igénypont szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy az optikai kapcsoló (13) az optikai szálak (14) közötti kapcsolási végrehajtó elem elektrooptikai modulátor, galvanoszkenner, vagy akaszto-optikai kapcsoló, amelyben a szögdiszperziót kompenzáló prizmák (29) vannak.
- 14. A 4. igénypont szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy az impulzusokat időben széthúzó diszperziós elem az optikai szál (42) előtt elhelyezett kis reflexiós veszteségű, legalább kél prizmából (29) vagy tükörből álló diszperziós széthúzó egység, és az optikai szálak (42) kilépési pontja után az impulzusokat inverz módon összenyomó antidiszperziós elem a leképező rendszer (24) részét képező, nagy anyagi diszperzióval rendelkező optikai elem.
- 15. A 14. igénypont szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a. nagy anyagi diszperzióval rendelkező optikai, elem egyZnSe osztókocka (47).
- 16. A. 10 15. Igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a referencia szkenner (26) több egy síkban levő, mérés céljára kiválasztott pontok, vagy ezek által meghatározott görbe szakaszok lehető legrövidebb úton való bejárására van kialakítva.
- 17. A 16. Igénypont szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a referencia szkenner (26) mozgásával párhuzamosan a szkennelési z síkot változtató optikai elemei tartalmaz.
- 18. A lő. vagy 17. igénypont szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a szkennelési z sik mélységben! változtatásához szükséges divergencia változtatáshoz egy lencserendszert és aktuáiorí, különösen piezoakínátort, vagy folyadékkristály, vagy elektrooptikai modulátort tartalmaz, vagy egy optikai szálat követő egy vagy több lencsét tartalmaz a referencia szkenner (26) fenyütjáhan, amely a nyaláb divergenciájának változtatásához, és ezáltal a szkennelés z síkjának változtatásához az optikai főtengellyel párhuzamosan mozgatható kialakítású.
- 19. Az. előző igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy az optikai szálak (42) és a leképző rendszer között egy programozhatóan mozgatható, optikai nyaláfeíoló szkenner (45) van beépítve, amelynek segítségével a mintában. (49) az. optikai szálak (42) kepe az azok közötti holtterek szkennelését is lehetővé tevő módon eltolható.2Ö. A 19. igénypont szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a optikai nyalábtóló szkenner (45) egy vagy két, motorosán mozgatott vagy forgatott, optikailag átlátszó lemez vagy tökőr.
- 21. Az előző igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy két-, vagy többfoton abszorpció gerjesztés (lö) létrehozására, és az így gerjesztett térfogatból kilépő fluoreszcencia (II) detektálására, vagy másodharmónikus jel detektálására van. kialakítva.
- 22. Az előző igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a 2D referencia szkenner (2ő), és a 3D optikai szál (42) mikropozfciónálő rendszer koordinátarendszereinek kalibrációjához a. minta (49) színijén egy sznbmikronos manipulátort (43) tartalmaz, amely által két egymásra merőleges tel réssel mozgatott két szkennel! koordináta rendszer egy harmadik koordinátarendszerben van kalibráláshoz letapogatva.
- 23. A 22. igénypont szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a manipulátor (43) az optikai szálak (42) 31) mozgatásához szükséges néhány mm-es xyz koordináta mozgástartományban mfeométeres beállási pontosság van biztosítva, és a szkennelési tartomány körül radiális elrendezésben legalább 80 akadálytalanul mozgatható optikai szál (42) van.
- 24. A 22. vagy 23. igénypont szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a manipulátor (43) szobmíkronos pontosságot biztosító komperrzálatían rugalmas vezetékekkel (66) van felépítve.
- 25. A 22-24. igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a manipulátor (43) DC szervomoíorokkal (67) van meghajtva.
- 26. A 22-25. igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy az optikai szálak (42) raegvezetésébez egy mozgató kar végéhez és az optikai szálhoz (42) rögzített, azzal egy nagyságrendbe eső átmérőjű filament. van beépítve.* ?7
- 27. Az előző igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy a mintán <17} átjutó- vagy reflektált infravörös sugárzást detektáló kialakítású.
- 28. Az előző igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy 13IC (Diílerential. Interférenoe Contrast), fáziskontraszt, vagy más látható UV vagy infravörös mikroszkóppal, van. kiegészítve.
- 29. Az. előző igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer, azzal jellemezve, hogy az optikai szálak (42) és az afokális rendszer közé helyezett nyalábosztökat (33) tartalmaz, a szádvégek számára rendelkezésre- álló hely megtöbbszörözésére.
- 30. Az előző igénypontok bármelyike szerinti mikroszkóp mérőrendszer,. azzal, jellemezve, hogy az optikai, szálak (42) és az optikai kapcsolók közé behelyezett hullámhossz szerinti nyalábosztót (33) tartalmaz, amely egy sokcsatornás detektorra vetíti a mintából (49) érkező és az optikai szálakon (42) áthaladó fényt.
- 31. Eljárás az 1. igénypont szerinti nemlineáris 3D mikroszkóp rendszer alkalmazására neuronok fiziológiás vizsgálatában, azzal jellemezve, hogy mikroszkóp segítségével egy 3D mintaíérijen kiválasztott vizsgálandó pontokban, fotokémiailag vagy csak fénnyel stimuláljuk egy vagy több kiválasztott idegsejt sejtrészleteit, és valós időben mérünk fiziológiai: paramétereket
- 32., A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fiziológiai paraméterként kiváltott elektromos aktivitást és/vagy más ionszmíeket mérünk.
- 33, A. 3 i. vagy 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó pontokban szekvenciálisán stimulálunk és mérünk, és ennek alapján ínput/output függvényeket határozunk meg.
- 34, A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó pontokon sze kvenciáli san v áltozta tü nk.
- 35, A 31. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a stimulálást és a mérést külön végezzük,
- 36, A. 31, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy neuronok tüzelését vizsgáljuk, és a mert tüzelésekből valós idejű módón mintázatokat határozunk meg.
- 37, A 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tüzelési mintázatok valós idejű meghatározásához CNN alapú számítógépet és/vagy gyors DSP .alapú feldolgozó egységet használunk.
- 38. Á 31-37, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy referencia szkennerrel (26) egy kiválasztott síkban, egy számított optimális bejárási útvonal mentén pásztázva, több sejtet vagy sejtrészletet mérünk és/vagy stimulálunk.
- 39. A 37-38, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a referencia szkenner (26) által mért aktivitási mintázat alapján állítjuk be a 3D csatornákat,
- 40, A 31-39, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy m~ vívó módon végezzük,
- 41. A 31-40. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy implantáimnok beépülésének és működésének nyomon követésére, vagy gyógyszer vegyületek neuronhálózatokon, sejteken történd tesztelésére végezzük.
- 42, A 31-41. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mérésekkel és/vagy stimuláiásokkal egyidejűleg egy lokálisan elhelyezett eszközön át a mintatérbe agoaistákat vagy .antagonistákat adagolunk.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU0500143A HU227859B1 (en) | 2005-01-27 | 2005-01-27 | Real-time 3d nonlinear microscope measuring system and its application |
| EP06710202A EP1851580B1 (en) | 2005-01-27 | 2006-01-27 | Real-time, 3d, non-linear microscope measuring system and method for application of the same |
| PCT/HU2006/000009 WO2006079861A1 (en) | 2005-01-27 | 2006-01-27 | Real-time, 3d, non-linear microscope measuring system and method for application of the same |
| AT06710202T ATE418085T1 (de) | 2005-01-27 | 2006-01-27 | Nichtlineares echtzeit-3d-mikroskopmessystem und verfahren zu seiner anwendung |
| DE602006004311T DE602006004311D1 (de) | 2005-01-27 | 2006-01-27 | Nichtlineares echtzeit-3d-mikroskopmessystem und verfahren zu seiner anwendung |
| US11/814,917 US7872748B2 (en) | 2005-01-27 | 2006-01-27 | Real-time, 3D, non-linear microscope measuring system and method for application of the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU0500143A HU227859B1 (en) | 2005-01-27 | 2005-01-27 | Real-time 3d nonlinear microscope measuring system and its application |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU0500143D0 HU0500143D0 (en) | 2005-03-29 |
| HUP0500143A2 HUP0500143A2 (en) | 2006-07-28 |
| HU227859B1 true HU227859B1 (en) | 2012-05-02 |
Family
ID=89985773
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0500143A HU227859B1 (en) | 2005-01-27 | 2005-01-27 | Real-time 3d nonlinear microscope measuring system and its application |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7872748B2 (hu) |
| EP (1) | EP1851580B1 (hu) |
| AT (1) | ATE418085T1 (hu) |
| DE (1) | DE602006004311D1 (hu) |
| HU (1) | HU227859B1 (hu) |
| WO (1) | WO2006079861A1 (hu) |
Families Citing this family (81)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1434522B1 (en) | 2000-10-30 | 2010-01-13 | The General Hospital Corporation | Optical systems for tissue analysis |
| US9295391B1 (en) | 2000-11-10 | 2016-03-29 | The General Hospital Corporation | Spectrally encoded miniature endoscopic imaging probe |
| US7865231B2 (en) | 2001-05-01 | 2011-01-04 | The General Hospital Corporation | Method and apparatus for determination of atherosclerotic plaque type by measurement of tissue optical properties |
| US7355716B2 (en) | 2002-01-24 | 2008-04-08 | The General Hospital Corporation | Apparatus and method for ranging and noise reduction of low coherence interferometry LCI and optical coherence tomography OCT signals by parallel detection of spectral bands |
| US7643153B2 (en) | 2003-01-24 | 2010-01-05 | The General Hospital Corporation | Apparatus and method for ranging and noise reduction of low coherence interferometry LCI and optical coherence tomography OCT signals by parallel detection of spectral bands |
| AU2004225188B2 (en) | 2003-03-31 | 2010-04-15 | The General Hospital Corporation | Speckle reduction in optical coherence tomography by path length encoded angular compounding |
| AU2004252482B2 (en) | 2003-06-06 | 2011-05-26 | The General Hospital Corporation | Process and apparatus for a wavelength tuning source |
| CN1875242A (zh) | 2003-10-27 | 2006-12-06 | 通用医疗公司 | 用于使用频域干涉测量法进行光学成像的方法和设备 |
| WO2005117534A2 (en) | 2004-05-29 | 2005-12-15 | The General Hospital Corporation | Process, system and software arrangement for a chromatic dispersion compensation using reflective layers in optical coherence tomography (oct) imaging |
| EP1771755B1 (en) | 2004-07-02 | 2016-09-21 | The General Hospital Corporation | Endoscopic imaging probe comprising dual clad fibre |
| WO2006017837A2 (en) | 2004-08-06 | 2006-02-16 | The General Hospital Corporation | Process, system and software arrangement for determining at least one location in a sample using an optical coherence tomography |
| US8965487B2 (en) | 2004-08-24 | 2015-02-24 | The General Hospital Corporation | Process, system and software arrangement for measuring a mechanical strain and elastic properties of a sample |
| EP2272421A1 (en) | 2004-08-24 | 2011-01-12 | The General Hospital Corporation | Method and apparatus for imaging of vessel segments |
| EP2302364A3 (en) | 2004-09-10 | 2011-04-06 | The General Hospital Corporation | System and method for optical coherence imaging |
| JP4997112B2 (ja) | 2004-09-29 | 2012-08-08 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 少なくとも１つの電磁放射を伝送させるための装置およびその製造方法 |
| JP2008521516A (ja) | 2004-11-29 | 2008-06-26 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | サンプル上の複数の地点を同時に照射し検出することによって光学画像生成を実行する構成、装置、内視鏡、カテーテル、及び方法 |
| EP2325803A1 (en) | 2005-04-28 | 2011-05-25 | The General Hospital Corporation | Evaluating optical coherence tomography information for an anatomical structure |
| US9060689B2 (en) | 2005-06-01 | 2015-06-23 | The General Hospital Corporation | Apparatus, method and system for performing phase-resolved optical frequency domain imaging |
| JP5547402B2 (ja) | 2005-08-09 | 2014-07-16 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 光コヒーレンストモグラフィにおいて偏光に基づく直交復調を実行する装置、方法及び記憶媒体 |
| KR20080066705A (ko) | 2005-09-29 | 2008-07-16 | 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 | 점진적으로 증가하는 분해능을 이용하여 하나 이상의 생물학적 샘플을 관찰 및 분석하기 위한 방법 및 장치 |
| JP5384944B2 (ja) | 2006-01-19 | 2014-01-08 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | ビームスキャニングによる上皮性管腔器官の光学的撮像システム |
| US8145018B2 (en) | 2006-01-19 | 2012-03-27 | The General Hospital Corporation | Apparatus for obtaining information for a structure using spectrally-encoded endoscopy techniques and methods for producing one or more optical arrangements |
| JP5524487B2 (ja) | 2006-02-01 | 2014-06-18 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | コンフォーマルレーザ治療手順を用いてサンプルの少なくとも一部分に電磁放射を放射する方法及びシステム。 |
| WO2007149603A2 (en) | 2006-02-01 | 2007-12-27 | The General Hospital Corporation | Apparatus for applying a plurality of electro-magnetic radiations to a sample |
| US9777053B2 (en) | 2006-02-08 | 2017-10-03 | The General Hospital Corporation | Methods, arrangements and systems for obtaining information associated with an anatomical sample using optical microscopy |
| US7982879B2 (en) | 2006-02-24 | 2011-07-19 | The General Hospital Corporation | Methods and systems for performing angle-resolved fourier-domain optical coherence tomography |
| WO2007133961A2 (en) | 2006-05-10 | 2007-11-22 | The General Hospital Corporation | Processes, arrangements and systems for providing frequency domain imaging of a sample |
| WO2008049118A2 (en) | 2006-10-19 | 2008-04-24 | The General Hospital Corporation | Apparatus and method for obtaining and providing imaging information associated with at least one portion of a sample and effecting such portion(s) |
| EP2602651A3 (en) | 2007-03-23 | 2014-08-27 | The General Hospital Corporation | Methods, arrangements and apparatus for utilizing a wavelength-swept laser using angular scanning and dispersion procedures |
| US10534129B2 (en) | 2007-03-30 | 2020-01-14 | The General Hospital Corporation | System and method providing intracoronary laser speckle imaging for the detection of vulnerable plaque |
| WO2008131082A1 (en) | 2007-04-17 | 2008-10-30 | The General Hospital Corporation | Apparatus and methods for measuring vibrations using spectrally-encoded endoscopy techniques |
| US7566173B2 (en) * | 2007-07-09 | 2009-07-28 | Alcon, Inc. | Multi-spot ophthalmic laser probe |
| JP5038094B2 (ja) * | 2007-10-31 | 2012-10-03 | オリンパス株式会社 | レーザー走査型顕微鏡 |
| US8059274B2 (en) * | 2007-12-07 | 2011-11-15 | The Spectranetics Corporation | Low-loss polarized light diversion |
| US7898656B2 (en) | 2008-04-30 | 2011-03-01 | The General Hospital Corporation | Apparatus and method for cross axis parallel spectroscopy |
| US8593619B2 (en) | 2008-05-07 | 2013-11-26 | The General Hospital Corporation | System, method and computer-accessible medium for tracking vessel motion during three-dimensional coronary artery microscopy |
| EP2288948A4 (en) | 2008-06-20 | 2011-12-28 | Gen Hospital Corp | ARRANGEMENT OF CONDENSED GLASS FIBER COUPLERS AND METHOD FOR THEIR USE |
| JP5667051B2 (ja) | 2008-07-14 | 2015-02-12 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | カラー内視鏡検査のための装置 |
| ES2957932T3 (es) | 2008-12-10 | 2024-01-30 | Massachusetts Gen Hospital | Sistemas, aparatos y procedimientos para ampliar el rango de profundidad de imagen de tomografía de coherencia óptica mediante submuestreo óptico |
| JP2012515576A (ja) | 2009-01-20 | 2012-07-12 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 内視鏡生検装置、システム、及び方法 |
| US8097864B2 (en) | 2009-01-26 | 2012-01-17 | The General Hospital Corporation | System, method and computer-accessible medium for providing wide-field superresolution microscopy |
| EP2394336B1 (en) | 2009-02-04 | 2023-05-24 | The General Hospital Corporation | Apparatus and method for utilization of a high-speed optical wavelength tuning source |
| US11490826B2 (en) | 2009-07-14 | 2022-11-08 | The General Hospital Corporation | Apparatus, systems and methods for measuring flow and pressure within a vessel |
| RU2560902C2 (ru) * | 2009-11-24 | 2015-08-20 | Алькон Рисерч, Лтд. | Одноволоконный многоточечный лазерный зонд для офтальмологической эндоиллюминации |
| US9304308B2 (en) * | 2009-12-09 | 2016-04-05 | Advanced Micro Devices, Inc. | Laser scanning module including an optical isolator |
| ES2588393T3 (es) * | 2009-12-15 | 2016-11-02 | Alcon Research, Ltd | Sonda láser multipunto |
| US8804126B2 (en) | 2010-03-05 | 2014-08-12 | The General Hospital Corporation | Systems, methods and computer-accessible medium which provide microscopic images of at least one anatomical structure at a particular resolution |
| US9069130B2 (en) | 2010-05-03 | 2015-06-30 | The General Hospital Corporation | Apparatus, method and system for generating optical radiation from biological gain media |
| US9557154B2 (en) | 2010-05-25 | 2017-01-31 | The General Hospital Corporation | Systems, devices, methods, apparatus and computer-accessible media for providing optical imaging of structures and compositions |
| US9795301B2 (en) | 2010-05-25 | 2017-10-24 | The General Hospital Corporation | Apparatus, systems, methods and computer-accessible medium for spectral analysis of optical coherence tomography images |
| JP6066901B2 (ja) | 2010-06-03 | 2017-01-25 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | １つまたは複数の管腔器官内または管腔器官にある構造を撮像するための装置およびデバイスのための方法 |
| JP2012042669A (ja) * | 2010-08-18 | 2012-03-01 | Sony Corp | 顕微鏡制御装置及び光学的歪み補正方法 |
| WO2012058381A2 (en) | 2010-10-27 | 2012-05-03 | The General Hospital Corporation | Apparatus, systems and methods for measuring blood pressure within at least one vessel |
| US20120257037A1 (en) * | 2011-04-07 | 2012-10-11 | Valerica Raicu | High speed microscope with two-stage scanning for detection of rarities in samples |
| US9330092B2 (en) | 2011-07-19 | 2016-05-03 | The General Hospital Corporation | Systems, methods, apparatus and computer-accessible-medium for providing polarization-mode dispersion compensation in optical coherence tomography |
| EP2748587B1 (en) | 2011-08-25 | 2021-01-13 | The General Hospital Corporation | Methods and arrangements for providing micro-optical coherence tomography procedures |
| EP2769491A4 (en) | 2011-10-18 | 2015-07-22 | Gen Hospital Corp | DEVICE AND METHOD FOR PRODUCING AND / OR PROVIDING RECIRCULATING OPTICAL DELAY (DE) |
| WO2013148306A1 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | The General Hospital Corporation | Imaging system, method and distal attachment for multidirectional field of view endoscopy |
| JP2015517387A (ja) | 2012-05-21 | 2015-06-22 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | カプセル顕微鏡検査のための装置、デバイスおよび方法 |
| WO2014031748A1 (en) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | The General Hospital Corporation | System, method, and computer-accessible medium for fabrication minature endoscope using soft lithography |
| US10245181B2 (en) | 2012-12-21 | 2019-04-02 | Alcon Research, Ltd. | Grin fiber multi-spot laser probe |
| US9968261B2 (en) | 2013-01-28 | 2018-05-15 | The General Hospital Corporation | Apparatus and method for providing diffuse spectroscopy co-registered with optical frequency domain imaging |
| WO2014120791A1 (en) | 2013-01-29 | 2014-08-07 | The General Hospital Corporation | Apparatus, systems and methods for providing information regarding the aortic valve |
| WO2014121082A1 (en) | 2013-02-01 | 2014-08-07 | The General Hospital Corporation | Objective lens arrangement for confocal endomicroscopy |
| WO2014144709A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The General Hospital Corporation | Methods and systems for characterizing an object |
| EP2997354A4 (en) | 2013-05-13 | 2017-01-18 | The General Hospital Corporation | Detecting self-interefering fluorescence phase and amplitude |
| EP3021735A4 (en) | 2013-07-19 | 2017-04-19 | The General Hospital Corporation | Determining eye motion by imaging retina. with feedback |
| US11452433B2 (en) | 2013-07-19 | 2022-09-27 | The General Hospital Corporation | Imaging apparatus and method which utilizes multidirectional field of view endoscopy |
| EP3910282B1 (en) | 2013-07-26 | 2024-01-17 | The General Hospital Corporation | Method of providing a laser radiation with a laser arrangement utilizing optical dispersion for applications in fourier-domain optical coherence tomography |
| WO2015105870A1 (en) | 2014-01-08 | 2015-07-16 | The General Hospital Corporation | Method and apparatus for microscopic imaging |
| WO2015116986A2 (en) | 2014-01-31 | 2015-08-06 | The General Hospital Corporation | System and method for facilitating manual and/or automatic volumetric imaging with real-time tension or force feedback using a tethered imaging device |
| US10228556B2 (en) | 2014-04-04 | 2019-03-12 | The General Hospital Corporation | Apparatus and method for controlling propagation and/or transmission of electromagnetic radiation in flexible waveguide(s) |
| KR102513779B1 (ko) | 2014-07-25 | 2023-03-24 | 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 | 생체 내 이미징 및 진단을 위한 장치, 디바이스 및 방법 |
| US10989661B2 (en) | 2015-05-01 | 2021-04-27 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Uniform and scalable light-sheets generated by extended focusing |
| US9696255B2 (en) * | 2015-10-16 | 2017-07-04 | National Central University | Image processing method of two-photon structured illumination point scanning microscopy |
| WO2017180680A1 (en) | 2016-04-12 | 2017-10-19 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | LIGHT-SHEET MICROSCOPE WITH PARALLELIZED 3D lMAGE ACQUISITION |
| TWI582407B (zh) * | 2016-05-06 | 2017-05-11 | 國立中央大學 | 粒子三維定位與追蹤裝置及其方法 |
| DE102017120317A1 (de) * | 2017-09-04 | 2019-03-07 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Optische Anordnung und Verfahren zur Beeinflussung einer Dispersion von Wellenlängen mindestens eines Lichtpulses oder Lichtstrahls |
| US20190101489A1 (en) * | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Michael John Darwin | Method and Apparatus for Simultaneously Measuring 3Dimensional Structures and Spectral Content of Said Structures |
| DE102017127424B3 (de) * | 2017-11-21 | 2019-04-25 | Bruker Optik Gmbh | Mikroskop |
| CN116592775B (zh) * | 2023-05-30 | 2023-12-22 | 北京国光领航科技有限公司 | 一种基于色散测量拉锥光纤芯径的测量装置及其测量方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5034613A (en) | 1989-11-14 | 1991-07-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Two-photon laser microscopy |
| US5659642A (en) * | 1992-10-23 | 1997-08-19 | Optiscan Pty. Ltd. | Confocal microscope and endoscope |
| US6411835B1 (en) * | 1997-01-13 | 2002-06-25 | Medispectra, Inc. | Spectral volume microprobe arrays |
| US5713364A (en) * | 1995-08-01 | 1998-02-03 | Medispectra, Inc. | Spectral volume microprobe analysis of materials |
| US5995281A (en) * | 1997-04-09 | 1999-11-30 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Device for coupling the radiation of short-pulse lasers in an optical beam path of a microscope |
| EP1259163A4 (en) | 2000-02-08 | 2006-05-03 | Cornell Res Foundation Inc | OPTICAL FIBER MULTIPHOTONIC EXCITATION FOR SPECTROSCOPY BY FLUORESCENCE |
| DE10044308A1 (de) * | 2000-09-07 | 2002-03-21 | Leica Microsystems | Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von Fluoreszenzlicht bei der konfokalen Rastermikroskopie |
-
2005
- 2005-01-27 HU HU0500143A patent/HU227859B1/hu not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-01-27 WO PCT/HU2006/000009 patent/WO2006079861A1/en active Application Filing
- 2006-01-27 US US11/814,917 patent/US7872748B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-01-27 EP EP06710202A patent/EP1851580B1/en not_active Not-in-force
- 2006-01-27 DE DE602006004311T patent/DE602006004311D1/de active Active
- 2006-01-27 AT AT06710202T patent/ATE418085T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE602006004311D1 (de) | 2009-01-29 |
| ATE418085T1 (de) | 2009-01-15 |
| US7872748B2 (en) | 2011-01-18 |
| HUP0500143A2 (en) | 2006-07-28 |
| US20080308730A1 (en) | 2008-12-18 |
| EP1851580A1 (en) | 2007-11-07 |
| HU0500143D0 (en) | 2005-03-29 |
| EP1851580B1 (en) | 2008-12-17 |
| WO2006079861A1 (en) | 2006-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU227859B1 (en) | Real-time 3d nonlinear microscope measuring system and its application | |
| Ji et al. | Technologies for imaging neural activity in large volumes | |
| EP1584918B1 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenz-Lebensdauer-Imaging-Nanoskopie | |
| Iyer et al. | Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy | |
| US11009459B2 (en) | Fast two-photon imaging by diffracted swept-laser excitation | |
| Straub et al. | Fluorescence lifetime three-dimensional microscopy with picosecond precision using a multifocal multiphoton microscope | |
| Tsai et al. | In vivo two-photon laser scanning microscopy with concurrent plasma-mediated ablation principles and hardware realization | |
| US20180202935A1 (en) | Multifocal imaging systems and method | |
| JP5547868B2 (ja) | 顕微鏡系およびこれを用いた方法 | |
| Straub et al. | Live cell imaging by multifocal multiphoton microscopy | |
| Becker et al. | Picosecond fluorescence lifetime microscopy by TCSPC imaging | |
| DE102009029831A1 (de) | Vorrichtung und Verfahren für die Mehr-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie zur Gewinnung von Informationen aus biologischem Gewebe | |
| WO2001023913A2 (en) | Optical confocal device having a common light directing means | |
| DE102008018475A1 (de) | Vorrichtung und Verfahren zur Lumineszenzmessung | |
| EP1291627A1 (de) | Verfahren und Anordnung zur Multiparameter-Akquisition von Einzelphotonen zur simultanen Erzeugung von zeit- und orts- sowie zeit- und wellenlängen-aufgelösten Fluoreszenz-Bildern | |
| WO2012083206A1 (en) | Concurrent multi-region optical imaging | |
| DE102004017956B4 (de) | Verfahren zur Untersuchung der Lebensdauer angeregter Zustände in einer Probe | |
| DE112015006288T5 (de) | Optische Messvorrichtung und optisches Messverfahren | |
| Niesner et al. | Intravital two‐photon microscopy: focus on speed and time resolved imaging modalities | |
| Bansal et al. | High-speed addressable confocal microscopy<? xpp qa?> for functional imaging of cellular activity | |
| CN111579486B (zh) | 基于低功率受激发射损耗的超分辨成像方法及成像系统 | |
| Goure | Optics in instruments: applications in biology and medicine | |
| Cicchi et al. | Multidimensional custom-made non-linear microscope: from ex-vivo to in-vivo imaging | |
| Olivier et al. | Confocal laser scanning microscopy | |
| Singh et al. | Optical microscopy methods for understanding learning and memory |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |