HU227706B1 - Methods and materials for making transgenic dicamba-degrading organisms - Google Patents

Description

Eljárások és anyagok dicamba-lebosíó, traaszgeiilkus organizmusok előállítására

A találmány tárgyát dicamba-herbícidet lebontani képes transzgenikus organizmusok 5 képezik, például olyan transzgenikus növények, amelyek dícambára toleránssá lettek alakítva. Á találmány tárgyát képezik dicamba-ieböutó enzimek is, valamint dícamba-lebontő enzimeket kódoló DNS-molekulák és DNS-konsírukciók. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások gyomnövények elpusztítására, dicamba-toleráns transzgenikus növények termesztésére szolgáló száníóföldön, és eljárások dícamba eltávolítására olyan anyagokból, amelyek szennyezésként tartalmazzák azt (bloremediáeio). A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások transzformánsok szelektálására dicamba-íoleranciára vagy a dicamba-lehontás eredményeként keletkező 3,6-diklór-szalicílsav fluoreszcenciájának detektálására alapozva.

Herbicideket rutinszerűen alkalmaznak a mezőgazdasági termelésben. Hatékonyságukat gyakran az alapján határozzák meg, hogy milyen mért-ékben képesek elpusztítani a haszonnövények termesztésére szolgáló szántó-földön nőtt gyomokat, és az értékesíthető haszonnövénynek a hérbícidre mutatott toleranciája alapján. Ha az értékesíthető haszonnövény nem toleráns a herbicidre, a herhíeid tönkreteszi az értékesíthető haszonnövény termőképességét vagy teljesen elpusztítja azt. Ezzel ellentétben, ha a berbídd nem elég erős, túl sok gyom növekedését teszi lehetővé a haszonnövények termesztésére szolgáló szántóföldön, amely viszont csökkenti az értékesíthető haszonnövény termőképességét. Ezért kívánatos olyan, gazdaságilag jelentős növények előállítása, amelyek herbícidekre toleránsak. A víz és mezőgazdasági területek környezeti minőségének megóvása céljából is kívánatos, hogy kifejlesszünk herbíeidek lebontására szolgáló technológiákat azokra az esetekre, ha az véletlenül kiömlik, vagy azokra az esetekre, ha a föld vagy a viz vártnál nagyobb mértékben szennyeződik.

Herbicideket és más xenofőb vegyűleteket inaktiváló enzimeket kódoló géneket már sokfele prokariőía és eukarióta organizmusból izoláltak. Néhány esetben ezeket a géneket genetikailag manipulálták növényekben való sikeres expresszió céljából. Ezzel a megközelítéssel olyan növényeket fejlesztettek ki, amelyek herbícidekre toleránsak, közelebbről 2,4-díklórfenoxi-ecetsavra íWillmítzer, Bio/Technology 7, 811-816 (1989)], bromoxynilre [Stalker és mtsai.,. Science 242, 419-423 (1988); kereskedelmi név: Buctrílj, glifozátra [Comai és mtsai,,

Natúré 317, 741-744 (1985); kereskedelmi név: Round-Up] és foszfino-trícinre [De Block és mtsai., BMB-01 6, 2513-2518 (1987); kereskedelmi név: Bastaj.

. ... jí. .r

A ^wdicamba”-t (kereskedelmi név: Banvel) herhieídként alkalmazzák egynyári és évelő, széles lomblevelű gyomok és néhány fuféle-gyom kiirtására, amelyek kukorica, cirok, gabonafelék között, legelőn, kaszálón, szabad legelőn, cukornád, spárga, gyep és magéri. termesztett fö között nőnek, azok megjelenése előtt vagy után. (lásd “Crop Protection Referenee”,

1803-1821. old., Chemical & Pharmaceutícal Press, Inc., New York, NY, 11. kiadás (1995)],

Sajnos a dföamba több, kereskedelmileg fontos haszonnövényt károsíthat (például babot, szójababot, gyapotot, borsót, burgonyát, napraforgót, paradicsomot, dohányt és gyümölcsfákat), díszfákat és dísznövényeket, és más széles lomblevelű növényt, ha érintkezésbe kerül azokkal (hivatkozás ugyanott). A dicamba kémiailag stabil, és néha tartósan a környezetben maradhat.

Dföamba a benzoesav-herblcidek osztályába tartozik. Feltételezések szerint, benzoesav-herhicidekre, beleértve díeambára toleráns növényeket l-amíno~cíklopropán-l-karbonsav (ACC) szintetázt kódoló antiszensz gén, ACC oxidáz antiszensz gén, ACC deanánáz-gén vagy ezek kombinációjának növénybe való beépítésével lehet előállítani (lásd 2,165,036. sz. kanadai szabadalmi leírás, közzétéve 1996. június 16,]. Azonban ebben a szabadalmi leírásban nincse15 nek bemutatva olyan kísérleti adatok, amelyek igazolják ezt a toleranciát.

ismeretesek dföambát metaboiizáló baktériumok [lásd 5,445,962. sz. üSA-bdi szabadalmi leírás; Kraeger és mtsai,, X Ágrie. Food Chem. 37. 534-538 (1989); Cork és Kmeger, Adv Appl. Mförohiol. 38, 1-66 (1991)'. Cork és Khalll., .Adv. Appl. Mierobiol. 40, 289-320 (1995)]. Feltételezések szerint ezen baktériumokból dicamba metabolízmusáéri felelős, speeifi20 kus géneket lehet izolálni., és dicamba-rezlsztens növények és más organizmusok előállítására lehet azokat alkalmazni (lásd ugyanott; Yang és mtsai., AnaL Biochem. 219, .37-42 (1994)] /Azonban a jelen találmány kidolgozása előtt még nem azonosítottak vagy izoláltak ilyen géneket.

A találmány tárgya Izolált és legalább részlegesen tisztított dicamba-iebontó O-deme25 tiláz, izolált és legalább részlegesen tisztított dlcamba-lebontó oxigenáz, izolált és legalább részlegesen tisztított dícamba-lebontő terredoxin, valamint izolált és legalább részlegesen tisztított dlcamba-lebontó reduktáz, valamennyi a lentebb definiáltak és leírtak szerint.

A találmány tárgyát, képezi olyan izolált DNS-molekula is, amely dícamha-lebontó oxigenázt kódoló DNS-szekvencíát tartalmaz, olyan Izolált DNS-molekula, amely dicamba30 lebontó ferredoxint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz és olyan izolált DNS-molekula, amely dlcamba-lebontó reduktáz! kódoló DNS-szekvenciáé tartalmaz. A találmány tárgyát képezi továbbá olyan BNS-konstmkeló, amely dicamba-lebontó- oxlgenázf kódoló DNS-szekveneiáí, dlcamba-lebontó ferredoxint kódoló DNS-szefcvenciái vagy dicamba-lebonfó reduktáz! kódoló

-3 DNS-szekvenciái tartalmaz úgy, hogy az egyes kódoló DNS-szekvenciák expressziős szabályzó szekvenciákhoz működőképesen vannak kapcsolva. Á találmány tárgyát képezi továbbá olyan DNS-konstmtóó, -amely dicamba-lebontó oxigenázt kódoló DNS-szekvencíát, dicambalebontó ferredoxint kódoló DNS-szekvenciát és dicamba-lebontó reduktázt kódoló DNS-szek5 venciát tartalmaz úgy, hogy az egyes kódoló DNS-szekvenciák expresszíós szabályzó szekvenciákhoz működőképesen vannak kapcsolva.

A találmány tárgyát képezi továbbá a fentebb definiált bármelyik DNS-konstrukció, amely olyan DNS-szekvencíát is- tartalmaz, amely a dicamba-lebontó enzime(ke)t növényi sejt vagy mikroorganizmus organell urnáihoz (kloroplasztiszhoz és/vagy mitokondriumboz) képes lö célba juttatni.

A találmány tárgyát képezi továbbá olyan transzgenikus gazdasejt, amely dicambalebontó oxigenázt kódoló DNS-t, dicamfea-lebontó ferredoxint kódoló DNS-í vagy dicambalebontó reduktázt kódoló DNS-t tartalmaz úgy, hogy az egyes DNS-ek expressziős szabályzó szekvenciákhoz működőképesen vannak kapcsolva. Továbbá, a találmány tárgyát képezi olyan transzgenikus gazdasejt, amely dieambadehonló oxigenázt kódoló DNS-t és dicamba-lebontó ferredoxint kódoló DNS-t, dicamba-lebontó reduktázt kódoló DNS-t, vagy dicamba-lebontó ferredoxint kódoló DNS-t és dicamba-lebontó reduktázt kódoló DNS-t tartalmaz úgy, hogy az egyes DNS-ek expresszíós szabályzó szekvenciákhoz működőképesen vannak kapcsolva. A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint a DNS olyan tranzitpepíidet kódoló

DNS-szekvenciát is tartalmazhat, amely a dicamba-lebontó enzim(ek)et növényi sejt vagy mikroorganizmus organellnmaihoz (kloroplaszíiszhoz és/vagy mitokondriumboz) képes célba juttatni. A transzgenikus gazdasejt lehet növényi sejt vagy prokarióta vagy eukarióta mikroorganizmus.

A találmány tárgyát képezi egy vagy több, olyan sejtet tartalmazó transzgenikus nő25 vény vagy növényi rész, amely dicamba-lebontó oxigenázt kódoló DNS-t, dicamba-lebontó ferredoxint kódoló DNS-t vagy dicamba-lebontó reduktázt kódoló DNS-t tartalmaz. úgy, hogy az egyes DNS-ek expresszíós szabályzó szekvenciákhoz működőképesen vannak kapcsolva. A találmány tárgyát képezi továbbá egy vagy több olyan sejtet tartalmazó transzgenikus növény vagy növényi rész, amely dscamba-tóbontő oxigenázt kódoló DNS-t és dícamba-iebontó ferredoxint kódoló DNS-t, dicamba-lebontó reduktázt kódoló DNS-t, vagy dicamba-lebontó ferredoxint kódoló DNS-t és dicamba-lebontó reduktázt kódoló DNS-t tartalmaz úgy, hogy az egyes DNS-ek expressziös szabályzó szekvenciákhoz működőképesen vannak kapcsolva. A találmány bizonyos előnyös megvalósítási módjai szerint, a DNS továbbá olyan tranziípeptideí *χ X.

kódoló DNS-szekvencíát tartalmaz, amely a díeamba-lebontó enzime{ke)t növényi sejt örganelUrm-aihoz képes célba juttató. Á tfanszgetócus növény vagy növényi rész előnyösen dicambára toleráns, vagy dieamba-íoloraneiájának mértéke megnövekedett díoamba-lebontó enzim(ek) expresszié) ának eredményeként.

A találmány tárgyát képezi eljárás is gyomok elpusztítására terszgemkus, dicambatoleráns növények termesztésére szolgáló szóntóföldön. Az eljárásban akkora mennyiségű dicambát alkalmazunk a száoíófoldön, amely hatékony gyomok elpusztítására.

A találmány tárgyát képezik eljárások dicambát tartalmazó anyag dekontamfoálására. A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint az eljárásban hatásos mennyiségű, trasszge10 oikus dlcamba-lebontó mikroorganizmust alkalmazunk az anyagon. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, az eljárásban hatásos mennyiségű díeamba-lebontó O~ demetiíázt alkalmazunk, vagy hatásos mennyiségű díeamba-lebontó oxígenáz, dicamba-lebontó ferredoxin és dícamba-lehöntó reduktáz kombinációját alkalmazzuk az anyagon.

A találmány tárgyát képezi eljárás transzformált növényi sejtek és transzformált növelő nyék szelekciójára ís, szelekciós-markéiként dicamba-íoleraneiál alkalmazva. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az eljárásban egy növényi sejtpopulációból legalább néhány növényi sejtet transzformálunk, igy azok. dicambára toleránsak, és az. eredményül kapott növényi sejtpopulációt dicambát tartalmazó, tenyésztési táptalajon növesztve a dlcamba koncentrációját úgy választjuk meg, hogy a transzformált növényi sejtek növekedjenek és a nem20 transzformált növényi sejtek ne növekedjenek. .A találmány egy' másik előnyös megvalósítási módja szerint, az eljárásban dícamhát alkalmazunk olyan növényi populációban, amelyről feltételezzük, hogy tartalmaznak transzformált növényeket, és az. alkalmazott dlcamba mennyiségét úgy választjuk meg, hogy transzformált növények növekedjenek, és nem-transzformált növények növekedése gátolva legyen.

Végül, a találmány tárgyát képezi eljárás transzformált gazdasejtek, intakt organizmusok és organizmus-részek szelektálására vagy szknnelésére. Az eljárásban előállítunk olyan gazdasejt-populáeiói, intakt organizmusokat vagy organizmus-részeket, amelyekről feltételezzük, hogy tartalmaznak transzformált gazdasejtekeí, intakt organizmusokat vagy organizmusrészeket, és meghatározzuk 3, ő-dí klór-szalicil savnak tulajdonítható fluoreszcencia jelenlétét vagy mértékét. A 3,ő-diklör~szasiciisav transzformált gazdasejtekben, intakt organizmusokban vagy organizmus-részekben képződik a dlcamba lebontásának eredményeként, de nem képződik nem-transzformálf gazdasejtekben, intakt organizmusokban vagy organizmus-részekben.

ϊ **i ο» *

- 5 L.ébra, A javasolt eleteontranszport vázlata dicamha 0-demet.ilázra, Elektronszál'lítás történik a NADH-ról egymás kővetőm reduktázns^-re, ferredoxitte~re és azután oxigeaázofcre. Az oxigén és a dícamha-szubsztrát reakcióját oxigenázw.·: katalizálja, miközben 3,6~diklórszalidlsav keletkezik, ox, oxidált; red, redukált.

2, ábra, Dicamba ö-demetilázban lévő ferredoxi-n-komponens levezetett amínosavszekvendájának összehasonlítása faredoxinok adrenodoxln-családtagiainak aminosavszekvenciájával. Jelölések a 2. ábrán; far dió ~ P.?e«i/omo,n<.75 maP&p&iPa Df-ő-ból származó dicamba O-demctiláz faredoxin-komponense (5. azonosítószámú szekvencia); férő rhoca = PhePohacter ca/.wárt«sbói származó faredoxin (lö. azonosítószámú szekvencia); fér caucr ~ lő CaiPoPaeier crc^cwdísból származó ferredoxin [11. azonossítószámú szekvencia]; tbcc rhocr - Ahoífococcux erytAropo/isfeól származó ferredoxin [12. azonossítószámú szekvencia]; putx psepu - AAcWornoms /.Wúáíból származó faredoxin (13 , azonosítószámú szekvencia); terp psesp ^:::: /Avtódkunoms fajból származó ferredoxin (14. azonosítószámú szekvencia). A 2. ábrán továbbá az 1-3. számozás a bakteriális faredoxinok adrenodoxín-családjának három konzer15 vatív motívumát jelöli.

3. ábra, .Dicamha G-demetilázban lévő két reduktáz-komponens levezetett aminosavszekvenciájának összehasonlítása FAD-íúggö piridín-nnkleotid reduktázok családtagjainak aminosav-szekvencíájával. Jelölések a 3. ábrán: redl dió ™ P. maPophiPa DM-ból származó dicamba ö-demetiláz reduktáz-komponense (7. azonosítószámé szekvencia); red2 dió - P.

meP&phPia Dl-6-ból származó dicamba O-demetiláz reduktáz-komponense (9. azonosítószámú szekvencia)·; ÁJÖÖ260Ő ~ $pfáng&M<»ia&' fajból származó reduktáz (15, azonosítószámú szekvencia); thed rboer^:::: A- ez^Wopofoból származó reduktáz (16. azonosítószámú szekvencia); cama psepu ~ P. /tikárból származó reduktáz (17. azonosítószámú szekvencia);. tera psesp ~ Pseialomouas fajból származó reduktáz (18. azonosítószámú szekvencia). A 3. ábrán továbbá az 1-5. számozás a FAD-fúggÖ pírídin-nukleotíd reduktázok öt konzervatív motívumát jelőfi.

Korábban végzett vizsgálatokban kimutatták [Cork és Kreuger, Adván. Appl Mcrobiol. 36, 1-56 és Yang és mtsai., Anal. Biochem. 219, 37-42 (1994)], hogy a Areudb/nonus ma&op&Wa talajbaktérium Dl-ő-törzse képes megszüntetni a dicamba herbicid30 aktivitását egyetlen reakciőlépésfeen, amelyben a dicamba (3,ö~diklór-2-metoxi-beozoesav) 3,6diklór-szalicílsavvá (3,6-DCSA) alakul. A 3,Ő-DCSA nem rendelkezik herbicid-aktivítással, és kimutatták, hogy nem fejt kí semmilyen káros hatást növényekre. Továbbá a 3,6-DCSA-t könnyen lebontja a talajban lévő normál baktériumflóra.

***«» X « * * χ **

-6A leírásban ismertetett kísérletek igazolják Yang és munkatársai [lásd ugyanott] hipotézisét, amely szerint 0-deraetiláz felelős a dícamba 3,ő-DCSA-vá alakításáért P matiqpfat&r Dl-6-törzs alkalmazása esetén, és kimutatták, hogy az ö-demetiláz egy három komponensből álló enzimrendszer, amely reduktázból, ferredoxinból és oxígenázból áll. Áz 1.

és 3. példában részletesen leírjuk a P. ^uPo/7/ufinből származó O-demetiláz és három komponensének izolálását, tisztítását és jellemzését. ?Á dieamba O-demetiláz bárom komponense által katalizált reakció reafccióvázlaiát bemutatjuk az 1. ábrán. Az 1, ábrán, bemutatottak szerint, elektronok vándorolnak a HADH-ról rednktázböl és ferredoxinból álló rövid elektrontovábbító láncon a terminális oxigenázig, amely katalizálja a dícamba oxidációját 3,6-DCSA-t előállítva.

lö A találmány első előnyös megvalósítási módja, szerint, a találmány tárgyát izolált, és legalább részlegesen tisztított, dícamba-lebontó enzimek képezik. A leírásban az „izolált kifejezés azt jelenti, hogy az enzimeket legalább azokból a sejtekből eltávolítjuk, amelyekben termelődtek (azaz abból a sejilizátutnből, amely tartalmazza azt), A leírásban „legalább részlegesen tisztított kifejezés azt. jelenti, hogy azokat legalább részlegesen elkülönítjük a sejtiizátum· más komponenseitől. Előnyösen az enzimeket elegendő annyira megtisztítani, hogy az enzimpreparátumok legalább körülbelül 70%-osan homogének legyenek.

A találmány tárgyát különösen izolált és legalább részlegesen tisztított dicambalehontó O-demetiláz képezi. A leírásban a „dícamba-lebontó O-demetiláz kifejezés dicambalebontó oxigenáz, dícarnba-lebontő ferredoxin és dicamba-lebontő reduktáz kombinációját je20 lenti, valamennyit lentebb definiáljuk,

A találmány tárgyát képezi izolált és legalább részlegesen tisztított dicaniba-lebontó oxigenáz is. A leírásban a „dieamba-lehontó oxigenáz” P. mattopfrilia Ol-ő-törzsből tisztított oxigenázt. jelent, és olyan oxígenázokat, amelyek az említett P. íw&opM/áabőí származó oxigenázzal legalább körülbelül 65%-ban homológ (és előnyösen azonos), és előnyösebben legalább körülbelül 75%-ban homológ (és előnyösen azonos), és előnyösebben legalább körülbelül 85%-ban homológ (és előnyösen azonos), sőt, még előnyösebben legalább körülbelül 95%-ban homológ anunosav-szekveneiával rendelkeznek, valamint amelyek képesek részt venni dícamba lebontásában. „Dicamba-leboníó oxigenázok közé tartoznak olyan mutáns oxigenázok, amelyek P. nm/ío/zóPíuből származó oxigenáz aminosav-szefcvenciájával rendeOteznek, amelyekben

3ö P. nxdtppóíónból származó oxigenáz szekvenciájához képest egy vagy több aminosav hozzáadása, deléciója vagy szubsztitúciója történt Ilyen oxigenázok lehetnek az oxigenáz enzímatíkusan aktív fragntensei, valamint olyan oxigenázok, amelyek P »m/nyriú/áíból származó oxigenázzal. egy adott mértékben homológok vagy azonosak, Dícamba-lebontó oxiger '

-7názok aktivitását az 1. és 3. példában leírtak szerint lehet meghatározni.

A találmány tárgyát képezi továbbá izolált és legalább részlegesen tisztított dicambalebontó ferredoxin. A leírásban a „díca.mba~lebontö ferredoxin”' P. maPophP/a DI-6-törzsből tisztított ferredoxint jelent, és olyan íerredoxinokat, amelyek az említett P, zm&öjpáz&oból származó ferredoxínsal legalább körülbelül 65%-ban homológ (és előnyösen azonos), és előnyösebben legalább körülbelül 75%-ban homológ (és előnyösen azonos), és előnyösebben legalább körülbelöl 85%-ban homológ (és előnyösen azonos), sót, még előnyösebben legalább körülbelül 95%-ban homológ amínosav-szekvesdával rendelkeznek; valamint amelyek képesek részt venni dicamba lebontásában, „Dicamba-lebontó ferredoxinok” közé tartoznak olyan mu10 táns ferredoxinok, amelyek F. m<z/mz?/nWból származó ferredoxin aminosav-szekvenciáiával rendelkeznek; de amelyekben a P, msÁophrfíaből származó ferredoxin szekvenciájához képest egy vagy több amínosav hozzáadása, deléciója vagy szubsztitúciója történt. Ilyen ferredoxinok lehetnek a ferredoxin enzimatiküsan aktív fragmenseí, valamint olyan ferredoxinok, amelyek P. wnÁydri/feból származó oxígenázzal egy adott mértékben homológok vagy azonosak.

Dicamba-lebontó ferredoxinok aktivitását az 1. és 3. példában leírtak szerint lehet meghatározni.

Végül, a találmány tárgyát képezi izolált és legalább részlegesen tisztított dicambalebontó reduktáz. A leírásban a „dicamba-lebontó reduktáz” F. maftophitia Dl-ó-torzsböí tisztított redoktázt jelent, és olyan reduktázokat, amelyek az említett F mu/topOriböi származó reduktázzal legalább körülbelül 65%-ban homológ (és előnyösen azonos), és előnyösebben legalább körülbelül 75%-ban homológ (és előnyösen azonos), és előnyösebben legalább körülbelül 85%-ban homológ (és előnyösen azonos), sőt, még előnyösebben legalább körülbelül 95%-ban homológ amínosav-szekvencíával rendelkeznek, valamint amelyek képesek részt venni dicamba lebontásában. „Dicamba-lebontó reduktázok” közé tartoznak olyan mutáns reduktázok, amelyek A ma/íopórtzobői származó reduktáz aminosav-szekvenchljával rendelkeznek, de amelyekben a P. /7?rtZtppA?7k?hől származó reduktáz szekvenciájához képest egy vagy több aminosav hozzáadása, deléciója vagy szubsztitúciója történt. Ilyen reduktázok lehetnek a reduktáz enzimatiküsan aktív fragmenseí, valamint olyan reduktázok, amelyek A moőrt/VnZ&rból származó oxígenázzal egy adott mértékben homológok vagy' azonosak.

Dicamba-lebontó reduktázok aktivitását az 1. és 3. példában leírtak szerint lehet meghatározni.

Aminosav-szekvenciahomolögia. mértékének meghatározására szolgáló módszerek szakember számára ismertek Például Genetícs Computing Group (GCG) szoftvercsomagjának FÁST A-programját (University of Wísconsin, Madison, Wí) lehet alkalmazni

különböző febérje-adatbázísokból, például „Swbs Protein Batabase”~ból szánnazó szekvenciák összehasonlítására.

A találmány szerinti dicamba-lebontö enzimeket az 1. és 3. példában leírtak -szerint lehet izolálni és tisztítani F. muFígzáriferbóí vagy más organizmusokból. Alkalmas, más organiz5 musok lehetnek például F. jnaltepktfia DI-6-törzstöl különböző baktériumok. Számos ilyen baktériumtörzs ismeretes, például sok talaibaktéríum, valamint édesvízi baktérium, lásd például 5,445,962, sz. USA-belí szabadalmi leírás; Krueger és mtsai., J. Agrie. Food Chem. 37, 534538 (1989); Cork és Krneger, Adv. Appl, Mícrobíol. 38, 1-66 (1991); Cork és Khalil, Adv. Appl. Mierohiol. 40, 289-320 (1995). Díeamba-lebontó baktériumok (azaz. olyan baktériumok, amelyek dicamba-t használnak szénforrásként) találhatók sok baktérium-nemzetségben, például ő)v.ó/.ngoz«aoöö; Aemmanas, Xantötaműnas, AícaPgems és Moraxeíla. Más, dicamba-íebontó baktériumtörzseket ezekhez a törzsekhez hasonlóan, szakember által ismert módszerekkel lehet izolálni.

A találmány szerinti dicamba-lebontö enzimeket azonban előnyösen rekombináns

DNS-leehnikák (lásd lentebb) alkalmazásával állítjuk elő. Különösen mutáns enzimeket állítunk elő ilyen módon, amelyek F muFöpóiFrtbói származó enzim olyan anünosav-szekvencíájávái rendelkeznek, amelyben a P. malíophAiaból származó enzim szekvenciájához képest egy vagy több aminosav hozzáadása, deléeiója vagy szubsztitúciója történt, például oltgonukleotidirányltött muíagenezis, ünkerpásztázó mutagenezís, poiáneráz láncreakciót alkalmazó mutagenezís és hasonlók alkalmazásával. Lásd Ausubei és munkatársai (szerk.), „Current Protocols ín Moíecular Bíology” (Wiley ínterseíence, 1990), és McPherson (szerk.), „Díreeted Mutagenesís. A Practícai- Approach”' (IKE Press. 1991).

A találmány egy második előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti dicamba-lebontö enzimeket kódoló, izolált DNS-molekulák. A le25 írásban az „izolált” kifejezés azt. jelenti, hogy a BNS-molekuIál. eltávolítottuk természetes környezetéből, vagy nem természetesen előforduló DNS-molekóla. Ilyen DNS-moíekulák előállítására szolgáló módszerek szakember számára ismertek. Lásd például Manlatis és munkatársai, „Moíecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor. NY (1982); Sambrook és munkatársai, „Moíecular Cioníng: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor, NY (1989),

A találmány szerinti í>NS-mo1ekulák lehetnek például Í2olált cDMS-ek vagy genomi kiónok, és lehetnek RNS-moíeknlák. P. pmftephflia DI-ő~törzsből származó, dicamba-lehontő enzimeket kódoló Honok azonosítását és izolálásár a 2. és 4-5. példában írjuk le. Dicambaleböntó enzimeket kódoló további Hónokat hasonló módszerekkel lehet előállítani. Az izolált

ϊ.:

-9klánokat vagy azok részeit próbaként lehet alkalmazni további klónok azonosítására és izolálására olyan orgmzmusokból, amelyek eltérnek azoktól a organizmusoktól amelyekből az eredetileg izolált klónak származtak. Alkalmas organizmusok lehetnek dícamba-lebontó baktériumok. A. fentebb leírtak szerint, A mafíqptófía DI-ő-törzsön kívül .számos baktériumtörzs is5 meretes, amely képes díeambát. lebontani. Lásd például 5,445,962. sz. USA-feeli szabadalmi leírás, Kroeger és mtsai., J. Agric. Food Chem. 37, 534-538 (1989); Cork es Kraeger, Adv. Appl. Microbíol. 38, 1-66 (1991); Cork és Khaki, Adv. Appl. Mierobiol. 40, 289-320 (1995).

A találmány szerinti DNS-moiekulákat kémiailag is lehet szintetizálni az izolált kiónok szekvenciáinak felhasználásával. Ilyen technikák szakember számára ismertek. DNS-szekven10' ciákat például foszfoamidit-tóniaá eljárással lehet szintetizálni automatizált DNSszíntetízátorban. A kémiai szintézisnek számos előnye van. A kémiai szintézis különösen azért kívánatos, mert a gazdaszervezet (amelyben a DN’S-szekvenciáí expresszijük) által előnyben részesített kódonokat. lehet alkalmazni az expresszió optimalizálására. Nem szükséges minden fcődont megváltoztatni ahhoz, hogy javított expressziét kapjunk, de előnyösen legalább a gaz15 daszervezetben ritkán használt kódonokat megváltoztatjuk a gazdaszervezet által előnyben részesített kódonokra. Nagymértékű expresszióhoz juthatunk, ha a ködőnek legalább körülbelül 50%-át, legelőnyösebben legalább körülbelül 80%-át megváltoztatjuk a gazdaszervezet által előnyben részesített kódonokra. Sok gazdaszervezet kódonpreferenciája ismert. Lásd például „Maximízing Gene Expressíon”, 225-85. old. (Keznikoff & Goid, szerk., .1986), FCT WO

97/31115. sz, és PCT WO 97/11086. sz, nemzetközi közzétételi iratok, EP 646643., EP

553494. sz. európai közzétételi iratok és 5,689,052., 5,567,862., 5,567,600., 5,552,299, és 5,017,692. sz USA-beli szabadalmi leírások. Más gazdasejtek ködonpreferenciájáí szakember által ismert módszerekkel lehet levezetni. Kémiai szintézis alkalmazásával a DNS-molekula vagy az általa kódolt fehérje szekvenciáját is könnyen meg lehet változtatni, például az 25 expresszió -optimalizálása, céljából (például mRNS szekunder struktúra eliminálása céljából, amely hatással van a transzkripcióra vagy transzlációra), egyedi restrikciós helyek kedvező helyekre való bevitele céljából, proteáz-hasitóhelyek deletálása céljából stb.

A találmány egy harmadik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik dicamba-lebontó enzimet kódoló DNS-t expressziós szabályzó szekvenciákhoz kap30 csolva tartalmazó, vagy több olyan kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-konstrukeió, amelyek dícamba-lebontó enzimet kódolnak, és az egyes DNS-,szekvenciák működőképesen vannak kapcsolva expressziós szabályzó szekvenciákhoz. A leírásban a „DNS-konsírukciófc” olyan mesterségesen előállított (nem természetsen előforduló) DNS-mofekdákat jelentenek, ί ·»ϊ *:*·

- 10melyek DNS gazdasejtekbe való bevitelére alkalmasak, és a kifejezésen éhünk kiméragéneket, expressziós kazettákat, és vektorokat.

A leírásban „möködőképesen kapcsolt” kifejezés. DNS-szekvenciák kapcsolatára utal (például a szekvenciák sorrendjére., a szekvenciák orientációjára és a különböző szekvenciák közötti viszonylagos távolságra) oly módon, hogy a kódolt fohériék expresszálódaak. Expressziós szabályzó szekvenciák és kódoló szekvenciák működőképes összekapcsolására szolgáló eljárások szakember számára jól Ismertek. Lásd például Maniatis és munkatársai, „Moléeular Cloning: A LaboraíoryManual·’, Cold Spring Harbor, NY (1982); Sambrook és munkatársai, „Moiecular Cloning; ALaboratory Manuaí”, Cold Spring Harbor, NY (1989).

lö „Expressziós szabályzó szekvenciák” olyas DNS-szekvenciák, amelyek bármilyen módon részt vesznek prokariőták és eukaríöták transzkripciójának vagy transzlációjának szabályzásában, Alkalmas expressziós szabályzó szekvenciák valamint előállításukra és alkalmazásukra szolgáló eljárások szakember által jól ismertek.

Áz expressziós szabályzó szekvenciák mindenképpen tartalmaznak promótert. A promóter lehet bármilyen DNS-szekvencia, amely transzkripciós aktivitást mutat a kiválasztott gazdasejtben vagy gazdaszervezetben. A promóter lehet indukálható vagy konstitutív, Lehet természetesen előforduló, állhat különböző természetesen előforduló promóterek részeiből, vagy lehet részlegesen vagy teljesen szintetikus. Promóterek tervezéséhez nyújt segítséget a promóterszerkezeí vizsgálata, például K&rley és Reynolds által, Nucleic Acids Rés. 15, 234320 61 (1987). A promóter transzkripciós slart-helyhe2 való viszonylagos helyzetét Is lehet, optimalizálni [lásd például Roberts és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 760-4 (1979)]. Szakember számára prokariótákban és eukariótakban alkalmazható sok promóter Ismeretes.

Növényekben alkalmazható konstitotív promóterek lehetnek például: növényi vírusokból származó promóterek, például karffolmozaík-vírusból származó 35S-promóter [Odell és mtsai., Natúré 313, §10-812 (1985)], fold! mogyoróban előforduló kforózísos csíkokat okozó cKülImovirusból származó, teljes hosszúságú íranszkriptum-promóter dupla enhanszerdoménnei [Maki és Shepherd, BBRC 244, 440-444 (1998)], ChloreHa-yirusból származó metiltranszferáz-gének promőterei (5,563,328. sz. USA-heli szabadalmi leírás) és mozaíkvirusból származó, teljes bosszúságé transzkripciós promóter (5,378,619, sz. USA-beli szabadalmi leírás); olyan génekből származó promóterek, mint rizsből származó aktin (McEIroy és mtsai., Plánt Celi 2, 163-171 (1990)], uhikítin [Chrisiensen és mtsai., Plánt Mól.

Bioi. 12, 619-632 (1989) és Chrisiensen és mtsai., Plánt Mól. Bíol. Γ8, 675-689 (1992)], pEMD [Last és mtsai., Theor. Appl. Ge.net. 81, 581-588 (1991)], MÁS [Veken és mtsai., í ‘U * *

....

- Π EMBO I 3, 2723-2730 (1984)], kukoricából származó H3-hiszton [Lepítií és mtsai'., Mól Gén. Génét. 231, 276-285 (1992) és Átanassova és mtsai., Plánt Journal. 2 (3), 291-300 (1992)], ffrossíca «α/wból származó ALS3 (WO 97/41228. sz. nemzetközi közzétételi irat); és különböző JgroZ?£mmrmm~génekból származó promóterek (lásd 4,771,002., 5,102/796.,

5,182,209. és 5,428,147. sz. USA-beli szabadalmi leírások).

Növényekben alkalmazható indukálható promóterek lehetnek: az ACB1-rendszerből számlázó promoter, amely rézre ad választ (Mett és mtsai., PNAS 90, 4567-4571 (1993)); kukoricából származó ln2~gén promótere, amely besizol-szdfonamid-herbicidre, saíeners-re ad választ (Hershey és mtsai.., Mól. Gén. Geneíics 22-7, 229-237 (1991) és Gatz és mtsai.. Mól.

Geo Genetícs 243·, 32-38 (1994)] és Tnlö-hől származó Tet-represszor promótere (Gatz és mtsai., Mól. Gén. -Génét. 227, 229-237 (1991)]; Különösen előnyös indukálható promoter növényekben való alkalmazásra az a promóter, amely olyan indukáló ágensre ad választ, amelyre növények normálisan nem adnak választ, ilyen típusú indukálható promóter például szteroidhormon génjéből származó indukálható promóter, amelynek transzkripciós aktivitása .15 giükokorriköszteroid hormonnal indukálható [Schena és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10421 (1991)]. Más, növényekben alkalmazható, indukálható promóterek leírását lásd EP 332104. számú európai közzétételi iratban, PCT WO 93/21334. és PCT WO 97/06269. számú nemzetközi közzétételi iratokban.

Baktériumokban alkalmazható promóterek például óGuri/ns órcurotrirvmo/í/dúrsból származó· maltogén amiláz-gén promótere, óGcrZ/a? /?<7m?htívrmAból származó alta-amiláz-gén promótere, m»y/r)/?yau/ricm?ísból származó BÁN amiláz-gén promótere,.

wbd&sból származó alkalikus proíeáz-gén promótere, ^öc?7/»s /wm/nsból származó xylozidáz-gén promótere, lambda-fág P& és Ft promóterei és Bscőezmh/u eoriból származó lac-, trp- és tac-promóterek, Lásd PCT WO 96/23893. és PCT WO 97/42320, számú nemzet25 közi közzétételi iratokat.

Élesztö-gazdasejtekhen alkalmazható promóterek például élesztőeredetű gllkoliíikus gének promóterei, alkohol dehidrogemíz gének promóterei, ΤΡΠ-promóter és ADH2-4cpromóter. Lásd PCT WO 96/23898. számú nemzetközi közzétételi iratot.

Fonalas gombákban alkalmazható promóterek például ADH3-promóter, tpíA30 promóter, Aspergi/Bs rnzueból származó JAK A amllázl kódoló gének promóterei,

Rfazofmstc&r mmómböl származó aszpartát-proteáz promótere, mgetből származó neutrális alía-amiláz promótere, A. v/gcrböl származó stabil alía-amikiz promótere, A. n/gerböl vagy mrumoAhóí származó glükoamiláz promótere, & mmfe/ből származó lipáz *Τϊ ~ 12promőtere, X, öröméből származó alkaiikus proteáz promőtere, X. orycöehól származó triózfosz® izomeráz promőtere és «Lúriaosból származó aeetamidáz. promőtere.

Lásd' PCT WO 96/23898. számú nemzetközi közzétételi iratot.

Emlős sejtekben alkalmazható promóterek például az $V40~promóter, meíallotionein5 gén promőtere, rágcsálóból származó emlötumor-virusból származó promótér. Rous-szarköma vírusból származó promótér és adeno vírus-2-bőÍ származó, fő, késői promótér. Lásd PCT WO

96/23898, és PCT WO 97/42320. számú nemzetközi közzétételi iratokat.

Rovarsejtekben alkalmazható promóterek például pohhedrin-promóter, Plöpromóter, Auí&praphei c«///r.w/crtból származó poiihedrözis-vims bázikus f'ebépe promőtere, baculovímsből származó, azonnali korai gén-1 promőtere és baculovirusból származó, 39Kjelű késleltetett korai gén promőtere.. Lásd PCT WÖ 96/23898. számú nemzetközi közzétételi iratot.

Végűi, más promóterek részeiből felépített promóterekel, és részlegesen vagy teljesen szintetikus promórerekeí is lehet alkalmazni [lásd például Ni és mtsai., Plánt J. 7, 661-676 (1995) és PCT WO 95/14998. számú nemzetközi közzétételi iratot, amelyekben ilyen, növényekben alkalmazható promótereket írnak lej.

A promótér tartalmazhat egy vagy több enhanszerelemet, vagy úgy lehet módosítva, hogy egy vagy több enhanszerelemet tartalmaz. A promótér előnyösen több enhanszerelemet tartalmaz Enhanszerelemeket tartalmazó promóterek nagyobb mértékű transzkripciót biztosi20 tanak olyan promóterekhez képest, amelyek nem tartalmazzák azokat. Növényekben alkalmazható enhanszereiemek például karfelmozaík-vírusból származó 35S~enfeanszerelem (5,106,739. és 5,164,316. számú U'SA-beh szabadalmi leírások) és óéro/ir&rm-mozaikvirusböl származó enfeanszerelem (Marti és mtsai.. Transgeníc Rés. 6, 143-156 (1997)]. Más sejtekben alkalmazható enhanszereiemek is ismeretesek. Lásd PCT WÖ 96/23898. számú nemzetközi közzétételi iratot, és “Enhancers Aad Enkaryotic Expression” (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1983).

Hatékony expresszió céljából a kódoló szekvenciát előnyösen 3’-végi nemtranszlálódö szekvenciához is kapcsoljuk működőképesen. A 3’~végi nem-transzlálódó szekvencia transzkripciós és/vagy transzlációs termináciös szekvenciákat tartalmaz, 3'-végi nem30 transzláiődó régiókhoz bakteriális, növényi vagy más eukariöta sejtek génjeinek szegélyező régióiból juthatunk. Prokarióiákban való alkalmazásra a 3’-végi nem-transzlálódó régió transzkripciós termináciös szekvenciát tartalmaz. Növényekben és más eukariötákban való alkalmazásra a 3'-végi nem-transzlálódó régió transzkripciós termináciös szekvenciát, és poliadenílálási

szekvenciát tartalmaz. Növényekben alkalmazható 3’~végi nem-transzlálódó szekvenciák például karfiolmozaik-vírusból származó 35S-génhől, fazeofa (magi génjéből, borsóból származó, nbulőz-bifoszfet karboxíiáz kis alegységének B9~génjébői, szójababból származó. 7S tartaléktápanyag-fehérje génejeihol, oktopm-szintetáz-génböl és nopaJin5 szintetáz-génból származó szekvenciák.

Növényekben és más eukaríótákban S’-végí nem-íransziálödá szekvenciákat is alkalmazunk. Az, 5’~végi nem-transzlálódó szekvencia az a mPNS-rész, amely az 5’-végi CAPhelytől a transzlációs iniciációs kódonig terjed. Ez a mRN'S-régió a transzlációs mieiáeióhoz szükséges eukariórákban, és szerepet játszik a génexpresszió szabályzásában. Növényekben al~ kalmazható 5’-_végl nem-transzlálódó régiók például lueerna-mozaíkvírusböl, uborkamozaikvímsböi származó burokfehérje génjéből és dohánymozaik-vírusból származnak,

A fentebb említettek szerint, a DNS-fconsírukció lehet vektor. A vektor tartalmazhat egy vagy több olyan replikáeíós rendszeri, amely lehetővé teszi annak replikáciőjáí gazdasejtekben. Önreplikációra képes vektorok lehetnek píazmídok, kozmidok és vírusvefctorok Más esetben a vektor lehet integrálódó vektor, amely lehetővé teszi, hogy a találmány szerinti dicamba-lebontó enzimet kódoló szekvencia integrálódjon a gazdasejt kromoszómájába. Kívánatos, hogy a vektor egyedi restrikciós helyekkel rendelkezzék a DNS-szekveneia inszeríátása céljából. Ha a vektor nem rendelkezik egyedi restrikciós helyekkel, módosítani lehet azt restrikciós helyek bevitele vagy eliminálása céljából, amely még alkalmasabbá teszi azt a további manipulációkhoz.

A találmány szerinti DNS-konstrukciókat különböző gazdasejtek transzformálására lehet alkalmazni (lásd lentebb). Genetikai markért (“szelektálható markért”) kell alkalmazni a transzformált gazdasejtek szelektálása céljából. A szelektálható markerek tipikusan lehetővé teszik a transzformált sejtek kinyerését negatív szelekcióval (azaz olyan sejtek növekedésének gátlásával, amelyek nem tartalmaznak szelektálható markert) vagy a szelektálható marker által kódolt termékre való szkríneléssel,

Á legelterjedtebben alkalmazott szelektálható markergén nővénytranszfonnádó esetén Tn5~hol izolált, neomicín foszfotransz&ráz-lí (nptíl) génje, amelyet ha növényi szabályzó szignálok vezérelnek, kanamieín-rezisxtenciát határoz meg (Fraley és mtsai,, Proc, Natl. Acad.

Sci. USA 89, 4803 (1983)1. Egy másik elterjedten alkalmazott szelektálható markergén a higrsmicín foszfóüranszföráz génje, amely higromicm-antibiotikumra határoz meg rezisztenciát [Vanden-Elzen és mtsai., Plánt Mól. Bioi. 5,299 (1985)}.

További, antibiotikum-rezisztenciát meghatározó, bakteriális eredetű szelektálható

z

- 14markergének például gentamicin acedltranszferáz, sztreptoxmcín foszfbtranszferáz, aminoglüko-zid S’-adeniltrauszteráz és bleomicin rezisztencia-determináns (Hayforá és mtsai., Plánt Physiol. 86_; 1216 (1988); Jones· és mtsai.. Mól. Gén. Génét. 210. 86 (1987); Sváb és tntsai.,. Plánt Mól. Biot 14, 197 (1990); Hille és mtsai., Plánt Mot Bioi, 7, 171 (1986)], Más, szeiek5 tálható markergének herbtcidrezisztendát határoznak meg, például glifozát, glüfozinát vagy bröwoxyml ellen (Comaí és mtsai., Natúré 317, 741-744 (1985); Gordon-Kamat és mtsai., Plánt Celí 2, 603-618 (1990) és Staíker és mtsai., Science 242, 419-423 (1988)].

Növésytrasszformációra szolgáié, nem bakteriális eredetű, más szelektálható markergének is ismeretesek. Ilyen gének például egérből származó dihidrofolát reduktáz, nö10 vényt 5-enoi-piruvil-sikimát-3-foszFáí szintetáz és növényi acetolaktát szintetáz [Eichholtz és mtsai., Somatíc Ceil Mól. Génét. 13.. 67 (1987); Shah és mtsai., Science 233. 478 (1986); Charest és mtsai., PlantCelí Rep. 8, 643 (1990)].

Feltételezhetően transzformált sejtek szkrinelésére általánosan alkalmazott gének, például β-glükoronidáz (GÜS), β-galaktozidáz, luciferáz és klöramfenikol aceíitemszféráz génje [Jeíferson, R. A., Plánt Mól, Bioi. Rep. 5, 387 (1987); Teeri és mtsai., E.MBO J. 8, 343 (1989); Konca és mtsai.. Proc. Natl. Acad, Sci. USA 84, 131 (1987), De Bloek és mtsai,, EMBO I 3. 1681 (1984)], zöld fluoreszcens fehérje (GFP) génje (ChaíSe és mtsai, Science 263, 802 (1,994).; Haselhoff és mtsai., T1G11, 328-329 (1995) és PCT WO 97/4.1228. számú nemzetközi közzétételi irat]. Viszonylag ritka transzformációs események azonosítására szol20 gálö másik megközelítésben olyan gént alkalmazunk, amely Zen moysfcan antocianmpigpentációs fofyamatsor domináns konstitutív szabályzóját tartalmazza [Ludwig és mtsai., Science 247. 449 (1990)1,

Prokariótákban és eukariótákbaa alkalmazható, növényekben alkalmazottaktól eltérő, alkalmas szelektálható markerek szintén jól ismertek Lásd például PCT WO 96/23898. és PCT

WO 97/42320. sz. nemzetközi közzétételi iratokat. Például antibiotikum-rezisztenciát (amplcüiinre, kanamicime, letraoíkünre., klóramíenikolra, neomicinre vagy Ingromicinre) alkalmazhatunk szelektálható markéiként.

A találmány szerinti megoldás másik vonatkozása szerint dicamba-toleraneiát alkalmazhatunk szelektálható markerként növényekre vagy növényi sejtekre. A „tolerancia” azt je30 lenti, hogy transzformált növényi sejtek képesek, növekedni, ha akkora mennyiségű dicambát tartalmazó tenyésztő táptalajra helyezzük azokat, amely megakadályozza nem-transzformált sejtek növekedését. A „tolerancia’' azt is jelenti, hogy transzformait növények képesek növekedni azt követően is, hogy akkora, mennyiségű dicambával kezeljük azokat, amely nem- 15**$ t

Jt· *aí· íranszförmáít növények növekedését gátolja.

Transzfermák növényi sejtek szelekciójára szolgáló eljárások szakember számára jól ismertek. Röviden összefoglalva, növényi sejtek populációjában (például egy explantátumban vagy embrionális szuszpenziós tenyészetben) legalább néhány növényi sejtet transzformálunk dicamba lebontását lehetővé tevő DNS~konstruk.cíövai vagy DNS-konstrukclók kombinációjával Az eredményűi kapott növényi sejtpopulációt olyan tenyésztő táptalajra helyezzük, amelyben ügy választjuk meg a dicamba koncentrációját, hogy a transzformált növényi sejtek növekedjenek, míg a nem-transzformált növényi sejtek ne növekedjenek. A megfelelő d'icamfeakoncenírációkat empirikusan határozzuk meg szakember által ismert módon.

lö Transzfermáit növények szelekciójára szolgáló módszerek szakember számára jól Ismertek. Röviden összefoglalva, dicambával kezelünk egy olyan növénypopulációt, amelyről feltételezzük, hogy a dicamba lebontását lehetővé tevő, DNS-konstrukciót vagy DNSkonstrukciók kombinációját tartalmazza. Λ dicamba mennyiségét úgy választjuk meg, hogy a transzformált növényi sejtek növekedjenek, és a nem-transzfonnáli növényi sejtek növekedése gátolva legyen. Az iuhibició mértéke elegendő keli, hogy legyen arra, hogy a transzformált és a nem-íranszformált növények könnyen megkülönböztethetők legyenek egymástól (azaz az inhibiciónak statisztikusait szignifikánsnak kell lennie), ilyen mennyiségeket empirikusan lehet meghatározni szakember által ismert módon.

Továbbá, 3,6-DCSA képződését, mint a dicamba lebontásának eredményét lehet fei20 használni szelekcióra és szknnelésre. 3,δ-DCSA képződése könnyen meghatározható ezen vegyidet fluoreszcenciájának megfigyelésével, amely transzformáit gazdasejtek, intakt organizmusok és organizmus-részek (például mikroorganizmusok, növények, növényi részek és növényi sejtek) szelekcióját és szkríneiéséi teszi lehetővé. Ebben a vonatkozásban a találmány szerinti megoldás lehetővé teszi transzformált gazdasejiek, intakt organizmusok és organizmussá részek szelekcióját és szkríneiéséi ugyanúgy, mint a zöld fluoreszcens fehérie esetén (lásd 5,162,227. és 5,491,084. számú USA-beli szabadalmi leírásokat és PCT WÖ 96/27675., WO 97/11094., WÖ 97/4.1228. és WO 97/42320. számú nemzetközi közzétételi iratokat, melyeket a kitanitás részének tekintünk). Főleg a szokásos speklrometriás módszerekkel lehet 3,6DCSA-t detektálni transzformált gazdasejtekben, intakt organizmusokban és organizmusai) részekben. Például mikroszkópra szúrőkombináeiót lehet csatlakoztatni fluoreszcencia gerjesztéséhez és detektálásához. Kézilámpát lehet alkalmazni laboratóriumi vagy terepen végzett.

munkához (lásd 1. példát). Fluoreszcens aktiválásra alapuló sejtosztályozást is lehet alkalmazni. 3,6-DCSA gerjesztési hullámhossza 312-313 nm, a maximális emisszió hullámhossza 424 nm.

Organizmusok „részei” : szervek, szövetek vagy bármilyen más rész. „Növényi részek” lehetnek magok, pollen, embriók, virágok, gyümölcsök, sarjak, levelek, gyökerek, szárak, expiamáímnok stb.

Dicamba-toloranciára vagy -dioamba-lébontásra alapuló szelekciót alkalmazhatunk dicamba-toleráns növények vagy dicamba-lehontó mikroorganizmusok előállításában, amely esetekben más szelektálható marker alkalmazására nincs szükség. Dioamba-tolerancíára vagy dicamba-lebontásra alapuló szelekciót alkalmazhatunk olyan transzgesíkus sejtek vagy organizmusok előállítása során, amelyek más kérdéses géneket expresszálnak. Sok ilyen gén isme10 retes, amelyek kereskedelmi értékkel rendelkező fehérjéket kódolnak, valamint növényeken javított mezőgazdasági tulajdonságokat meghatározó gének (lásd példáid PCT WO 97/41228, számú nemzetközi közzétételi iratot, melyet teljes egészében a kitárni ás részének tekintünk),

A találmány szerinti DNS-konstrakciókat különböző gazdasejtek, például prokarióták. és eukariöták transzfbrmíálására lehet alkalmazni. Dieamba-lebontó enzime(ke)f és a szelektál15 ható markért, kódoló DNS-szekveneiák {ha külön szelektálható markért alkalmazunk) lehetnek ugyanazon vagy különböző DNS-konstrukciókon. Előnyösen egyetlen DNS-konstrukeión, transzkripciós egységként vannak elhelyezve úgy,, hogy valamennyi kódoló szekvencia együtt expresszálódik, A kérdéses gén(efc) és a dieamba-lebontó eazíme(ke}t kódoló BNS-szekveneia (DNS-szekveneiák) (ha szelektálható markéiként díc&mba-toleranciát vagy dicamba-lebontást alkalmazunk) lehetnek ugyanazon vagy különböző DNS-konstrukcióhan is. Ilyen DNSkonstrnkciökat a fentebb leírtak szerint állítunk elő.

Alkalmas gazdasejtek lehetnek profcariöta és eukaríóta .mikroorganizmusok (például baktériumok, például AgroOaeteríarn &íme/hcmnst és Esckeríc/aa co/h, élesztők, például Óhcchcwtnyees' cerewa? és más gombák, például Aspergjffas fajok), növényi sejtek, rovar25 sejtek és emlős sejtek. A gazdasejt előnyösen olyan sejt, amely normálisan nem képes dieambát lebontani. A. találmány szerinti megoldást alkalmazhatjuk olyan gazdasejtek dicamba-lebontási mértékének fokozására, amelyek normálisan kénesek dieamhát lebontani.

Tehát a találmány szerinti „franszgenikus” sejtek és organizmusok közé olyas sejtek és organizmusok tartoznak,, amelyek normálisan nem képesek dieamhát lebontani, de amelyek a találmány szerint transzformálva képesek lebontani ezt a herbicidet, A találmány szerinti „franszgenikus” sejtek és organizmusok közé tartoznak olyan sejtek és organizmusok is, amelyek normálisan képesek dieambát lebontani, de amelyek a találmány szerint transzformálva több ilyen herbicidet képesek lebontani vagy a herbieidet hatékonyabban képesek lebontani.

- 17Prokarióta és eukarióta gazdasejtek transzformálására szolgáló eljárások szakember számára jói ismertek. Lásd például Maniaüs és munkatársai, _:5>folecular Cloning: A .Lahoratory Manual”, Cold Spring Harbor, NY (1952); .Sambrook és munkatársai:, „Molecular Cloning: A Lahoratory Manual”, Cold Spring Harbor, NY (1989),

Például számos, eljárást fejlesztettek ki növények transzformációjára, beleértve biológiai és fizikai transzformációs eljárásokéi. Lásd például Miki és munkatársai, „Proeedures fór Introdueing Poreign DNS intő PlantsL „Methods in Plánt Molecular Bíology and' Bioteeimology’^s című könyvben, Glick, B. R. és Thompson, J. E. szerk. (CRC Press, Inc,, Boca Raton, 1.993), 67-88. old. Továbbá rendelkezésre állnak növényi sejt vagy szövet transzformálására és növények regenerálására szolgáló vektorok és át vrtra tenyésztési eljárások. Lásd például Gruber és munkatársai, „Vectors fór Plánt. Transíormatíon”, „Methods ín Plánt Molecular Biology and Bioíechnology” cimd könyvben, Glick, B. R. és Thompson, J. E. szerit (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993), 89-Π9. old, A 6. példában leírunk egy konkrét példát növények transzformálására, a találmány szerinti megoldás alkalmazásával.

A legelterjedtebben alkalmazott eljárás expresszlós vektor növényekbe való bevitelére

Apwóöemrmmot alkalmazó természetes transzformációra alapul [lásd példáid Horsch és mtsai., Science 227, 1229 (1985)]. A. fástnejaeiens és,-4. rá/zögmes növényi patogén talajbaktériumok, amelyek genetikailag képesek növényi sejteket transzformálni. A. tWe/riefonsbol és ,4. z'kí'zíígez’c.s-böl származó Ti- és Ri-plazmidok, sorrendben, a növény genetikai transzformálá20 sáért felelős géneket hordoznak [lásd például Kado, C. L, Crit. Rév. Plánt Sci. IÖ, 1 (1991)]. AywA7cmrmn^í?-vektot'rendszerek és Agzote/erara-közvetíteát géntranszfert alkalmazó eljárásokat számos hivatkozásban leírnak, például Miki és munkatársai, mint fent; Moíoney és munkatársai, Plánt Cell Reports §, 238 (1989); és 4,940,838, és 5,464,763. sz. USA-beii szabadalmi leírások.

Növényíranszfii'tniáeióra általánosan alkalmazható módszer mikrorészecske-közvetített transzformáció, amelyben DNS-t mikrorészecskék felszínén továbbítunk. Az expresszlós vektort bíolisztikus berendezéssel visszük be növényi szövetekbe, amely akkora sebességre gyorsítja fel a mikrorészecskéket, amely elegendő a növényi sejtfalakon és membránokon való átfutáshoz [Stanforá és mtsai.. Part. Sci, Technoi, 5, 27(1987); Satiford, J. C,_s Trends Biotech·.

6, 299 (1988); Sanford, I. C. Physiol. Piaci 79, 206 (1990); Klein és mtsai., Bíoteohnology 10,

268 (1992)].

DNS növényekbe fizikai való célba juttatására szolgáló másik módszer célsejtek ultrahangos kezelése (szonikálása) ÍZhang és mtsai,, Bio/Iechnology 9, 996 (1996)]. Más módszer

- 18szerint iíposzőma- vagy szféroplasA-fuziót alkalmazunk expressziós vektorok növényekbe való bevitelére [Deshayes és mtsai., EMBÖI. 4, 273'1 (1985); Christou és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3962 (198?]. Protoplasztok közvetlen DNS-feivételét is leírták CaCL-os kiesapás, poHviml-alkohoi vagy poll-L-ornitin alkalmazásával [Ham és mtsai., Mól. Gém Génét.

199. Ι6Ϊ (1985) és Draper és mtsai., Plánt Cell Physiol. 23, 451 (1982)}. Protoplasztok és egész sejtek és szövetek elektroporáeiójáí is leírták [Dóm? és mtsai., “Abstraets of Vlíth International Gongress on Plánt Cell and Tissae Culíure lÁPTC”, A2-38, 53. old. (1990); D’ííallum és mtsai.. Plánt Cell 4, 1495-1505 (1992); Spencer és mtsai., Plánt Mól, Bioi. 24, 51-61 (1994·)].

A találmány szerinti megoldással bármilyen típusó transzgenikus, dicamba-toleráns növényt létre lehet hóm. Különösen széles lomblevelű növényeket (például babok, szójababok, gyapot, borsók, burgonyák, napraforgók, paradicsomok, dohány, gyümölcsfák és dísznövények és fák) lehet így transzformálni, amelyekről jelenleg ismeretes, hogy a dicantba károsítja azokat, így a berhícidre toleránssá válnak. Más növényeket (például kukorica, cirok, gabonai 5 félék, cukornád, spárga és füvek) is lehet transzformálni, amelyeket jelenleg dieambára toleránsaknak tekintünk, így megnöveljük a herbicíd irányában matatott toleranciájukat. Konkrétan, bármilyen kétszikű vagy egyszikű növényt lehet transzformálni a találmány szerinti DNSkonstrukciókkal. A „toleráns” kifejezés azt jelenti, hogy a transzformált növények akkora mennyiségű dícamba jelenlétében képesek növekedni, amely gátolja a nem-transzfonsáft növé20 nyék növekedését.

Előre látható, hogy a találmány szerinti, dieamba-iebontó oxigenázok a trauszgenikus gazdasejtekben és organizmusokban található endogén reduktázokkaí és férredoxinokkal együtt képesek működni dicamba lebontásában. Növényi kloropfasztiszok különösen gazdagok reduktázokban és ferredoxiuokban. Ennek megfelelően, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, transzgenikos, dicamba-toleráns növények előállítására olyan peptideí (például tranzítpeptidet) kódoló szekvenciát alkalmazunk, amely a dícaniba-íebontő oxlgenázt a kloroplasztiszba juttatja („kloroplasztiszba juttató szekvencia”). A kloroplasztiszba juttató szekvenciát kódoló DNS előnyösen a dicamba-lebontó oxlgenázt. kódoló szekvenciától szintézísíránnyal szemben (5’-irányban) helyezkedik el, de el lehet azt helyezni a kódoló szekven30 ciátől szintézisirányban (3 Ahányban} Is, vagy a kódoló szekvenciától mind szintézisiránnyal szemben, mind szlntézlslrányban. Bármilyen alkalmas kloroplasztiszba jutíattö szekvenciát lehet alkalmazni. Kloroplasztiszba juttató szekvencia például kukoricából származó cab-m7szlgfiálszekvencia [lásd Becker és mtsai.. Plánt Mól, Bioi. 20, 49 (1992) és PCP WO

-1997/41228. számú nemzetközi közzétételi irat], borsóból származó giníation reduktáz szignálszekvencia .(Crerssen és mtsai., Plánt J. 2, 129 (1991) és PCT WO 97/41228. számú nemzetközi közzétételi irat] és borsóból származó ribulóz-l,5-blfoszlát karboxíláz kis alegységének szignálszekvenciája (19. azonosítószámú szekvencia [Fluhr és mtsai., EMBÖ J. 5, 2Ö63-207I (1986)]. A találmány egy alternatív előnyös megvalósítási módja szerint közvetlenül transzformálunk kloropiasztlszokal olyan konstrukcióval, amelyek kloroplasztiszban működőképes· pro.mótert tartalmaz, így a kloröplasAiszban kapunk oxigenáz-expressziót [lásd például WO 95/24492. számú nemzetközi közzétételi iratot és 5,545,818. számú USA-belí szabadalmi leírást] Természetesen, ha a kiválasztod íranszgenikus gazáasejt vagy organizmus nem lennel .10 elegendő endogén reduktáz!, fetredoxint vagy mindkettőt, a gazdasejtet vagy organizmust transzformálni lehet úgy, hogy az egyik vagy mindkét, enzimet, valamint oxigenází termeljen.

A találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya eljárás gyomnövények kiirtására olyan szántóföldőn, ahol íranszgenikus, dicamba-toleráns növények növekednek. Az eljárásban hatásos mennyiségű dieamhát juttatunk a. szántóföldre a gyomok kiirtása céljából. Dieamba alkalmazására szolgáló módszerek és különböző típusú gyomok kiirtására hatásos mennyiségű dieamba mennyiségei ismeretesek Pásd “Crop Protecíion Refereneefo 1803-1821. old., Chemical & Pharmaeeutieal Press, Inc. New York, NY, 11. kiadás (1995)}.

A találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya eljárás egy anyagban, például talajban, vízben vagy dicamba-gyártó üzemben keletkezett hulladékban lévő dieamba lebontására. Ilyen lebontást a találmány szerinti dicamba-lebontó enzimekkel lehet végezni, Az. enzimeket olyan mikroorganizmusokból tisztítjuk, amelyek természetes módon expresszálják azokat (lásd az 1. vagy 3. példát) vagy azokat termelő transzgenikus gazdasejíekből lehet tisztítani. Ha ilyen enzimeket alkalmazunk az eljárásokban, akkor a megfelelő kofaktorokat is biztosítani kell (lásd 1. példát). A hatásos mennyiségeket szakember által ismert módon, empirikusan lehet meghatározni (lásd 1. példát). Más módszer szerint, íranszgenikns prokarióta és eukarióta mikroorganizmusokat lehet alkalmazni dieamba lebontására ilyen anyagokban, 'Íranszgenikus prokarióta és eukarióta mikroorganizmusokat a fentebb leírtak szerint lehet előállítani, és a hatásos mennyiségeket szakember álfa! ismert módon, empirikusan lehet meghatározni,

Dieamba nagy mennyiségekben, folyamatosan jut a környezetbe. A dieamba eliminálása nagyrészt a föld talajában és vizeiben élő mikroorganizmusokban található enzimrendszer hatásától függ. Az, hogy megértsük az említett enzimrendszerek, például dicamba-lehontó 0-

-2010 demetüázok és három komponensének működését, fontos a természetes és genetikailag módosított mikroorganizmusok kiaknázásáért tett erőfeszítésekhez, amelyeket htoremediációra és szennyezett talaj, víz és más anyagok helyreállítására alkalmazunk. Tehát a találmány szerinti dicamba-lebontó enzimeket, DNS-molekulákat, DNS-konstrukciókat stb, kutatási eszközként alkalmazhatjuk a dicamba-Tebontás és bioremeáiáciős kutatásában.

Végül, a találmány szerinti dicamba-lebontó enzimeket dícamba meghatározására szolgáló vizsgálati eljárásokban alkalmazunk.. A vélhetően dícambát tartalmazó mintát összekeverjük dieamba-iebontó Ö-demeíilázzal vagy dicamba-lebontó oxigenáz, dieamba-iebontó ferredoxin és dícamba-febonió reduktáz kombinációjával. Megtelető vizsgálati eljárásokat az 1. és 3, példában írunk le. Főleg a 3,,6-DCSA képződésére visszavezethető tluoreszcencía detektálása vagy mérése tesz lehetővé könnyen elvégezhető- vizsgálati eljárást.

Psejid&mfffi&x fna/laphíiia Dí-ó-törzshel származó dícamba O-demetitáz kt tisztítása és it

Jíaktérínm és körülmények. Fsearfomoms mfémpnllia DI-6-íötzseí dicambával tartósan szennyezett talajból Izoláltunk [Kreuger és mtsai., J. Agrie, Food Chem., 37, 534-5-3-8 (1989)}. A baktériumot Dr, Dougias Cork bocsátotta rendelkezésünkre (Illinois Institute of Technology, Chicago, IL), és redukált kiorid-tápközegben tartottuk fent [Kruger,

J. P., Ph.D. thesis, Illinois Institute of Technology, Chicago, IL (1989)}, melyet dicambával (2 mg/ml), vagy glükózzal (2 mgZml) és ,,€asamino”-savakkai (2 mg/ml) egészítettünk ki. A szénforr ásókat szűréssel sterilizáltuk és a tápközeghez aotoklávozás után adtuk hozzá. Szilárd táptalajt 1 vegyes-% Gelrite (Scott Laboratories, West 'Warwick, R.I.) hozzáadásával állítottunk elő.

2.5 FegyrweA' és reagensek. Dicamhát, 3,6-DCSA-t és [^HC]~díearnhát (U~fenil~^HC,

42.4 mCi/mmol, radiokémiái tisztasága 98%-nál nagyobb) a Sandoz Ágro, Inc, cégtől (Des Plaines, IL) szereztük be. Az oldhatóság fokozása céljából a dícamba- és a 3,6-DCSÁtörzsoldatokat ROH-val titráltuk pH 7,0-re. Valamennyi- vegyszert a Sigrna Chemical Co. (Sí. Louís, MO) cégtől szereztünk be, hacsak másképpen nem jelöljük. Superose 12, Mono Q, Q30 Sepharose (Pasi FIow) és Phenyl-Sepharose (CL-4B) oszlopokat illetve tölteteket az FFLCkészuíékfeez (nagyhatékonyságú íblyadék-kromatogyáihoz) a Pharmacia cégtől (Mihvauk.ee,

Wí) cégtől szereztük be. Ampholyte pH 4-ö-ot és ampholyte pH 4-9-et a Serva (Heídelberg,

Németország) cégtől szereztük be. Afcrílamidot. β-merkaptoetanolt, Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetrametil-21 etiléndiannot (TEMED) és ammónátm-perszulfátot (APS) a Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA) cégtől szereztük be. Vékonyréteg-krömatográfiás lemezeken (TLC) szihkagél volt (250 gin vastagságú) ÜV 254 indikátorral, ezeket J. T. Barker Chemical Co. cégtől (Phillipsburg, NJ) szereztük be.

Hpsgd/d eijárés&k Dicamba O-demelíÍáz-aktivh.ásí [^WC]-3,Ő~DCSA kialakulásával mértünk ['^Cj-dlcambáhöl. Röviden összefoglalva, az enzim-komponensek keverékeiben az aktivitást 3ö^oC-on mértük, egy standard 300 μΐ-es reakciókeverék 25 mM kálinm-fószfát-puífert (pH 7,0), 10 mM MgCb-ot, 0,5 mM NADH-t (béta-níkotínamid-adenindínnkleotid, redukált forma), 0,5 mM va<ÍI)-szu1fátot, 50 μΜ hideg dicambát, 2,5 μΜ [³⁴C]10 dicambát (a radioaktív dicamba végső specifikus aktivitása 1,9 mCi/mmol volt), és különböző mennyiségű sejtlizátumot vagy részlegesen tisztított enzimet tartalmazott. Az. utolsó tisztítási lépésekben valamennyi enzimaktivitást vizsgáló eljárást foszíáí-pufferben végeztünk, mivel azt találtuk; hogy a dicamba O-demetíláz aktivitás pH-optimuma a foszfát-pufferek középső tartományában volt, és fószflt-pufeben magasabb enzimaktivitást. figyeltünk meg, mint Tris15 HCI-pnfferfeen (trís-(hidroxi-metii)-aminometán-hidroklorid] pH 7,Ö-en, Á reakciókat a szubsztrát, a dicamba hozzáadásával indítottuk. Meghatározott időpontokban a reakciókat 50 μΐ 5 tf%~os kénsav hozzáadásával állítottuk le. A dicambát és dicamba-rneiabolítokat azután kétszer extraháltuk egy térfogai éterrel, és az extráktumokat szárazra pároltuk. Az extrakcíós eljárás kitermelése (átlag ± standard deviáció) 87% ± 2% volt dicantbára és 85% + 3% 3,620 DCSA-ra (Yang és mtsai., Anal. Bioehe®. 219, 37-42 (1994)].

{^wC]-dícambát és (^uC]-jelölt mefabolitokat vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) választottuk el. Az éterrel extrahált dicambát és metabolitjait 50 μΐ éterben vettük fel a TLClapra való felvitel előtt A TLC-hez használt oldószer-rendszer kloroform-etanol-eeefsav (85:10:5 térfogatarányban) volt. Az elválasztott reakciótermékekei úgy tettük láthatóvá és mérhetővé, hogy a TLC-lemezeket foszfor-ernyőre helyeztük 24 óra hosszáig, és azután Phosphorlmager SF (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) készülékben szkrlneltük azokat. A TLC-lapokon levő lóitok radioaktivitásának mennyiségét ügy határoztuk meg, hogy egy adott foltból származó összes pixel számát viszonyítottuk ugyanezen a lemezen lévő, ismert mennyiségű (^í4Ci-dicamba foltjának pixelszámához. Egy egység aktivitást akkora enzimmennyíség30 kém definiálunk, amely 1 nmol 3,6-DCSA-t állít elő percenként 30°C-ou. A specifikus aktivitásokat a vizsgálati eljárásban alkalmazott reakciőkeverékben lévő Ossz-fehérjekoncentrácíóra vonatkoztattuk.

«ϊ *

-22A dicamba demefiláz reduktáz komponensének aktivitását 2,6-diklór-fenol-mdofencl (ÖCIP) redukciójának mérésével határoztuk meg Hitachi U-2000 spektrofotométerben. A reakció 0,5 mM NADH-t, 0,2 mM FAD-oí (flavin-adenin-dinukleetíd), 50 μΜ DCíP-ef, 20 m.M Tris-puffert (pH S,ö) és 100-löö μΙ enzimmintát tartalmazott 1 ml össztérfogathan. Az abszorbancía változását 600 nm-eu szobahőmérsékleten mértük. A specifikus aktivitást' a redukált DC1P 600 nrn-en mért, 21,0 mM'W⁴ extinkdós koefficienséből számítottuk ki. A specifikus aktivitást nmol percenként redukált DCIP-ként fejeztük ki 1 mg fehérjére vonatkoztatva.

Továbbá in sifu DClP-vizsgáíati eljárást alkalmaztunk a reduktás-aktivitás detektálására és lokalizálására az izeelektromos fókuszáló (IEF) géleken elválasztott íehésjepreparátu10 mokban, Miután. a fehérjéket lEF-gélen elekíroforetizálfuk, a sávokat kivágtuk a gélből és 20 ml, hideg, 20 mM Tris-HCl-puffetrel (pH 8,0) mostuk. Alacsony olvadáspontú agarózt feloldottunk 10 ml, 20 mM Tris-HCI-putlérben (pH 8,0) való melegítéssel, 1,5 vegyes-% végkoneenírációbsn. Amikor az agaróz lehűlt szobahőmérséklet közelébe, kiegészítettük 0,2 mM FAD-al, 50 μΜ DCIP-vel és 0,5 mM NADH-val A. vizsgálati eljárás reakeíókeverekét üveg15 lemezre öntöttük és hagytuk megszilárdulni. A gélt a megszilárdult reakciókeverék tetejére helyeztük, és 15 percre hagytuk, hogy felvegye a szobahőmérsékletet. Ha a gélszelet reduktázaktivitással rendelkező fehérjét tartalmazott, a redukált DCIP színtelen sávja alakult ki a DCIP kék hátterében.

wfc A sejteket addig növesztettük rázógépen (250 rpm, 3G^oC~on), amíg 550 nm-en mért optikai denzitásuk 1,3-1,5 lett folyadékban, csökkentett kíoridet tartalmazó, glükóz és „Casamíno”-savak keverékét tartalmazó tápközegben. A sejteket centri&gálással elkülönítettük, kétszer mostuk hideg 100 mM MgCb~ban, és újra eerárífogáítuk. A sejtpasztát vagy rögtön fölhasználtuk, vagy gyorsan lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és -80°C-on tároltuk. Az enzim tisztításakor 25 g fagyasztott sejtet felolvasztottunk, és 50 ml izoláló püffedjen felsznszpendáU'uk, amely 25 mM Tris-puffert (pH 7,0), lö mM MgCb-ot és 0,5 mM EDTA-t tartalmazott. Fenil-metil-szuLtöníl-fiuoridot és ditiotreitoh adtunk hozzá, 0,5 mM és 1 mM végkoncentráeióban, sorrendben, 10 mg lízozim és 1 mg Dnáz hozzáadása után a sejteket 10 percig keveriettük jégen és szeníkáiással (szonikátor; XL2020-tnodeil; Heat Systems) összetörtük azokat jégen, a szonikátort közepes teljesítményre állítottuk.' („seífing 5”), a szonikálás 20 másodpercig tartett és 40 másodperc szünet volt. Az így kapott sejtlizáíumoí 90 ral-re higífottnk izoláló pufferrel, és cemn&gáhuk 76.000 x g-n, 1 óra hosszáig, 4°C-on. A felűlüszót használtuk tiszta sejthzátum-ferrásként.

-23 EfrstotWfrds, Valamennyi eljárást 4^QC-oa végeztük, hacsak másképpen nem jelöljük. Szilárd ammónmm-szulfátoc lassan adagoltunk 90 ml térfogatú, tiszta sejtfeátumba 40 vegyes» % telítettségig, állandó kevettetés közben. 15 perc kevertetés után a keveréket 15.400 x g-n centrifugátok 15 percig, és a csapadékéi kidobtuk. További szilárd nmrnóniurn-szulfátot ada5 goltunk 70 vegyes-% telítettségig, a íéíülúsző állandó kevertetése közben. 15 perc kevertetés után a keveréket a fentebb leírt körülmények között centrifugátok. A íelüiószót kidobtuk, és a csapadékot minimális térfogatú A-pnfferhen (20 mM TRIS pH 8,0, 2,5 mM MgCI?, 0,5 mM EDTA, 5 tértbgat-% glicerin és 1 mM ditíotreitoi) feloldottuk.

A 40%-7Ö% ammönium-szulfát-telítettségnél kicsapódott anyagot azután FPLC10 készülékbe kötött Phenyl-Sepharose-oszlopra (2,5 χ 10 cm) vittük, és csökkenő ammóníumszulíát-gradienssel (10 vegyes-%-ről ö vegyes-%-ra) eluátok. Az oszlopot előzőleg 10 vegyes% ammónium-szulfáíot tartalmazó A-pntrerrei ebátok. Az áramlási sebesség 1 ml/pere volt. A fehétjekoncentrációkat folyamatosan követtük A»-«ál az oszlop eluálása közben. Áz oszlopot 1.20 ml lő vegyes-% ammöníum-szulfáfot tartalmazó A-puíferrel mostuk, mire Á₂sö~nái alap15 vonalat kaptunk. A megkötődött fehérjéket 210 ml össztérfogatú, A-puíferben lévő, csökkenő ammömum-szulBt-gradienssel (10 vegyes~%-rol 0 vegyes%-ra) eluáltnk. 2 mtl-es frakciókat gyűjtöttünk. Az egyes frakciókból 10 μί-es alikvotokat vettünk, és standard dicamba Ödemetiláz-aktivitást mérő vizsgálati eljáráshoz (lásd fentebb) adtuk, kivéve azt, hogy nemradioaktív dieamháí alkalmasunk szubsztrátként. A dicamba 0-demetiláz-aktivÍtást úgy áe20 íektáltuk, hogy kézi UV-lámpával (312 nm, Fotodyne) sötét-szobában követtük a dicamba átalakulását a nagymértékben fluoreszcens reakciótermékké (3,ó-DCSA~vá).

Ez az eljárás lehetővé tette a dicamba O-demetiláz felbontását három részre (,,ροοΓra), amelyek az elválasztott komponenseket (jelölésük I, H. és III komponens) tartalmazták. Valamennyi komponens esszenciális volt a dicamba O-demetiláz aktivitáshoz (lásd lentebb). Ha az. egyik komponens aktivitását vizsgátok, a másik két komponenst feleslegben adtuk hozzá. Egy típusú aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítettük (I komponens, 128-145. frakciók; II. komponens, nem kötődött 12-33. frakciók; III. komponens, 62-92. frakciók).

(r) /fe £ to»g?<s>«e«s ffrztoto. Az I komponens aktivitását tartalmazó frakciókat (a Phenyl-Sepharose-öSzlöptöi 0 M ammóniunr-szulfárnál eluálódoit, 128-145. frakciók) egyesítő tettük, melyek osszíértögaía 34 ml volt. Az egyesített mintákat 10 ml-re töményítettük centrifegálással, Centriprep-10 (Amicon) berendezés alkalmazásával, és azután Q-Sepharose (Fást Flow) FPLC-oszlopra (Tharmacia) vittük (2,5 x 6 cm), melyet A-pufferrel ekvilíhráiínnk és 80 ml Á-pnfferrel mostunk. Az oszlopra kötődött fehérjéket 100 mi, Á-pnfrerben lévő, lineáris

- 24 K€l~gradienssel (O-tól 0,6 M-ig) eluáltuk, 1 ná/perc- áramlási sebességgel. 1,5 percenként szedtünk frakciókat. Az I. komponens aktivitását mutató frakciókat (29-37.) egyesítettük, Apuderrel szemben diaüzáimk egy éjszakán át, 4^&C~on, és MonoQ HR 5/5 FPLC anioncserélő oszlopra vittük A-pu.fferben. A. fehérjéket I ml/perc áramlási, sebességgel eluáltuk 50 ml, nő5 vekvő koncentrációjú (ö~ö,5 M) KCI-gradiens alkalmazásával. Az I komponens aktivitását mutató frakciókat (19-25.) egyesítettük és centrifugálással 0.4 ml-re íöményltetfük Ceníríeon10 berendezés alkalmazásával. A töményítelí mintát azután kromatográfiásak vetettük alá Superose 12 FPLC-oszíopon (1,6 x 50 cm), 0,2 mí/perc áramlási sebességgel, 100 mM KCl-í tartalmazó A-puffer alkalmazásával. Az I. komponens aktivitását mutató, 7-10. frakciókat egyesítettük és centrifugálással töményitetíük Cemricon-10 berendezés alkalmazásával.

A részlegesen tisztított Ϊ. komponenst hideg, 1 vegyes-%-os glicínnel hígítottuk és további háromszor cenirifugáiássai töményítettük Céntricon-10 berendezés alkalmazásával kisózás céljából, IFF-clektroforézisre való előkészítéshez. A kisózott mintát azután 6 vegyes-%-os lEF-gélre (pH 4-6) vittük, és elekfrolbrézisnek vetettük alá 1,5 óra hosszáig 4⁰C~on (lásd len15 íebb). Flektroforézis után a gélt 25 mM hideg föSzfat-pufFerrel (pH 7,0) mostuk 5 percig, és azután a gélsávokzt tartalmazó szeleteket kis darabokból álló kockákra (6 mm x 4 mm) vágtuk. A fehérjét ügy eluáltuk a kockákra vágott géldarabokbóL hogy pípettaheggyel felaprítottuk azokat 10 pl 25 mM foszfáí-puOer (pH 7,0) jelenlétében Az egyes szegmensekből -származó fehérjét összekevertük feleslegben lévő II és ΠΙ komponenssel, és dicamba G-demetíiáz20 aktivitásra vizsgáltuk. Az I. komponens aktivitását mutató gélszegmenst (amelynek színe vörösesbarna is volt) 12,5 vegyes-% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó poliakrllamid-gélre (SDS-PACíE) vittük a minta tisztaságának ellenőrzése céljából.

fii) A ll áeapene® ús'riúása, A Phenyi-Sepharose oszlopkromatográflából kapott Π. komponenst A-pufferrel szemben diallzáituk egy éjszakán át, 4^aC~on, és FPLC Q~

Sepharose-osziopra (2,5 x 6 cm) vittük. A míntseluálás körülményei azonosak voltak a fentebb, I komponensre leírtakkal, kivéve, hogy az elúciós gradiens 0-1 M KCi volt Á-pufferben. A. II kompones aktivitását mutató frakciókat (30-37. frakciók) egyesítettük, A-pufferrel szemben diallzáituk, 0,4 mí-re íöményiíettük. és Superose 12 FPLC-oszlopra ( Lő x 50 cm) vittük. A míntafelvifel és az eiöeíó eljárása azonos volt a fentebb, I. komponensre leírtakkal. A II.

komponens aktivitását mulató (3-6.) frakciókat egyesítettük, azonos térfogatú A-pufferrel hígítottuk és MonoQ FPLC-oszlopra vittük. A fehétjéket az oszlopról ugyanolyan KCl-gradiens alkalmazásával eluáltuk, mint az 1. komponens esetén. A 20-25. frakciók mutatták a II. kom- 25 ponens aktivitását. A részlegesen fisztifott ö. komponenst tovább tisztítotok íEF-elektroforézisseí (pH 4-6), ugyanolyan körülményeket alkalmazva, mint az I. komponensre leírtak esetén. A II. komponens aktivitását mutató gélszegmenst 12,5 vegyes-%-os SDS-PxAGE-ra vittük további analízis céljára.

A Ifi áompímemv risztoEa Phenyi-Sepharose oszlopkromatográfíából kapott

IS. komponenst A-pufferrei szemben dializáltuk egy éjszakán át, 4°C-on, és FPLC QSepharose-oszíopra (2,5 x 6 cm) vittük. A körülmények azonosak voltak a fentebb, I. komponensre leírtakkal. A ΙΠ. kompones aktivitását mutató frakciókat (26-38. frakciók) B-puftérrel [10 mM TRIS pH 7,5, 2,5 mM MgCL, 0,5 mM EDTA, 5 tér.fbgat-% glicerin és I mM ditiofreiíol] szemben díaiizáhuk és 5 rnl-re töményltettük. „Blue dye aSlnity mátrix” (Cibacron .Blue 3GA, type 3000 (Sigma)] töltöttünk egy FPLC-oszlopba (1x5 cm), és elő-ekvilihráltuk 20 ml B-pufferrel. A töményített IH. komponenst a “Blue dye” oszlopra vittük, és 20 ml BpüOerrei mostuk 0,2 ml/perc áramlási sebességgel, ameddig az oszlopról lefolyó A» elérte az alapvonal szintjét. A kötött fehérjét azután 5 mM NADH-vai elváltuk B-pufferben. Reduktáz15 aktivitást tartalmazó frakciókat ügy detektáltuk, hogy «ficamba O-demeüláz aktivitásra vizsgáltunk feleslegben jelenlévő I. és II. komponensekkel, valamint úgy is, hogy az egyes frakciók képesek voltak-e DCIP-et redukálni NADH jelenlétében. A mindkét vizsgálat szerint, erőteljes reduktáz-aktivitással rendelkező frakciókat egyesítettük, 100 mM KCí-ot tartalmazó Apufíértel szemben dializáltuk, és felvittük Superose 12 FPLC-ösziopra. Ugyanolyan körülmé20 nyék között végeztük a futtatást, mint azt az. I. komponensre leírtuk. D€IP-red«keiői katalizáló fehérjét tartalmazó frakciókat egyesitettűk, A-pufFerrel szemben dializáltuk és FPLCMonoQ-oszlopra vittük. A fehérjéket ugyanolyan körülmények között eluáltuk, mini azt az L komponensre leírtuk. Részlegesen tisztított Hí. komponenst tovább tisztítotok IFFgéielektroförézissel (pH 4-6). Az IEF~geIben, reduktáz-aktivitással rendelkező fehériéket úgy detektáltuk, hogy DCIP-redukciót vizsgáltunk agaröz-gélre fektetve, a fentebb leírtak szerint. A II. komponens aktivitását mutató gélszegmeasf 12,5 vegyes-%-os SDS-PAGE-ra vittük további analízis céljából.

Az IFF-gélekhőí kivágtuk a fehéíjecstkokal, és 12,5 vegyes-%-os SÖS-poliakrilamid-gél rmntaíelvivó helyeibe helyeztük.

Elektroíorézís után a tisztított féhépéket tartalmazó gélszeleteket PYDF-membránra (polivinilidén-difluorid, Mlllipore) blöfföltük “Trans-Blot cefi” (Bio-Rad, Ríchmcnd, CA) berendezés alkalmazásával, 25 V-on, 16 óra hosszáig. A blottoló puffét 10 mM-os CAPS-ot [3(cíklohexil-amino)-l-propáuszulforisav, pH 10,0} tartalmazó 20 tf-%-os metanolos oldat volt.

* ·* < * ί X ♦ * ' ♦ * »** **** .<

- 26A szekvenátást Applied Biosystems Inc. cégtől beszerzett, “420 ÍT-jelü készülékben végeztük Edman-lebontást alkalmazva [Edmon és- Bensehen, S. B. Needleman (szerk.) “Protein sepuence determinatíon’j 2. kiadás, Springer-Veriage (1.975), New York).

A fehér] ekoncenf rációkat Bradfbrd módszere 5 [Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976)] szerint határoztuk meg, standardként marhaszérumalbumint alkalmaztunk.

A7M-E4GTÚ Nátrium-dodeeil-szulDtot tartalmazó gélelekíföforézisí (SDS-PAGB) Laemndí (Natúré 227, -680-685 (1970)] módosított módszere szerint hajtottuk végre. 85 x 65 x 9,75 mm-es,. .12,5 vegyes-%-os· SDS-gébkeí az alábbiak szerint készítettük el: futtató gél: 2,5 ml 49 vegyes-%-os akrílamid/bisz-akrilamid-oidat (37.5:1), 1 ml futtató puffer-oldai [3 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,8 vegyes-% SDS], 4,5 ml HjO, 5 μΐ 'FEMED és 40 ul 10 vegyes-%-os APS; míntagél'. 0,5 ml 40 vegyes-%-os akrilamid/bisz-akrilamíd-oldat, 0,5 ml mintagél-puíFeroldaí [1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,8 vegyes-% SDS], 3 ml fEO, 5 μΐ TEMED és 12,5 pl 10 vegyes-%-os APS. Az- eiektroforézis-puffer összetétele: 25 mM Tris-HCl- (pH 8,3), 0,2 M glícin és 0,1 vegyes-% SDS. A miníapuffer 0,25 ml nhntagél-puíFert, 0,6 ml 20 vegyes-% SDS-í. 0,2 ml (í-merkapíoetanolt és 0,95 ml 9,1 vegyes-% brőmfenolkékeí tartalmazott 59 íérfógaí-%-os glicerinben. Az elektroförézist 89 V-on végeztük „Bío-Rad Mini Gél” készülékben, ameddig a nyomkövető festék 0,5 cm-re volt a gél anód felé eső végétől. A fehérjéket 0,1 vegyes-% Coomassíe örifliast Blue R-250-el festettük meg, amely izopropanol, víz és eeetsav 3.6.1 tér20 fegat-arányó keverékében volt. A festékíelenitésí metanol, víz és ecetsav 7:83.1.0 térfogatarányú keverékében végeztük. A fehérjestandardek (Gibco BRL) az alábbiak voltak: míozin (2.14,2 kDa), fbszforiláz-B (111,4-kDa), marhaszérum-albumin (74, 2-5 kDa), ovalbamin (45,5 kDa), szénsav anhídráz (29,5 kDa). β-laktoglobulín (18,3 kDa) és lizozim (1.5,4 kDa).

meghejfaazása. A peptidek molekulatömegét (M_r) denaturáló kö25 rübnények között becsültük meg SBS-kAGB-analízís alkalmazásával. A l._} ö. és IB. natív komponensek molekulatömegeit gélszűréssel határoztuk meg Superose 12 HR 19/39 FPLCoszlopon (Pharmacia), 0,2 mi/perc áramlási sebességgel, 100 KCl-ot tartalmazó Apúderben. A kalibráló fehérjék a Bío-Rad cégtől származó gélszűrő-standardek voltak: marhából -származó tíreogtobuKn (670 kDa), marhából származó gamma globulm (158 kDa), csirkéid bői származó ovalbumin (44 kDa), lóból származó mioglobín (17 kDa) és Β-12-vítamin (1,35 kDa). A Superose 12 oszlop kizárási térfogatát B-lu-e Dextran (M_f 2.009.990, Sígma) alkalmazásával határoztuk meg.

£ •ϊ »♦♦}; .j. I

- 27 /EK Izoelektromos fókuszáló (IEF) gélelefctroforézist vertikális, mini-gél készülékben (dMGV-100 modell, C.B.S. Sclentiic Co., Del Mar, CA) hajtottuk végre. lEF-géieket (70 x 90 x I mm) 6 vegyes-%-os políakrilamiddai készítettünk az alábbi komponensek összekeverésével: kö ml 30 vegyes-%~os akríIamid.Ábísz-akriiamid (37:5:1), Ö,S g glicerin, 0,32 ml ampholyfe pH 4-6 (Séma), 0,08 ml ampholyte pH 4-9 (Serva), 5,2 ml BjO. 10 pl TEMED és 80 td 10 vegyes~%-os APS A katódpoffer 100 mM β-aíanín és az anódpuffer 100 mM ecetsav volt. Körülbelül 1-10 μΐ 1 vegyes%~os glicínben lévő fehér)emlntákaf összekevertük azonos térfogatú mintapuíforrel (50 térfogat-%-os glicerin, 1,6 térfogat~%~os ampholyte pH 4-9, 2,4 térfogat-%-os smpbolyte pH 4-öj. A mintákat a gél katód felőli végénél vittük fel, és 200 V-on vándoroltaítuk azokat 1,5 óra hosszáig és 400 V-on további 1,5 óráig, A fehérjéket Coomassie Brilliant Blue R-250 alkalmazásával festettük meg, fentebb, az SDS-poliakrdarmd-gélekre leírtak szerint. Az (EF-markerek (Sigma) a következők voltak', amiloglükozídáz, pí 3,6; glükóz oxidáz. pl 4,2' trípszin-inhihitor, pl 4,6; p-íakiogiobuíin-Á, pl 5,1; szénsav anhidráz-il, pl 5,4; szénsav anhidráz-II, pl 5,9 és szénsav anhidráz-L ni 6,6.

Emedhai Dícamba Ö-demeííláz által katalizált demetilálási reakció kinetikáját kezdeti reakciósebességek analizálásával tanulmányoztuk, állandó enzimkoncentráció jelenlétében és a szubsztrát (dícamba) koncentrációját növelve. A reakciókeverékek 25 iaM káliumfoszfát-puffért (pH 7,0), 10 tsM MgCh-ot, 0,5 mM NADH-t, 0,5 mM FeSCV-ef, 25 pg részlegesen tisztított O-metiiáz-enzlmet (a 40 vegyes-% és 70 vegyes-% közötti telítettség között kicsapódott ammőníum-szulfat-frakciót tiszta sejtlizáfumbóí), különböző koncentrációjú (0,550 μΜ) dícambát és különböző koncentrációjú fⁱ⁴C]-dica.mbát (V-fenil-^í4Q 42,4 mCl/mmoi) tartalmaztak 300 ut össztérfogatban. Azokban a vizsgálati eljárásokban, ahol 0,5 μΜ és 1 μΜ közötti dicamba-kOncenfráciőkaf ^alkalmaztunk, a reakcíőíérfogatot 900 pi-re növeltük, hogy elegendő mennyiségű radioaktív dícamba és mefabolitjai álljanak rendelkezésre a detektálás le25 hetövé tételét biztosítva. Ezekben a kísérletekben a reakcióban lévő más komponensek, mennyiségét megháromszoroztuk, A P'^!C]~díeamha konverzióját [ⁱ⁴C]-3,ő-DCSA-vá különböző időpontokban határoztuk meg, valamennyi alkalmazott dícamba-konccntrácíö esetén, Pbosphorímager SF alkalmazásával, amely radioaktivitásra képes pásztázni foszfor-ernyőkön, amelyeket TLC-lemezek hatásának tettük ki 24 óra hosszáig. Egy egység aktivitást akkora en30 zimmennyíségként definiálunk, amely 1 omol 3,.6-DCSA-í állít elő percenként 3Ö^öC-on. Az egyes reakciók kezdeti sebességét a reakciósebesség idő függvényében felvett görbéjén határoztunk meg az egyes szubszirárkooceníráciőfc esetén. Az adatokat Míchaelis-Menten-kinetika ,ί ,, * »ί X >

, *. ϊ

X*

-28 szerint modelleztük, és a K_;íi és V_ms>· értékeket Lineweaver-Burk-gőrbék Illesztésével határoztok meg SigmáPlot® (Jandel Scientibc, Corte Madera, CA) alkalmazásával.

Előzetes kísérletekben Clark-oxigénelektrod alkalmazásával mértük az oxigéníbgyasztásí standard dicamba Ö-detneüláz vizsgálati eljárásban, szub szíréiként dlcambát alkalmazva. A dicamba O~demetíláz által katalizált, dicamba ö-demetilálás oxigénígényének Igazolása céljából reakciókat végeztünk anaerob kamrában, amely I ppm-nél kevesebb oxigént tartalmazott Az oxigén kiszorítását a reakclókeverékből 4®C~on végeztük. Enzimet nem tartalmazó reakciókeverékeket egy reakeióedénybe helyeztünk, és gumírozott kupakkal lezártuk. Az oxigén kiszorításához az edényt, evakuáltuk kétszer vákuummal és minden egyes alkalommal nitrogént áramoltattunk át rajta. A harmadik evakuálás után az edényen 90% nitrogént és 10% hidrogént tartalmazó gázkeveréket áramoltattunk át. Az enzimoldatból ehhez hasonlóan kihajtottuk az oxigént (ügyeltünk arra, hogy az. enzimoldatot. ne buborékoltassuk) A reakciókeverékeket és az enzimoldatot egyaránt anaerob kamrába (95% nitrogént és 5% hidrogént tartalmazó atmoszféra) vittük át. Kétszáz mikroliter tiszta sejtlízátumot Injektáltunk a gumírozod. kupakon át egy mikrofecskendővel, és gyengéden összekevertük 960 μΐ oxigénmentes reakciókeverékkel, A reakciókat 3ö^ö'C~on végeztük.

A reakciótermékeket TLC-iemezefcen vizsgáltuk, ami azt mutatta, hogy a [^!4C]~3,óDCSA-képződés sebessége [^:4C]~dieambaból anaerob körülmények között szignifikánsan kisebb volt, mint a reakciósebesség ugyanennyi enzímmennyiségef alkalmazva aerob körülmények között Anaerob körülmények között látszólag nem volt dicamba átalakulás 3,6-DCSAvá 1 órán belül. Viszont párhuzamos reakciókeveréket véve az anaerob kamrából 30 perc múlva és levegővel inkubálva a dicamba Ö-demetiláz-enzimkomplex egyik komponense szignifikáns mennyiségben oxígenáz. volt.

Megjegyezhetjük, hogy a [ⁱ⁴C]~dicamba üt vüro konverziója [^HC]~3,ő-DCSA-vá hasonló módon történik, mint a korábban leírt üt vivő konverzió (Cork és Kreuger, A.dv. Appl. Microhiol. 36, 1-66 (1991); Yang és mtsai;, Anal. Biochem. 219, 37-42 (1994)]. Ezekben a kísérletekben a DCSA-t reakciótermékként azonosították TL€~vel és kapilláris elektroforézissel egyaránt. A DCSA-t meggyőzően azonosították, a dicamha-lebontás az első fo termékeként mind üt vívó, mind ót vúro gázkromatográfia és tömegspektrometria alkalmazásával.

és k&fa&tertgények Á dicamba O-detnefiláz három komponensének phenyl-sepharose oszlopkromatogránával végzett első elválasztása után a részlegesen tisztított preparátumokat egyenként további tisztításnak vetettük alá Q-Sepharose oszlopon (2,5 x 6 ’A: : Ρ , £»;» Í»»a » **í ** * « Λ#. ««

- 29 cm). A mintákat Q-Sepharose (Fást Flow) FFEC-osziopra (Pharmacia) vittük A-pufrérben, és 109 mi 0-0,6 M KCI-gradienssel (az oxígenáz-konrponensre) vagy 0-1,0 M KCI-gradienssel (a ferredoxin és a reduktáz komponensekre) eluáltuk, 1,5 ml-es frakciókat szedve. Aa egyes oszlopokról származó, megfelelő egyesített frakciókat (oxígenáz-tíszfnásbői a 29-37. frakciókat, ferredoxín-tisztitásből a 30-37. frakciókat vagy a redukíáz-ítszütásból a 26-38. frakciókat) használtuk a komponens- és kofakíorigények meghatározására,

A három komponenst O-demetiiáz-akíivitásra vizsgáltuk különböző kombinációkban, a komponensek igényeinek meghatározása céljából.

A kofaktorigények meghatározása céljából az O-demeüláz-aktivítást vizsgáltuk' a háti) rom komponens és [^l4C}-dicamba keverékének alkalmazásával, 30 percig., 3Ö°C-on. A reakcíókeverékben lévő (optimalizált arányt biztosítva), részlegesen tisztított fehérje mennyiségei:

pg öxigenáz, 5 5 pg ferredoxin és 50 pg redukíáz. Az alkalmazott kofaktorok koncentrációi a reakeiókeverékben: 0,5 mM NAOH, 0,2 mM FAD, 0,5 mM FeSO₄, lö m.M MgCla, 0,5 mM

NADFH és 0,2 mM FMN.

jgODMÉmZ/T £ A dicamba O-demeíiiáz Fhenyl-Sepharose-oszlophoz legerősebben kötődő komponense (eleinte 1 komponensnek, azt kővetően oxigenáznak jelöltük) jól megkülönböztethetően vörösesbarna színű volt. Ez vas-kén klaszíer(eke)í vagy hem-csopörío(ka)t tartalmazó fehérje (fehérjék) potenciális jelenlétét jelzi. A Phenyl-Sepharose-osziopróí származó,

I. komponens aktivitásával rendelkező frakciókat további tisztításnak vetettük alá Q-Sepharose (Fást Flow) és MonoQ-kromatográftával, és azután Superose 12-t alkalmazó, métetkizáráson alapuló elválasztásnak vetettük alá. Az I, komponensnek megfelelő fehérjét azután IEF-gélen tisztítottuk tovább.

Az lEF-géi legjelentősebb csíkjából (látszólagos pl körülbelül 4,6) származó· fehérjét kivágtuk és SDS-PAGE-val megtisztítottuk a megmaradt kisebb szennyeződésektől. A lEF-el végzett, tisztítással után, az 1. komponensnek megfelelő fehérje tisztasága 90%-nál nagyobb volt, melyet Coomassie Blue-val megfestett SDS-poliakrílamid-gél denzítömetriás analízisével határoztunk meg.

Meghatároztuk a körülbelül 40.000 Dalion látszólagos molekulatömegű, domináns fehérje FMermmálís aminosav-szekvencíáját. Az anhnosav-szekvenálás eredményei azt mutatták, hogy az N-terminális régió első 29 aminosavja az alábbi szekvencia (a zárójelben lévő csoportok a legvalőszinübb csoportok):

.

X

...» %<

Tfer Phe Val Arg Asn Alá Trp Tyr Val Ála Alá Lea Pro Gin Gb Len Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr He Lea Asp (Ásp vagy Thr) (Pro) (1. azonosítószámú szekvencia).

adatbázisokban lévő szekvenciákkal való összehasonlítás kevés homoló5 giát mutatott, vagy egyáltalán nem matatott homológ! át más, leírt monoemgeaázök vagy diöxigenázok. amino-iermínális szekvenciáival.

/1 áomponmx Phenyl-Sepbarose oszlophoz nem kötődött fehérje-frakciót IL komponensnek jelöltük. Mivel ez a sárgás színű frakció helyettesíthető volt Chzióidhzm p.o.?hunAm«t»bőI származó ferredoxínnal (de lassúbb reakciósebességgel), amikor a vizsgálati l ö eljárásokban az 1. és III. komponensekkel kombinációban végeztük, próbaképpen ferredoxintartaímú frakcióként jelöltük. A üzGsrrtrimmból származó ferredoxin egyértelműen működött a II. komponens helyett, de azt véve, hogy a Π. komponens igen szennyezett volt ezekben a kísérletekben, a Cfosó'kdnnfoól származó enzim hatékonysága szignifikánsan alacsonyabb volt mint a Dl-ö-törzsböl származó feltételezett ferredoxin. Konkrét esetben, 55 pg részlegesen tisztított II. komponenst összekevertünk feleslegben hozzáadott I. és III. komponenssel, amely a dicamba 3,6-DCSÁ-vá alakulását körülbelül 5 nmol.mínXmg'⁵ sebességgel katalizálta, míg 100 gg C/oxAáémmbóí származó, nagymértékben tisztított ferredoxin csak 0,6 nmei ..min'⁴ .mg** aktivitást eredményezett,

Q-Sepharose (Fást .Fiow) kromatográfiai, Superose 12 gélszűrést és MonoQ20 kromatográfiai magában foglaló tisztítási lépésekkel körülbelül egy milligramm tisztított fehérjéhez jutottunk 25 gramm kiindulási nedves sejtből. Ezt a frakciót hasonló módon tisztítottak, mint az oxigenáz-komponenst elektroforézis alkalmazásával, IEF~géIen és azt követően az- aktív lEF-ffakció SDS-polakrílamid-géien végzett elektroforézisével,

A Π. komponens aktivitásának analízise az lEF-géí szegmenseiről eíuált feh értékben azt mutatta, hogy körülbelül pl 3,0-al rendelkező frakció tartalmazta az aktív fehérjét a II. komponensben. Ezen gélszeíetről eluáltuk a fehérjét és SDS-PAGE-ra vittük. A gél Coomassie Blue-val való megfestése egy szembetűnő fehérjecsíkot (körülbelül 28.000 Dalion moleknlatömegü) hozott elő az elkenödöií, alacsony molekulátömegö fehérjék között.

/// A dicamba O-demetiláz ΠΙ. komponense kötődött a Phenyl30 Sepharose-oszlöphoz magas ammőníum-szulfát koncentrációban, és körülbelül 4 vegyes-% ammónínm- szulfát-koncentrációnál eluáíöáott. Ezt a világossárga if akciót próbaképpen reduktázt tartalmazó frakcióként azonosítottuk az alapján, hogy képes volt oxidált cítokróm-c és D€IF~t redukálni NÁDH jelenlétében, és mivel helyettesíthető volt sertésszivböl származó * »*»Χ χ

-31 citofe'óm-c reduktázzal (Type I, Sígma) 1. és fi. komponenst tartalmazó vizsgálati eljárásokban. Ebben a reakciósorozatban 50 gg részlegesen tisztított 1Π. komponens alkalmazásával körülbelül 5 nmol.min'ímg'⁵ reakciósebességet értünk el, ha azt feleslegben lévő 1. és Π . komponenssel kevertük össze. A nagymértékben tisztított citokróm-e reduktáz körülbelül 2,5 nmol.mm ^:.mg'^! specifikus aktivitást matatott a reakcióban, amely aktivitás jóval az alatt volt, amit a ΠΙ. komponens mutatott, ha figyelembe vesszük ezen vizsgálati eljárásokban alkalmazott, nyers ill komponens szennyezett állapotát Továbbá, a ΠΙ, komponens reduktázaktivitást mutatott, ha eítokróm-e-vel vagy 2,6-diklór-fenol-índofenollal CDCPIP) inkubáliuk NADfi jelenlétében. Sem az I. komponens, sem: a II. komponens nem mutatott aktivitást ebben a két reduktázt vizsgáló eljárásban.

A frakció további kromatográfiás tisztítása Q-Sepbarose-t (Fást Flow), „blue dye affinity mátrix’-ot, Superose 12-t és MonoQ-tőltetet tartalmazó oszlopokon kis mennyiségű fehérjét eredményezett a reduktáz-aktivitással rendelkező frakciókban. A. III. komponensnek megfelelő fehérje tisztasága körülbelül 70%~os volt, melyet az aktív febérjefrakció denzitomel15 riás analízisével határoztunk meg SDS-PAGE~n való elválasztás és Coomassie Blue-val való festés után.

A ΠΙ. komponens további tisztítása, közben azt találtuk, hogy a MonoQ-oszloppal végzett lépés után két különböző fehérjetrakció tartalmazott reduktáz-aktivhást, ha azt a ferredoxin- és oxigenáz-komponensekkel együtt vizsgáltuk. Ezen két frakció további tisztítása 1EF20 gélen végzett elektroforézissel kiderítette, hogy a. két frakció reduktáz aktivitása jól megkülönböztethetően eltérő izoelektromos ponttal rendelkezik. Ezt úgy mutattuk ki, hogy az 1.EFgélbol származó, két reduktáz-frakciót tartalmazó egyes sávokat kivágtuk, és a kivágott szeleteket. DCIP-reakciókeveréket tartalmazó, alacsony olvadáspontú agaróz-pámára tettük. Mindkét gelszeleten azonosiíottunk reduktáz-akhvltást a DC1P NADFI-fuggő redukciója által, amelyben az színtelen, redukált formába alakult. A 35. frakcióban lévő reduktáz körülbelül 5,6 látszólagos pí-vel rendelkezett, míg a. 27. frakcióból származó reduktáz körülbelül 4,8 látszólagos pl-vei rendelkezett.

Áz lEF-gélböl származó, mindkét reduktáz-afcrívirás instabil volt, és kis mennyiségben volt jelen, Valóban, csak a MonoQ-oszlopról elnált 35. frakcióból származó reduktázban ma30 radt elegendő fehérjekoncentráció és aktivitás- a további tisztításhoz és jellemzéshez. Ezt a reduktáz-aktivítási tartalmazó lEP-gél-szeletből a fehérjét előéltük és SDS-PAGE-val elválasztottuk a szennyező fehérjéktől. Ezen a gélen egy kiemelkedő fehérje tömege körülbelül

45,000 Dákon. Méreikízárásra alapuló kromatográfia azt mutatta, hogy a Ifi. komponens molekulafömege körülbelül 50.OOö Dalion natív állapotában,

Die&mbe O~kemedMz bi&kémkii jellemzése. Dicamba O-demetíláz-aktívitást in vit.ro inknbálások alatt mértünk 20° és 5Ö^C'C közötti hőmérséklet-tartományban és körülbelül 6 és 9 közötti pH-η, Az aktivitás éles maximuma volt 3ö°C-nál, valamint szélesen elnyújtva 6,5 és 7,5 közötti pH-értékeken. Az enzimaktivitás az. alkalmazott pH-puffer típusától függ. Például pH 7,0-en az aktivitás körülbelül 40%-ai alacsonyabb Tris-lartaknú puilerben, mint foszfáttartalmú pufiérben.

A K_ra- és Ymax-értékeket dicamba O-demetilázra két párhnzamos kísérletből származó adatokra illesztett Michaelis-Menten- és Lineweaver-Burk-görbékhől határoztok meg,

SigmaPlot© alkalmazásával. A dicamba Körtékét körülbelül 9,9 + 3,9 μΜ-nak becsültük és a reakció V^-értékét körülbelül 108 + 12 nmol/perc/mg-nak becsültük.

A három komponenst dicamba O-demetiláz-aktívitásra vizsgáltuk különböző kombinációkban. Egyik komponens sem mutatott aktivitást, ha egymagában vizsgáltuk. Valóban, szignifikáns mennyiségű O-demeíiláz-aktivrtást csak akkor lehetett detektálni, ha mindhárom komponenst kombináltuk. Az 1. és H. komponens keveréke· kis mennyiségű enzlmaktivitást mutatott, amely valószínűleg a I komponens frakciói által szennyezésként tartalmazott ΠΙ. komponens nyomokban való jelenlétének tulajdönitfeatő.

A NADH és a NADPH egyaránt hozzájárult az enzim aktivitásához, a NADH jelentősen hatékonyabban, mint a NADPH Mg² szükséges volt az enzimaktivitáshoz. Fe², fiavin20 adcuin-dinnkleotid (FAD) és tiaván-mononuldeoíid (FMN) kis stimuláló hatást mutatott, vagy egyáltalán nem stimulálta az enzimaktivítást, részlegesen tisztított fehérjepreparátumokkal végzett kísérletekben. A legmagasabb aktivitást NADB, Fe²*, Mg² és FAD kombinációjával kaptuk.

Pseudemonas medt&phifá® Dl-ó-tömbol származó dicamba 0-demetlláz egy háromkomponensü oxigenáz [Wang, X-X., fih.D. thesis (1996), University of Nebmska-Dncoln, Lincoln, NE], amely a dicamba nevű herbicid 3,6~dÍklÓF~szalieiÍsawá (3,6-DCSA; 2-hídroxí-3,ódiklör-szalícilsav) való átalakulásáért felelős. Tisztítási vázlatot terveztünk, amely lehetővé tette mindhárom komponens homogén vagy közel homogén állapotba való tisztítását.

A bárom komponens első elválasztása Pbenyl-Sepharose-oszlopön végzett kromatográfla volt, A részlegesen tisztított komponensek enzimaktivitásai és más jellemzői lehetővé tették a komponensek feltételezett azonosítást redukíázként, íerredoxinként és oxigenázként,

- 33 amely ahhoz hasonló összetétel, amelyet számos más, korábban tanulmányozott hem-tartalmú és bemet nem tartalmazó, többkomponensű oxigenáz esetén találtak [Batle és mtsai., “Cherasiry aad bíochemisüv of flavoenzymes” című könyvben, KI kötet, 543-565. old., szerk.

F. Müte, CRC Press, Boca Raton; Harayama és mtsai. Anno. Rév. Microbioi 46, 565-601 5 (1992); Mason és Cammaek, Anno. Rév. Microbioi. 46, 277-305 (1992); Roscfee és mtsai.,

Bíoehem. Biophys. Acta 1252, Γ77-Ι79 (1995)]. A Rhenyi-Sepharose-oszlopről izolált HL komponens mind a citokróm-c, mind a DCIP-featék NADH-függő redukcióját katalizálta Továbbá az a képessége, hogy elősegíti a dieamba konvertálását 3,6-DCSA-vá, ha I. és H. komponenssel kombináljuk, részben helyettesíthető eitokróm-c redukíázzal, A Π. komponens hete

í.

?0 iyeííesithető Cl&slriíáttfx /xrsmmöianzböl származó ferredoxiu hozzáadásával az I. és KI komponenst tartalmazó reakciókban. Az O-demetliálási reakciók elősegítéséhez a molekuláris oxigén ab szólót szükségessége azt jelzi, hogy a fennmaradt komponens oxigenáz.

űxigenázfítc· A dieamba ö-demeftláz 1 komponensét (oxigenázisc-nek jelöljük) homogenitásig tisztítottuk, és N-temFuális aminosav-szekvenálásnak vetettük alá. Az eredményül kapott, 29 aminosavból álló szekvencia nem mutatott szignifikáns homológját semmilyen más, különböző adatbankokban rendelkezésre álló fehérjeszekvenciával. Azonban ebből az aminosav-szekvenálásból származó információk lehetővé tettek olyan degeneráit oligonukleotidpróbák tervezését, amelyeket sikeresen alkalmaztunk az L komponens génjének detektálására és klónozására (lásd 2. példát). Továbbá, ezen klón nukleotidszekvenciájából származó ami«ösav-szekvencia. összehasonlítása az adatbázisokban lévő íéhérseszekvencíákkal erős homológját mutatott más oxigenázokkal (lásd 2. példát).

Az oxigenázosc látszólagos molekulatömege S.DS-polizÁríiamid-gélekhen való migrációja alapján körülbelül 40.000 Daitonnak becsülhető. Tisztított oxígenáz-preparátumok csak egy to sávot mutattak Coomassie Blne-val festett SDS-poiiakrílamid-géleken, és ebben a esik25 bán lévő fehérje Bdman-lebontása csak egy N-termínáhs fajta jelenlétét mutatta. A natív oxigenázme méretkizáráson alapuló oszlopon való viselkedésére alapuló becslések szerint a molekula mérete körülbelül 90.000 Dalion. Ezen valamennyi eredmény alapján feltételezzük, hogy a natív oxigenáz homodímerként fordul elő.

Számos, többkomponensű rendszer oxígenáz/hídroxiláz komponense (o,P>)„~dpnsó alegység-elrendeződést mutat, amelyben a nagyobb α-alegység mérete körülbelül 50.000

Dalion, és a kisebb β-aíegység molekulatömege körülbelül 20.000 Dalion [Harayma és mtsai.,

Annu. Rév. .Microbioi. 46, 565-601 (1992)). Ezzel ellentétben úgy tűnik, hogy a dieamba O*» *

Λ ».

- 34 demetiláz oxigenáz-komponense egyetlen, körülbelül 40 kDa molekulaiömegü alegységgel rendelkezik, amely valószínűleg dimerként fordul elő natív állapotában. Ez az (a)_B~űpusu alegyseg-elrendezödés hasonló ahhoz, arait más, jól jellemzett oxigenáz esetén találtak, például sp. CBS-törzsbő! származó, 4-klór-feníl-acetát 3,4-dioxigenáz [Márkus és mtsai.,

I. Bioi. Chera, 261, 12883-12888 (1986)], Psettdűm&nas cepaciahrit származó ítalát-dioxigenáz (Baíie és masai., 3 Bioi. Chem, 262. 1510-1.518 (1987)], C’omu/rmzau' rer/oxteröu/ból származó 4-szuifobenzoát 3,4-dioxigenáz [Locher és mtsai., Siochem. J. 274, 833-842 (1991)], Pse&damanas pvtída 86-ból származó 2»oxo-l,2-dihidrö~kmolin 8-monöoxigenáz [Rosche és mtsai., Bíoehem. Biophys. Acta 1252. 177-179 (1995)'], jpswzte/m/íge«e.shől származó 4-karbonil-dífenil éter-díoxígenáz [öehmel és mtsai., Arch. Mierobiol. 163, 35-41 (1995)] és fsesáwosymöífoból származó 3-klór-benzoát 3,4-dioxlgenáz [Nakatsu és mtsai., Mlcrobiology (Readlng) 141, 485-495 (1995)] esetén.

Ferredíixhí^iC' A díeamha 0-deíneti.láz II komponensét (ferredöxin^) néhány őszlopkromatográíiás lépéssel és JEF alkalmazásával tisztítottuk. SDS-PAGE-vai végzett utolsó

1.5 tisztítás egy tó fehériecsikot adott (M,· kb. 28.000) és valamivel kisebb fefeéijék kenödése volt látható.

Meghatároztuk a 28.000 Dalion látszólagos molekulatömegű fehérje N-termínális anénosav-szekvenciáját. Ez az aminosav-szekvencia; lehetővé tette degenerált oligcmokleotídpróbák előállítását, és ezeket a próbákat alkalmaztuk a fehérjét kódoló genomi klón izolálására.

Bár a klón által termelt fehérje terredoxin (ferredoxfos&m) volt, ezt követően meghatároztuk, hogy nem aktív dícaruba-lebontásban, ha dícamba O-demetiláz másik két komponensével kombináljuk (az adatokat nem mutatjuk be)..

Más bizonyítékok alátámasztják azt a következtetést, hogy a ferredoxin₂w>s nem a dícamba 0-demet.íláz femedoxin-komponense volt. Az első, hogy a fehérje molekulatömege (28 kDa) jelentősen magasabb, mint baktériumokból származó többkomponensű oxigenázokban található, más ferredoxinok molekulatömege (azaz 8-13 kDa) [Butié és mtsai., ‘Ohemisüy and biochernístry of tlavoenzymes’' című könyvben (szerk, F. Malter), 111. kötet, 543-565, old., CRC Press, Boca Raton; Harayama és mtsai.. Arat .Rév. Mícrobíoi. 46, 565601 (1992)).

Másodszor, ferredoxímsuu-ból származó, 20 amínosavból álló N-terminális szekvencia különböző fehéíje-adatházisokban lévő, más aminosav-xzekven.eiákkal való összehasonlítása [Genetics Computing Group (GCG) szoftvercsomagját alkalmazva (Uoiversity of Wísconsm,

Madison, Wlj nagymértékű homológját (8-0-85%: azonosság a legvalószínűbb 'N-termínális

- 35 “i:

* > « térredoxtpjs^-szekvenci^ioz viszonyítva) mutatott kí számos· kétkiaszteres, bakteriális ferredoxianal (Psosdbmom? söífreAbÖl, .F.tmítíbmoBüs' pítífobhól, J^oöfoÓöfcter o^s^teusbói és Az&fofraefer v?>re&«ői/bót származó ferredoxinokkal).

A négy, ferredoxin»Da-ai erős homoiőgiát mutató· diklaszteres ferredoxln [3Fe-4Sj5 taszterrel rendelkezik, melyet egy [4Fe~45'j-klaszter követ a. fehérje N-termínálisánál. Ez alapján feltételezzük, hegy a frrredoxm_2Sw_s jelentősen különbözik a [2Fe-2S]~klaszterekkel rendelkező fen-edoxin-komponensektöi, melyek rendszerint bemet nem tartalmazó,, többkomponensű oxlgenázokkal asszociáltak [fíarayama es mtsai., Anno. Rév. Microbiol. 46, 565-601 (1992); Mason és Cammack, Anna. Rév. Microhiol. 46, 277-305 (1992); Rosebe és mtsai.,

Bioebem. Biophys Acta 1252, 177-179 (1995)].

ítedfa&lásafe· A dieamba Ö-derneiiláz 1Π, komponens (reduktázoic-uek jelöltük) tisztítása volt a legnehezebb a három komponens közül. Ez részben a látszólagos instabilitásnak és a D.l-6-tőrzs lízáíumaiban való alacsony előfordulási gyakoriságnak volt tulajdonítható. Mindezek ellenére elegendő mennyiségű fehérjét tisztítottunk ahhoz, hogy megbecsüljünk egy köze1.5 ütő molekulatömeget, amely 45.000 Dalton volt. Ez hasonló volt a méretkizáráson alapuló kromatográfiával meghatározott molekulatömeghez, amely 50.000 Dalton volt, és ez alapján feltételeztük, hogy a reáuktázpjc natív formájában monomerként fordul elő. A redukiázkomponeas tisztítását tovább bonyolította, hogy a MonoQ-oszlopon végzett kromatográfia és az IEF a tisztított reduktáz-preparátumokat felbontotta két, látszólag eltérő pl-értékkel rendel20 feezó aktivitásra A MonoQ-oszlopról származó mindkét frakció működőképes volt ferredoxittojc-el és -oxigenázjoic-d való kombinációban dieamba O-demetiláz-aktiviíás létrehozására. Két hasonló flavoprotein található ő/feígumonos· fajhoz tartozó RW1-törzsben, amelyek mindegyike egyformán jói működik reduktáz-komponensként a háromkomponensű dibenzofotán 4,4a~diöxigenázban, melyet a közelmúltban írtak le [Bűnz és Cook, I Baeteriol. 175, 646725 6475 (1993)]; Érdekes, hogy mindkét rednktáz 44.000 Dalion molekülatőmegű volt, amely nagyon hasonlóan a reduktázoso 45.000 Dalion molekulatömegéhez. Több komponenst figyeltek meg a farkasbab (csillagfört) gyökércsomóiban előforduló leghemoglobm rednktáz esetén is izoelektromos fókuszálást technikát alkalmazva ffupunov és mtsai., Biokhimiya (angol kiadás) 162, 378-379 (19S2)]. Ebben az esetben az IEF alkalmazásával négy, elkülöníthető kom30 ponensí mutattak ki, amelyek MABH-föggo redukiáz-aktívitássa! rendelkeztek, A kérdés megoldása. céljából, vagyis hogy vajon csak egy reáuktázotc létezik, amely két tormában fordul elő, vagy kél, különböző rednktáz létezik a Dl-6-íörzshen, egy javított eljárás kifejlesztésére van szükség a fehérje nagyobb mennyiségben való izolálására és/vágy a kérdéses gen(ek)

- 36 “i i * «·* klónozására és szekvenrílására (lásd 3 . és 5. példát).

Dieam/m O~detttetifáz miq/ífom'ágői. A fentebb· leírt egyedi komponensek fizikai és biokémiai tulajdonságain kívül, az enzimaktívás analízisével kimutattuk, hogy az ö~demetíláz~ rendszer erős affinitást (K_m~ kb. 10 μΜ) mutat szubsztrátja irányában, és V_max-éríéke körül5 belül 100-110 nmol/pereöng. Ahogyan az mérsékelt időjárási zónában gyűjtött ial&jbaklérium esetén várható volt, a maximális enzimakílvitást 3Ö°C hőmérséklet körül figyeltük meg. Míg az enzimrendszer pH-optimuma 6,5-7,5 pl-Ltartományban volt, egy adott enzimpreparátummal mért aktivitást erősen befolyásolta az alkalmazott pH-pufferrendszer típusa. Tris-puífer jelenlétében mért enzímaktívitás legalább 40%-al alacsonyabb volt, mint íosztat-putíerben mérve ugyanazon a pH-n.

A dicamba O-demetiláz három komponense által katalizált reakció vázlatát az I. ábrán mutatjuk be. Az elektronok a NADH-ról jóinak redukíázból és ferreáoxinbóí álló rövid elektrontovábbító láncon a terminális oxigenázig, amely katalizálja a dicamba oxidációját. A dicamba 0-dem.etíláz és számos többkomponensű dioxigenáz közötti hasonlóságok alapján feltételezzük, hogy a dicamba O-demetiláz potenciálfean rejtett dioxlgenáz-aktivitással rendelkezhet. Azonban nyilvánvaló, hogy ez az enzim nem tartozik a dioxigenázok osztályába, amelyek Ö3-t hasítanak, és egy atom oxigént építenek be a ío-szuhsztrálba és más, kis szerves sznbsztrátba, például a~keí.oglutarátha (Fnfcumori és Hausinger, 3. Bioi. Chem. 268, 2431124317 (1993)]. Valóban, nagymértékben tisztított reduktáznje> ferredo.xínyjc és oxígenáztve kombinációja csak Oj-ΐ, NADH-t, Be^-t és dicambáí igényel az aktivitáshoz,

2.

származó dicamba O-demetaázban léve oxige25 Az 1. példába leírtak szerint .meghatároztuk az oxigenázojc N-terminális aminosavszekvenciájának első 29 aminosavjáí (a zárójelbe tett csoportok a legvalószínűbbek):

Thr Phe Val Arg Asn Alá Trp Tyr Val Áb .Alá Leu Pro Gin Glu Leu Ser Giu Lys Pro Leu Gly Arg Thr He Len Ásp (Asp vagy Thr) (Pro) (1. azonosítószámú szekvencia).

Ez a szekvencia lehetővé tette degenerák oligonukleotid-prőbák tervezését, amelyeket az öperon cég (Alameda, CA.) szintetizált, Konkrétan, 32 próbából álló keveréket alkalmaztunk, amely próbák mindegyike 17 nukleotid hosszúságú volt, és az összes lehetséges ♦ ·* *<

nukbotidszekvenciát tartalmazta, amely a fentebb vastag betűvel kiemelt arnínosav-szekvenciát (Xaa-ként Cys-t alkalmaztunk) kódolhatja. Az oligonukleoííd-próbák 3’-végükőn áigoxigeainnsl (DIG) voltak jelölve a Boehringer Mannheim cég (indianapolis, IN) által megadott utasítások szerint.

A DIG-jelölt próbákat először P. mmkop/á/m Dl-ó-bői származó genomí DNS-hez hibridizákalluk, amelyet különböző kombinációjú restrikciós enzimekkel emésztettünk, 1%-os agaröz-géiben megfuttattok, és nylon-szűrőre blottoltuk. Ezen eredmények alapján, méret, szerint űakcionálí genomí könyvtárat állkodnnk elő pBluescript IIKS+ vektorban, és EsdíencA/öf eoh DH5a kompetens sejtekbe transzformáltuk, A genomí könyvtár 1-2 kb mérető lf) Xbo.IŰIi.udní-üagmensekeí tartalmazott, A DIG-jelölt oiigonukleotid-próbákat egy sorozat nylon-szűrőkre felvitt bakteriumklónhoz hibridizáltattuk. A pozitív kolóniákból piazmid-DNS-t izoláltunk és szubkiónoztuk. Valamennyi szubkfón mindkét szálát szekvenáítuk az „üniversity of Xebraska-Lineohí ’ DNS-szekvenáló berendezésén, A DIG-jelölt próbák hibridízáltatását és detektálását a Boehringer Mannhehn eég eljárása szerint végeztük.

Azonosítottuk az oxigenázpjc-et kódoló genomi DNS-klónt. Az egész oxigenázc-c-et kódoló nuBeotidszekvenciát és a levezetett aminosav-szekveneiát 2. és 3. azonosítószámú szekvenciaként mutatjuk be, lentebb a szekvencíalisiában.

A klón raAíeotidszekveneiájábói származó anúnosav-szefcveneia és a „Swiss Protein

Database”-ban lévő fehérjeszekvenciák összehasonlításával homológiát mutattunk ki más oxí20 genázokfcal. A homológját GCG-szoüvercsomag FÁSTÁ-prograníjának alkalmazásával határoztak meg. A legnagyobb mértékű homológját vaníliát demetiláz .ψ., 19151.

számú ATCC-íőrzsből származó) oxigenáz-koniponensével találtunk, amely 33,8%-os azonosságot mutatott.

nemének tisztítása és jellemzése

Baktériumtenyészetek és tiszta sejtllzáíamok előállítása. Pseudomonas- mshophiha Dí~ő~ törzset beoltottunk hat, egyenként kétliteres Erlenmeyer-lombikba, amelyek egy liter, szénfbr30 fásként 2,0 rag/rnl glükózzal és 2,0 mg/ml „Casamino”-ammosavzkkal kiegészített, csökkented klorid-tarialmú tápközeget tartalmaztak (Krenger, IP P., Ph.D. thesis, 1989, Illinois Institute of Technology, Chicago). A tenyészeteket orhhábs rázógépen (225 tpm, 30°C-on) inkubáltuk.

Amikor a tenyészet Asoo-értéke 1,5 és 2,0 között volt, a sejteket elkülönítettük oentrhügálással, »« φ

- 38 Seekman Ávanti 3-251 centrifugában, JLA-10.500 rotor alkalmazásával, 4000 g-n, 20 percig. A leülepedett sejteket -80°€-on tároltuk. A. fagyasztott sejteket felszuszpendáituk 40 ml, 100 mM MgCU-fean, újra lecentrifugálíuk a fentebb leírtakkal azonos körülmények között, és azután felszuszpendáltuk feltáró pufferben (190 ®M 3-{N~morfolínoj-propánszulfonsav [MOPS], pH 7,2, I mM ditiötrertol, 5% glicerin), 2 ml feltáró puffért adtunk 1 gramm nedves· sejthez. Hozzáadtunk 80 μΙ llzozisnot 1 gramm sejthez, baktéríum-eMraktumokban alkalmazható proteáz-inhibítotkökféllal együtt (Sigma P8465), amelyből 5 ml-t adtunk 20 gramm nedves sejthez. Végűi hozzáadtunk fenil-ntetíl-szulfoíól-öuoridot (100% etanolban oldott, 0,1 M törzsoldatból) 200 μΙ-t 50 ml feltáró pufferbe. A sejteket ultrahangos feltáróban (Sonics and

Materials Inc., Model VCX 600) roncsoltuk szét, 9,0 másodperces kezelésekkel, közben 3.0 másodperces nyugalmi időszakokkal, összesen 30 percig, 50%~os amplitúdónál. A lizált sejteket lecmtrifegálíuk 75 percig, 56.000 g-n, JA-25.50 rotorban, Beckmaa Avatni 3-251 centrifugában, 4°C-on. A feiülúszót (tiszta sejt-lizátűmot) dekantáltuk, és hozzáadtunk glicerint 15% végkoncentrációban -80°€-on való tároláshoz.

&íeant&e O-demeriJás fiam/mnensemeh ft&sdeii tisztítása. Körülbelül 2,7 gramm fehérjét tartalmazó, tiszta sejflízátnmot felvittünk Pharmacia XK 26/őö~osziopra, amely 25 ml DEAE-Sepharose Fást Flow töltetet tartalmazott, amely 1 mM ditiotreitolt és 15 íf% glicerint tartalmazó, 50 tnl MOPS (pH 7,2) puferef (A-puffer) volt ekviübrálva. Az oszlopot „BloCAD” perfúziós kromatográfiás munkaállomáshoz (USDA NRICGP Grant #9504266) csatla20 koztattűk, és 5,0 nd/perc áramlási sebességet alkalmaztunk. Miután az anyagot felvittük az oszlopra, A-pűtTerrel mostuk, amíg a 280 nm-en leolvasott ahszorhanola 0,1 alá csökkent. Dicamba Ö-demeüláz mindhárom komponense kötődött a DEAE-oszlophoz ilyen körülmények között. Az oszlopot 0-500 mM NaCÍ~gradÍenssel mostuk, A-pulferben. Ennek eredményeként a ferredoxin 400 mM NaCl-nál eluálődott, és 250 mM NaCl-nél együtt eluálődott a reduktáz és az oxigenáz-korapcmens.

riszritdsu A DEÁE-Sepharose oszlopról eluált, ferredoxin^c-tartaimú frakciókat egyesítettük, és kicseréltük a puffért 5 térf.% glicerint és 200 mM MaCI-t tartalmazó· 50 mM MOFS-ra (pH 7,2) (B-pufferre), Azután beíöményiteítúk körülbelül 2 ml-re Amicon föményitö-eelláöan, YMlö-rnemörán alkalmazásával, és Cent.ricon.10 tötnényítöben, A. mintát azután fel vittük elöíölíöíí Pharmacia HíPrep 26/60 Sephaeryl S-100 oszlopra, amelyet előzőleg

B-puífertel ekvilíbráltunk, és 0,5 ml/perc áramlási sebességet alkalmaztunk Pharmacia FPLCberendezéshen. Az aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítettük, és kicseréltük a puffért 1 mM r ^>er *»r J, ,

- 39 diíiotretelí és 5 íérf % glicerint tartalmazó 50 mM MOPS-pufíene (pH 7,2) (C-pufferre). A frakciókat betöményítettük körülbelül 2 ml-re, és azután felvittük Pharmacia Mono Q HR 5/5oszlopra, melyet C-pufferrel ekvillbráltunk. Az oszlopon 0-2,0 M lineáris Na€l~gradienselúclőt alkalmaztunk C-pufferhen. Ferredoxin-aktivitást tartalmazó frakciókat fehérjetartalom5 ra vizsgáltuk és -8Ö°C~on tároltok.

Acr&á&üpyc ö'sztfrízs/z Á DEAE-Sepharose oszlopról az első íiszitási lépésben eluált, oxígenázZreduktáz-komponenseket tartalmazó frakciókat egyesítettük, és hozzáadtunk ammónium-szulíatot 1,5 M végkoncentrácíőhan. 4°C-on inkubálíuk 1,5 óra hosszáig, és a mintákat 75 percig centrifugáltuk 56.000 g~n, 4°€-on, 3A-25.50 rotorban, Beckman Avató 3-251 cent10 rifrígáhan. A feiülúszóvai dolgoztunk tovább, és felvittük 25 ml Phenyl-Sepharose- 6 Fást FIow töltetet tartalmazó Pharmacia XK 2ő/2ö-osziopra 5,0 ml/perc áramlási sebesség alkalmazásával, az oszlopot előzőleg 1,5 M mmnőaium-szulfátot tartalmazó A-pufferrei ekvlllbráltuk. A reduktáz-komponenst tartalmazó frakciókat egyesítettük, és a puffért kicseréltük B~p«fferre, és betöményítettük körülbelül 2 ml-re Amicon íömémdtő-cellában, YM W-membrán alkahnazásá15 val, és CentriconlÖ töményítőben.. A 2 ml mintát felvittük előiöltöif Pharmacia HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 oszlopra, amelyet előzőleg B-pufferrel ekvilibráltunk, és 0,5- ml/perc áramlási sebességet alkalmaztunk. A reduktáz-aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítettük, és a puffért kicseréltük C-puffene, és beiöméayitettük körülbelül 2 ml-re, A 2 mi mintái felvittük előtölíött Pharmacia Mono Q HR. 5/5-oszlopra, melyet C-pufferre! ekvillbráltunk. Az oszlopon 0-2,0 M lineáris NaCl-gradiens-elúciót alkalmaztunk C-pufferben, 0,5 ml/pere áramlási sebességgel. A reduktáz-aktivitást tartalmazó frakciókat fehérjetartalomra vizsgáltuk és -8<3®C~on tároltuk.

Gyors enzimGzsgálatl eljárás. A három komponens aktivitását külön-külön követtük olyan, reakciókban, amelyben ^uC-jelölt dieamhát alkalmaztunk olyan reakciőkeverékbeti, ahol a további két komponenes feleslegben volt. Az egyes reakciókban a puffer-oldat az alábbiakat tartalmazta: 24 wM kálium-foszíát-puffer (KPj) (pH 7,0), 0,48 mM NADH, 0,48 mM FeSCL és 9,6 mM MgCB, amelyből 200 pl fehétje-míntához adagoltunk 30 pl „master” dicambakeverékkel együtt (a „master⁵' keverék összetétele: 562,4 pl steril viz, 12,0 pl 50 mM dícamba és 25,6 pl ^:4C-dicamba-törzsoldat (1,28 pCi]) 311 ul össztérfogatban, áltól a ⁵⁴C-dicamba specifikus aktivitása 4,12 pCi/'ml volt. 60 perc múlva, a reakciókat 50 pl, 5 térf% kénsav és 500 pl éter hozzáadásával állítottuk le. A reakciócsöveket vortexe.n megkevertettük, és mikrocenirifugában (Eppendorf, 54Í5C modell) 14.000 x g~n, 2 percig centnfegáltuk. Az enzimaktivítás gyors vizuális becsléséhez az egyes reakciócsöveket kézi UV-lámpa (Fotodyne *♦*» i . 40 Inc., 3-6000 modell) alá helyeztük a DCSA reakciótennék fluoreszcenciájának detektálása céljából. Áz enzi makit vitás pontosabb, felkvantítatív méréseihez, a re&kcióíermékeket vékonyréteg-kromatográtía alkalmazásával elválasztottuk az 1. példában leírtak .szerint.

Fe&éíyektmcenfeádd mey&níár&z&sai A tisztítási eljárás különböző fázisaiban kapott, frakciókban Braáford vizsgálati eljárás alkalmazásával határoztuk meg a fehérje-koncentrációt (standarad eljárás; Bio-Rad; lásd 1. példát).

A ítéld

A tisztított ferredoxin-fehérjéből (a tisztítás leírását lásd a .3. példában) kapott Nterminális szekvencia 29 amínosav hosszúságú volt (a fehérjék szekvenálását az „Univ-ersity of Nebraska-Lincoln Protein Core Facility”-ben végeztük, standard Edman-lehcmtási eljárás alkalmazásával; lásd az 1. példában leírtakat). A szekvenciát összehasonlítottuk a Genbankadatbázissal, ami azt mutatta, hogy 35% azonosság van 26 aminosavból álló, átfedő szakaszon

1.5 egy PszWomouas· fajból származó terpredoxinnak amely egy [2Fe-2S]-ferredoxin az adrenodoxm-csaiádban. A szekvencia-információt három degenerált oligonukleotíd (két előremenő és egy reverz) tervezésére használtuk fél A két, 17-tagu előremenő Iáncinditó oligonukleotíd a tisztított ferredoxin-fehérjéből nyert, N-teraiináiis amínosav-szefcveneiára alapúk. A 17-tagú reverz láncindító oligonukleotíd hat korábban szekvenálí, bakteriális adtenodoxin-típusú ferredoxin C-termínális végéhez közeli, hat aminosavból álló, konzervatív szekvenciára alapult. A Iáncinditó oligonukleotídokat „egymásba illesztett’ („nested) PCRreakclóban alkalmaztuk egy 191 bp méretű termék atnphfikálására F, möPopőfőu össz-DNSből. A terméket „pGEM-T Easy” vektorba (Promega, Madison, WI) kiónoztuk és szekvenáltuk. A DNS-szekvenálást az „University of Nebraska-Lmcoln DNA Sequencing Core

Facility”~be« végeztük, standard dídezoxí-mediáit lánetermináeiós eljárás alkalmazásával. A klón levezetett aminosav-szekvenciájának analízisével igazoltuk, hogy egyezik a tisztított ferredoxin-fehérjéből korábban kapott, N-terminális és belső amínosav-szekvenciávai. Továbbá, a leszármaztaíott aminosav-szekvencia 48%-ban azonos volt teljes hosszúságában /Wvfeőoeíúr copmvázmból származó (2Fe-2Sj-ferredoxínnal. A klónozott fragmenst megje30 Iöltük dígoxigeninnel (D1G) (Roche Diagnosíics), standard PCR-eljárás alkalmazásával (DIG/Gemus-rendszer használati utasítása szerint), és Soufhem-bloftal bibrldizáltattuk F.

moáopőúőriból származó össz-DNS-hez, melyet előzőleg számos számos restrikciós enzimmel emésztettünk. A gént körülvevő restrikciós basítőhelyek térképét a próbához hibridizálódott κ « «x«e «♦·.* * * «Λ X * *» > *♦

- 41 restrikciós tf agmensek mérete alapján áhitoítuk össze. Ez a kezdeti kísérlet azt mutatta, hogy a gént. egy XhoI/Pstl-fragmens tartalmazta, amely körülbelül 1 kb hosszúságú volt. Azután P„ mn/toplnlinhól származó őssz-DNS-í Xbeí- és Esti-enzimekkel emésztettünk, és a restrikciós fragmenseket gélben elválasztottuk. A 0,5 és 1,5 kb méret közötti íragmenseket kivágtuk a gélből , és a pBloescripí ΪΙ KS+ vektorba (Stratageae, Inc. ) ligái fok, és DH5a-seiíeköe (Gibco

BRL, Inc.) transzformáltuk. A méret szerint frakeionált könyvtárat tartalmazó baktérí tunkolómákat DIG-jelőlt próbával szkrmeííük, és azonosítottunk egy 900 bp méretű: Xhoí/Pstlífagmenst. Szekvencia-analízissel kimutattuk, hogy ez a klón teljes hosszúságú, 318 bp méretű ferredoxin-gént (4. azonosítószámú szekvencia) tartalmazott, amely 105 amínosavbói álló,

11,4 kDa méretű fehérjét (5. azonosítószámú szekvencia) kódolt. A klónozott génből levezetett amlnosav-szekvencia egyezett a tisztított ferredoxin-fehérjéböl korábban kapott, Nternúnálís és belső aminosav-szekvencíával. Továbbá, a levezetett aminosav-szekvencía teljes hosszúságában homológ volt a bakteriális (2Fe-2S}-ferredoxínok adrenodoxin-esaládjának többi tagjával, 42%-os azonosságot találtunk Rhadohaefer e^wtatsbót származó ferredoxinnal és 35%-os azonosságot találtunk Exendor/mnasböl származó térredoxirmal (lásd 2. ábrát). A többi három ferredoxin Gmfcócícúv· crescen/asból, Xóofföoocxw eryüWpo/Aból és /xttídúhól származott. Ehhez a családhoz tartozó fehérjék egyetlen 2Fe-2S vas-kén-klasztert kötnek és hárem konzervatív motívummal rendelkeznek. Az 1. motívum három konzervatív ciszteint tartalmaz, amelyek 2Fe-2S-ligandumok. A 2. motívum, negatívan töltött aminosavakból álló klasztert tartalmaz, A 3. motívum tartalmazza a 2Pe~2S~klaszferben lévő, negyedik konzervatív ciszteint

Két reduktáz-gént klónoztunk a 4. példában leírt megközelítés alkalmazásával, a ferredoxin-gén klónozása céljából. A tisztított reduktáz-fehérjébel (a tisztítás leírását lásd a 3. példában) kapott N-termínáfís szekvencia 25 aminosav hosszúságú volt. A szekvenciát összehasonlítottuk a Geubank-adatbazissal, ami azt mutatta, hogy 90% azonosság van 20 aminosavbői álló, átfedő szakaszon díoxin díoxigenáz sp, RW 1-ből korábban izolált há30 romkomponensú enzim) ciíokróra P45ö--ttpusú redukfáz-korapönensével. A tisztított fehérje tripszines emésztésével 10 amínosavbói álló, belső szekvenciához jutottunk. A belső szekvencia 87,5%-ban azonos volt sp. RWl-böl származó, ugyanilyen chokrótn P450íípusú reduktáz 62-69. anúnosavaival. Ezt. a szekvencia-információt három degenerák

-42oligonukleorid (két előremenő és egy reverz} tervezésére használtuk fel. A kér, I7-tagú előremenő láncinditő oligonukleotid az N-terminális aminosav-szekvenc'iára alapult, és a 17-íagú reverz láncinditó oligonukleotid a belső arósosav-szekvenciára alapúit. A láncindító oiigonukleotídokat „egymásba illesztett” („nesíed”) PCR-reakcióban alkalmaztuk egy 180 bp mérető termék arnpHfikálására P. .wákyW/áz össz-DNS-bői. A terméket „pGEM-T Easy” vektorba klónoztuk és szekvenáituk. A klón levezetett aminosav-szekvenciájának analízisével igazoltuk, hogy egyezik a tisztított reduktáz-febérjéböl korábban kapott, N-terminális és belső ajninosav-szekvenciával. Továbbá, a leszármazhatott aminosav-szekvenda 80%-bau azonos volt teljes hosszúságában. ÓFúúígo/nouus sp. RW1 -törzsből származó dioxin dioxígenáz citokröm F-450-tipusú reduktáz komponensével.

A klónozott fragmenst megjelöltük digoxigeninnel (DUG), és Southern-blöttal hibridízáhattuk F. zm/z<^&z#ából származó össz-DNS-hez, melyet előzőleg számos számos restrikciós enzimmel emésztettünk. A Soufhem-híot azt mutatta, hogy a DíG-jelolt próba két különböző lókuszt ismert fel P, m«Fopó//á?ból származó ossz-DNS különböző restrikciós emésztési termékekben. A megfigyelés alapján feltételezzük, hogy két redukfáz-gén van P. maPopóFiö genomjának különböző helyzeteiben. Lehetséges, hogy a két gén azonos és duplán fordul elő, amely két azonos reduktaz-fehérjéí kódol. Alternatív módon, az egyik gén rővidebb fehériét kódol, amelynek nincs aktivitása, vagy teljes hosszúságú fehérjét kódol, amelynek alacsony aktivitása van az általunk alkalmazott O-demeíiláz vizsgálati eljárásba!. Mivel, olyan gén klónozása szükséges, amely optimális aktivitással rendelkezik, a DIG-jelölí próbái alkalmaztuk mindkét redukfáz-gén azonosítására.

Ha F. maZRy;P/úí?böl származó ossz-DNS-t Kp.nl- és LcoIU-enzimekkel emésztettünk, a DKí-jeiölt próba egy restrikciós fragmenshez hibridizálódott, amely körülbelül 4,0 kb hosszúságú volt, és egy másik, nagyobb fragmenahez, amely körülbelül 20 kb mérető volt. A

4,0 kb mérető Kpn.bLcoRI-fragmensben lévő gént körülvevő, számos restrikciós hashöhely térképét a próbához hibridizálódott restrikciós fragmensek mérete alapján állítottuk össze. A restrikciós térkép azt mutatta, hogy a teljes gént ennek a 4,0 kb méretű fragmensnek kell tartalmazta. Ezt kővetően P. mu/á.y7A'?'Fuból származó össz-DNS-í Kpnl- és EcoRI-enzimekkel emésztettünk, és a restrikciós fragmenseket gélben elválasztottuk. A. 3,0 és 5.0 kb hosszúság közötti fragmenseket kivágtuk a gélből, és a pBluescript 11 KS+ vektorba ligáitok, és DH5asejtekbe transzformáltuk. A méret szerint Irakéi önált könyvtárat tartalmazó bsktériurokolóniákai DlG-jelölí próbával szkrineltúk, és azonosítottunk egy 4,3 kb méretű Kpnl/EeoRlfragmensi. Szekvencia-analízissel kimutattuk, hogy ez a klón teljes hosszúságú, 1224 bp mé- 43 retű reduktáz-gent (6.. azonosítószámú szekvencia) tartalmazott, és 408 aminösavból álló, 43,7 kDa méretű fehérjét (7. azonosítószámú szekvencia) kódolt A klónozott génből levezetett, aminosav-szekvencia egyezett a tisztított redúktáz-fehérjébol korábban kapott, N-terniinális és belső antinosav-szekvenciával. Továbbá, a levezetett aminosav-szekvencia teljes hosszúságá5 bán homológ volt legalább négy másik, FAD-fuggő ptridin-nukleotíd reduktázzal, 69%-os azonosságot találtunk sp. RW1-törzsből származó, díoxín dioxigenáz eitokróm

P45ö-tipusü rednktáz-komponensévei, és 36% azonosságot találtunk Psewfom&nas fajból származó terpredoxin reduktázzal (lásd 3, ábrát). A másik két FAD-ínggő pírídm-nukleofid reduktáz. A, ez>yórc>uö//xből és A. pW'rfcrből származott. FAD-fuggő pírídin-nukleotid reduktázok családjához tartozó fehérjék öt konzervatív motívummal rendelkeznek. Az 1. és 3, motívum bárom konzervatív gíieint tartalmaz, és megfelel az ADP-kötőhelynek FAD-ra és NAD(F)-re, sorredben. Az 5. motívum megfelel a FAD-őavm-csoport kötőhelyének.

A második gén klonozása céljából, A. /t/ü/ropVri/mbőI származó ossz-BNS-t KpnI- és EcoiU-enzímekkei emésztettünk, és az eredményül kapott restrikciós fragmenseket agaróz15 gélben elválasztottuk. Körülbelül 20 kb méretű fragmenseket kivágtuk a gélből, és számos restrikciós enzimmel emésztettük, és azután Southern-hlottal a DÍG-jelőlt próbához hihridlzáltattnk. A. második gént körülvevő restrikciós hasitóhelyek térképét a próbához híhridizálódoft restrikciós fragmensefc mérete alapján állítottuk össze. Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy a teljes hosszúságú gént egy Ápal-feagmensnek kell tartalmaznia, amely körülbelül 3,0 kb hosszúságú. Ezt kővetően A. möAöplW&tból származó össz-DNS-t Apai-enzimmel emésztettünk. és a restrikciós fragmenseket gélben elválasztottuk. A 2,0 és 4,0 kb hosszúság közötti tfaginenseket kivágtuk a gélből, és a pBbeserlpl Π KS+ vektorba ligáitok, és DH5a~$ejtekbe transzformáltuk. A méret szerint írakcionált könyvtárat tartalmazó hakiériumkolóniákaí D1Gjelölt próbával szkrínellük, és azonosítottunk egy 3,0 kb méretű Apal-fragmemk Szekvencia25 analízissel kimutattuk, hogy ez a 3,0 kb méretű klón teljes hosszúságú, 1227 bp mérető nyitott leolvasási fázist (S azonosítószámú szekvencia) tartalmazott, és 409 amínosavbó'l álló, 43,9 kDa méretű fehérjét (9. azonosítószámú szekvencia) kódolt. A második reduktáz-gén által kódolt aminosav-szekvencia majdnem azonos volt (98,8%-os azonosság) az első gén szekvenciájával.

-44 Abból a célból, hogy a dicamba ö-derneííláz három komponensét egyenként olyan kazettákba helyezzük, amelyek alkalmasak növényi expresszióra, az alábbi lépéseket végeztük.

Láncinditó oBgonukleotidokat terveztünk mindhárom gén 5’-végén lévő Ncol-hasítóhely és 3’vegén lévő Xbal-hasitőbely létrehozása céljából, PCR-amphtikácÍóval. Az eredményül kapott PCR-termékeket. szekvenálással valídáituk, és azután az egyes· géneket, egyenként klónoztuk pRTL'2-vekíorba (Dr. Tóm Clemente biztosította, Plánt Transformadon Core Research Faciiíty, Llníversity of Nebraska, Lincoln, Nebraska). Ez a vektor dohányban „marást” okozó lö vírusból („fobueno eteti ms; TEV) származó, 144 bp mérető transzlációs en-hanszerszekvenciál [Carrington és Freed, L Vírology 64, 1590-1597 (1990)] tartalmaz a poüíinfcer 5’végénél. Az oxigenáz-, reduktáz- és ferredoxin-géneket azután egyenként klónoztuk XhoI/Xbal-fragmensként pXLP36-jelü növényi expressziós vektorba (índu Maid biztosította, üniversíty of Kentucfcy, Lexington, Kentucky) [Malii és Shepard, Biochem, Biopbys.. Rés.

Comnrun. 2.44, 440-444 (1998)]. Ez a bináris vektor fold! mogyoróban előforduló, ídorózist okozó vírusból származó teljes hosszúságú promótert (PCISV FLt3ő) tartalmaz dupla enhanszer-donfonnel konstitutív expresszió céljából növényekben, és borsóból származó rbcS 3’-végi szekvenciát a transzkripció hatókon)' terminációjához (Maid és Shepard, Biochem. Biopbys. Rés. Commun. 344, 440-444 (1998)]. Egy bináris vektorban mindhárom gént tattal20 mázó konstrukciókat lehet előállítani a három gén számos, különböző sorrendben és orientációban való kombinációjának alkalmazásával.

Az alábbi módszereket alkalmaztuk oxigenáz-, ferredoxln- és reduktáz-kunstrukeíók Agtetioctertien forne/hcúwbe való bevitelére egyenként, és az egyes konstrukciók .dméá/o/zrisba és dohányba való transzformálására. A három konstrukciót X. teniefactefís

CSSC1 -törzsbe vittük módosított háromszuiős keresztezed eljárással, melyet rutinszerűen alkalmaznak a “Plánt Transformation Core Research Faciíity”-ben. Eszerint as egyes konstrukciókat. tartalmazó, Kscúermőáa c&fi sejteket A. .tame/aeiens sejtek és £. coli sejtek keverékével Ínkubáltuk, amelyek pRK2öl3-jelű helper plazmldot tartalmaztak (plazmid-mobilizáláshoz). Azután az egyes konstrukciókat tartalmazó A. tee/aerem sejteket alkalmaztuk dohány és ,4ro'áá'/íf?s'A transzformálására a “Plánt Transformation Core Research Faeiüty'’ segítségével.

Dohány esetén, levéi-explaníáíumokat ínkuháitunk az egyes konstrukciókat tarialmaző, X.

mw/mriens sejtek szuszpenzlójával, és a sarjakat kanamicint tartalmazó, szilárd táptalajon regeneráltuk [Horsch és mtsai , Science 227. 1229-1231 (1985)]. A dohány transzformációs eljá-45·*· ι:

, ♦. 5.:.

fosát részletesen az alábbiakban ismertetjük.

Körülbelül 7,5-10 cm~es leveleket válogattunk 1 hónapos növényekről (a csúcson két levél), Ez 30-40 explantálumhoz volt elegendő. A leveleket nagy főzőpohárba helyeztük, és dífoO-val fedtük 20-30 percig. A vizet leöntöttük, és a leveleket 10% CWrox^ÍM-eI plusz Tween 20 ^m-al fedtük (1 csepp 50 ml-re). A leveleket 15 percig hagytuk áztatni, és 3X-5X mostuk steril dH₂O-val. A levéllemez külső szélét, a csúccsal és a levélnyéllel (petíote) levágtuk, a középső erezetet kivágtuk, és a maradék szövetet 0,5 x 0,5 cm mérető darabokra vágtak. .Az explantátnmokal eiőtenyészíeítüL tálcánként 30-at, adaxiáks oldalúidra! felfelé, 1 na10 pig a beoltás előtt.

efáátthása;

ml Xg?OŐ£?cmr/«zn-tenyészetet indítottunk megfelelő antibiotikumokkal kiegészített, YEP-tápközegben (10 ,g/l pepf.cn, 10 gti NaCI és 5 g/I élesztőkivonat, pH 7,0). Hagytuk, hogy a sejísűrüség elébe a maximumot. A 2 ml tenyészetet szubkultúrába vittük 50 ml YEP15 tápköz.egben, és hagytuk növekedni 6-8 óra hosszáig {28°C-on, állandó rázatás közben). A sejteket eentrifegálássa! elkülönítettük (3000-400 rpm). A baktérium-üledékeket felszuszpendálíuk ÖD₆6e~0,3-! ,0-re, együtt-tenyésztési tápközegben.

Az előállított dgrcóím/efoínn-ínoknlnmof átvittük Petri-csészékbe. Áz elötenyésztett explantátumokaf 30 percig inoknlálfuk. Az explantátumokaf steril szűrőpapírra bloítohuk, és

0,8% agarral szilárdított együtt-tenyésztési tápközegbe helyeztük (10 explantátum csészénként), amelyet befedtünk steril szűrőpapírral (együtt tenyésztett növények az adaxiális oldalukkal felfelé). Az explantátomokaí 3 napig tenyésztettük együtt. Az együtt-tenyésztési időszak után az explantátumokaf rövid ideig mostuk regenerációs fápközegben.

A mosott, explantáiurnokat steril szűrőpapírra blöfföltük, és szövetet (10 explantátum csészénként) átvittük 0,8% agarral szilárdított regenerációs tápközegbe, amely még szelekciós ágenst (150 mgd kanamicint) tartalmazott. Az explantáiurnokat adaxiális oldalukkal felfelé tenyésztettük. A szövetet kéthetente átvittük friss regenerációs tápközegbe, és a sarjakat kivágtuk (> 3 cm), és szubkultúrába vittük gyökerextető tápközegbe. A. gyökeres sarjakat .azután talajba telepítettük

Aesgddágfc

MS-sók B5-vitaminokkal, 3% szacharóz kiegészítve 1 mgd BAP-al, 1 mgd NAA-val es 8 ugri pCPA-val (p-klőr-fenoxi-ecetsawal):. pH 5,7. (Megjegyzés: minden növekedési szart:,

.. 46 bályzót sterilre szőrünk),

1/30 MS/S5~iápközeg, 3% szacharózzal, 1,0 m.gd ΒΑΡ-al, 0,1 mg/1 NAA-val és 8 Pg/l pÜP A-va! kiegészítve.

MS/B5-tápközeg, 1 ,ö mgri BÁP-al, 0,1 mg/l NAA-val és 3% szacharózzal kiegészítve, pH 5, 7. Carbenicilíin (500· mg/i) és cefotaxime (1.00 aog/1) antibiotikumokat alkalmazunk.

MS-sők teljes erősségű B5-vitaminokkal, kiegészítve 0,1 mg/1 NAA-val és 1% szacha10 rózzal. A tápközeget 0,8% agar szilárdítja. Az antibiotikumok koncentrációja (ha 75 mg/1 „npt IF’-t aik.almazo.nk).' 500 mg/i carbenicillm és 100 mgó eeíotaxíme.

Kiválasztottunk tíz-tíz sarjai mindhárom transzformációs kísérletből gyökerezteíö· tápközegbe helyeztük néhány hétre, és azután cserepekbe ültettük üvegházban. Arabidqpds esetén egy cserép virágzó növényt inkubáhunk A. temeföctefts sejtek szuszpenzíójával, amelyek az egyes konstrukciókat tartalmazták, és azután a növényeket hagytuk felmagzani (Bechtokl és mtsai., Ü.R, Acad. Sci. Paris, Sciences de la víe/Life Sciences 3.1ő, 1194-1199 (1993); Clough és Bem, Plánt X ló, 735-743 (1998)}. Magokat fogtunk, és csíráztattuk azokat kanamicint tartalmazó tápközegben. Miután a csíranővények kielégítő mértékben győkénendszerí fejlesztettek, néhány növényt kiválasztottunk az egyes trmiszformációs kísérletekből, és átültettük cserépbe tenyésztő kamrában.

A transzformált növényekben, az egyes gének expressziójának kiértékeléséhez néhány transzformáit növényből származó levelek lizátumát felvittük Western-blotra, és próbaként olyan poliklonális ellenanyagokat alkalmaztunk, amelyek a dícamba Ö-demetiláz három komponensét detektálták. .Az egyes enzimek növényi extraktumokhan való aktivitásának meghatá25 rozása céljából olyan megközelítést alkalmaztunk, amelyben az oxigenáz-, íerredoxin- vagy' reduktáz-fehéíjéket expresszálő, transzfonnált növényekből származó levelek iizátumait kombináltuk feleslegben lévő, P. muúqpMfe Dl~ö-törzsből tisztított, O-demetiláz további komponenseivel. Ezt a keveréket teszteltük dieamba O-demetSáz-aktivhásra standard ⁵⁴C-jelöh álcámba vizsgálati eljárással (lásd az 1, és 3, példában leírtakat) és HPLC vizsgálati eljárásban, amelyben nem-radioaktlv dícamba-t alkalmaztunk szubsztrátkent ídioamaha és 3,ő-DCSA különböző pontokban eluálódik a HPLC-ról es merni lehet).

A géntermékek kloroplasztisxban való expresszíójának tesztelése céliából olyan konstrukciókat áhítottunk elő, amelyekben az oxigenáz, íerredoxin és reduktáz 5’-végénél egy ♦ «·χ_Λ * tranzitpepfíd-szekvencla volt. Ilyen megközelítést, sikeresen alkalmaztak sznlfonil-karhamidherbicidtolerancia dohánynövényekbe való bevitelére [O’Keefe és .mtsai, Plánt Physiol, 10$, 473-478 (1994)}. Konkrétabban borsóból származó, ribulóx-.l,5-bifoszfát karboxíláz kis alegységének tranzitpeptid-($zignál)szekvenciáiáí (19. azonosítószámú nukleinsav-szekveneia) gén5 technológiailag bevíttök oxígenáz-, ferredoxin- vagy reduktáz-gént tartalmazó, intermedier pRTLz-vektorba, amelyben mindegyik saját expresszíós szabályzó szekvenciáját tartalmazta (lásd fentebb). Ezt úgy végeztük, hogy a tranzitpeptid mindkét végén létrehoztunk Neoíhasitóhelyeket, láneindító oligonukleotidokkal és PCR-elj árassal, Az Ncoí-hasitéhely elsegití a tranzitpeptid bevitelét a TEV-vezetöszekvencía és a riporterién (oxigenáz, reduktáz vagy

Ferredoxin) közé az pRTL2-vektorban. Azután az egész kazettát (TEV-vezetöszekvencía, tranzitpeptid és riportergén) kivágtuk a pRTL2~yekiorból XhoI/Xbaí-fragmensként, és bevíttök P€lSVFLt3ó~promóíert és rbcS 3’-termmátorí tartalmazó, pKLP36-)elü bináris vektorba.

Úgy teszteltük annak a valószínűségét, hogy a bakteriális férredoxin-gén kódonhasználata nem volt teljesen optimális növényi sejtekben hatékony transzlációra, hogy ugyanolyan ami15 uosav-szekvencíát kódoló, szintetikus térredoxín-gént szintetizáltunk, mint a P. «ja/íop/s/ra Dl-6-törzsből származó ferredoxin amínosav-szekvenciája, de kétszikű növényekre optimalizált kődon-eltérésekkel, a szintézist az Entelechon, GmbH cégnél végezték (Regensburg, Németország), Jól dokumentált, hogy a kődonhasználatban történt változtatások esszenciálisak bakteriális PJ. toxln-gének optimális expressziójához növényi sejtekben [lásd például Díehn és mtsai., Génébe Englneering 18, S3-99 (1996)].

Növények permetezése

Transzgenikus dohány-növények dicamba-rezisztencíájának tesztelése céljából, a 6.

példában, fentebb leirt I<rgenerácíöbői származó magokat csíráztattunk, és 10-12-leveies állapotig növesztettük. A „Department of Ágronomy” segítségével ezeket a növényeket egyenletesen („állandó lölyadékszáílífási sebességgel”) permeteztük [Bnrnside, Weed Science 17, 102104 <i9ő9)j, elíerjedten alkalmazott permetező-berendezés alkalmazásával, amely az ISCO cég gyártmánya volt, A permetező TEE3ET szórófejjel és ernyővel rendelkezett, körülbelül 3,0

30- km/őra szállítási sebességet és 42 psí nyomást alkalmaztunk. A szórófej .körülbelül 20,3 em-re volt. a növények levelei fölött. Dleanrbs-t (kereskedelmi forgalomban lévő termék. Clariíy) különböző koncentrációban permeteztünk a növényekre nem-ionos felületaktív anyaggal keverve,

0,41 hektáronként (1 acre) körülbelül 90,86 liter' mennyiségben, nagynyomású levegő alkalma- 48zásával.

Az eredeti növény pusztítás mértékét leíró görbe felvétele céljából, vad iipusö dohánynövényeket kezeltünk növekvő koncentrációjú dieamha-val 0 és 0,55 kg/hektár (azaz 0,5 IhsZacre) közötti tartományban. Megállapítottak, -hogy a vad típusú növények. 100%-ban érzé5 kenyek voltak 0,55 kg/hektár mennyiségű dieambára, majd az oxigenáz-gént egymagában vagy trauzitpepbddel tartalmazó, transzgenikus növényeket kezeltünk növekvő koncentrációjú dícamba-val, 0,55 kg/hektár és 5,5 kg/hektár közötti mennyiségben. Az oxigenáz-génkonstnrkciót tartalmazó, de tranzitpeptidet kódoló szekvenciát nem tartalmazó, transzgenikus növények rezisztensek voltak dicamba-ra (azaz növekedtek és egészségesek voltak) legalább 2,75 kg/hektár mennyiségű dicamba-kezeiesre. Az oxígenáz-génkonstrukciót tranzitpeptiddel tartalmazó, transzgenikus dohánynövények növekedtek és egészségesek voltak még akkor is, ha 5,5 kg/hektár mennyiségű dicamba-val permeteztük azokat. Tehát, az oxigenáz-gént tranzitpepiidet kódoló szekvenciával vagy anélkül tartalmazó, transzgenikus növények megjelenése hasonló volt a kezeletlen kontroll növényekéhez abban az esetben, ha maximum a jelzett mennyiségű dioamba-val kezeltük azokat, mig ugyanekkora mennyiségű dicamba-val kezelt, nem-íranszgenikus növények csökkent mértékben növekedtek, elhervadtak és súlyos nekrózist mutattak.

Egy hasonló kísérletben a három génkönstrukciót (oxígenáz-, ferredoxán- és reduktázgéneket) tartalmazó, transzgenikus növényeket permeteztünk Ó, I38 kg/hektár dicamfeávat A három génkonstrukciót tartalmazó, transzgenikus növények növekedtek és egészségesek voltak, ha ilyen dicamba-koncenttádó alkalmazásával permeteztük azokat, mig ugyanilyen mennyiségű dicamöa-val kezelt nem-transzgeníkus növények csökkent mértékben növekedtek, elhervadfak és súlyos nekrózist mutattak. Mivel az oxigenáz-konstrukciöt tartalmazó növények toleránsak voltak dícamba-ra 2,75 kg/hektár dicamba alkalmazása esetén is, előre látható, hogy a három génkönstrukciót tartalmazó transzgenikus növények hasonlóan rezisztensek 2,75 kg/hektár, sőt még több dicamba alkalmazása esetén Is.

Ezek az eredmények egyértelműen alátámasztják, hogy a találmány szerinti, dieambalebontó oxigenázzal vagy a három génkonstrukcióval transzformált, transzgenikus növények szerzett rezisztenciával rendelkeznek dicamba-ra.

-49A szekvenmíistáhan található kötette» szövegek fordításai

1, szekvencia: 28. pozíció: az Xaategvalóssánöbbes: Asp vagy Thr pozíció: az Xaa legvalószínűbben: Pro

Claims (23)

1. SZABAÖALMf IGÉNYPONTOK

   1, DNS-molekula, amely a követkézé amiaesav-szekvenciak bármelyikével rendelkezó, drcamha-Ieboatá ferreáoxisi kódoló DNS-szesvesciát tartalmaz:

   a) az 5. azonosítószámú szekvenciát (SEQ ID NO: 5) tartalmazó amisosav-szekv’eneía;

   b) aminosav-szekvencia, mely 5. azönositőszánrá szekvencia (SEQ H3 NO: 5) enzsmatikosaa aktív fragxnense; és ej az. 5. azonosítószámú szekvenciával legalább mintegy 85%-baxt azonos amint>sav-s>?ekvencia, amely dieaínba-lebimíő ferredoxin-akílvitással rendelkezik.
2. 2. Az Ϊ. igénypont szerinti DNS-mofckrtia, amely 5. azonosítószámú (SEQ ÍD KO: 5} an'ítísosav-székveB•eiájö dicawba-lebontó ferredoxtnt kódoló .DNS-szekveaciát tartalmaz.
3. 3. .Az. I. igénypont szerinti DNS-molekula, amely tartalmazza a 4. azonosítószámú rtaláernsav-szekvescíát (SEQ l'D NO: 4).
4. 4. ONS-molekula, amely a következő aminosav-szekvenciák bármelyikével rendelkező, dicamba-írixmíó rednktázt kódoló DNS-sze^eneiát tatínknaz:

   a) 7. vagy 9. azonosítószámú szekveacíávai (SEQ ID NO: 7 vagy 9) rendelkező ammosav-szekveneia; bj ammesav-szekverscia, amely az a) pontban léirt ammosav-szekvescía enzimatikusan aktív frsgmense; és

   c) az a) pontiban leírt ammosav-szekveactával legalább mintegy 85%-fean azonos aminem-szekvencia, amely átoamba-lébontó reduktáz-akimtással. rendelkezik,
5. 5. A 4. igénypont szerimi DNS-molekula, amely 7- azonosítószámú :mtínosav-szekveneiájú (SEQ ID NO: 7} dicamfes-leboniö reduktázt kódoló DNS-szekveaeiát tartalmaz.

   ó. A 4, igénypont szerinti DNS-molekmls, amely 9. azonosítószámú ammosav-szekveaeiájú (SEQ ID NO: 9) dícamba-lébontó rednktázt kódoló BNS-szekveaelaí tartalmaz.
6. 7. A 4. igénypont szeriad DNS-jnolekala,.-amely 6. vagy 8. azonosítószámú nnktessav-szekvensáát (SEQ ID NO: 6 vagy 8) tartalmaz.
7. 8. DNS-konslrnkció, amely legalább egy expresszié» szabályzó szekvenciákhoz múködőképesea kapcsolt, 1 -7. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekalát tartalmaz,
8. 9. A 8,. igénypont szerinti .DNS-konstrakció, amelyben a nuklemsav-szekvencin kétszikű növényekben opttinsíízált expressziére kiválasztott kódenokkal rendelkezik,.
9. 10. Dioamha-lebontó ö-meölázt kódoló DNS-konstrakció, amely expressziős szabályzó szekvenciákhoz makbáéképeses kapcsolt, a következőket, kódoló BNS~szekvenciát tartalmaz:

   a) a következő aminosav-szekveneiák bármelyikét tartalmazó, dícamba-lebontó ©xigenázt:

   $)a 3, azonosítószámú szekvencia (SEQ ID NO: 31:

   ii) sminosav-sziekveacia, amely a 3. azonosítószámú szekvencia (SEQ ID NO: 3) enzimatikusan aktív frsgmense: vagy fii)· a 3, azonosítószámú szekvenciával (SEQ ID NO: 3) legalább mintegy 85%-Nsn azonos aminosavszekvencia, amely dicamba-lebosíó oxigenaz-tóvitással rendelkezik; és ív} a ,3. azonosítószámú szekvenciától (SEQ ID NO: 3) egy szubsztitúcióban, egy sddícióhaa vagy egy szabszritócióban és egy adóidéban különböző aminosav-szekvencia;

   #♦*» «

   -51 fe) a következő amiímsav-szekvenciák bármelyikét tartalmazó, dicamha-iebomő ferredoxmt: i) az 5. azonosstószámű szekvenciát tartalmazó amifiösav-szekvencía (SEQ ID NO: 5); h) ammosav-szekveneia, amely az 5, azonosítószámú szekvencia (SEQ ID NO: 5) enzhnatiknsan aktív íragmenss; vagy in) az 5. azonosítószámú szekvenoíávsl legalább mintegy 85%-baa azonos arninosav-szekvencia, amely dioamfea-leboníó íérredoxin-aktivitássai reodeikezík;: ás

   c) a kővetkező aminosav-szekveasdák bármelyikét tartalmazó, dieamba-isámtó redukíázt:

   íj a 7. vagy 9. azonosítószámú szekvenciával (SEQ ID NO: 7 vagy 9) rendelkező xmmosav-szekvencia; it) anrioosav-szekveaeia, amely az. i) pontban leírt aminosav-szekvestóa enzfenatikassn aktív .fragmesse; vagy üt) az í) pontban leírt anrissosav-szekveasciával legalább mintegy 85%-ban azonos ammosav-saekveKcia, amely dicamba-lebontó red&kíáz-iikdvisássaí rendelkezik, tí. A 8. igénypont szerinti DNS-konsirakeió, amely konstrukció olyas tranzltpeprideí kódoló nnkldnsavszekveaciát.is tartalmaz, amely a dicamba-lebontó oxigesázt növényi sejt organellumaíhoz képes célba jnkafeú.
10. 12, A 11, igénypont szerinti DNS-konstrakció, amelyben a aanzhpeptideí .a 19. azonosítószámú szekvencia (SEQ ID NO: 5.9) kódolja.
11. 13, A 8-12, igénypontok bámmlyike szerinti DNS-korsstrakcíó, amely vektor.
12. 14, A 13. igénypont szerinti DNS-konsítríkció, ahol a vektor tartalmaz növényi promótert,
13. 15, Tranazgesikus gazáasejt, amely 8-13. igénypontok bármelyike szerinti DNS-kossírokriót tartalmaz.

    lö, A 15. igénypont szerinti aanszgenikus gazdasejt, amelyben a DNS-konstníkció a következőket kódoló DNS-szekverseiút tartalmaz: a 3. azonosítószámú: aminosav-smkvenciával (SEQ ID NO: 3) rendelkező díeambalebontó oxigenázt; az 5. azonosítószámú aminosav-szekvermiával (SEQ 53 NQ: 5) rendelkező dleamha-lebontó ferredasint; és a 7. vagy 9. szonosttószámű aminössv-szekvencíáv&I (SEQ ID NO: 7 vagy 9) rendelkező dicsmba-lefeon.tó redaktázt.
14. 17, A 15, vagy 16. igénypont szerinti írasszgenikns gszdaseii, amely növényi sejt.
15. 18, A IS. vagy: ló. igénypont szerinti traaszgeoikas gázoláséit, amely nnkmmgamztnas.

    Í9. A 8-54. igénypontok bármelyike szerinti DNS-konstrakció alkalmazása trarsszgesikus növény előállítására.
16. 20. A 19. igénypont szerinti alkalmazás_f ahol a EINS-konstníkció a következőket kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz: a 3. azonosítószámú aminossv-szekvcnciávsí (SEQ ID NO: 3) rendelkező, dícamba-iefeontó oxigénért; az 5. azonosítószámú aminosav-szekveneiával (SEQ ID NQ; 5) rendelkező, díeamba-lebontó ierredoxínt; és a 7. vagy 9. azonosítószámú aíninosav-szekveneiával (SEQ 53 NO: 7 vagy 9) rendelkező, díeamba-lebontó rednktázt.
17. 21. Az 19. vagy 20. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint dicambára toleráns, kétszikű vagy· egyszikű növényt állítunk elő.
18. 22. Eljárás gyomnövények kiirtására a 19-21, igénypontok: bármelyike .szerint előállított transzgemkns növényt tartalmazó szántófoldön, ezzel/elemezve, hogy a szántóíöldös található gyomok kiirtásához hatásos menynyiségő dicambát juttatónk a szántóföldre.

    '
19. 23·. Eljárás dicambát tartalmazó anyag, dckoníaminálására, mezői hogy 18, igénypont szerinti dicambo-leboaiő, íranszgesrikns jníkroorgsnizsnnst alkalmazunk. az anyagon akkora mennyiségbe», amely haté 52*»** * * * * « ♦ * <· «V * ♦ « A χ.

    »** * φ *>

    kony az anyagban levő diéamba legalább agy részének lebontására.
20. 24. Eljárás trasszfonnált növényi sejtek szrtlektálására, azzírfjelfemezve, hogy i) veszünk egy növényi sejtpopulációt;

    ti) a növényi sejtpopulációban lévó növényi sejtek legalább egy részét mmszformáljuk a 8-14. igénypontok bármelyike szemű DNS-kotsstrukciövjd; es

    Iii) az Így kapott növényi sejtpopulációt díeambát tartalmazó tenyésztési táptalajon növesztjük, amdyben a dómba koncentrációját úgy állítjuk be, hogy a 8-14. igénypontok bármelyike szerinti DNS-kesstrukcíóval transzformált növényi sejtek növekedjenek, a nem-iransztórmáit növényi sejtek pedig ne ríövekeálenek.

    •25. Eljárás transzformált növények szelektálására, azzal jellemezve. begy

    I) veszünk egy olyan növényi populációt, melynek feltehetően van olyan tagja, atnely a 8-14. igénypontok bármelyike szerinti DNS'konstrukcióval lett transzformálva: és isi akkora mennyiségű díeambát alkalmazunk a szelektálni kívánt növényi populáción, amelynek jelenlétében a 8-14, igénypontok bármelyike szériád DNS-konsirukcíóval transzformált növények növekednek, a nem-transzíormák .növények növekedése pedig gátolt.

    2& Eljárás transzformált gazdsseitek, intakt növények vagy növényrészek szelektálására vagy szkrtnelésóre, azzal jellemezve, hogy il olyan gazdasejteket, intakt növényeket vagy növényrészeket tartalmazó populációt veszünk, melyetek tagjai feltehetően tartaltnazsak 8-13. igénypontok bármelyike szerinti DNS-konstmkcióval fcsaszfonaált gaatbsej teket, intakt növényeket vagy növényrészeket, miáltal azok képesek dicambát lebontani;

    is)· a gazdasejteket, intakt növényeket vagy növényrészeket tartalmazó populációt dicsmbával érintkezteíjük; és

    Ili) mq’ltattkozzuk a 3,6-diklör-szalieilssvnsk mlaidonitható fluoreszcencia jelenlétét vagy mértékét, amely Xó-dikiöí-sz&iieilsav a transzformált g&zdasepekben, intakt növényekben vagy növényrészekben képződik dicamfoa lebontásának eredményeként,
21. 27. izolált és legalább részlegesen tisztított, dicamba-lebontó íerredoxin, amely a kővetkező aminosavszékvenciák bármelyikét tartalmazza:

    a) az 5. azonosítószámú szekvenciát (SEQ 1Ϊ3 NO: 5) tartalmazó ammosav-szekveueia;

    b) aminosav-szekvencia, amely az 5, azonosítószámú szekvencia (SEQ Π> NO: 5) enrimaűkusan akűv fragmense; és

    c) az 5. azonosítószámú szekvenciával (SEQ ÍD NO: 5) legalább mintegy 65%-b.an azonos amínosavszekvencia;

    ahol az áh b) és c) pontok szerinti aminosav-szekvenciák mindegyike rendelkezik iérredoxín enzimsklivitással.
22. 28. A 27. igénypont szerinti dicamba-lebontó feedoxm, amely 5, azonosítószámú ammossv-szekveneíáí (SEQ ©NO: 5) tartalmaz.

    27. Izolált és legalább részlegesen tisztított, dicamba-iébontó redukiáz, amely az alábbi axninosavszekvenciák bármelyikét tartalmazza;

    a) , a 7, vagy 9. azonosítószámú szekvenciával (SEQ © NO: 7 vagy 9) rendelkező ammossv-szekveneia;

    b) aminosav-szekveneia, amely az a) pontban leírt atninosav-szekvencia enzimatiknsan aktív fragmense;

    c) az a) pontban leírt mím^av-sgdkvesciávai legalább mintegy 75%-baa azonos amiuosav-szekvescia; ahol az a),, b) és c) pontok szerinti aörinosav-szekvenelák mindegyike rendelkezik xedaktáz enzitnatóvitás38, A 28. igénypont szerinti dicamba-léboníó reduktáz, amely tartalmazza & 7. azonosítószámú amiaosavszekveneiáí: (SBQ ID NO: 7),

    33. A 28, igénypont szerinti dseanrivt-lebostó: reduktáz, amely tartalmazza a 9, (SEQ IB NO: 9) azonosítószámú amínosav-szekvesciát.
23. 32. Eljárás dicambát tartalmazó anyag dehoníaminálására, asza/ jellemezve,. hogy 27. igénypont szerinti dioamba-Iebontó ferredoxint, 29. igénypont szerinti dlcamfea-lebouíó redukíázt vagy lö. igénypont szerinti BNSkonstrukcíó által kódolt, diosmbs-bbontö O-demetiíázt alkalmazunk az anyagon az anyagban található dieamba legalább egy részének lebontására hatékony mennyiségben.