NO331869B1

NO331869B1 - Dicamba-nedbrytende ferredoxin, DNA molekyler, konstruksjoner, transgene vertsceller, planter og organismer, og fremgangsmater for deres anvendelse

Info

Publication number: NO331869B1
Application number: NO20033811A
Authority: NO
Inventors: Donald P Weeks; Xiao-Zhuo Wang; Patricia L Herman
Original assignee: Univ Nebraska
Priority date: 2001-02-28
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2012-04-23
Also published as: ATE463501T1; KR20040052482A; MXPA03007770A; HUP0303214A3; AU2002252165B2; NO20033811L; CA2439179C; RU2003128987A; RU2292348C2; CA2439179A1; EP1379539B1; DE60235879D1; NO20033811D0; HU227706B1; EP1379539A2; JP2005506043A; HUP0303214A2; EP1379539A4; NZ528010A; MX336472B

Abstract

Oppfinnelsen tilveiebringer isolerte og minst delvis rensede dicamba-nedbrytende enzymer, isolerte DNA-molekyler som koder for dicamba-nedbrytende enzymer, DNA-konstruksjoner som koder for dicamba-nedbrytende enzymer, transgene vertsceller omfattende DNA som koder for dicamba- nedbrytende enzymer og transgene planter og plantedeler omfattende en eller flere celler omfattende DNA som koder for dicamba-nedbrytende enzymer. Oppfinnelsen tilveiebringer videre et transit- peptid for anvendelse i en DNA-konstruksjon omfattende slike dicamba- nedbrytende enzymer som målsøker nevnte dicamba-nedbrytende oksygenase til organeller i en plantecelle. Ekspresjon av de dicamba-nedbrytende enzymene resulterer i produksjonen av dicamba-nedbrytende organismer, omfattende dicamba-tolerante planter. Oppfinnelsen tilveiebringer videre en metode for å kontrollere ugress i en åker inneholdende de transgene dicamba-tolerante plantene ifølge foreliggende oppfinnelse og en metode for å rense et materiale inneholdende dicamba omfattende å tilføre en effektiv mengde av en transgen mikroorganisme eller dicamba-nedbrytende enzym(er) ifølge foreliggende oppfinnelse til materialet. Til slutt tilveiebringer oppfinnelsen en metode for seleksjon av transformerte planter og planteceller basert på dicamba-toleranse og en metode for seleksjon eller screening av transformerte vertsceller, intakte organismer og deler av organismer basert på fluorescensen av 3,6- diklorsalicylsyre produsert som et resultat av dicamba-nedbrytning.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår transgene organismer som kan bryte ned herbicidet dicamba, omfattende transgene planter som er gjort tolerante til dicamba. Oppfinnelsen angår også DNA-molekyler og DNA-konstruksjoner som koder for dicamba-nedbrytende enzymer. Oppfinnelsen angår videre en metode for å kontrollere ugress i åkrer med dicamba-tolerante transgene planter og en metode for fjerning av dicamba fra materialer forurenset med det (bioremediering). Til slutt angår oppfinnelsen metoder for seleksjon av transformanter basert på dicamba-toleranse eller ved deteksjon av fluorescensen til 3,6-diklorsalicylsyre som blir dannet som et resultat av dicamba-nedbrytning.

Herbicider blir anvendt rutinemessig i jordbruket. Deres effektivitet blir ofte bestemt ved deres evne til å drepe ugressvekst i åkrer og toleransen av nytteveksten til herbicidet. Hvis nytteveksten ikke er tolerant til herbicidet, vil herbicidet enten redusere produktiviteten av nytteveksten eller drepe alt sammen. Omvendt, hvis herbicidet ikke er sterkt nok, kan det tillate for mye ugressvekst i åkeren som deretter vil senke produktiviteten av nytteveksten. Det er derfor ønskelig å produsere økonomisk viktige planter som er tolerante til herbicider. For å beskytte vannet og miljøkvaliteten av dyrket mark, er det også ønskelig å utvikle teknologier for å bryte ned herbicider i tilfeller av uhell med søl av herbicidet eller i tilfeller med uakseptabelt høye nivåer av jord- eller vannforurensing.

Gener som koder for enzymer som inaktiverer herbicider og andre xenofobiske forbindelser har tidligere blitt isolert fra en rekke prokaryote og eukaryote organismer. I noen tilfeller har disse genene blitt genetisk konstruert for vellykket ekspresjon i planter. Ved hjelp av denne fremgangsmåten er det utviklet planter som er tolerante til herbicidene 2,4-diklorfenoksyeddiksyre (Streber og Willmitzer

(1989) Bio/Technology 7:811-816; 2,4-D), bromoksynil (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423; produktnavn Buctril), glyfosat (Comai et al. (1985) Nature 317:741-744; produktnavn Round-Up) og fosfinotricin (De Block et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518; produktnavn Basta).

Wang et al., Applied and Environmental Microbiology, vol. 63, no. 4, 1997, beskriver deteksjon av en enzymaktivitet som omdanner dicamba til 3,6-diklorsalicylsyre in vitro i cellelysater av Pseudomonas maltophilia DI-6. Wang et al. beskriver separasjonen av et delvis renset lysat til tre rå-fraksjoner, tentativt identifisert med en oksygenase, et ferredoxin og en reduktase. Fraksjonene ble ikke fullstendig renset og ingen enzymkomponent ble klonet eller sekvensert.

WO/98/045424 beskriver dicamba-nedbrytende enzymer, isolerte DNA molekyler som koder for dicamba-nedbrytende enzymer, og relaterte produkter og metoder for anvendelse, slik som en metode for å kontrollere ugress i et område som inneholder transgene dicamba-tolerante planter.

Dicamba (produktnavn Banvel) blir anvendt som et pre- og postspirings herbicid for kontroll av ettårige og flerårige bredbladete ugress og mange gressaktige ugress i mais-, durra-, korn-, høy-, "rangeland"-, sukkerrør-, asparges-, torv- og gressfrøåkrer og beitemark. Se Crop Protection Reference, side 1803-1821 (Chemical & Pharmaceutical Press, Inc., New York, NY, 11. utg., 1995). Uheldigvis kan dicamba skade mange kommersielt viktige avlinger (omfattende bønner, soyabønner, bomull, erter, poteter, solsikker, tomater, tobakk og frukttrær), prydplanter og -trær og andre bredbladete planter når det kommer i kontakt med dem. Id. Dicamba er kjemisk stabil og kan noen ganger forbli i miljøet.

Dicamba er i klassen av benzosyreherbicider. Det er antydet at planter tolerante til benzosyreherbicider, omfattende dicamba, kan produseres ved å innføre et 1-aminosyklopropan-1-karboksylsyre (ACC)-syntaseantisensgen, et ACC-oksydaseantisensgen, et ACC-deaminasegen eller kombinasjoner derav i plantene. Se kanadisk patentsøknad 2.165.036 (publisert 16. juni, 1996). Imidlertid demonstrerer ingen eksperimentelle data presentert i denne søknaden slik toleranse.

Bakterier som metaboliserer dicamba er kjent. Se U.S. patent nr. 5.445.962; Krueger et al., J. Agric. Food Chem., 37, 534-538 (1989); Cork og Krueger, Adv. Appl. Microbiol., 38, 1-66 (1991); Cork og Khalil, Adv. Appl. Microbiol., 40, 289-320

(1995). Det har vært antydet at de spesifikke genene ansvarlig for dicamba-metabolisme ved disse bakteriene kunne isoleres og anvendes for å produsere dicamba-resistente planter og andre organismer. Se id. og Yang et al., Anal. Biochem., 219:37-42 (1994). Imidlertid, før foreliggende oppfinnelse, hadde ingen slike gener blitt identifisert eller isolert.

Oppfinnelsen tilveiebringer et DNA-molekyl omfattende en DNA-sekvens som koder for et dicamba-nedbrytende ferredoxin som har en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: a. en aminosyresekvens omfattende SEKV ID NR:5;

b. en aminosyresekvens som er et enzymatisk aktivt fragment av SEKV ID

NR:5; og

c. en aminosyresekvens som er minst 85 % identisk med SEKV ID NR:5 og som har dicamba-nedbrytende ferredoxinaktivitet.

Oppfinnelsen tilviebringer også et DNA-molekyl omfattende en DNA sekvens som koder for en dicamba-nedbrytende reduktase som har en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: a) en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:7 og SEKV ID NR:9; b) en aminosyresekvens som er et enzymatisk aktivt fragment av nevnte aminosyresekvens (a); og, c) aminosyresekvens som er minst 85% identisk med nevnte aminosyresekvens (a), og som har dicamba-nedbrytende reduktase aktivitet.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en DNA-konstruksjon omfattende et DNA molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, operabelt koblet til minst en ekspresjonskontrollsekvens.

I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen en DNA-konstruksjon som koder for en dicamba-nedbrytende O-demetylase, idet nevnte dicamba-nedbrytende O-demetylase omfatter en DNA sekvens funksjonelt koblet til

ekspresjonskontrollsekvenser, hvori nevnte DNA sekvens koder for:

a) en dicamba-nedbrytende oksygenase omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: (i) SEKV ID NR:3; (ii) en aminosyresekvens som er et enzymatisk aktivt fragment ifølge SEKV ID NR:3; (iii) en aminosyresekvens som er minst 85% identisk med SEKV ID NR:3 og som har dicamba-nedbrytende oksygenase aktivitet; og, (iv) en aminosyresekvens som er forskjellig fra SEQ ID NO:3 med en substitusjon, et tillegg, eller en substitusjon og et tillegg; b) et dicamba-nedbrytende ferredoxin omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: (i) en aminosyresekvens omfattende SEKV ID NR:5; (ii) en aminosyresekvens som er et biologisk aktivt fragment av SEKV ID NR:5; og, (iii) en aminosyresekvens som er minst 85% identisk med SEKV ID NR:5 og som har dicamba-nedbrytende ferredoxin aktivitet; og c) en dicamba-nedbrytende reduktase omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: (i) en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: SEKV ID NR:7 og SEKV ID NR:9; (ii) en aminosyresekvens som er et enzymatisk aktivt fragment av nevnte aminosyresekvens i (a); og, (iii) en aminosyresekvens som er minst 85% identisk med nevnte aminosyrsekvens (a) og som har dicamba-nedbrytende reduktase aktivitet.

Hvilken som helst av de ovenfor identifiserte DNA-konstruksjonene kan også omfatte en DNA-sekvens som koder for et transit-peptid som målsøker det dicamba-nedbrytende enzymet(ene) til organeller i en plantecelle eller mikroorganisme (kloroplast og/eller mitokondrier).

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en transgen vertscelle omfattende en DNA konstruksjon ifølge et hvilket som helst av kravene 8-13. DNA'et kan, i noen utførelsesformer, også omfatte en DNA-sekvens som koder for et transit-peptid som målsøker det dicamba-nedbrytende enzymet(ene) til organeller i en plantecelle eller mikroorganisme (kloroplast og/eller mitokondrier). Den transgene vertscellen kan være en plantecelle eller en prokaryot eller eukaryot mikroorganisme.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en transgen plante eller plantedel omfattende en eller flere celler omfattende en DNA konstruksjon ifølge et hvilket som helst av kravene 8-13.1 noen utførelsesformer omfatter DNA'et ytterligere en DNA-sekvens som koder for et transit-peptid som målsøker det dicamba-nedbrytende enzymet(ene) til organeller i en plantecelle. Den transgene planten eller plantedelen er fortrinnsvis tolerant til dicamba eller har hatt dens toleranse til dicamba økt som et resultat av ekspresjonen av det dicamba-nedbrytende enzymet(ene).

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å kontrollere ugress i en åker inneholdende en transgen dicamba-tolerant plante ifølge et hvilket som helst av kravene 18-20 som omfatter å tilføre en mengde av dicamba til åkeren som er effektiv til å kontrollere ugresset.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for dekontaminering av et materiale inneholdende dicamba, som omfatter tilføring av en mengde av en dicamba-nedbrytende transgen mikroorganisme ifølge krav 17 til materialet, idet mengden er effektiv for å nedbryte minst noe av dicamba i materialet.

Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for dekontaminering av et materiale inneholdende dicamba, som omfatter tilføring av en mengde av en dicamba-nedbrytende O-demetylase kodet for av DNA konstruksjonen ifølge krav 10, til materialet, idet mengden er effektiv til å nedbryte minst noe av dicamba i materialet.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for seleksjon av transformerte planteceller som omfatter tilveiebringing av en populasjon av planteceller;

transformering av minst noen av plantecellene i populasjonen av planteceller med DNA konstruksjonen ifølge et hvilket som helst av kravene 8-13 slik at de er tolerante overfor dicamba; og

dyrking av den resulterende populasjonen av planteceller i et kulturmedium inneholdende dicamba i en konsentrasjon valgt slik at de transformerte plantecellene vil vokse og slik at ikke-transformerte planteceller ikke vil vokse.

Videre tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for selektering av transformerte planter som omfatter;

tilveiebringing av en populasjon av planter som kan omfatte planter som kan bli transformert med DNA konstruksjonen ifølge et hvilket som helst av kravene 8-13 slik at de er tolerante overfor dicamba; og

tilføring av en mengde av dicamba til populasjonen av planter, idet mengden av dicamba blir valgt slik at de transformerte plantene vil vokse og slik at veksten av ikke-transformerte planter vil bli hemmet.

Til slutt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for seleksjon av eller screening for transformerte vertsceller, intakte organismer og deler av organismer som omfatter;

tilføring av en populasjon av vertceller, intakte organismer eller deler av organismer som kan omfatte vertceller, intakte organismer eller deler av organismer som kan bli transformert med DNA konstruksjonen ifølge et hvilket som helst av kravene 8-13 slik at de kan nedbryte dicamba;

bringe populasjonen av vertceller, intakte organismer eller deler av organismer i kontakt med dicamba; og

bestemme nærværet eller nivået av fluorescens som skyldes 3,6-diklorsalicylsyre, idet 3,6-diklorsalicylsyren blir dannet i vertceller, intakte organismer eller deler av organismer som et resultat av nedbrytning av dicamba.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1. Et diagram av det foreslåtte elektrontransportskjemaet for dicamba O-demetylase. Elektroner fra NADH blir overført sekvensielt fra reduktaseDictil ferredoxinDicog deretter til oksygenaseDic- Reaksjonen av oksygen med substratet dicamba for å danne 3,6-diklorsalicylsyre blir katalysert ved oksygenaseDic- oks, oksydert; red, redusert. Figur 2. Sammenligning av den avledede aminosyresekvensen til ferredoxinkomponenten av dicamba O-demetylase med aminosyresekvensene til medlemmer av adrenodoxinfamilien av ferredoxiner. I Figur 2 er ferr di6 = ferredoxinkomponent av dicamba O-demetylase fra Pseudomonas maltophilia DI-6 [SEKV ID NR:5]; fer6 rhoca = ferredoxin fra Rhodobacter capsulatus [SEKV ID NR:10]; fer caucr = ferredoxin fra Caulobacter crescentus [SEKV ID NR:11]; thcc rhocr = ferredoxin fra Rhodococcus erythropolis [SEKV ID NR: 12]; putx psepu = ferredoxin fra Pseudomonas putida [SEKV ID NR:13]; terp psesp = ferredoxin fra Pseudomonas sp. [SEKV ID NR:14]. I Figur 2 betegner dessuten tallene 1-3 de tre konserverte motivene i adrenodoxinfamilien av bakterielle ferredoxiner.

Figur 3. Sammenligning av den avledede aminosyresekvensen til de to reduktasekomponentene av dicamba O-demetylase med aminosyresekvensene til medlemmer av familien av FAD-avhengige pyridinnukleotidreduktaser. I Figur 3 er redl di6 = reduktasekomponent av dicamba O-demetylase fra P. maltophilia DI-6 [SEKV ID NR:7]; red2 di6 = reduktasekomponent av dicamba O-demetylase fra P. maltophilia DI-6 [SEKV ID NR:9]; AJ002606 = reduktase fra Sphingomonas sp.

[SEKV ID NR:15]; thcd rhoer = reduktase fra R. erythropolis [SEKV ID NR:16]; cama psepu = reduktase fra P. putida [SEKV ID NR:17]; tera pscsp = reduktase fra Pseudomonas sp. [SEKV ID NR:18]. I Figur 3 betegner dessuten tallene 1-5 de fem konserverte motivene i FAD-avhengige pyridinnukleotidreduktaser.

Tidligere studier (Cork og Kreuger, Advan. Appl. Microbiol. 36:1-56 og Yang et al.

(1994) Anal. Biochem. 219:37-42) har vist at jordbakterien, Pseudomonas

maltophilia, stamme DI-6, kan ødelegge herbicidaktiviteten til dicamba gjennom en enkelttrinns-reaksjon hvor dicamba (3,6-diklor-2-metoksybenzosyre) blir omdannet til 3,6-diklorsalicylsyre (3,6-DCSA). 3,6-DCSA har ingen herbicidaktivitet og er ikke vist å ha noen skadelige effekter på planter. I tillegg blir 3,6-DCSA lett brutt ned av den normale bakteriefloraen i jord.

Forsøkene beskrevet her bekrefter hypotesen til Yang et al. (se id.) at en O-demetylase er ansvarlig for omdannelsen av dicamba til 3,6-DCSA ved P. maltophilia- stamme DI-6 og fastslår at O-demetylase er et tre-komponent enzymsystem bestående av en reduktase, et ferredoxin og en oksygenase. Se Eksempel 1 og 3 som beskriver isoleringen, rensingen og karakteriseringen av P. maltophilia O-demetylase og dens tre komponenter i detalj. Reaksjonsskjemaet for reaksjonen katalysert ved de tre komponentene av dicamba O-demetylase er presentert i Figur 1. Som illustrert i Figur 1, beveger elektroner fra NADH seg gjennom en kort elektronkjede bestående av reduktasen og ferredoxinet til den terminale oksygenasen som katalyserer oksydering av dicamba for å produsere 3,6-DCSA.

"Dicamba-nedbrytende O-demetylase" er definert her til å bety en kombinasjon av en dicamba-nedbrytende oksygenase, et dicamba-nedbrytende ferredoxin og en dicamba-nedbrytende reduktase, alle som definert nedenfor.

"Dicamba-nedbrytende oksygenase" er definert her til å bety oksygenasen renset fra P. maltophilia- stamme DI-6 og oksygenaser som har en aminosyresekvens som er minst ca. 65 % homolog (og fortrinnsvis identisk), og mer foretrukket minst ca. 75 % homolog (og fortrinnsvis identisk), og mer foretrukket minst ca. 85 % homolog (og fortrinnsvis identisk) og enda mer foretrukket minst ca. 95 % homolog (og fortrinnsvis identisk) til aminosyresekvensen til P. ma/fop/?///'a-oksygenasen og som kan delta i nedbrytningen av dicamba. "Dicamba-nedbrytende oksygenaser" omfatter mutante oksygenaser som har aminosyresekvensen til P. maltophilia-oksygenasen hvor én eller flere aminosyrer er tilsatt, deletert eller substituert for aminosyrene i P. ma/fop/?///'a-oksygenasesekvensen. Slike oksygenaser omfatter enzymatisk aktive fragmenter av oksygenasen, så vel som oksygenaser som har en gitt prosent homologi eller likhet med P. ma/fop/7/7/a-oksygenasesekvensen. Aktivitet til dicamba-nedbrytende oksygenaser kan bestemmes som beskrevet i Eksempel 1 og 3.

"Dicamba-nedbrytende ferredoxin" er definert her til å bety ferredoxinet renset fra P. maltophilia- stamme DI-6 og ferredoxiner som har en aminosyresekvens som er minst ca. 65 % homolog (og fortrinnsvis identisk), og mer foretrukket minst ca. 75 % homolog (og fortrinnsvis identisk), og mer foretrukket minst ca. 85 % homolog (og fortrinnsvis identisk), og enda mer foretrukket minst ca. 95 % homolog (og fortrinnsvis identisk) til aminosyresekvensen til P. ma/top/7///a-ferredoxinet og som kan delta i nedbrytningen av dicamba. "Dicamba-nedbrytende ferredoxiner" omfatter mutante ferredoxiner som har aminosyresekvensen til P. maltophilia-ferredoxinet hvor én eller flere aminosyrer er tilsatt, deletert eller substituert for aminosyrene i P. ma/fop/?///'a-ferredoxinsekvensen. Slike ferredoxiner omfatter

enzymatisk aktive fragmenter av ferredoxinet, så vel som ferredoxiner som har en gitt prosent homologi eller likhet til P. ma/fopM/a-ferredoxinsekvensen. Aktivitet til dicamba-nedbrytende ferredoxiner kan bestemmes som beskrevet i Eksempel 1 og 3.

"Dicamba-nedbrytende reduktase" er definert her til å bety reduktasene renset fra P. maltophilia- stamme DI-6 og reduktaser som har en aminosyresekvens som er minst ca. 65 % homolog (og fortrinnsvis identisk), og mer foretrukket minst ca. 75 % homolog (og fortrinnsvis identisk), og mer foretrukket minst ca. 85 % homolog (og fortrinnsvis identisk) og enda mer foretrukket minst ca. 95 % homolog (og fortrinnsvis identisk) til aminosyresekvensen til én av P. maltophilia- reduktasene og som kan delta i nedbrytningen av dicamba. "Dicamba-nedbrytende reduktaser" omfatter mutante reduktaser som har aminosyresekvensen til én av P. maltophilia-reduktasene hvor én eller flere aminosyrer er tilsatt, deletert eller substituert for aminosyrene i P. ma/fop/?///'a-reduktasesekvensen. Slike reduktaser omfatter enzymatisk aktive fragmenter av reduktasen, så vel som reduktaser som har en gitt prosent homologi eller likhet til P. ma/topM/a-reduktasesekvensen. Aktivitet til dicamba-nedbrytende reduktaser kan bestemmes som beskrevet i Eksempel 1 og 3.

Metoder for bestemmelse av graden av homologi til aminosyresekvenser er velkjent på området. For eksempel kan FASTA-programmet i Genetics Computing Group (GCG)-programvarepakken (Universitetet i Wisconsin, Madison, Wl) anvendes for å sammenligne sekvenser i forskjellige proteindatabaser så som Swiss Protein Database.

De dicamba-nedbrytende enzymene kan isoleres og renses som beskrevet i Eksempel 1 og 3 fra P. maltophilia eller andre organismer som bryter ned dicamba. Egnede andre organismer omfatter bakterier forskjellig fra P. maltophilia-stamme DI-6 som bryter ned dicamba. Mange stammer av slike bakterier er kjent og omfatter mange jordbakterier så vel som ferskvannsbakterier. Se f.eks. U.S. patent nr. 5.445.962; Krueger et al., J. Agric. Food Chem., 37, 534-538 (1989); Cork og Krueger, Adv. Appl. Microbiol., 38,1-66 (1991); Cork og Khalil, Adv. Appl. Microbiol., 40, 289-320 (1995). Dicamba-nedbrytende bakterier (dvs. bakterier som anvender dicamba som eneste karbonkilde) er funnet i mange slekter av bakterier omfattende, men ikke begrenset til, Pseudomonas, Sphingomonas, Aeromonas, Xanthomonas, Alcaligenes og Moraxella. Som disse stammene kan andre dicamba-nedbrytende bakteriestammer isoleres ved metoder velkjent på området.

Fortrinnsvis blir imidlertid de dicamba-nedbrytende enzymene fremstilt ved anvendelse av rekombinante DNA-teknikker (se nedenfor). Spesielt blir mutante enzymer som har aminosyresekvensen til P. maltophilia- enzymet hvor én eller flere aminosyrer er tilsatt, deletert eller substituert for aminosyrene i P. maltophilia-sekvensen fremstilt på denne måten ved anvendelse av for eksempel oligonukleotid-dirigert mutagenese, linker-scanning mutagenese, mutagenese ved anvendelse av polymerasekjedereaksjon og lignende. Se Ausubel et al. (red.), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience 1990) og McPherson (red.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991).

Isolerte DNA-molekyler som koder for dicamba-nedbrytende enzymer er tilveiebrakt. "Isolert" blir anvendt her for DNA-molekylet som er fjernet fra dets naturlige miljø eller er ikke et naturlig forekommende DNA-molekyl. Metoder for fremstilling av disse DNA-molekylene er velkjent på området. Se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY

(1989).

For eksempel kan DNA-molekylene være isolert cDNA eller genomiske kloner og kan også omfatte RNA-molekyler. Identifikasjonen og isoleringen av kloner som koder for de dicamba-nedbrytende enzymene av P. maltophilia- stamme DI-6 er beskrevet i Eksemplene 2 og 4-5. Ytterligere kloner som koder for dicamba-nedbrytende enzymer kan oppnås på lignende måte. De isolerte klonene eller deler av dem kan anvendes som prober for å identifisere og isolere ytterligere kloner fra organismer forskjellig fra de som klonene opprinnelig ble isolert fra. Egnede organismer omfatter bakterier som bryter ned dicamba. Som angitt ovenfor er mange stammer av bakterier, i tillegg til P. maltophilia- stamme DI-6, kjent som bryter ned dicamba. Se U.S. patent nr. 5.445.962; Krueger et al., J. Agric. Food Chem., 37, 534-538 (1989); Cork og Krueger, Adv. Appl. Microbiol., 38, 1-66 (1991); Cork og Khalil, Adv. Appl. Microbiol., 40, 289-320 (1995).

DNA-molekylene kan også bli kjemisk syntetisert ved anvendelse av sekvensene til isolerte kloner. Slike teknikker er velkjent på området. For eksempel kan DNA-sekvenser syntetiseres ved fosfoamidittkjemi i en automatisert DNA-syntesemaskin. Kjemisk syntese har flere fordeler. Spesielt er kjemisk syntese ønskelig, fordi kodoner foretrukket av verten hvor DNA-sekvensen vil bli uttrykt kan anvendes til å optimalisere ekspresjon. Ikke alle kodonene trenger å bli endret for å oppnå forbedret ekspresjon, men fortrinnsvis blir minst kodonene sjelden anvendt i verten endret til vertsforetrukne kodoner. Høye ekspresjonsnivåer kan oppnås ved å endre mer enn ca. 50 %, mest foretrukket minst ca. 80 %, av kodonene til vertsforetrukne kodoner. Kodonpreferansene til mange vertsceller er kjent. Se f.eks. Maximizing Gene Expression, side 225-85 (Reznikoff & Gold, red., 1986), PCT WO 97/31115, PCT WO 97/11086, EP 646643, EP 553494 og U.S. patent nr. 5.689.052, 5.567.862, 5.567.600, 5.552.299 og 5.017.692. Kodonpreferansene til andre vertsceller kan utledes ved metoder kjent på området. Også, ved anvendelse av kjemisk syntese, kan sekvensen til DNA-molekylet eller dets kodede protein lett forandres for f.eks. å optimalisere ekspresjon (f.eks. eliminere mRNA-sekundære strukturer som interfererer med transkripsjon eller translasjon), legge til unike restriksjonsseter ved hensiktsmessige punkter, fjerne proteasekutteseter, etc.

Ved oppfinnelsen tilveiebringes også DNA-konstruksjoner omfattende DNA som koder for et dicamba-nedbrytende enzym funksjonelt koblet til ekspresjonskontrollsekvenser eller en rekke DNA-kodende sekvenser, der hver koder for et dicamba-nedbrytende enzym og hver er funksjonelt koblet til ekspresjonskontrollsekvenser. "DNA-konstruksjoner" er definert her til å være konstruerte (ikke-naturlig forekommende) DNA-molekyler som er anvendelige for å innføre DNA i vertsceller, og betegnelsen omfatter kimæriske gener, ekspresjonskassetter og vektorer.

Som anvendt her, angir "funksjonelt koblet" bindingen av DNA-sekvenser (omfattende rekkefølgen av sekvensene, orienteringen av sekvensene og den relative avstanden mellom de forskjellige sekvensene) på en slik måte at de kodede proteinene blir uttrykt. Metoder for å funksjonelt koble ekspresjonskontrollsekvenser til kodende sekvenser er velkjent på området. Se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989).

"Ekspresjonskontrollsekvenser" er DNA-sekvenser involvert på hvilken som helst måte i kontroll av transkripsjon eller translasjon i prokaryoter og eukaryoter. Egnede ekspresjonskontrollsekvenser og metoder for å fremstille og anvende dem er velkjent på området.

Ekspresjonskontrollsekvensene må omfatte en promoter. Promoteren kan være hvilken som helst DNA-sekvens som viser transkripsjonen aktivitet i den valgte vertscellen eller organismen. Promoteren kan være induserbar eller konstitutiv. Den kan være naturlig forekommende, kan være sammensatt av deler av forskjellige naturlig forekommende promotere eller kan være delvis eller helt syntetisk. Veiledning for utforming av promotere er gitt ved studier av promoterstruktur, så som den til Harley og Reynolds, Nucleic Acids Res., 15, 2343-61 (1987). Også lokasjonen av promoteren i forhold til transkripsjonsstart kan optimaliseres. Se f.eks. Roberts, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76, 760-4

(1979). Mange egnede promotere for anvendelse i prokaryoter og eukaryoter er velkjent på området.

For eksempel omfatter egnede konstitutive promotere for anvendelse i planter: promoterne fra plantevirus, så som 35S-promoteren fra blomkålmosaikkvirus (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985), fullengde transkript-promoteren med dupliserte enhancerdomener fra peanøtt klorotisk strek caulimovirus (Maiti og Shepherd, BBRC 244:440-444 (1998)), promotere til Chlorella-virus metyltransferasegener (U.S. patent nr. 5.563.328) og fullengde transkript-promoteren fra brunrotmosaikkvirus (U.S. patent nr. 5.378.619); promoterne fra slike gener som risaktin (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990)), ubikitin (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989) og Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)), pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588

(1991)), MAS (Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)), mais H3-histon (Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231:276-285 (1992) og Atanassova et al., Plant Journal 2(3):291-300 (1992)), Brassica napus ALS3 (PCT-søknad WO 97/41228); og promotere til forskjellige Agrobacterium- gener (se U.S. patent nr. 4.771.002, 5.102.796, 5.182.200, 5.428.147).

Egnede induserbare promotere for anvendelse i planter omfatter: promoteren fra ACE1-systemet som responderer til kobber (Mett et al. PNAS 90:4567-4571

(1993)); promoteren til mais In2-genet som responderer til benzensulfonamid som er et herbicidbeskyttende stoff (Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237

(1991) og Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994)) og promoteren til Tet-repressoren fra Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237 (1991). En spesielt foretrukket induserbar promoter for anvendelse i planter er én som responderer til et induserende middel som planter normalt ikke responderer til. Et eksempel på induserbar promoter av denne typen er den induserbare promoteren fra et steroidhormongen, der den transkripsjonene aktiviteten til dette blir indusert av et glukokortikosteroidhormon. Schena et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:10421 (1991). Andre induserbare promotere for anvendelse i planter er beskrevet i EP 332104, PCT WO 93/21334 og PCT WO 97/06269.

Egnede promotere for anvendelse i bakterier omfatter promoteren til Bacillus stearothermophilus maltogenisk amylasegen, Bacillus licheniformis alfa-amylasegen, Bacillus amyloliquefaciens BAN-amylasegen, Bacillus subtilis alkalisk proteasegen, Bacillus pumilus xylosidasegen, fag lambda PR- og PL-promoterne og Escherichia coli lac-, trp- og fac-promoterne. Se PCT WO 96/23898 og PCT WO 97/42320.

Egnede promotere for anvendelse i gjærvertsceller omfatter promotere fra gjærglykolytiske gener, promotere fra alkohol dehydrogenase-gener, TPI1-promoteren og<y>ADH2-4c-promoteren. Se PCT WO 96/23898.

Egnede promotere for anvendelse i filamentøse sopper omfatter ADH3-promoteren, fp/<y>A-promoteren, promoterne til genene som koder for Aspergillus oryzae TAKA-amylase, Rhizomucor miehei asparaginsyre proteinase, Aspergillus niger nøytral alfa-amylase, A. niger syrestabil alfa-amylase, A. niger eller Aspergillus awamori glukoamylase, R. miehei lipase, A. oryzae alkalisk protease, A. oryzae triosefosfatisomerase og Aspergillus nidulans acetamidase. Se PCT WO 96/23898.

Egnede promotere for anvendelse hos pattedyrceller er SV40-promoteren, metallotioneingenpromoter, murin brysttumorviruspromoter, Rous sarkom viruspromoter og adenovirus 2 hoved sen promoter. Se PCT WO 96/23898 og PCT WO 97/42320.

Egnede promotere for anvendelse i insektceller omfatter polyhedrinpromoter, P10-promoter, Autographa californica polyhedrosevirus basisk proteinpromoter, baculovirus umiddelbar tidlig gen 1-promoter og baculovirus 39K forsinket-tidlig genpromoter. Se PCT WO 96/23898.

Til slutt kan promotere sammensatt av deler av andre promotere og delvis eller fullstendig syntetiske promotere anvendes. Se f.eks. Ni et al., Plant J., 7:661-676

(1995) og PCT WO 95/14098 som beskriver slike promotere for anvendelse i planter.

Promoteren kan omfatte, eller bli modifisert til å omfatte, ett eller flere enhancerelementer. Fortrinnsvis vil promoteren omfatte en rekke enhancerelementer. Promotere inneholdende enhancerelementer sørger for høyere nivåer av transkripsjon sammenlignet med promotere som ikke omfatter dem. Egnede enhancerelementer for anvendelse i planter omfatter 35S-enhancerelementet fra blomkålmosaikkvirus (U.S. patent nr. 5.106.739 og 5.164.316) og enhancerelementet fra brunrotmosaikkvirus (Maiti et al., Transgenic Res., 6, 143-156 (1997)). Andre egnede enhancere for anvendelse i andre celler er kjent. Se PCT WO 96/23898 og "Enhancers And Eukaryotic Expression" (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1983).

For effektiv ekspresjon blir de kodende sekvensene fortrinnsvis også funksjonelt koblet til en 3' utranslatert sekvens. Den 3' utranslaterte sekvensen inneholder transkripsjons- og/eller translasjonstermineringssekvenser. De 3' utranslaterte regionene kan oppnås fra de flankerende regionene av gener fra bakterie-, plante-eller andre eukaryote celler. For anvendelse i prokaryoter, vil den 3' utranslaterte regionen omfatte en transkripsjonstermineringssekvens. For anvendelse i planter og andre eukaryoter, vil den 3' utranslaterte regionen omfatte en transkripsjonstermineringssekvens og en polyadenyleringssekvens. Egnede 3' utranslaterte sekvenser for anvendelse i planter omfatter de til blomkålmosaikkvirus 35S-genet, faseolinfrø lagringsproteingenet, ert ribulose bifosfat karboksylase liten subenhet E9-genet, soyabønne 7S-lagringsproteingenene, oktopin syntase-genet og nopalin syntase-genet.

I planter og andre eukaryoter blir også en 5' utranslatert sekvens anvendt. Den 5' utranslaterte sekvensen er delen av et mRNA som strekker seg fra 5' CAP-setet til translasjonsstartkodonet. Denne regionen av mRNA'et er nødvendig for translasjonsstart i eukaryoter og spiller en rolle i regulering av genekspresjon. Egnede 5' utranslaterte regioner for anvendelse i planter omfatter de til alfalfa mosaikkvirus, agurkmosaikkvirus-kappeproteingen og tobakksmosaikkvirus.

Som angitt ovenfor kan DNA-konstruksjonen være en vektor. Vektoren kan inneholde ett eller flere replikasjonssystemer som tillater den å replikere i vertsceller. Selvreplikerende vektorer omfatter plasmider, kosmider og virale vektorer. Alternativt kan vektoren være en integrerende vektor som tillater integreringen i vertscellens kromosom av sekvensene som koder for de dicamba-nedbrytende enzymene ifølge foreliggende oppfinnelse. Vektoren har ønskelig også unike restriksjonsseter for insersjon av DNA-sekvenser. Hvis en vektor ikke har unike restriksjonsseter, kan den modifiseres for å innføre eller eliminere restriksjonsseter for å gjøre den mer egnet for videre manipulasjoner.

DNA-konstruksjonene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes til å transformere en rekke vertsceller (se nedenfor). En genetisk markør må anvendes for seleksjon av transformerte vertsceller ("en seleksjonsmarkør"). Seleksjonsmarkører tillater normalt transformerte celler å bli gjenvunnet ved negativ seleksjon (dvs. hemme vekst av celler som ikke inneholder seleksjonsmarkøren) eller ved å screene for et produkt kodet for av seleksjonsmarkøren.

Det vanligste anvendte selekterbare markørgenet for plantetransformasjon er neomycin fosfotransferase II (npf//)-genet, isolert fra Tn5, som, når det er plassert under kontroll av planteregulatoriske signaler, overbringer resistens til kanamycin. Fraley et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:4803 (1983). Et annet mye anvendt selekterbart markørgen er hygromycin fosfotransferase-genet som overbringer resistens til antibiotikumet hygromycin. Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol., 5:299

(1985).

Ytterligere selekterbare markørgener av bakteriell opprinnelse som overbringer resistens til antibiotika omfatter gentamycin acetyl transferase, streptomycin fosfotransferase, aminoglykosid-3'-adenyl transferase og

bleomycinresistensdeterminanten. Hayford et al., Plant Physiol. 86:1216 (1988), Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86 (1987), Svab et al., Plant Mol. Biol. 14:197

(1990), Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171 (1986). Andre selekterbare markørgener overbringer resistens til herbicider så som glyfosat, glufosinat eller bromoksynil. Comai et al., Nature 317:741-744 (1985), Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990) og Stalkeret al., Science 242:419-423 (1988).

Andre selekterbare markørgener for plantetransformasjon er ikke av bakteriell opprinnelse. Disse genene omfatter for eksempel musedihydrofolat reduktase, plante 5-eno/pyruvylshikimat-3-fosfat syntase og planteacetolaktat syntase. Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 (1987), Shah et al., Science 233:478 (1986), Charest et al., Plant Cell Rep. 8:643 (1990).

Vanlig anvendte gener for screening av antatt transformerte celler omfatter (3-glukuronidase (GUS), (3-galaktosidase, luciferase og kloramfenikol acetyltransferase. Jefferson, R. A., Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 (1987)., Teeri et al., EMBO J. 8:343 (1989), Koncz et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:131 (1987), De Block et al., EMBO J. 3:1681 (1984), grønt fluorescerende protein (GFP) (Chalfie et al., Science 263:802 (1994), Haseloff et al., TIG 11:328-329 (1995) og PCT-søknad WO 97/41228). En annen tilnærming for identifikasjon av relativt sjeldne transformasjonshendelser er anvendelse av et gen som koder for en dominant konstitutiv regulator av Zea mays anthocyanin pigmenteringssyntese. Ludwig et al., Science 247:449 (1990).

Egnede seleksjonsmarkører for anvendelse i prokaryoter og eukaryoter forskjellig fra planter er også velkjent. Se f.eks. PCT WO 96/23898 og PCT WO 97/42320. For eksempel kan resistens til antibiotika (ampicillin, kanamycin, tetracylin, kloramfenikol, neomycin eller hygromycin) anvendes som seleksjonsmarkør.

I henhold til et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse kan toleranse til dicamba anvendes som en seleksjonsmarkør for planter og planteceller. "Toleranse" betyr at transformerte planteceller kan vokse (overleve og regenerere til planter) når de blir plassert i dyrkningsmedium inneholdende et nivå av dicamba som forhindrer utransformerte celler fra å gjøre det. "Toleranse" betyr også at transformerte planter kan vokse etter tilsetning av en mengde av dicamba som hemmer veksten av utransformerte planter.

Metoder for seleksjon av transformerte planteceller er velkjent på området. Kort fortalt blir minst noen av plantecellene i en populasjon av planteceller (f.eks. et eksplantat eller en embryosuspensjonskultur) transformert med en DNA-konstruksjon eller kombinasjon av DNA-konstruksjoner som sørger for dicamba-nedbrytning. Den resulterende populasjonen av planteceller blir plassert i dyrkningsmedium inneholdende dicamba i en konsentrasjon valgt slik at transformerte planteceller vil vokse, mens utransformerte planteceller ikke vil vokse. Egnede konsentrasjoner av dicamba kan bestemmes empirisk som kjent på området.

Metoder for seleksjon av transformerte planter er også kjent på området. Kort fortalt blir dicamba satt til en populasjon av planter mistenkt for å omfatte en DNA-konstruksjon eller en kombinasjon av DNA-konstruksjoner som sørger for dicamba-nedbrytning. Mengden av dicamba er valgt slik at transformerte planter vil vokse og veksten av utransformerte planter vil bli hemmet. Nivået av hemning må være tilstrekkelig, slik at det lett kan bli sett forskjell på transformerte og utransformerte planter (dvs. hemning må være statistisk signifikant). Slike mengder kan bestemmes empirisk som kjent på området.

Videre kan dannelsen av 3,6-DCSA som et resultat av nedbrytningen av dicamba anvendes for seleksjon og screening. Dannelse av 3,6-DCSA kan lett bestemmes ved å observere fluorescensen av denne forbindelsen, hvilket tillater seleksjon og screening av transformerte vertsceller, intakte organismer og deler av organismer (f.eks. mikroorganismer, planter, plantedeler og planteceller). I dette henseendet tillater oppfinnelsen seleksjon og screening av transformerte vertsceller, intakte organismer og deler av organismer på samme måte som for grønt fluorescerende protein (GFP). Se U.S. patent nr. 5.162.227 og 5.491.084 og PCT-søknadene WO 96/27675, WO 97/11094, WO 97/41228 og WO 97/42320. Spesielt kan 3,6-DCSA detekteres i transformerte vertsceller, intakte organismer og deler av organismer ved anvendelse av konvensjonelle spektrofotometriske metoder. For eksempel kan mikroskoper være utstyrt med passende filterkombinasjoner for fluorescenseksitasjon og -deteksjon. En håndholdt lampe kan anvendes for laboratoriearbeid eller feltarbeid (se Eksempel 1). Fluorescensaktivert cellesortering kan også anvendes. 3,6-DCSA blir eksitert ved en bølgelengde på 312-313 nm, med en maksimum emisjonsbølgelengde på 424 nm.

"Deler" av organismer omfatter organer, vev eller hvilken som helst annen del. "Plantedeler" omfatter frø, pollen, embryoer, blomster, frukter, skudd, blader, røtter, stammer, eksplantater, etc.

Seleksjon basert på dicamba-toleranse eller dicamba-nedbrytning kan anvendes ved fremstilling av dicamba-tolerante planter eller dicamba-nedbrytende mikroorganismer, der anvendelse av en annen seleksjonsmarkør ikke trenger å være nødvendig. Seleksjon basert på dicamba-toleranse eller dicamba-nedbrytning kan også anvendes ved fremstilling av transgene celler eller organismer som uttrykker andre gener av interesse. Mange slike gener er kjent og omfatter gener som koder for proteiner av kommersiell verdi og gener som overbringer forbedrede agronomiske egenskaper til planter (se f.eks. PCT WO 97/41228).

DNA-konstruksjonene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes til å transformere en rekke vertsceller, omfattende prokaryoter og eukaryoter. DNA- sekvensene som koder for det dicamba-nedbrytende enzymet(ene) og seleksjonsmarkøren, hvis en separat seleksjonsmarkør blir anvendt, kan være på samme eller forskjellige DNA-konstruksjoner. Fortrinnsvis er de arrangert på en enkel DNA-konstruksjon som en transkripsjonsenhet, slik at alle de kodende sekvensene blir uttrykt sammen. Også genet/genene av interesse og DNA-sekvensen(e) som koder for det/de dicamba-nedbrytende enzymet/enzymene, når dicamba-toleranse eller dicamba-nedbrytning blir anvendt som en seleksjonsmarkør, kan være på samme eller forskjellige DNA-konstruksjoner. Slike konstruksjoner blir fremstilt på samme måte som beskrevet ovenfor.

Egnede vertsceller omfatter prokaryote og eukaryote mikroorganismer (f.eks. bakterier (omfattende Agrobacterium tumefaciens og Escherichia colf), gjær (omfattende Saccharomyces cerevisiae) og andre sopper (omfattende Aspergillus sp.), planteceller, insektceller og pattedyrceller. Fortrinnsvis er vertscellen én som normalt ikke bryter ned dicamba. Imidlertid kan foreliggende oppfinnelse også anvendes for å øke nivået av dicamba-nedbrytning i vertsceller som normalt bryter ned dicamba.

Således omfatter de "transgene" cellene og organismene ifølge foreliggende oppfinnelse celler og organismer som normalt ikke bryter ned dicamba, men som har blitt transformert ifølge oppfinnelsen slik at de kan bryte ned dette herbicidet. De "transgene" cellene og organismene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også celler og organismer som normalt bryter ned dicamba, men som har blitt transformert ifølge oppfinnelsen slik at de kan bryte ned mer av dette herbicidet eller å bryte ned herbicidet mer effektivt.

Metoder for å transformere prokaryote og eukaryote vertsceller er velkjent på området. Se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); PCT WO 96/23898 og PCT WO 97/42320.

For eksempel er en rekke metoder for plantetransformasjon utviklet, omfattende biologiske og fysiske transformasjonsprotokoller. Se for eksempel Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" i: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. og Thompson, J. E. red. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) s. 67-88.1 tillegg er vektorer og in wfro-kulturmetoder for plantecelle- eller vevstransformasjon og regenerering av planter tilgjengelig. Se for eksempel Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" i: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. og Thompson, J. E. red. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) s. 89-119. Eksempel 6 tilveiebringer et spesifikt eksempel på transformasjon av planter ifølge foreliggende oppfinnelse.

Den mest anvendte metoden for innføring av en ekspresjonsvektor i planter er basert på det naturlige transformasjonssystemet til Agrobacterium. Se for eksempel Horsch et al., Science 227:1229 (1985). A. tumefaciens og A. rhizogenes er plantepatogene jordbakterier som transformerer planteceller genetisk. Ti- og Ri-plasmidene til henholdsvis A. tumefaciens og A. rhizogenes bærer gener ansvarlig for genetisk transformasjon av planten. Se for eksempel Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sei. 10:1 (1991). Beskrivelser av Agrobacterium-vektorsystemer og metoder for Agrobacterium- mediert genoverføring er gitt av en rekke referanser, omfattende Gruber et al., supra, Miki et al., supra, Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989) og U.S. patent nr. 4.940.838 og 5.464.763.

En generell anvendelig metode for plantetransformasjon er mikroprosjektil-mediert transformasjon hvor DNA blir båret på overflaten av mikroprosjektiler. Ekspresjonsvektoren blir innført i plantevev med en biolistisk anordning som akselererer mikroprosjektilene til hastigheter tilstrekkelig for å penetrere plantecellevegger og membraner. Sanford et al., Part. Sei. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J. C, Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C, Physiol. Plant 79:206

(1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992).

En annen metode for fysisk levering av DNA til planter er ultralydbehandling av

målceller. Zhang et al., Bio/Technology 9:996 (1991). Alternativt har liposom- eller sferoplastfusjon blitt anvendt for å innføre ekspresjonsvektorer i planter. Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985), Christou et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:3962

(1987). Direkte opptak av DNA i protoplaster ved anvendelse av CaCI2-utfelling, polyvinylalkohol eller poly-L-ornitin er også angitt. Hain et al., Mol. Gen. Genet.

199:161 (1985) og Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982). Elektroporering av protoplaster og hele celler og vev er også beskrevet. Donn et al., i: Abstracts of Vllth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, s. 53

(1990) ; D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992) og Spencer et al., Plant

Mol. Biol. 24:51-61 (1994).

Transgene dicamba-tolerante planter av hvilken som helst type kan fremstilles ifølge oppfinnelsen. Spesielt kan bredbladete planter (omfattende bønner, soyabønner, bomull, erter, poteter, solsikker, tomater, tobakk, frukttrær og prydplanter og trær) som for tiden er kjent for å bli skadet av dicamba transformeres slik at de blir tolerante til herbicidet. Andre planter (så som mais, durra, korn, sukkerrør, asparges og gress) som for tiden er betraktet tolerant til dicamba kan transformeres for å øke deres toleranse til herbicidet. Spesifikt kan hvilken som helst tofrøbladet eller enfrøbladet plante transformeres med DNA-konstruksjonene ifølge foreliggende oppfinnelse. "Tolerant" betyr at de transformerte plantene kan vokse i nærvær av en mengde av dicamba som hemmer veksten av utransformerte planter.

Det er forventet at de dicamba-nedbrytende oksygenasene kan fungere med endogene reduktaser og ferredoxiner funnet i transgene vertsceller og organismer for å bryte ned dicamba. Plantekloroplaster er spesielt rike i reduktaser og ferredoxiner. Følgelig er det foretrukket for fremstilling av transgene dicamba-tolerante planter å anvende en sekvens som koder for et peptid (f.eks. et transit-peptid) som vil lede den dicamba-nedbrytende oksygenasen inn i kloroplaster ("en kloroplastmålsøkende sekvens"). DNA som koder for den kloroplastmålsøkende sekvensen er fortrinnsvis plassert oppstrøms (5') for sekvensen som koder for den dicamba-nedbrytende oksygenasen, men kan også være plassert nedstrøms (3') for den kodende sekvensen eller både oppstrøms og nedstrøms for den kodende sekvensen. Hvilken som helst egnet kloroplastmålsøkende sekvens kan anvendes. Eksempler på kloroplastmålsøkende sekvenser omfatter mais cab-m7 signalsekvensen (se Becker et al., Plant Mol. Biol. 20:49 (1992) og PCT WO 97/41228), ertglutation reduktase-signalsekvensen (Creissen et al., Plant J. 2:129

(1991) og PCT WO 97/41228) og ert ribulose 1,5-bisfosfat karboksylase liten subenhet-signalsekvensen (nukleinsyresekvens representert ved SEKV ID NR: 19)

(Fluhr et. al., EMBO J. 5, 2063-2071, (1986)). En alternativ foretrukket måte er den direkte transformasjonen av kloroplaster ved anvendelse av en konstruksjon omfattende en promoter funksjonell i kloroplaster for å oppnå ekspresjon av oksygenasen i kloroplaster. Se f.eks. PCT-søknad WO 95/24492 og U.S. patent nr. 5.545.818. Selvfølgelig, hvis en valgt transgen vertscelle eller organisme ikke produserer tilstrekkelig endogen reduktase, ferredoxin eller begge deler, kan vertscellen eller organismen transformeres slik at den produserer ett av eller begge disse enzymene så vel som oksygenasen.

I et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å kontrollere ugress i en åker hvor transgene dicamba-tolerante planter vokser. Fremgangsmåten omfatter å tilføre en effektiv mengde av dicamba til åkeren for å kontrollere ugresset. Metoder for å tilføre dicamba og mengder av dicamba som er effektive for å kontrollere forskjellige typer av ugress er kjent. Se Crop Protection Reference, side 1803-1821 (Chemical & Pharmaceutical Press, Inc., New York, NY, 11.utg., 1995).

I et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bryte ned dicamba til stede i et materiale, så som f.eks. jord, vann eller avfallsprodukter fra en dicamba-fabrikk. Slik nedbrytning kan gjennomføres ved anvendelse av de dicamba-nedbrytende enzymene. Enzymene kan renses fra mikroorganismer som naturlig uttrykker dem (se Eksempel 1 og 3) eller kan renses fra transgene vertsceller som produserer dem. Hvis enzymene blir anvendt i slike metoder, må også passende kofaktorer bli tilveiebrakt (se Eksempel 1). Effektive mengder kan bestemmes empirisk som kjent på området (se Eksempel 1). Alternativt kan transgene prokaryote og eukaryote mikroorganismer anvendes for å bryte ned dicamba i slike materialer. Transgene prokaryote og eukaryote mikroorganismer kan produseres som beskrevet ovenfor, og effektive mengder kan bestemmes empirisk som kjent på området.

Dicamba blir innført i miljøet i store mengder på kontinuerlig basis. Elimineringen av dicamba er i stor grad avhengig av virkningen av enzymsystemer som er funnet i mikroorganismer som holder til i jorden og vannet til planten. En forståelse av disse enzymsystemene, omfattende dicamba-nedbrytende O-demetylaser og deres tre komponenter, er viktig i anstrengelser for å utnytte naturlig og genetisk modifiserte mikrober for bioremediering og gjenopprettelsen av forurenset jord, vann og andre materialer. Således kan de dicamba-nedbrytende enzymene, DNA-molekylene, DNA-konstruksjonene, etc. anvendes som forskningsverktøy for studie av dicamba-nedbrytning og bioremediering.

Til slutt kan de dicamba-nedbrytende enzymene anvendes i en test for dicamba. En prøve mistenkt for å inneholde dicamba blir blandet med en dicamba-nedbrytende O-demetylase eller en kombinasjon av en dicamba-nedbrytende oksygenase, et dicamba-nedbrytende ferredoxin og en dicamba-nedbrytende reduktase. Egnede tester er beskrevet i Eksempel 1 og 3. Spesielt er detektering eller kvantifisering av fluorescensen som skyldes dannelse av 3,6-DCSA en hensiktsmessig test.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1: Rensing og karakterisering av komponentene av dicamba O-demetylase fra Pseudomonas maltophilia DI-6

METODER OG MATERIALER:

Bakterie og vekstbetingelser. Pseudomonas maltophilia, stamme DI-6 (Kreuger, et al., (1989) J. Agric. Food Chem., 37:534-538) ble isolert fra et jordområde vedvarende forurenset med dicamba. Bakterien ble gitt av Dr. Douglas Cork fra Illinois Institutt for teknologi (Chicago, IL) og ble dyrket på redusert kloridmedium (Kreuger, J.P., (1989) doktorgradsavhandling, Illinois Institutt for teknologi, Chicago, IL), supplert med enten dicamba (2 mg/ml) eller en blanding av glukose (2 mg/ml) og casaminosyrer (2 mg/ml). Karbonkildene ble filtersterilisert og satt til mediet etter at det var autoklavert. Fast media ble fremstilt ved tilsetning av 1 %

(vekt/vol) Gelrite (Scott Laboratories, West Warwick, R.I.).

Kjemikalier og reagenser. Dicamba, 3,6-DCSA og[14C]dicamba (U-fenyl-14C, 42,4 mCi/mmol, radiokjemisk renhet større enn 98 %) ble levert av Sandoz Agro, Inc. (Des Plaines, IL). For å øke løselighet, ble dicamba- og 3,6-DCSA- lagerløsningene fremstilt ved titrering med KOH til pH 7,0. Alle kjemikalier ble anskaffet fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), hvis ikke annet er angitt. Superose 12, Mono Q, Q-sefarose (Fast Flow) og fenyl-sefarose (CL-4B) kolonnepakker for FPLC ("fast performance" væskekromatografi) apparat ble skaffet til veie fra Pharmacia (Milwaukee, Wl). Amfolytt pH 4-6 og amfolytt pH 4-9 ble anskaffet fra Serva (Heidelberg, FRG). Akrylamid, (3-merkaptoetanol, N,N,N',N'-tetrametyletylendiamin (TEMED) og ammoniumpersulfat (APS) var fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Tynnsjiktskromatografi (TLC)-plater var silikagel (250 um tykkelse) med UV 254-indikator og ble anskaffet fra J. T. Baker Chemical Co. (Phillipsburg, NJ).

Enzymtester. Dicamba O-demetylaseaktivitet ble undersøkt ved å måle dannelsen av[14C]3,6-DCSA fra [<14>C]dicamba. Kort fortalt ble aktiviteten i blandinger av enzymkomponenter målt ved 30°C i en standard 300 ul reaksjonsblanding inneholdende 25 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0), 10 mM MgCI2, 0,5 mM NADH (beta-nikotinamid adenindinukleotid, redusert form), 0,5 mM jern(ll) sulfat, 50 uM kald dicamba, 2,5 uM [<14>C] dicamba (den endelige spesifikke aktiviteten til radioaktiv dicamba var 1,9 mCi/mmol) og forskjellige mengder av cellelysat eller delvis renset enzym. Alle enzymtester i løpet av det endelige rensingstrinnet ble utført i fosfatbuffer, fordi pH-optimum for dicamba O-demetylaseaktivitet ble funnet å være i midtområdet av fosfatbuffere, og høyere enzymaktivitet ble observert med fosfatbuffer sammenlignet med Tris-HCI [tris(hydroksymetyl)aminometanhydroklorid] buffer ved pH 7,0. Reaksjoner ble initiert ved tilsetning av substratet, dicamba. Ved spesifikke tidspunkter ble reaksjonene stanset ved tilsetning av 50 ul av 5 % (vol/vol) H2SO4. Dicamba og dicamba-metabolitter ble deretter ekstrahert to ganger med ett volum eter, og ekstraktene ble inndampet til tørrhet. Effektivitetene av gjenvinning (gjennomsnitt + standardavvik) for ekstraksjonsprosedyren var 87 % + 2 % for dicamba og 85 % + 3 % for 3,6-DCSA (Yang et al., Anal. Biochem. 219:37-42 (1994)).

[<14>C]dicamba og<14>C-merkede metabolitter ble separert ved tynnsjiktskromatografi (TLC). Eter-ekstrahert dicamba og dens metabolitter ble gjenoppløst i 50 ul eter før overføring til en TLC-plate. Løsningsmiddelsystemet for kjøring av TLC var kloroform-etanol-eddiksyre (85:10:5 [vol/vol/vol]). De atskilte reaksjonsproduktene

ble visualisert og kvantifisert ved å eksponere TLC-platen til en fosforskjerm i 24 timer og deretter scanne skjermen i en Phosphorlmager SF (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Estimater av radioaktivitetmengden i et spesielt område på TLC-platen ble bestemt ved å sammenligne det totale pikselantallet i det området i forhold til et område på den samme platen inneholdende en kjent mengde av [<14>C]dicamba. Én aktivitetsenhet ble definert som enzymmengden som katalyserer dannelsen av 1 nmol 3,6-DCSA fra dicamba pr. minutt ved 30°C. Spesifikke aktiviteter ble basert på den totale proteinkonsentrasjonen av testblandingen.

Aktiviteten til reduktasekomponenten av dicamba-demetylase ble undersøkt ved å måle reduksjon av 2,6-diklorfenolindofenol (DCIP) med et Hitachi U-2000-spektrofotometer. Reaksjonen inneholdt 0,5 mM NADH, 0,2 mM FAD (flavinadenindinukleotid), 50 uM DCIP, 20 mM Tris-buffer (pH 8,0) og 10-100 ul enzymprøve i et totalt volum på 1 ml. Forandringen i absorbans ved 600 nm med tid ble målt ved romtemperatur. Spesifikk aktivitet ble beregnet ved anvendelse av en ekstinksjonskoeffisient ved 600 nm av 21,0 mM"<1>cm"<1>for redusert DCIP. Spesifikk aktivitet ble uttrykt som nmol DCIP redusert min"<1>mg"<1>av protein.

I tillegg ble en in situ DCIP-test anvendt for å detektere og lokalisere reduktaseaktiviteten i proteinfremstillinger separert på isoelektrisk fokuserende (IEF) geler. Etter elektroforese av proteinene på en IEF-gel, ble spor skåret ut av gelen vasket med 20 ml kald 20 mM Tris-HCI-buffer (pH 8,0). Lavtsmeltende agarose ble oppløst ved oppvarming i 10 ml 20 mM Tris-HCI-buffer (pH 8,0) i en endelig konsentrasjon på 1,5 % (vekt/vol). Når agarosen avkjølte til nær romtemperatur, ble den supplert med 0,2 mM FAD, 50 uM DCIP og 0,5 mM NADH. Testblandingen ble helt over på en glassplate og fikk stivne. Gelbiten ble plassert på toppen av den stivnede reaksjonsblandingen og fikk feste seg ved romtemperatur i 15 minutter. Hvis gelbiten inneholdt et protein med reduktaseaktivitet, ble et fargeløst bånd av redusert DCIP dannet i den blå bakgrunnen av DCIP.

Cellelysater. Celler ble dyrket til en optisk densitet ved 550 nm av 1,3 til 1,5 i væskeredusert kloridmedium inneholdende en blanding av glukose og casaminosyrer på en rotasjonsrister (250 rpm ved 30°C). Cellene ble høstet ved sentrifugering, vasket to ganger med kald 100 mM MgCI2og sentrifugert igjen. Cellepastaer ble enten anvendt umiddelbart eller raskt frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80°C. Ved tidspunktet for enzymrensing ble 25 g nedfryste celler tint og resuspendert i 50 ml isoleringsbuffer inneholdende 25 mM Tris-buffer (pH 7,0), 10 mM MgCI2og 0,5 mM EDTA. Fenylmetylsulfonylfluorid og ditiotreitol ble satt til endelige konsentrasjoner på henholdsvis 0,5 mM og 1 mM. Etter tilsetning av 10 mg lysozym og 1 mg DNase ble celler omrørt i 10 min på is og sprengt ved ultralydbehandling (modell XL2020-sonikator; Heat Systems) på is ved en medium innstilling (innstilling 5) med tolv 20-sekunders pulser og 40-sekunders hvileintervaller. De resulterende cellelysatene ble fortynnet til 90 ml med isoleringsbuffer og sentrifugert ved 76.000 x g i 1 time ved 4°C. Supernatanten ble anvendt som kilden for renset cellelysat.

Enzymrensing. Alle prosedyrer ble utført ved 4°C, hvis ikke annet er angitt. Fast ammoniumsulfat ble langsomt satt til et 90-ml volum av renset cellelysat til 40 %

(vekt/vol) metning, med konstant omrøring. Etter 15 minutters omrøring ble blandingene sentrifugert ved 15.400 x g i 15 minutter og utfellingen ble kastet. Ytterligere fast ammoniumsulfat ble satt til 70 % (vekt/vol) metning, med konstant omrøring av supernatanten. Etter 15 minutters omrøring ble blandingene sentrifugert under betingelsene beskrevet ovenfor. Supernatanten ble kastet, og utfellingen ble resuspendert i et minimalt volum av buffer A (20 mM Tris [pH 8,0], 2,5 mM MgCI2, 0,5 mM EDTA, 5 % (vol/vol) glyserol og 1 mM ditiotreitol).

40 % - 70 % ammoniumsulfatutfellingen ble deretter fylt på en fenyl-sefarose kolonne (2,5 ganger 10 cm) forbundet med et FPLC-apparat (Pharmacia) og eluert med en avtagende lineær gradient av (NH4)2S04fra 10 % (vekt/vol) til 0 %

(vekt/vol). Kolonnen var preekvilibrert med buffer A inneholdende 10 % (vekt/vol) ammoniumsulfat. Strømningshastigheten var 1 ml/min. Proteinkonsentrasjoner ble kontinuerlig monitorert ved A28ounder kolonneeluering. Kolonnen ble vasket med 120 ml buffer A inneholdende 10 % (vekt/vol) ammoniumsulfat inntil<y>A28o-baselinjeavlesninger ble oppnådd. Bundne proteiner ble eluert med en avtagende gradient av (NH4)2S04i buffer A [10 til 0 % (vekt/vol) (NH4)2S04i et totalt volum på 210 ml]. Fraksjoner på 2 ml ble samlet opp. Delmengder på 10 ul ble tatt fra hver

fraksjon og satt til standard dicamba O-demetylasetestblanding (se ovenfor), bortsett fra at ikke-radioaktiv dicamba ble anvendt som substrat. Dicamba O-demetylaseaktivitet ble detektert ved å monitorere omdannelsen av dicamba til det sterkt fluorescerende reaksjonsproduktet 3,6-DCSA med en håndholdt UV-lampe (312 nm, Fotodyne) i et mørkerom.

Denne prosedyren tillot separering av dicamba O-demetylase i tre fraksjoner inneholdende de separerte komponentene (betegnet komponent I, II og III). Hver komponent var essensiell for dicamba O-demetylaseaktivitet (se nedenfor). Når en enkel komponent ble undersøkt, ble de andre to komponentene gitt i overskudd. Fraksjoner inneholdende en enkel type aktivitet ble slått sammen (komponent I, fraksjoner 128-145; komponent II, ubundne fraksjoner 12-33; komponent III, fraksjoner 62-92).

( i) Rensing av komponent I. Fraksjoner inneholdende komponent l-aktivitet (under eluering fra en fenyl-sefarose kolonne ved 0 M (NH4)2S04, fraksjoner 128-145) ble slått sammen for å gi et totalt volum på 34 ml. De sammenslåtte prøvene ble konsentrert til 10 ml ved sentrifugering i en Centriprep-10-anordning (Amicon) og deretter overført til en Q-sefarose (Fast Flow) FPLC-kolonne (Pharmacia) (2,5 ganger 6 cm) ekvilibrert med buffer A og vasket med 80 ml buffer A. Proteiner bundet til kolonnen ble eluert med en 100 ml lineær gradient av 0 til 0,6 M KCI i buffer A ved en strømningshastighet på 1 ml/min. Fraksjoner ble samlet opp ved 1,5 minutts intervaller. De fraksjonene som har komponent l-aktivitet (fraksjoner 29-37) ble slått sammen, dialysert mot buffer A natten over ved 4°C og overført til en Mono Q HR 5/5 FPLC-anionebytterkolonne i buffer A. Proteiner ble eluert ved 1 ml/min ved anvendelse av en 50 ml gradient av økende KCI-konsentrasjon (0 til 0,5 M). Fraksjoner som viser komponent l-aktivitet (fraksjoner 19 til 25) ble slått sammen og konsentrert til 0,4 ml ved sentrifugering i en Centricon-10-anordning. Den konsentrerte prøven ble deretter underkastet kromatografi på en Superose 12 FPLC-kolonne (1,6 ganger 50 cm) ved en strømningshastighet på 0,2 ml/min med buffer A inneholdende 100 mM KCI. Fraksjoner 7-10 som viser komponent I-aktivitet ble slått sammen og konsentrert ved sentrifugering i en Centricon-10-anordning.

Delvis renset komponent I ble fortynnet med kald 1 % (vekt/vol) glysin og konsentrert ved sentrifugering i en Centricon-10-anordning tre ganger til for å avsalte den i fremstilling for IEF-elektroforese. Den avsaltede og konsentrerte prøven ble deretter overført til en 6 % (vekt/vol) I EF (pH 4-6) gel og underkastet elektroforese i 1,5 time ved 4°C (se nedenfor). Etter elektroforese ble gelen vasket med 25 mM kald fosfatbuffer (pH 7,0) i 5 minutter, og deretter ble hver bit av gelsporet delt i små (6 mm x 4 mm) terninger. Protein ble eluert fra terning-gelfragmentene ved å knuse dem med en pipettespiss i nærvær av 10 ul av 25 mM fosfatbuffer (pH 7,0). Protein fra hvert segment ble blandet med et overskudd av komponent II og III og undersøkt for dicamba O-demetylaseaktivitet. Gelsegmentet som viste komponent l-aktivitet (som også hadde rødbrun farge) ble satt på en 12,5 % (vekt/vol) natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel (SDS-PAGE) for å sjekke prøverenhet.

( ii) Rensing av komponent II. Komponent II oppnådd ved fenyl-sefarose kolonnekromatografi ble dialysert mot buffer A natten over ved 4°C og overført til en FPLC Q-sefarose kolonne (2,5 ganger 6 cm). Prøveelueringsbetingelser var identisk med de beskrevet ovenfor for komponent I bortsett fra at elueringsgradienten var 0 til 1 M KCI i buffer A. Fraksjoner som har komponent II-aktivitet (fraksjoner 30-37) ble slått sammen, dialysert mot buffer A, konsentrert til 0,4 ml og overført til en FPLC Superose 12-kolonne (1,6 ganger 50 cm). Prosedyrene for tilsetning av prøve og eluering var identisk med de beskrevet ovenfor for komponent I. Fraksjoner som har komponent ll-aktivitet (fraksjoner 3-6) ble slått sammen, fortynnet med et likt volum av buffer A og overført til en FPLC Mono Q-kolonne. Proteiner ble eluert fra kolonnen ved anvendelse av samme KCI-gradient som for komponent I. Fraksjoner 20-25 viste komponent ll-aktivitet. Delvis renset komponent II ble ytterligere renset ved IEF (pH 4-6) elektroforese ved anvendelse av samme betingelser som beskrevet for komponent I. Gelsegmentet som viste komponent ll-aktivitet ble satt til en 12,5 % (vekt/vol) SDS-PAGE for videre analyse.

( iii) Rensing av komponent III. Komponent III oppnådd ved fenyl-sefarose kolonnekromatografi ble dialysert mot buffer A natten over ved 4°C og overført til

en FPLC Q-sefarose kolonne (2,5 ganger 6 cm). Betingelser var identisk med de beskrevet ovenfor for komponent I. Fraksjoner som har komponent 11 l-aktivitet (fraksjoner 26-38) ble dialysert mot buffer B [10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 2,5 mM MgCb, 5 % (vol/vol) glyserol, 1 mM ditiotreitol] og konsentrert til 5 ml. Blåfargeaffinitetsmatriks [Cibacron Blue 3 GA type 3000 (Sigma)] ble pakket inn i en FPLC-kolonne (1x5 cm) og preekvilibrert med 20 ml buffer B. Konsentrert komponent III ble fylt på blåfargekolonnen og vasket med 20 ml buffer B ved en strømningshastighet på 0,2 ml/min inntil A2sotil kolonneeffluenten nådde baselinjenivåer. Bundet protein ble deretter eluert med 5 mM NADH i buffer B. Fraksjoner inneholdende reduktaseaktivitet ble detektert ved å teste for dicamba O-demetylaseaktivitet i nærvær av et overskudd av komponent I og II og også ved evnen hver fraksjon har til å redusere DCIP i nærvær av NADH. Fraksjoner som har sterk reduktaseaktivitet i begge tester ble slått sammen, dialysert mot buffer A inneholdende 100 mM KCI, konsentrert til 0,2 ml og overført til en FPLC Superose 12-kolonne. Samme betingelser ble anvendt for å kjøre Superose-kolonnen som beskrevet for komponent I. Fraksjoner inneholdende proteiner som katalyserte DCIP-reduksjon ble slått sammen, dialysert mot buffer A og overført til en FPLC Mono Q-kolonne. Proteiner ble eluert ved anvendelse av samme betingelser som for komponent I. Delvis renset komponent III ble ytterligere renset ved IEF (pH 4-6) gelelektroforese. Reduktaseaktiviteten til proteiner i IEF-gelen ble detektert ved å teste for DCIP-reduksjon i et agarosegelovertrekk som beskrevet ovenfor. Gelsegmentet som viste komponent ll-aktivitet ble satt til en 12,5 % (vekt/vol) SDS-PAGE for videre analyse.

Bestemmelse av NH2- terminale aminosyresekvensen Proteinbånd ble skåret ut fra IEF-geler og plassert i brønnene av en 12,5 % (vekt/vol) SDS polyakrylamidgel. Etter elektroforese ble gelbitene inneholdende de rensede proteinene overført til en PVDF (polyvinylidendifluorid)-membran (Millipore) i en Trans-Blot-celle (Bio-Rad, Richmond, CA) ved 25 volt i 16 timer. Overføringsbufferen var en løsning av 20 % (vol/vol) metanol med 10 mM CAPS [3-(sykloheksylamino)-1-propansulfonsyre], pH 10,0. Sekvensering ble utført ved anvendelse av en Applied Biosystems Inc. 420 H-maskin ved Edman-nedbrytning (Edman og Henschen

(1975) side 232-279 i S. B. Needleman (red.), Protein sequence determination, 2. utg., Springer-Verlage, New York). Bestemmelse av proteinkonsentrasjon. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved metoden ifølge Bradford (1976) Anal. Biochem. 72:248-254, med bovint serumalbumin som standard.

SDS- PAGE. Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ble utført i henhold til modifiserte metoder ifølge Laemmli (Laemmli (1970) Nature, 227:680-685). 12,5 % (vekt/vol) SDS-geler på 85 x 65 x 0,75 mm ble laget som følger: kjøregel: 2,5 ml 40 % (vekt/vol) akrylamid/bis-løsning (37:5:1), 1 ml kjørebufferløsning [3 M Tris-HCI (pH 8,8), 0,8 % (vekt/vol) SDS], 4,5 ml H20, 5 ul TEMED og 40 ul 10 % (vekt/vol) APS; oppkonsentreringsgel: 0,5 ml 40 %

(vekt/vol) akrylamid/bis, 0,5 ml oppkonsentreringsbufferløsning [1 M Tris-HCI (pH 6,8), 0,8 % (vekt/vol) SDS], 3 ml H20, 5 ul TEMED og 12,5 ul 10 % (vekt/vol) APS. Sammensetningen av kjørebufferen var 25 mM Tris-HCI (pH 8,3), 0,2 M glysin og 0,1 % (vekt/vol) SDS. Prøvebufferen inneholdt 0,25 ml oppkonsentreringsbuffer, 0,6 ml 20 % (vekt/vol) SDS, 0,2 ml p-merkaptoetanol og 0,95 ml 0,1 % bromfenolblått (vekt/vol) i 50 % (vol/vol) glyserol. Elektroforese ble utført ved 80 volt i et Bio-Rad Mini Gel-apparat inntil sporfargen var 0,5 cm fra anodeenden av gelen. Proteiner ble farget med 0,1 % (vekt/vol) Coomassie Brilliant Blue R-250 i en blanding av isopropanol, vann og eddiksyre ved et forhold på 3:6:1 (vol/vol/vol). Avfarging ble utført i en blanding av metanol, vann og eddiksyre ved et forhold på 7:83:10 (vol/vol/vol). Standard proteiner (Gibco BRL) omfattet: myosin (214,2 kDa), fosforylase B (111,4 kDa), bovint serumalbumin (74,25 kDa), ovalbumin (45,5 kDa), karbonisk anhydrase (29,5 kDa), p-laktoglobulin (18,3 kDa) og lysozym (15,4 kDa).

Bestemmelse av molekylvekt. Molekylvekten ( Mr) til peptider under denaturerende betingelser ble estimert ved anvendelse av SDS-PAGE analyse. Molekylvekt til de native komponentene I, II og III ble estimert ved gelfiltrering gjennom en Superose 12 HR 10/30 FPLC-kolonne (Pharmacia) ved en strømningshastighet på 0,2 ml/min i buffer A inneholdende 100 mM KCI. Kalibreringsproteiner var gelfiltreringsstandarder fra Bio-Rad. De var: bovint tyroglobulin (670 kDa), bovint gammaglobulin (158 kDa), kyllingovalbumin (44 kDa), hestemyoglobin (17 kDa) og vitamin B-12 (1,35 kDa). Kolonnevolumet til Superose 12-kolonnen ble beregnet ved anvendelse av blå dekstran { Mr 2.000.000, Sigma).

IEF. Isoelektrisk fokuserende (IEF) gelelektroforese ble utført i et vertikalt mini-gel-apparat (Modell #MGV-100) fra C.B.S. Scientific Co. (Del Mar, CA). IEF-geler med 6 % (vekt/vol) polyakrylamid (70 x 90 x 1 mm) ble laget ved å blande følgende: 1,6 ml 30 % (vekt/vol) akrylamid/bis (37:5:1), 0,8 g glyserol, 0,32 ml amfolytt pH 4-6

(Serva), 0,08 ml amfolytt pH 4-9 (Serva), 5,2 ml H20, 10 ul TEMED og 80 ul 10 %

(vekt/vol) APS. Katodebufferen var 100 mM (3-alanin og anodebufferen var 100 mM eddiksyre. Proteinprøver i omtrent 1 til 10 ul av 1 % (vekt/vol) glysin ble blandet med et likt volum av prøvebuffer [50 % (vol/vol) glyserol, 1,6 % (vol/vol) amfolytt pH 4-9, 2,4 % (vol/vol) amfolytt pH 4-6]. Prøver ble tilsatt på katodeenden av gelen og fikk migrere ved 200 volt i 1,5 time og 400 volt i ytterligere 1,5 time. Proteiner ble farget med Coomassie Brilliant Blue R-250 ved anvendelse av metoden beskrevet ovenfor for SDS-polyakrylamidgeler. IEF-markører (Sigma) var: amyloglukosodase, pl 3,6; glukose oksydase, pl 4,2; trypsinhemmer, pl 4,6; P-laktoglobulin A, pl 5,1; karbonisk anhydrase II, pl 5,4; karbonisk anhydrase II, pl 5,9 og karbonisk anhydrase I, pl 6,6.

Kinetikkanalyse. Kinetikkene til demetyleringsreaksjonen katalysert ved dicamba O-demetylase ble studert ved å analysere de innledende hastigheter av reaksjonen i nærvær av en konstant konsentrasjon av enzymet og økende konsentrasjoner av substratet, dicamba. Reaksjonsblandinger inneholdt 25 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0), 10 mM MgCI2, 0,5 mM NADH, 0,5 mM FeS04, 25 ug delvis renset O-demetylaseenzym [40 % - 70 % (vekt/vol) (NH4)2S04-fraksjonen fra et renset cellelysat], forskjellige konsentrasjoner (0,5 til 50 uM) av dicamba og forskjellige konsentrasjoner (0,025 til 2,5 uM) av [<14>C]dicamba (U-fenyl-<14>C, 42,4 mCi/mmol) i et totalt volum på 300 ul. For tester med dicamba-konsentrasjoner på 0,5 uM og 1 uM ble reaksjonsvolumet økt til 900 ul for å sikre at tilstrekkelige mengder av radioaktiv dicamba og dens metabolitter var til stede for å tillate deteksjon. I disse reaksjonene ble mengdene av alle andre komponenter i reaksjonen tredoblet. Omdannelsen av [<14>C]dicamba til [<14>C]3,6-DCSA ble bestemt for forskjellige tidspunkter ved hver konsentrasjon av dicamba ved anvendelse av en Phosphorlmager SF for å scanne radioaktivitet på fosforskjermer som hadde blitt eksponert for TLC-plater i 24 timer. Én aktivitetsenhet ble definert som enzymmengden som danner 1 nmol 3,6-DCSA pr. minutt ved 30°C. De innledende hastighetene til hver reaksjon ble bestemt ved å plotte reaksjonshastigheten versus tid ved hver substratkonsentrasjon. Data ble modellert til Michaelis-Menten kinetikker, og verdier av Km og Vmaksble bestemt ved tilpassing til Lineweaver-Burk-plott ved anvendelse av SigmaPlot® (Jandel Scientific, Corte Madera, CA).

Oksygenkrav. Preliminære eksperimenter som anvendte en Clark-oksygenelektrode indikerte oksygenforbruk i løpet av en standard dicamba O-demetylasetest med dicamba som et substrat. For å verifisere et krav for oksygen i O-demetyleringen av dicamba ved dicamba O-demetylase, ble reaksjoner utført i et anaerobt kammer som inneholdt mindre enn 1 ppm oksygen. Metodene for fortrengning av oksygen fra reaksjonsblandingen ble utført ved 4°C. Reaksjonsblandinger som mangler enzym ble plassert i et medisinglass og forseglet med en gummikork. For fortrengning av oksygen ble medisinglasset evakuert to ganger ved vakuum og gjennomgasset hver gang med nitrogen. Etter en tredje evakuering ble medisinglasset gjennomgasset med 90 % nitrogen pluss 10 % hydrogen. Enzymløsningen ble likeledes renset for oksygen (med forsiktighet slik at enzymløsningen ikke fikk bobler). Både reaksjonsblandingene og enzymløsningene ble overført til et anaerobt kammer (95 % N2- 5 % H2atmosfære). To hundre og førti mikroliter renset cellelysat ble injisert gjennom gummikorken med en mikrosprøyte og blandet forsiktig med 960 ul oksygenfri reaksjonsblanding. Reaksjoner ble utført ved 30°C.

En undersøkelse av reaksjonsproduktene på TLC-plater viste at hastigheten av [<14>C]3,6-DCSA produksjon fra [<14>C]dicamba under anaerobe betingelser var betydelig lavere enn hastigheten til reaksjoner med samme enzymmengde under aerobe betingelser. Under anaerobe betingelser var det praktisk talt ingen omdannelse av dicamba til 3,6-DCSA i løpet av 1 time. Når imidlertid en parallel reaksjonsblanding ble tatt fra det anaerobe kammeret etter 30 min og inkubert med luft, var en betydelig mengde av én av komponentene av dicamba O-demetylaseenzymkomplekset en oksygenase.

Det kan registreres at in wfro-omdannelsen av [<14>C]dicamba til[14C]3,6-DCSA etterligner in wVo-omdannelsen dokumentert tidligere (Cork og Kreuger, Adv. Appl. Microbiol. 36:1-66 (1991); Yang et al., Anal. Biochem. 219:37-42 (1994)). I disse studiene ble DCSA identifisert som et reaksjonsprodukt ved både TLC og kapillær elektroforese. Stringent identifikasjon av det første hovedproduktet av dicamba-nedbrytning som DCSA både in vivo og in vitro er oppnådd ved gasskromatografi-massespektrometri-analyser.

Komponent- og kofaktorkrav. Etter den innledende separeringen av de tre

komponentene av dicamba O-demetylase ved fenyl-sefarose kolonnekromatografi, ble de delvis rensede fremstillingene ført individuelt gjennom én ytterligere rensing på en Q-sefarose kolonne (2,5 ganger 6 cm). Prøver ble overført til en Q-sefarose (Fast Flow) rask proteinvæskekromatografikolonne (Pharmacia) i buffer A og eluert med en 100-ml lineær gradient av 0 til 0,6 M KCI (for

oksygenasekomponenten) eller 0 til 1,0 M KCI (for ferredoxin- og reduktasekomponentene) i 1,5-ml fraksjoner. Passende sammenslåtte fraksjoner fra separate kolonner for oksygenaserensing (fraksjoner 29 til 37), for ferredoxinrensing (fraksjoner 30 til 37) eller for reduktaserensing (fraksjoner 26 til 38) ble anvendt for bestemmelsen av komponent- og kofaktorkrav.

De tre komponentene ble testet for O-demetylaseaktivitet i forskjellige kombinasjoner for å bestemme komponentkrav.

For å bestemme kofaktorkrav, ble O-demetylaseaktivitet testet ved anvendelse av en blanding av de tre komponentene med [<14>C]dicamba i 30 minutter ved 30°C. Mengdene av delvis renset protein (gitt i et optimalisert forhold) i reaksjonsblandingene var 85 ug oksygenase, 55 ug ferredoxin og 50 ug reduktase. Konsentrasjonen av kofaktorer anvendt i reaksjonsblandingene var 0,5 mM NADH, 0,2 mM FAD, 0,5 mM FeS04, 10 mM MgCI2, 0,5 mM NADPH og 0,2 mM FMN.

RESULTATER

Komponent I. Komponenten til dicamba O-demetylase som bandt hardest til fenyl-sefarose kolonnen (betegnet initialt som komponent I og deretter identifisert som en oksygenase) var tydelig rødbrun. Dette antydet den mulige tilstedeværelsen av et protein(er) inneholdende en jern-svovel cluster(e) eller en hemgruppe(r). Fraksjonene med komponent l-aktivitet fra fenyl-sefarose kolonnen ble underkastet ytterligere rensing ved Q-sefarose (Fast Flow) og Mono Q-kromatografi og deretter separering på en Superose 12-størrelseseksklusjonsgelkolonne. Komponent l-proteinet ble deretter videre renset på en IEF-gel.

Protein fra hovedbåndet på IEF-gelen (med et tydelig pl på omtrent 4,6) ble skåret ut og separert fra hvilken som helst gjenværende mindre forurensing ved SDS-PAGE. Komponent l-hovedproteinet oppnådd etter rensing ved IEF var mer enn 90 % rent som bedømt ved densitometrisk analyse av denne SDS-polyakrylamidgelen farget med Coomassie blå.

Den N-terminale aminosyresekvensen til det dominante proteinet med en tydelig molekylvekt på omtrent 40.000 Dalton ble bestemt. Resultater av aminosyresekvensering indikerte at de første 29 aminosyrene i den N-terminale regionen var til stede i den følgende sekvensen (rester i parentes er beste gjetninger): Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp (Asp eller Thr) (Pro)

[SEKV ID NR:1].

Sammenligning med aminosyresekvenser i forskjellige databaser tydet på lite eller ingen homologi med NH2-terminale sekvenser angitt for andre monoksygenaser eller dioksygenaser.

Komponent II. Proteinfraksjonen som ikke bandt til en fenyl-sefarose kolonne ble betegnet som komponent II. Fordi denne gulaktig fargede fraksjonen kunne erstattes av ferredoxin fra Clostridium pasteurianum (men med langsommere reaksjonshastigheter) når tester ble utført i kombinasjon med komponentene I og Ill, ble den foreløpig betegnet som en ferredoxin-inneholdende fraksjon. C/osfr/'c//'um-ferredoxinet fungerte klart istedenfor komponent II, men gitt den sterkt urene naturen til komponent II anvendt i disse eksperimentene, var effektiviteten av Clostridium- enzymet betydelig lavere enn den til det antatte ferredoxinet fra stamme DI-6. Spesielt 55 ug delvis renset komponent II blandet med overskuddsmengder av komponentene I og III katalyserte omdannelsen av dicamba til 3,6-DCSA ved en hastighet på omtrent 5 nmol min"<1>mg"<1>, mens 100 ug høyt renset ferredoxin fra Clostridium resulterte i en aktivitet på bare 0,6 nmol min" 1 mg .

Rensingstrinn som involverer Q-sefarose (Fast Flow) kromatografi, Superose 12-gelfiltrering og Mono Q-kromatografi ga omtrent ett milligram renset protein fra opprinnelig 25 gram cellepasta. Denne fraksjonen ble renset på lignende måte som oksygenasekomponenten ved elektroforese på en IEF-gel og påfølgende elektroforese av den aktive IEF-fraksjonen på en SDS-polyakrylamidgel.

Analyse av komponent ll-aktivitet i proteiner eluert fra segmenter av IEF-gelen tydet på at en fraksjon med et pl på omtrent 3,0 inneholdt det aktive proteinet i komponent II. Protein fra denne gelbiten ble eluert og underkastet SDS-PAGE. Farging av gelen med Coomassie blå avslørte ett utpreget proteinbånd (molekylvekt på ca. 28.000 Dalton) sammen med et diffust område med proteiner med lavere molekylvekt.

Komponent III. Komponent III av dicamba O-demetylase ble holdt tilbake på en fenyl-sefarose kolonne i høye konsentrasjoner av (NH4)2S04og eluert ved omtrent 4 % (vekt/vol) (NH4)2S04. Denne lysegule fraksjonen ble foreløpig identifisert som en reduktase-inneholdende fraksjon basert på dens evne til å redusere oksydert cytokrom c og DCIP i nærvær av NADH og fordi den kunne erstattes av cytokrom c-reduktase fra svinehjerte (Type 1, Sigma) i tester med komponentene I og II. I dette settet med reaksjoner ga anvendelse av 50 ug delvis renset komponent III en reaksjonshastighet på omtrent 5 nmol min"<1>mg"<1>, når blandet med et overskudd av komponentene I og II. Den høyt rensede cytokrom c-reduktasen viste en spesifikk aktivitet på omtrent 2,5 nmol min"<1>mg"<1>i reaksjonen, en aktivitet godt under den tilveiebrakt av komponent III, når en tar i betraktning urenheten til grovkomponenten III anvendt i disse testene. I tillegg viste komponent III reduktaseaktivitet når inkubert med cytokrom c eller 2,6-diklorfenol-indofenol (DCPIP) i nærvær av NADH. Verken komponent I eller komponent II viste aktivitet i noen av disse to reduktasetestene.

Ytterligere rensing av denne fraksjonen ved kromatografi på kolonner inneholdende Q-sefarose (Fast Flow), blåfargeaffinitetsmatriks, Superose 12 og Mono Q-pakker resulterte i lave mengder av protein i fraksjonene med reduktaseaktivitet. Komponent lll-proteinet var ca. 70 % rent som bedømt ved densitometrisk analyse av den aktive proteinfraksjonen etter separering ved SDS-PAGE og farging med Coomassie blå.

Noe som ytterligere vanskeliggjorde rensing av komponent III, var at det ble funnet to forskjellige proteinfraksjoner fra Mono Q-kolonnetrinnet inneholdende reduktaseaktivitet når testet med ferredoxin- og oksygenasekomponentene. Ytterligere rensing av disse to fraksjonene ved elektroforese på en IEF-gel viste at reduktaseaktivitetene til de to fraksjonene hadde tydelig forskjellige isoelektriske punkter. Dette ble demonstrert ved å skjære ut spor inneholdende hver av de to reduktasefraksjonene fra IEF-gelen og legge bitene på toppen av en pute av lavtsmeltende agarose inneholdende en DCIP-reaksjonsblanding. Reduktaseaktivitet i begge gelbiter ble identifisert ved den NADH-avhengige reduksjonen av DCIP til dens fargeløse, reduserte form. Reduktasen i fraksjon 35 hadde et tydelig pl på omtrent 5,6, mens reduktasen i fraksjon 27 hadde et tydelig pl på omtrent 4,8.

Begge reduktaseaktiviteter isolert fra IEF-gelbitene var ustabile og til stede i små mengder. Faktisk hadde bare reduktasen fra fraksjon 35 fra Mono Q-kolonnefraksjoneringen tilstrekkelig proteinkonsentrasjon og aktivitet som tillot ytterligere rensing og karakterisering. En bit fra en IEF-gel inneholdende denne reduktaseaktiviteten ble eluert og separert fra forurensende proteiner ved SDS-PAGE. Det dominerende proteinet i denne gelen var ett med en vekt på omtrent 45.000 Dalton. Størrelseseksklusjonsgelkromatografi hadde angitt en omtrentlig molekylvekt på 50.000 Dalton for komponent III i dens native tilstand. Biokjemiske karakteristika av dicamba O- demetylase. Dicamba O-demetylaseaktivitet ble målt under inkuberinger in vitro ved temperaturer i området fra 20°C til 50°C og ved pH-verdier fra omtrent 6 til 9. Aktivitet toppet seg skarpt ved 30°C og bredt ved pH-verdier mellom 6,5 og 7,5. Enzymatisk aktivitet var avhengig av typen pH-buffer anvendt. Ved for eksempel pH 7 var aktivitet omtrent 40 % lavere i Tris-inneholdende buffere enn i fosfatinneholdende buffere.

Verdier for Km og VmakSfor dicamba O-demetylase ble estimert ved anvendelse av SigmaPlot® for å danne "best fit"-kurver fra Michaelis-Menten og Lineweaver-Burk-plott av data fra duplikateksperimenter. Km for dicamba ble estimert å være omtrent 9,9 ± 3,9 uM, og Vmaksfor reaksjonen ble estimert å være omtrent 108 12 nmol/min/mg.

De tre komponentene ble testet for dicamba O-demetylaseaktivitet i forskjellige kombinasjoner. Ingen av komponentene viste enzymaktivitet når de ble testet alene. Faktisk kunne en betydelig mengde av O-demetylaseaktivitet bare detekteres når alle tre komponenter ble slått sammen. En blanding av komponentene I og II viste små mengder av enzymaktivitet, sannsynligvis på grunn av spormengder av komponent III som forurenset komponent l-fraksjonene.

Både NADH og NADPH støttet enzymaktivitet, der NADH var markert mer effektiv enn NADPH. Mg<2+>var nødvendig for enzymaktivitet. Fe<2+>, flavinadenindinukleotid (FAD) og flavinmononukleotid (FMN) produserte liten eller ingen stimulering av enzymatisk aktivitet med de delvis rensede proteinfremstillingene i disse eksperimentene. Den høyeste aktiviteten ble oppnådd ved anvendelse av en kombinasjon av NADH, Fe<2+>,Mg<2>+ og FAD.

DISKUSJON

Dicamba O-demetylase fra Pseudomonas maltophilia, stamme DI-6, er en tre-komponent oksygenase (Wang, X-Z (1996) doktorgradsavhandling, Universitetet i Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE) ansvarlig for omdannelsen av herbicidet, dicamba (2-metoksy-3,6-diklorbenzosyre), til 3,6-diklorsalicylsyre (3,6-DCSA; 2-hydroksy- 3,6-diklorbenzosyre). Rensingsskjemaer er laget som har tillatt isoleringen av hver av de tre komponentene til en homogen eller nær-homogen tilstand.

Innledende separering av de tre komponentene ble oppnådd ved kromatografi på en fenyl-sefarose kolonne. Enzymatiske aktiviteter og andre karakteristika av de delvis rensede komponentene tillot en foreløpig identifikasjon av komponentene som en reduktase, et ferredoxin og en oksygenase - en sammensetning lignende den funnet i flere andre tidligere studerte heminneholdende og ikke-heminneholdende, multikomponente oksygenaser (Batie, et al. (1992) side 543-565,1 F. Muller (red.), Chemistry and biochemistry of flavoenzymes, vol. Ill, CRC Press, Boca Raton; Harayama, et al. (1992) Annu. Rev. Microbiol. 46:565-601; Mason og Cammack (1992) Annu. Rev. Microbiol. 46:277-305; Rosche et al.

(1995) Biochem. Biophys. Acta 1252:177-179). Komponent III isolert fra fenyl-sefarose kolonnen katalyserte den NADH-avhengige reduksjonen av både cytokrom c og fargen, DCIP. I tillegg kunne dens evne til å støtte omdannelse av dicamba til 3,6-DCSA når kombinert med komponentene I og II, delvis erstattes av cytokrom c-reduktase. Komponent II kunne erstattes ved tilsetning av ferredoxin fra Clostridium pasteurianum til reaksjoner inneholdende komponentene I og III. Det absolutte behovet for molekylært oksygen for å støtte O-demetyleringsreaksjonen antydet at den gjenværende komponenten var en oksygenase.

OksygenaseDic- Komponent I av dicamba O-demetylase (betegnet som oksygenaseDic) er renset til homogenitet og underkastet N-terminal aminosyresekvensering. Den resulterende sekvensen av tjueni aminosyrerester viste ingen betydelig homologi med andre proteinsekvenser i de forskjellige databankene. Imidlertid tillot informasjonen oppnådd fra denne aminosyresekvensen utformingen av degenererte oligonukleotidprober som med hell er anvendt for å detektere og klone komponent l-genet (se Eksempel 2). Videre viste en sammenligning av aminosyresekvensen avledet fra nukleotidsekvensen til denne klonen med den til proteinsekvensene i databasen sterk homologi med andre oksygenaser (se Eksempel 2).

Den tydelige molekylvekten til oksygenaseDic, estimert fra dens migrering i SDS-polyakrylamidgeler, er omtrent 40.000 Dalton. Rensede fremstillinger av oksygenasen viste bare ett hovedbånd på SDS-polyakrylamidgeler farget med Coomassie blå, og Edman-nedbrytning av proteinet inneholdt i dette båndet indikerte tilstedeværelse av bare én N-terminal art. Estimater avledet fra oppførselen av nativ oksygenaseDicpå størrelseseksklusjonsgelkolonner indikerer en molekylstørrelse på omtrent 90.000 Dalton. Alle disse resultatene indikerer at den native oksygenasen eksisterer som en homodimer.

Oksygenase/hydroksylase-komponenten av flere multikomponentsystemer er sammensatt av et (aP)n-type subenhetarrangement hvor den større a-subenheten er omtrent 50.000 Dalton i størrelse og den mindre (3-subenheten er omtrent 20.000 Dalton i molekylvekt (Harayama, et al. (1992) Annu. Rev. Microbiol. 46:565-601). Derimot synes oksygenasekomponenten av dicamba O-demetylase å ha en enkel subenhet på omtrent 40 kDa i molekylvekt som kan eksistere som en dimer i dens native tilstand. Dette (a)n-type subenhetarrangementet ligner det funnet i andre godt karakteriserte oksygenaser så som 4-klorfenylacetat 3,4-dioksygenase fra Pseudomonas sp. stamme CBS (Markus, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:12883-12888), ftalat dioksygenase fra Pseudomonas cepacia (Batie, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:1510-1518), 4-sulfobenzoat 3,4-dioksygenase fra Comamonas testosteroni (Locher, et al. (1991) Biochem. J., 274:833-842), 2-okso-1,2-dihydrokinolin 8-monooksygenase fra Pseudomonas putida 86 (Rosche et al.

(1995) Biochem. Biophys. Acta 1252:177-179), 4-karboksydifenyleter dioksygenase fra Pseudomonas pseudoalcaligenes (TJehmel, et al. (1995) Arch. Microbiol. 163:35-41) og 3-klorbenzoat 3,4-dioksygenase fra Pseudomonas putida, (Nakatsu, et al. (1995) Microbiology (Reading) 141:485-495).

FerredoxinDic- Komponent II (ferredoxinDic) av dicamba O-demetylase ble renset ved mange trinn av kolonnekromatografi og IEF. Endelig rensing ved SDS-PAGE ga ett hovedbånd av protein (Mr~28.000) og et diffust område med noe mindre proteiner.

Den N-terminale aminosyresekvensen til proteinet med en tydelig molekylvekt på omtrent 28.000 Dalton ble bestemt. Denne aminosyresekvensen tillot fremstilling av degenererte oligonukleotidprober, og disse probene ble anvendt for å isolere en genomisk klon som koder for dette proteinet. Selv om proteinet produsert av denne klonen var et ferredoxin (ferrodoxin28kDa), ble det deretter bestemt ikke å være aktiv i nedbrytningen av dicamba når kombinert med de andre to komponentene av dicamba O-demetylase (data ikke vist).

Andre bevis støtter konklusjonen om at ferrodoxin28kDaikke er ferredoxinkomponenten av dicamba O-demetylase. For det første er molekylvekten til dette proteinet (28 kDa) betydelig høyere enn den til de andre ferredoxinene funnet i multikomponente oksygenaser fra bakterier (dvs. 8-13 kDa)

(Batie, et al. (1992) side 543-565, i F. Muller (red.), Chemistry and biochemistry of flavoenzymes, vol. Ill, CRC Press, Boca Raton; Harayama, et al. (1992) Annu. Rev. Microbiol. 46:565-601).

For det andre avslørte en sammenligning av den N-terminale sekvensen av 20 aminosyrerester oppnådd fra ferredoxin28kDamed andre aminosyresekvenser i de forskjellige proteindatabankene ved anvendelse av Genetics Computing Group (GCG)-programvarepakke (Universitetet i Wisconsin, Madison, Wl) sterk homologi (80-85 % likhet sammenlignet med den mest sannsynlige N-terminale sekvensen av ferredoxin28kDa) med flere dicluster-bakterielle ferredoxiner (de fra Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas putida, Rhodobacter capsulatus og Azotobacter vinelandii). De fire dicluster-ferredoxinene som viste sterk homologi med ferredoxin28kDahar en [3Fe-4S] duster fulgt av en [4Fe-4S] duster ved N-terminalen av proteinet. Dette indikerer at ferredoxin28kDaer klart forskjellig fra ferredoxinkomponentene med [2Fe-2S] clustere som vanligvis er forbundet med ikke-hem multikomponente oksygenaser (Harayama, et al. (1992) Annu. Rev. Microbiol. 46:565-601; Mason og Cammack (1992) Annu. Rev. Microbiol. 46:277-305; Rosche, et al. (1995) Biochem. Biophys. Acta 1252:177-179).

ReduktaseD\ c- Komponent III av dicamba O-demetylase (betegnet som reduktaseDic) er den mest gjenstridige av de tre komponentene å rense. Dette skyldes delvis dens tydelige ustabilitet og lave mengde i lysater av stamme DI-6. Ikke desto mindre er tilstrekkelig protein renset for å tildele en foreløpig molekylvekt på 45.000 Dalton. Dette ligner molekylvekten på omtrent 50.000 Dalton oppnådd fra størrelseseksklusjonsgelkromatografi og indikerer at reduktaseDiceksisterer i dens native form som en monomer. Rensingen av reduktasekomponenten er videre komplisert ved det faktum at kromatografi på en Mono Q-kolonne og I EF separerer rensede reduktasefremstillinger i to aktiviteter med tilsynelatende forskjellige pl-verdier. Begge fraksjonene fra Mono Q-kolonnen virket i kombinasjon med renset ferredoxinDicog oksygenaseDicfor å produsere dicamba O-demetylaseaktivitet. Tilstedeværelsen i Sphingomonas sp. stamme RW1 av to lignende flavoproteiner som fungerer like godt som reduktasekomponenter i den tre-komponent dibenzofuran 4,4a-dioksygenasen er nylig angitt av Bunz og Cook (Bunz og Cook (1993) J. Bacteriol. 175:6467-6475). Begge reduktaser var interessant 44.000 Dalton i molekylvekt, ganske lik den til 45.000 Dalton reduktaseDic- Multiple komponenter av leghemoglobin reduktase er også observert i lupinrotknoller ved anvendelse av isoelektrisk fokuserende teknikker (Topunov, et al. (1982) Biokhimiya (engelsk utgave) 162:378-379). I dette tilfellet avslørte I EF fire separate komponenter med NADH-avhengig reduktaseaktivitet. Svaret på spørsmålet om hvorvidt det bare er én reduktaseDicsom eksisterer i to former eller to forskjellige reduktaser i stamme DI-6 vil være avhengig av utviklingen av forbedrede prosedyrer for å isolere større mengder av proteinene og/eller på kloningen og sekvenseringen av genet(ene) involvert (se Eksempel 3 og 5).

Dicamba O- demetylasekarakteristika. I tillegg til de fysiske og biokjemiske egenskapene til de individuelle komponentene angitt ovenfor, har analyser av enzymatisk aktivitet vist at O-demetylasesystemet har en sterk affinitet (Km= -10 uM) for dets substrat og en Vmakspå omtrent 100-110 nmol/min/mg. Som forventet for en jordbakterie oppsamlet i en temperert klimasone, ble den maksimale enzymatiske aktiviteten observert ved temperaturer nær 30°C. Mens pH-optima for enzymsystemet var i området fra pH 6,5 til pH 7,5, ble aktiviteten målt med en gitt enzymfremstilling sterkt påvirket av type pH-buffersystem anvendt. Aktivitet i nærvær av Tris-buffere var minst 40 % lavere enn med fosfatbuffere ved samme

PH.

Reaksjonsskjemaet for reaksjonen katalysert av de tre komponentene av dicamba O-demetylase er presentert i Figur 1. Elektroner fra NADH beveger seg gjennom en kort elektronkjede bestående av reduktasen og ferredoxinet til den terminale oksygenasen som katalyserer oksydering av dicamba. Likheter mellom dicamba O-demetylase og mange multikomponente dioksygenaser indikerer at dicamba O-demetylase potensielt kan ha skjult dioksygenaseaktivitet. Det er imidlertid klart at dette enzymet ikke er i klassen med dioksygenaser som splitter 02og innfører ett oksygenatom i hovedsubstratet og det andre i et lite organisk substrat så som a-ketoglutarat (Fukumori og Hausinger (1993) J. Biol. Chem. 268:24311-24317). Faktisk krever kombinasjoner av høyt renset reduktaseDic, ferredoxinDicog oksygenaseDicbare 02, NADH, Mg<2+>, Fe<2+>og dicamba for aktivitet.

EKSEMPEL 2: Identifikasjon og sekvensering av en klon som koder for oksygenasen av dicamba O-demetylase i Pseudomonas maltophilia DI-6

Som angitt i Eksempel 1, er de første 29 aminosyrene av den N-terminale aminosyresekvensen til oksygenaseDicbestemt å være (rester i parentes er beste gjetninger): Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp (Asp eller Thr) (Pro)

[SEKV ID NR:1].

Denne sekvensen tillot utformingen av degenererte oligonukleotidprober som ble syntetisert ved Operon, Alameda, CA. Spesielt ble en blanding av 32 prober, som hver var 17 nukleotider lange og inneholdt alle de mulige nukleotidsekvensene som kunne kode for aminosyresekvensen uthevet i fet skrift ovenfor, anvendt. Oligonukleotidprobene var 3-ende-merket med digoxigenin (DIG) i henhold til instruksjoner gitt av Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN.

De DIG-merkede probene ble først hybridisert til P. maltophilia DI-6 genomisk DNA som hadde blitt kuttet med forskjellige kombinasjoner av restriksjonsenzymer, atskilt på en 1 % agarosegel og overført til et nylonfilter. Basert på disse resultatene ble et størrelsesfraksjonert genomisk bibliotek konstruert i pBluescript II KS+ vektoren og transformert inn i Escherichia coli DH5a-kompetente celler. Det genomiske biblioteket inneholdt 1-2 kb Xho I/ Hind III- fragmenter. De DIG-merkede oligonukleotidprobene ble hybridisert til en matrise av bakterielle kolonier streket ut på nylonfiltre. Plasmid-DNA ble isolert fra positive kolonier og subklonet. Begge tråder av hver subklon ble sekvensert ved DNA-sekvenseringsfasiliteten ved Universitetet i Nebraska-Lincoln. Hybridisering og deteksjon av DIG-merkede prober ble utført i henhold til protokoller gitt av Boehringer Mannheim.

En genomisk DNA-klon som koder for oksygenaseDicble identifisert. Nukleotidsekvensen og den utledede aminosyresekvensen til hele oksygenaseDicer gitt i sekvenslisten nedenfor som henholdsvis SEKV ID NR:2 og SEKV ID NR:3.

En sammenligning av aminosyresekvensen avledet fra nukleotidsekvensen til denne klonen med den til proteinsekvensene i Swiss Protein Database viste homologi med andre oksygenaser. Homologi ble bestemt ved anvendelse av FASTA-programmet i GCG-programvarepakken. Den sterkeste homologien var med oksygenasekomponenten av vanillat demetylase (fra Pseudomonas sp., ATCC stamme 19151) som viste 33,8 % likhet.

EKSEMPEL 3: Rensing og karakterisering av andre komponenter av dicamba O-demetylase i Pseudomonas maltophilia DI-6

Bakteriekulturer og fremstilling av rensede cellelysater. Pseudomonas maltophilia, stamme DI-6, ble inokulert i seks to-liters Erlenmeyerkolber inneholdende én liter redusert kloridmedium (Kreuger, J.P. 1989. Doktorgradsavhandling. Illinois Institutt for teknologi, Chicago) supplert med glukose (2,0 mg/ml) og casaminosyrer (2,0 mg/ml) som karbonkildene. Kulturer ble inkubert på en orbital rister (225 rpm ved 30°C). Celler ble høstet ved en A6ooi området fra 1,5 til 2,0 ved anvendelse av en JLA-10.500 rotor i en Beckman Avanti J-25I sentrifuge ved 4.000 x g i 20 minutter. Pelleterte celler ble lagret ved -80°C. De frosne cellene ble resuspendert i 40 ml av 100 mM MgCI2, pelletert igjen ved anvendelse av samme betingelser som ovenfor og deretter resuspendert i sonikeringsbuffer (100 mM 3-[N-morfolino]propansulfonsyre (MOPS) (pH 7,2), 1 mM ditiotreitol, 5 % glyserol) i et forhold på 2 ml sonikeringsbuffer pr. gram celler våt vekt. Lysozym ble tilsatt i et forhold på 80 ul pr. gram celler sammen med en proteasehemmercocktail for bakterielle ekstrakter (Sigma, P 8465) i et forhold på 5 ml pr. 20 gram celler våt vekt. Til slutt ble fenylmetylsulfonylfluorid (0,1 M lagerløsning i 100 % etanol) tilsatt i et forhold på 250 ul pr. 50 ml sonikeringsbuffer. Cellene ble sprengt med en sonikator (Sonics and Materials Inc., modell VCX 600) i 9,0 sekunders pulser, med 3,0 sekunders hvileperioder, i 30 minutter ved en amplitude på 50 %. Lyserte celler ble sentrifugert i 75 minutter ved 56.000 x g i en JA-25.50 rotor til en Beckman Avanti J-25I sentrifuge ved 4°C. Supernatanten (renset cellelysat) ble dekantert og glyserol ble satt til en endelig konsentrasjon på 15 % før lagring ved -80°C.

Innledende rensing av dicamba O- demetylasekomponenter. En delmengde av det rensede cellelysatet inneholdende omtrent 2,7 gram protein ble overført til en Pharmacia XK 26/60 kolonne inneholdende 25 ml DEAE-Sefarose Fast Flow ekvilibrert med 50 mM MOPS (pH 7,2), 1 mM ditiotreitol og 15 % (vol/vol) glyserol (buffer A). Kolonnen var forbundet med en Bio-CAD arbeidsstasjon for perfusjonskromatografi (USDA NRICGP Grant # 9504266) og kjørt ved en strømningshastighet på 5,0 ml/min. Etter at kolonnen var fylt, ble den vasket med buffer A inntil absorbansavlesingen ved 280 nm avtok til under 0,1. Alle tre komponenter av dicamba O-demetylase var bundet til DEAE-kolonnen under disse betingelsene. Kolonnen var utviklet med en lineær gradient av 0 til 500 mM NaCI i buffer A. Dette resulterte i elueringen av ferredoxinet ved 400 mM NaCI og samelueringen av reduktase- og oksygenasekomponentene ved 250 mM NaCI.

Rensing av ferredoxinDlc. Fraksjoner inneholdende ferredoxinD|Celuert fra DEAE-Sefarosekolonnen ble slått sammen og buffer byttet til 50 mM MOPS (pH 7,2), 5 % glyserol (vol/vol) og 200 mM NaCI (buffer B). De ble deretter konsentrert til omtrent 2 ml ved anvendelse av en Amicon-cellekonsentrator med en YM 10-membran og en Centricon 10-konsentrator. Denne prøven ble deretter overført til en forhåndspakket Pharmacia HiPrep 26/60 Sefakryl S-100 kolonne ekvilibrert med buffer B og kjørt ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min på et Pharmacia FPLC-apparat. Fraksjoner som viste aktivitet ble slått sammen og buffer byttet til 50 mM MOPS (pH 7,2), 1 mM ditiotreitol og 5 % glyserol (vol/vol) (buffer C). Fraksjonene ble konsentrert til omtrent 2 ml og deretter fylt på en Pharmacia Mono Q HR 5/5 kolonne ekvilibrert i buffer C. Kolonnen var utviklet med en lineær gradient av 0 - 2,0 M NaCI i buffer C. Fraksjoner som inneholdt ferredoxinaktivitet ble testet for proteininnhold og lagret ved -80°C.

Rensing av reduktaseDic. Fraksjoner fra den innledende DEAE-Sefarosekolonnen inneholdende oksygenase/reduktase-komponentene ble slått sammen, og ammoniumsulfat ble satt til en endelig konsentrasjon på 1,5 M. Etter inkubering ved 4°C i 1,5 time ble prøvene sentrifugert i 75 minutter ved 56.000 x g ved 4°C i en JA-25.50 rotor til en Beckman Avanti J-25I sentrifuge. Supernatanten ble beholdt og tilsatt ved en strømningshastighet på 5,0 ml/min på en Pharmacia XK 26/20 kolonne inneholdende 25 ml fenyl-sefarose 6 Fast Flow ("high sub") som ble ekvilibrert i buffer A inneholdende 1,5 M (NH4)2S04. Fraksjoner som inneholdt reduktasekomponenten ble slått sammen, buffer byttet til buffer B og konsentrert til omtrent 2 ml ved anvendelse av Amicon-konsentratoren med en YM30-membran og en CentriconlO-konsentrator. 2 ml-prøven ble overført til en forhåndspakket Pharmacia HiPrep 26/60 Sefakryl S-100 kolonne ekvilibrert i buffer B og kjørt ved 0,5 ml/min. Fraksjoner inneholdende reduktaseaktivitet ble slått sammen, buffer byttet til buffer C og konsentrert ned til omtrent 2 ml. 2 ml-prøven ble satt til en forhåndspakket Pharmacia Mono Q HR 5/5 kolonne som var ekvilibrert i buffer C. Kolonnen var utviklet med en lineær gradient av 0 - 2,0 M NaCI i buffer C ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min. Fraksjoner som viste reduktaseaktivitet ble testet for proteininnhold og lagret ved -80°C.

Raske enzymtester. Aktivitet for hver av de tre individuelle komponentene ble målt i reaksjoner ved anvendelse av<14>C-merket dicamba i en reaksjon inneholdende et overskudd av de gjenværende to komponentene. For hver reaksjon ble en bufferløsning sammensatt av 24 mM kaliumfosfat (KPi) buffer (pH 7,0), 0,48 mM NADH, 0,48 mM FeS04 og 9,6 mM MgCI2satt til 200 ul proteinprøve sammen med 30 ul ferdig blanding (562,4 ul sterilt vann, 12,0 ul 50 mM dicamba og 25,6 ul 14C-dicamba stamløsning [1,28 uCi]) for et totalt volum på 311 ul og en<14>C-dicamba-spesifikk aktivitet på 4,12 uC/ml. Etter 60 min ble hver reaksjon stanset ved tilsetning av 50 ul 5 % H2S04(vol/vol) og 500 ul eter. Reaksjonsrør ble vortekset og sentrifugert i en mikrofuge (Eppendorf, modell 5415C) ved 14.000 x g i 2 minutter. For en rask visuell vurdering av enzymatisk aktivitet ble hvert reaksjonsrør plassert under et håndholdt UV-lys (Fotodyne Inc., modell 3-6000) for å detektere fluorescens av reaksjonsproduktet, DCSA. For mer nøyaktige, semi-kvantitative målinger av enzymatiske aktiviteter, ble reaksjonsprodukter separert ved anvendelse av tynnsjiktskromatografi som beskrevet i Eksempel 1.

Proteinkonsentrasjonsbestemmelser. Fraksjonene oppnådd ved forskjellige trinn av rensingsprotokollen ble undersøkt for proteinkonsentrasjon ved anvendelse av Bradford-testen (standard protokoll; Bio-Rad; se Eksempel 1).

EKSEMPEL 4: Identifikasjon og sekvensering av en klon som koder for ferredoxinoic

Den N-terminale sekvensen oppnådd fra det rensede ferredoxinproteinet (rensing beskrevet i Eksempel 3) var 29 aminosyrer lang (sekvensering av proteiner ble utført ved proteinkjernefasiliteten ved Universitetet i Nebraska-Lincoln ved anvendelse av en standard Edman-nedbrytningsprosedyre; se Eksempel 1). En sammenligning av denne sekvensen med Genbank-databasen viste at den var 35 % identisk i en 26 aminosyreoverlapping med et terpredoxin fra Pseudomonas sp., et bakterielt [2Fe-2S] ferredoxin i adrenodoxinfamilien. Sekvensinformasjonen ble anvendt for å utforme tre degenererte oligonukleotidprimere (to fremover og én revers). Sekvensen av de to 17mer fremoverprimerne var basert på den N-terminale aminosyresekvensen oppnådd fra det rensede ferredoxinproteinet. Sekvensen av den 17mer reverse primeren var basert på en konservert sekvens av seks aminosyrer nær den C-terminale enden av seks tidligere sekvenserte bakterielle adrenodoxintype-ferredoxiner. Primerne ble anvendt i en nested PCR-reaksjon for å amplifisere et 191 bp produkt fra totalt P. maltophilia- DNA. Produktet ble klonet inn i pGEM-T Easy-vektoren (Promega, Madison, Wl) og sekvensert. DNA-sekvensering ble utført ved DNA-sekvenseringskjernefasiliteten ved Universitetet i Nebraska-Lincoln ved anvendelse av en standard dideoksy-mediert kjedetermineringsprosedyre. En analyse av den antatte aminosyresekvensen til denne klonen bekreftet at den matchet den N-terminale- og indre aminosyresekvensen tidligere tilveiebrakt fra det rensede ferredoxinproteinet. Videre hadde den avledede aminosyresekvensen 48 % likhet over hele dens lengde med et [2Fe-2S] ferredoxin fra Rhodobacter capsulatus. Det klonede fragmentet var merket med digoxigenin (DIG) (Roche Diagnostics) ved anvendelse av en standard PCR-protokoll (DIG/Genius System User's Guide) og hybridisert ved en Southern blot til totalt P. maltophilia- DNA som hadde blitt kuttet med flere restriksjonsenzymer. Et kart over restriksjonssetene som omgir genet ble konstruert basert på størrelsene av restriksjonsfragmentene som hybridiserte til proben. Dette innledende eksperimentet viste at genet var del av et Xho \/ Pst l-fragment som var omtrent 1 kb langt. Deretter ble totalt P. maltophilia-DNA kuttet med Xho I og Pst I, og restriksjonsfragmentene ble atskilt på en gel. Fragmenter mellom 0,5 og 1,5 kb lengde ble skåret ut av gelen, ligert inn i vektoren pBluescript II KS+ (Stratagene, Inc.) og transformert inn i DH5a-celler (Gibco BRL, Inc.). Bakteriekolonier inneholdende det størrelsesfraksjonerte biblioteket ble screenet med den DIG-merkede proben og et 900 bp Xho \/ Pst I-fragment ble identifisert. Sekvensanalyse viste at denne klonen inneholdt et fullengde 318 bp ferredoxingen [SEKV ID NR:4] som kodet for et 11,4 kDa protein sammensatt av 105 aminosyrerester [SEKV ID NR:5]. Aminosyresekvensen antatt av det klonede genet matchet den N-terminale- og indre aminosyresekvensen tidligere oppnådd fra det rensede ferredoxinproteinet. Videre var den antatte aminosyresekvensen homolog over hele dens lengde med fem andre medlemmer av adrenodoxinfamilien av [2Fe-2S] bakterielle ferredoxiner, i området fra 42 % likhet med et ferredoxin fra Rhodobacter capsulatus til 35 % likhet med et ferredoxin fra Pseudomonas (se Figur 2). De andre tre ferredoxinene var fra Caulobacter crescentus, Rhodococcus erythropolis og Pseudomonas putida. Proteiner i denne familien binder en enkel 2Fe-2S jern-svovel-cluster og har tre konserverte motiver. Motiv 1 omfatter tre konserverte cysteiner som er 2Fe-2S ligander. Motiv 2 inneholder en duster av negativt ladede rester. Motiv 3 omfatter det fjerde konserverte cysteinet i 2Fe-2S clusteren.

EKSEMPEL 5: Identifikasjon og sekvensering av kloner som koder for reduktaseDic

To reduktasegener ble klonet ved samme fremgangsmåte som ble anvendt i Eksempel 4 for å klone ferredoxingenet. Den N-terminale sekvensen oppnådd fra det rensede reduktaseproteinet (rensing beskrevet i Eksempel 3) var 25 aminosyrer lang. En sammenligning av denne sekvensen med Genbank-databasen viste at den var 90 % identisk i en 20 aminosyreoverlapping med en cytokrom P450-type reduktasekomponent av dioxin dioksygenase, et tre-komponent enzym tidligere isolert fra Sphingomonas sp. RW1. En indre sekvens av 10 aminosyrerester ble også oppnådd fra tryptiske kuttinger av det rensede proteinet. Den indre sekvensen hadde 87,5 % likhet med restene 62 til og med 69

i samme cytokrom P450-type reduktase fra Sphingomonas sp. RW1. Denne sekvensinformasjonen ble anvendt for å utforme tre degenererte oligonukleotidprimere (to fremover og én revers). Sekvensen av de to 17mer fremoverprimerne var basert på den N-terminale aminosyresekvensen, og sekvensen av den 17mer reverse primeren ble basert på den indre aminosyresekvensen. Primerne ble anvendt i en nested PCR-reaksjon for å amplifisere et 180 bp produkt fra totalt P. maltophilia- DHk. Produktet ble klonet inn i pGEM-T Easy-vektoren og sekvensert. En analyse av den antatte aminosyresekvensen til denne klonen bekreftet at den kodet for et protein som matchet den N-terminale- og indre aminosyresekvensen oppnådd fra det rensede reduktaseproteinet. Videre hadde den antatte sekvensen 80 % likhet over hele dens lengde med cytokrom P-450 type reduktasekomponenten til dioxin dioksygenasen fra Sphingomonas sp. RW1.

Det klonede fragmentet ble merket med DIG og hybridisert ved en Southern blot til totalt P. maltophilia- DHk som hadde blitt kuttet med flere restriksjonsenzymer. Southern blot viste at den DIG-merkede proben gjenkjente to forskjellige loki i de ulike restriksjonskutteproduktene fra P. maltophilia totalt DNA. Denne observasjonen antydet at det er to reduktasegener lokalisert i forskjellige posisjoner i genomet til P. maltophilia. Det er mulig at de to genene er identiske dupliseringer som koder for identiske reduktaseproteiner. Alternativt kunne ett av genene kode for et forkortet protein uten aktivitet eller et fullengde protein med lav aktivitet i vår dicamba O-demetylasetest. Fordi det var nødvendig å klone genet som koder for et protein med optimal aktivitet, ble den DIG-merkede proben anvendt til å gjenvinne begge reduktasegenene.

Når totalt P. maltophilia- UNk ble kuttet med Kpn I og EcoR I, hybridiserte den DIG-merkede proben til ett restriksjonsfragment som var omtrent 4,0 kb langt og til et annet større fragment med en størrelse på omtrent 20 kb. Et kart over flere restriksjonsseter som omgir genet lokalisert på 4,0 kb Kpn UEcoR l-fragmentet ble konstruert basert på størrelsene av forskjellige restriksjonsfragmenter som hybridiserte til proben. Restriksjonskartet antydet at hele genet skulle være lokalisert på dette 4,0 kb fragmentet. Deretter ble totalt P. maltophilia- DNA kuttet med Kpn I og EcoR I, og restriksjonsfragmentene ble atskilt på en gel. Fragmenter mellom 3,0 og 5,0 kb i lengde ble skåret ut av gelen, ligert inn i vektoren pBluescript II KS+ og transformert inn i DH5a-celler. Bakteriekolonier inneholdende det størrelsesfraksjonerte biblioteket ble screenet med den DIG-merkede proben, og et 4,3 kb Kpn UEcoR l-fragment ble identifisert. Sekvensanalyse viste at denne klonen inneholdt et fullengde 1224 bp reduktasegen [SEKV ID NR:6] og kodet for et 43,7 kDa protein bestående av 408 aminosyrer [SEKV ID NR:7]. Aminosyresekvensen forutsagt ved det klonede genet matchet den N-terminale- og indre aminosyresekvensen tidligere oppnådd fra det rensede reduktaseproteinet. Videre var den antatte aminosyresekvensen homolog over hele dens lengde med minst fire andre FAD-avhengige pyridinnukleotidreduktaser, i området fra 69 % likhet med en cytokrom P450-type reduktasekomponent av dioxin dioksygenase fra Sphingomonas sp. RW1 til 36 % likhet med terpredoxin reduktasen fra en Pseudomonas- ax\ (se Figur 3). De to andre FAD-avhengige pyridinnukleotidreduktasene var fra R. erythropolis og P. putida. Proteiner i denne familien av FAD-avhengige pyridinnukleotidreduktaser har fem konserverte motiver. Motivene 1 og 3 inneholder tre konserverte glysinrester og svarer til ADP-bindingssetet for henholdsvis FAD og NAD(P). Motiv 5 svarer til setet som binder FAD-flavingruppen.

For å klone det andre genet, ble totalt P. maltophilia- DNA kuttet med Kpn I og EcoR I, og de resulterende restriksjonsfragmentene ble atskilt på en agarosegel. Fragmenter med en størrelse på omtrent 20 kb ble skåret ut av gelen, kuttet med flere restriksjonsenzymer og deretter hybridisert ved Southern blot til den DIG-merkede proben. Et kart over restriksjonssetene som omgir det andre genet ble konstruert basert på størrelsene av restriksjonsfragmentene som hybridiserte til proben. Disse eksperimentene viste at det fullengde andre reduktasegenet var del av et Apa l-fragment som var omtrent 3,0 kb langt. Deretter ble totalt P. maltophilia- DHk kuttet med Apa I, og restriksjonsfragmentene ble atskilt på en gel. Fragmenter mellom 2,0 og 4,0 kb i lengde ble skåret ut av gelen, ligert inn i vektoren pBluescript II KS+ og transformert inn i DH5a-celler. Bakteriekolonier inneholdende det størrelsesfraksjonerte biblioteket ble screenet med den DIG-merkede proben og et 3,0 kb Apa l-fragment ble identifisert. Sekvensanalyse viste at 3,0 kb klonen inneholdt en åpen leseramme på 1227 bp [SEKV ID NR:8] og kodet for et 43,9 kDa protein bestående av 409 aminosyrer [SEKV ID NR:9]. Aminosyresekvensen kodet for av det andre reduktasegenet er nesten identisk (98,8 % likhet) med sekvensen av det første genet.

EKSEMPEL 6: Transformasjon av planter

For å plassere hvert av de tre genene som koder for komponentene av dicamba O-demetylase individuelt inn i kassetter egnet for ekspresjon i planter, ble de følgende trinnene utført. Oligonukleotidprimere ble utformet for å danne et Nco I-sete ved 5'-enden og et Xba l-sete ved 3'-enden av hvert av de tre genene ved PCR-amplifisering. Ektheten av de resulterende PCR-produktene ble bekreftet ved sekvensering, og hvert gen ble deretter klonet individuelt inn i pRTL2-vektoren (gitt av Dr. Tom Clemente i kjernefasiliteten for plantetransformasjon, Universitetet i Nebraska, Lincoln, Nebraska). Denne vektoren inneholderen 144 bp translasjonsenhancersekvens fra tobakketsevirus (TEV) (Carrington og Freed, J. Virology, 64:1590-1597 (1990)) ved 5'-enden av polylinkeren. Oksygenase-, reduktase- og ferredoxingenene, hver med en 5' translasjonsenhancer, ble deretter klonet individuelt som Xho \ IXba l-fragmenter inn i planteekspresjonsvektoren pKLP36 (oppnådd fra Indu Maiti, Universitetet i Kentucky, Lexington, Kentucky) (Maiti og Shepard, Biochem. Biophys. Res. Commun., 244:440-444 (1998)). Denne binære vektoren inneholder peanøtt klorotisk virus fullengdepromoter (PCISV FLt36) med et duplisert enhancerdomene for konstitutiv ekspresjon i planter og ert rbcS 3' sekvensen for effektiv transkriptterminering (Maiti og Shepherd, Biochem. Biophys. Res. Commun., 244:440-444 (1998)). Konstruksjoner med alle tre genene på én binær vektor kan produseres ved anvendelse av kombinasjoner av de tre genene i flere forskjellige rekkefølger og orienteringer.

De følgende metodene ble anvendt for å flytte oksygenase-, ferredoxin- og reduktasekonstruksjonene individuelt inn i Agrobacterium tumefaciens og for å transformere hver konstruksjon inn i Arabidopsis og tobakk. De tre konstruksjonene ble flyttet inn i A. tumefaciens- stammen C58C1 ved en modifisert triparental parringsprosedyre rutinemessig anvendt ved kjernefasiliteten for plantetransformasjon. Dette involverte inkubering av Escherichia co//-celler som bærer hver konstruksjon med en blanding av A. tumefaciens- ceWer og £. co//-celler som bærer hjelperplasmidet pRK2013 (for plasmidmobilisering). A. tumefaciens-celler inneholdende hver av konstruksjonene ble deretter anvendt for å transformere tobakk og Arabidopsis med hjelp av kjernefasiliteten for plantetransformasjon. For tobakk ble bladeksplantater inkubert med en suspensjon av A fume/ac/ens-celler inneholdende hver av konstruksjonene, og skudd ble regenerert på fast medium inneholdende kanamycin (Horsch et al., Science, 227:1229-1231 (1985)). Detaljene i tobakkstransformasjonsprotokollen er som følger.

Fremstilling av tobakkseksplantater:

7,6-10,2 cm blader ble valgt fra 1 måned gamle planter (øverste 2 blader). Dette er tilstrekkelig for 30-40 eksplantater. Bladene ble plassert i et stort beger og dekket med dH20 i 20-30 minutter. Vannet ble ledet bort og bladene dekket med 10 % Chlorox™ pluss Tween 20™ (1 dråpe pr. 50 ml). Blader fikk ligge i bløt i 15 minutter og skylt 3X-5X med sterilt dhbO. Den ytre randen av bladet sammen med spissen og bladstilken ble trimmet, midtribben ble dissekert ut og det gjenværende vevet ble skåret i 0,5 x 0,5 cm kvadrater. Eksplantatene ble prekultivert, 30 pr. plate, med aksial side opp, i 1 dag før inokulering.

Agrobacterium inokulumfremstilling:

En 2 ml-kultur av Agrobacterium ble initiert i YEP-medium (10 g/l pepton, 10 g/l NaCI og 5 g/l gjærekstrakt, pH 7,0) tilsatt passende antibiotika. Kulturen fikk bli mettet. 2 ml-kulturen ble overført til 50 ml YEP-medium og fikk vokse i 6-8 timer (28°C med konstant risting). Cellene ble høstet ved sentrifugering (3.000-4.000 rpm). De bakterielle pelletene ble resuspendert til en endelig OD66o= 0,3-1,0, i samdyrkningsmedium.

Fremstilt<y>4grofcacfer/'wm-inokulum ble overført til petriplater. De forhåndsdyrkede eksplantatene ble inokulert i 30 minutter. Eksplantatene ble overført til sterilt filterpapir og plassert over på samdyrkningsmedium (10 eksplantater pr. plate) stivnet med 0,8 % agar, som ble dekket med et sterilt filterpapir (samkultureksplantater med aksial side opp). Eksplantatene ble dyrket sammen i 3 dager. Etter samdyrkningsperioden ble eksplantatene kort vasket i regenereringsmedium.

De vaskede eksplantatene ble overført til sterilt filterpapir, og vevet (10 eksplantater pr. plate) ble overført til regenereringsmedium gjort stivt med 0,8 % agar, pluss det passende selektive midlet (kanamycin 150 mg/l). Eksplantatene ble dyrket med aksial side opp. Vevet ble overført hver 2. uke til ferskt regenereringsmedium, og skudd ble skåret bort (>3 cm) og subkultivert til rotdannende medium. Skuddene med røtter ble deretter akklimatisert til jord.

Reagenser:

Predyrkningsmedium ( PM) :

MS-salter med B5-vitaminer, 3 % sukrose tilsatt 1 mg/l BAP, 0,1 mg/l NAA og 8Mg/I pCPA (p-klorfenoksyeddiksyre), pH 5,7 (NB: filtersterilisér alle vekstregulatorer).

Samdyrkningsmedium ( CM) :

1/10 MS/B5-medium, tilsatt 3 % sukrose, 1,0 mg/l BAP, 0,1 mg/l NAA og 8Mg/I pCPA.

Regenereringsmedium ( RM) :

MS/B5-medium tilsatt 1,0 mg/l BAP, 0,1 mg/l NAA og 3 % sukrose, pH 5,7. Anvend antibiotikaene karbenicillin (500 mg/l) og cefotaxim (100 mg/l).

Rotdannende medium:

MS-salter med full styrke B5-vitaminer, tilsatt 0,1 mg/l NAA og 1 % sukrose. Gjør mediet stivt med 0,8 % agar. Oppretthold antibiotikaene (hvis anvendelse av npt II 75 mg/l) karbenicillin (500 mg/l) og cefotaxim (100 mg/l).

Ti skudd ble valgt fra hver av de tre transformasjonseksperimentene, plassert på rotdannende medium i noen få uker og deretter flyttet til potter i drivhuset. For Arabidopsis ble en potte av planter med blomster inkubert med en suspensjon av A. tumefaciens- ceWer inneholdende hver av konstruksjonene, og plantene fikk deretter sette frø (Bechtold et al., CR. Acad. Sei. Paris, Sciences de la vie/Life sciences, 316:1194-1199 (1993); Clough og Bent, Plant J., 16(6):735-743 (1998)). Frøet ble samlet opp og spirte på medium med kanamycin. Etter at frøplantene hadde utviklet et tilstrekkelig rotsystem, ble mange planter valgt fra hvert transformasjonseksperiment og flyttet til potter i et vekstkammer.

For evaluering av ekspresjonen av hvert gen i de transformerte plantene, ble Western blot av bladlysater fra mange transformerte planter fremstilt og tilsatt polyklonale antistoffer som detekterer de tre komponentene av dicamba O-demetylase. For å bestemme enzymaktiviteter for hvert enzym i planteekstrakter, var fremgangsmåten å kombinere bladlysater fra transformerte planter som uttrykker oksygenase-, ferredoxin- eller reduktaseproteinene med overskuddsmengder av de andre O-demetylasekomponentene renset fra P. maltophilia stamme DI-6. Disse blandingene ble testet for dicamba O-demetylaseaktivitet med både standard<14>C-merket dicamba-test (se Eksempel 1 og 3) og en HPLC-test ved anvendelse av ikke-radioaktiv dicamba som substrat (dicamba og 3,6-DCSA eluerer ved forskjellige punkter fra HPLC og kan kvantifiseres).

For å teste ekspresjon av genprodukter i kloroplastene, ble konstruksjoner utført med en transit-peptidsekvens ved 5'-enden av oksygenase-, ferredoxin- og reduktasegenene. En slik fremgangsmåte var vellykket for innføring av toleranse til sulfonylureaherbicidene i tobakksplanter (0'Keefe et al., Plant Physiol., 105:473-478 (1994)). Mer spesifikt ble ert ribulose 1,5-bisfosfat karboksylase liten subenhet transit-peptid (signal) sekvens (nukleinsyresekvens representert ved SEKV ID NR:19) genetisk overført til en intermediær pRTL2-vektor inneholdende oksygenase-, ferredoxin- eller reduktasegenene, hver med dets egen ekspresjonskontrollsekvens (se ovenfor). Dette ble oppnådd ved å lage Ncol-seter på begge ender av transit-peptidet ved anvendelse av oligonukleotidprimere og PCR-protokollen. Ncol-setene letter innføringen av transit-peptidet mellom TEV-ledersekvensen og rapportørgenet (oksygenase, reduktase eller ferredoxin) i pRTL2-vektoren. Hele kassetten (TEV-leder, transit-peptidet og rapportørgenet) ble deretter kuttet ut av pRTL2-vektoren som et Xhol/Xbal-fragment og innført i den binære vektoren pKLP36 inneholdende PCISV FLt36-promoteren og rbcS 3'-terminatoren.

For å teste muligheten av at kodonanvendelsen av det bakterielle ferredoxingenet ikke var fullstendig optimal for effektiv translasjon i en plantecelle, ble et syntetisk ferredoxingen som koder for samme aminosyresekvens som P. maltophilia stamme DI-6 ferredoxin, men med optimalisert kodonvalg for tofrøbladete planter, syntetisert ved Entelechon, GmbH (Regensberg, Tyskland). Det er godt dokumentert at endringer i kodonanvendelse er essensiell for optimal ekspresjon av de bakterielle B.f.-toksingenene i planteceller (se f.eks. Diehn et al., Genetic Engineering, 18:83-99 (1996)).

EKSEMPEL 7: Sprøyting av planter

For å teste resistensen av de transgene tobakksplantene til dicamba, ble frø fra To-generasjonen beskrevet i Eksempel 6 ovenfor spirt og dyrket til 10-12-bladers stadiet. Med hjelp fra Avdeling for landbruksfag ble disse plantene underkastet "eksakt sprøyting" ved anvendelse av en sprøyte laget på bestilling (Burnside, Weed Science vol. 17, nr. 1, 102-104, 1969) produsert av ISCO. Sprøyten har en TEEJET-dyse og skjerm, anvender en leveringshastighet på 1,87 mpt og et trykk på 42 PSI. Dysehøyden er satt 20 cm over plantene. Dicamba (kommersielt produkt- Clarity), ved forskjellige konsentrasjoner, ble sprøytet på plantene blandet med et ikke-ionisk overflateaktivt middel ved en mengde på 18,7 ml/m<2>(20 gallon pr. acre) under sammenpresset luft.

For å etablere en innledende drepekurve, ble villtypetobakksplanter behandlet med økende konsentrasjoner av dicamba i området fra 0 til 0,056 g/m<2>(0 til 0,5 pund/acre). Ved å ha etablert 100 % sensitivitet av villtypeplantene til 0,056 g/m<2>(0,5 pund/acre) av dicamba, ble transgene planter inneholdende oksygenasegenet alene med eller uten transit-peptidet behandlet med økende konsentrasjoner av dicamba i området fra 0,056 til 0,55 g/m<2>( 0,5 pund/acre til 5 pund/acre). Transgene planter som bærer oksygenasegenkonstruksjoner, men som mangler den transit-peptidkodende sekvensen viste resistens (dvs. vokste og var friske) til dicamba-behandling på minst 0,275 g/m<2>(2,5 pund/acre). De transgene tobakksplantene som bærer oksygenasegenkonstruksjonene med transit-peptidet vokste og var friske når de ble sprøytet med en konsentrasjon av dicamba på opptil 0,55 g/m<2>(5 pund/acre). Det betyr at transgene planter inneholdende oksygenasegenet med eller uten en transit-peptidkodende sekvens lignet de ubehandlede kontrollplantene opptil minst de angitte mengdene av dicamba, mens de ikke-transgene plantene behandlet med samme mengder av dicamba viste redusert vekst, visning og alvorlig nekrose.

I et lignende eksperiment ble transgene planter inneholdende tre-gen-konstruksjonen (oksygenase-, ferredoxin- og reduktasegener) sprøytet med 0,014 g/m<2>(0,125 pund/acre) dicamba. Transgene planter inneholdende tre-gen-konstruksjonen vokste og var friske når de ble sprøytet med denne konsentrasjonen av dicamba, mens de ikke-transgene plantene behandlet med samme mengde av dicamba viste redusert vekst, visning og alvorlig nekrose. Siden transgene planter med oksygenasekonstruksjonen alene viste dicamba-toleranse opptil 0,275 g/m<2>(2,5 pund/acre) dicamba, er det antatt at de transgene plantene inneholdende tre-gen-konstruksjonen vil vise lignende resistens opptil 0,275 g/m<2>(2,5 pund/acre) eller til og med høyere.

Disse resultatene demonstrerer klart at de transgene plantene transformert med den dicamba-nedbrytende oksygenasen eller tre-gen-konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse har tilegnet seg resistens til dicamba.

Claims

1. DNA-molekyl,karakterisert vedat det omfatter en DNA-sekvens som koder for et dicamba-nedbrytende ferredoxin som har en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: a. en aminosyresekvens omfattende SEKV ID NR:5; b. en aminosyresekvens som er et enzymatisk aktivt fragment av SEKV ID NR:5; og c. en aminosyresekvens som er minst 85 % identisk med SEKV ID NR:5 og som har dicamba-nedbrytende ferredoxinaktivitet.

2. DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter en DNA-sekvens som koder for et dicamba-nedbrytende ferredoxin omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR:5.

3. DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter en nukleinsyresekvens ifølge SEKV ID NR:4.

4. DNA-molekyl,karakterisert vedat det omfatter en DNA sekvens kodende for en dicamba-nedbrytende reduktase som har en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: a) en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:7 og SEKV ID NR:9; b) en aminosyresekvens som er et enzymatisk aktivt fragment av nevnte aminosyresekvens (a); og, c) aminosyresekvens som er minst 85% identisk med nevnte aminosyresekvens (a), og som har dicamba-nedbrytende reduktase aktivitet.

5. DNA molekyl ifølge krav 4,karakterisert vedat det omfatter en DNA sekvens kodende for en dicamba-nedbrytende reduktase omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR:7.

6. DNA molekyl ifølge krav 4,karakterisert vedat det omfatter en DNA sekvens kodende for en dicamba-nedbrytende reduktase omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR:9.

7. DNA molekyl ifølge krav 4,karakterisert vedat det omfatter en nukleinsyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:6 og SEKV ID NR:8.

8. DNA konstruksjon,karakterisert vedat den omfatter et DNA molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, operabelt koblet til minst en ekspresjonskontrollsekvens.

9. DNA konstruksjon ifølge krav 8,karakterisert vedat nukleinsyresekvensen har kodoner valgt for optimalisert ekspresjon i tofrøbladete planter.

10. DNA konstruksjon,karakterisert vedat den koder for en dicamba-nedbrytende O-demetylase, idet nevnte dicamba-nedbrytende O- demetylase omfatter en DNA sekvens funksjonelt koblet til ekspresjonskontrollsekvenser, hvori nevnte DNA sekvens koder for: a) en dicamba-nedbrytende oksygenase omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: (i) SEKV ID NR:3; (ii) en aminosyresekvens som er et enzymatisk aktivt fragment ifølge SEKV ID NR:3; (iii) en aminosyresekvens som er minst 85% identisk med SEKV ID NR:3 og som har dicamba-nedbrytende oksygenase aktivitet; og, (iv) en aminosyresekvens som er forskjellig fra SEQ ID NO:3 med en substitusjon, et tillegg, eller en substitusjon og et tillegg; b) et dicamba-nedbrytende ferredoxin omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: (i) en aminosyresekvens omfattende SEKV ID NR:5; (ii) en aminosyresekvens som er et biologisk aktivt fragment av SEKV ID NR:5; og, (iii) en aminosyresekvens som er minst 85% identisk med SEKV ID NR:5 og som har dicamba-nedbrytende ferredoxin aktivitet; og c) en dicamba-nedbrytende reduktase omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: (i) en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: SEKV ID NR:7 og SEKV ID NR:9; (ii) en aminosyresekvens som er et enzymatisk aktivt fragment av nevnte aminosyresekvens i (a); og, (iii) en aminosyresekvens som er minst 85% identisk med nevnte aminosyrsekvens (a) og som har dicamba-nedbrytende reduktase aktivitet.

11. DNA konstruksjon ifølge krav 8 eller krav 10,karakterisert vedat den videre omfatter en nukleinsyresekvens kodende for et transit peptid som målsøker nevnte nukleinsyresekvens til organeller i en plantecelle.

12. DNA konstruksjon ifølge krav 11,karakterisert vedat nevnte transit peptid blir kodet av SEKV ID NR: 19.

13. DNA konstruksjon ifølge et hvilket som helst av kravene 8-12,karakterisert vedat nevnte DNA konstruksjon er en vektor.

14. Transgen vertcelle,karakterisert vedat den omfatter en DNA konstruksjon ifølge et hvilket som helst av kravene 8-13.

15. Transgen vertcelle ifølge krav 14,karakterisert vedat nevnte DNA konstruksjon omfatter en DNA sekvens kodende for: en dicamba-nedbrytende oksygenase som har en aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR:3, en dicamba-nedbrytende ferredoxin med aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR:5, og en dicamba-nedbrytende reduktase med en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:7 og SEKV ID NR:9.

16. Transgen vertcelle ifølge krav 14 eller krav 15,karakterisert veda t den er en plantecelle.

17. Transgen vertcelle ifølge krav 14 eller krav 15,karakterisert veda t den er en mikroorganisme.

18. Transgen plante eller del av en plante,karakterisert vedat den omfatter en eller flere celler omfattende en DNA konstruksjon ifølge et hvilket som helst av kravene 8-13.

19. Transgen plante eller plantedel ifølge krav 18,karakterisert veda t nevnte DNA konstruksjon omfatter en DNA sekvens kodende for: en dicamba-nedbrytende oksygenase med en aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR:3, et dicamba-nedbrytende ferredoxin med en aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR:5 og en dicamba-nedbrytende reduktase med en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV ID NR:7 og SEKV ID NR:9.

20. Transgen plante eller plantedel ifølge krav 18 eller krav 19,karakterisert vedat planten er en tofrøbladet eller enfrøbladet plante som er tolerant overfor dicamba.

21. Fremgangsmåte for kontrahering av ugress i en åker inneholdende en dicamba-tolerant transgen plante ifølge et hvilket som helst av kravene 18-20,karakterisert vedat den omfatter tilføring av en mengde av dicamba til åkeren som er effektiv for å kontrollere ugresset i åkeren.

22. Fremgangsmåte for dekontaminering av et materiale inneholdende dicamba, karakterisert vedat den omfatter tilføring av en mengde av en dicamba-nedbrytende transgen mikroorganisme ifølge krav 17 til materialet, idet mengden er effektiv for å nedbryte minst noe av dicamba i materialet.

23. Fremgangsmåte for selektering av transformerte planteceller,karakterisert vedat det omfatter tilveiebringing av en populasjon av planteceller; transformering av minst noen av plantecellene i populasjonen av planteceller med DNA konstruksjonen ifølge et hvilket som helst av kravene 8-13 slik at de er tolerante overfor dicamba; og dyrking av den resulterende populasjonen av planteceller i et kulturmedium inneholdende dicamba i en konsentrasjon valgt slik at de transformerte plantecellene vil vokse og slik at ikke-transformerte planteceller ikke vil vokse.

24. Fremgangsmåte for selektering av transformerte planter,karakterisert vedat den omfatter; tilveiebringing av en populasjon av planter som kan omfatte planter som kan bli transformert med DNA konstruksjonen ifølge et hvilket som helst av kravene 8-13 slik at de er tolerante overfor dicamba; og tilføring av en mengde av dicamba til populasjonen av planter, idet mengden av dicamba blir valgt slik at de transformerte plantene vil vokse og slik at veksten av ikke-transformerte planter vil bli hemmet.

25. Fremgangsmåte for selektering, eller screening av transformerte vertceller, intakte organismer og deler av organismer,karakterisert vedat den omfatter; tilføring av en populasjon av vertceller, intakte organismer eller deler av organismer som kan omfatte vertceller, intakte organismer eller deler av organismer som kan bli transformert med DNA konstruksjonen ifølge et hvilket som helst av kravene 8-13 slik at de kan nedbryte dicamba; bringe populasjonen av vertceller, intakte organismer eller deler av organismer i kontakt med dicamba; og bestemme nærværet eller nivået av fluorescens som skyldes 3,6-diklorsalicylsyre, idet 3,6-diklorsalicylsyren blir dannet i vertceller, intakte organismer eller deler av organismer som et resultat av nedbrytning av dicamba.

26. Fremgangsmåte for dekontaminering av et materiale inneholdende dicamba, karakterisert vedat den omfatter tilføring av en mengde av en dicamba-nedbrytende O-demetylase kodet for av DNA konstruksjonen ifølge krav 10, til materialet, idet mengden er effektiv til å nedbryte minst noe av dicamba i materialet.