HU226584B1 - Polymer-lipid microencapsulated gases for use as imaging agents - Google Patents

Description

A találmány diagnosztikai leképezőszerekre, különösen mikrorészecske formájú ultrahangos leképezőszerekre vonatkozik, amelyek kapszulázott lipidet tartalmaznak a szer echogenicitásának hosszú időn keresztül való fenntartása érdekében.

Az emberi és állati belső szervek és szerkezetek ultrahangos leképezésénél az ultrahang, amely olyan hanghullám, amelynek frekvenciája az emberi fül számára hallható tartomány felett van, visszaverődik, amikor a testbe jut. A különböző szövetek különbözőképpen verik vissza az ultrahangot, és a belső szerkezetekről visszaverődött különböző hullámokat ezután detektálják és elektronikusan látható formára alakítják.

Bizonyos körülmények között azonban különösen nehéz a szervekről vagy azok szerkezetéről használható képet nyerni, mivel az adott szerkezet nem megfelelően elérhető a körbevevő szövetek következtében és kontrasztfokozó szer jelenléte nélkül az ultrahanghullámok reflexiója által kapott ultrahangos kép nem megfelelő. Bizonyos fiziológiai és patológiai körülmények detektálása és megfigyelése lényegesen javítható, ha fokozzuk az ultrahangos kép kontrasztját oly módon, hogy a kérdéses szervbe vagy más egyéb szerkezetbe egy szert juttatunk be infúzióval. Más esetekben magának a kontrasztfokozó szer mozgásának kimutatása különös fontosságú. így például bizonyos véráramlási mintákat, amelyekről tudott, hogy bizonyos kardiovaszkuláris elváltozások eredménye, úgy lehet láthatóvá tenni, hogy a véráramba kontrasztképző szert juttatunk infúzióval és figyeljük annak dinamikáját a véráramban.

Az ultrahangos kontrasztszerként alkalmas anyagok úgy működnek, hogy hatással vannak az ultrahanghullámra, amely a testen keresztül megy és visszaverődik, és így egy képet alkot, amiből orvosi diagnózis állítható fel. A különböző típusú anyagok különbözőképpen és különböző mértékben befolyásolják az ultrahanghullámokat. Továbbá bizonyos, a kontrasztnövelő szerekkel kiváltott hatások könnyebben mérhetők és könnyebben megfigyelhetők, mint mások. Kontrasztanyag céljára az ideális készítmény kiválasztásával előnyben részesítik az olyan anyagokat, amelyek különösen erőteljes hatással vannak az ultrahanghullámra, amely keresztülmegy a testen. Ugyancsak szempont, hogy az ultrahanghullámokra kifejtett hatás könnyen mérhető legyen. Három fő kontrasztnövelő hatás ismert, amely az ultrahangos leképezésnél szerepet játszik: a visszaszórás, a sugárgyengítés és a hang sebességének különbözősége.

Visszaszórás: ha az ultrahanghullám, amely keresztüljut a testen egy szerkezettel, így egy szervvel vagy más testszövettel találkozik, a szerkezet visszaveri az ultrahanghullámok egy részét. A szervezetben lévő különböző szerkezetek különbözőképpen verik vissza az ultrahangenergiát és különböző erősséggel. Ezt a reflektált vagy visszavert energiát detektálják és alkalmazzák az adott szerkezet, amelyen az ultrahanghullámok keresztüljutottak, leképezésére. A „visszaszórás” kifejezés egy olyan jelenségre utal, amely során az ultrahangenergia visszaverődik a forrásra egy anyag által, amely bizonyos fizikai jellemzőkkel rendelkezik.

Régóta megfigyelték, hogy egy ultrahang képnél megfigyelt kontraszt növelhető olyan anyagok jelenléte révén, amelyekről ismert, hogy nagy mennyiségű visszaszórást okoznak. Ha egy ilyen anyagot a test egy meghatározott részébe adagolunk, növelhető a kontraszt a test ezen részéről kapott ultrahangos kép és az ilyen anyagot nem tartalmazó környező szövetek között. Nyilvánvaló, hogy fizikai tulajdonságaik alapján a különböző anyagok különböző mértékben váltanak ki visszaszórást. Ennek megfelelően a kontrasztnövelő anyagokkal összefüggő kutatásokat olyan anyagokra irányították, amelyek stabilak, nem toxikusak és maximális mennyiségű visszaszórást mutatnak.

Egy anyag azon képessége, hogy ultrahangenergiát képes visszaszórni, az anyag olyan jellemzőitől függ, mint például az anyag összenyomhatósága. Ha különböző anyagokat vizsgálunk, hasznos, ha az anyag egy adott tulajdonságát vizsgáljuk, amely a visszaszórást okozza, ez a „szórási keresztmetszet. Egy adott anyag szórási keresztmetszete arányos a szóró sugarával és függ továbbá az ultrahangenergia hullámhosszától, valamint az anyag más egyéb tulajdonságaitól [J. Ophir és K. J. Parker, Contrast Agents in Diagnostic Ultrasound, Ultrasound in Medicine & Biology, IS, n. 4, 319, 323 (1989)].

A különböző anyagok kontrasztfokozó szerként való alkalmasságának vizsgálatánál számolhatunk azzal, hogy az adott szer minél nagyobb szórási keresztmetszettel rendelkezzen és ennek megfelelően a szer minél nagyobb kontrasztot hozzon létre az ultrahangos leképezésnél. Feltehető, hogy egy szilárd részecske összenyomhatósága sokkal kisebb, mint a környező közegé és ugyanakkor a részecske sűrűsége sokkal nagyobb. Ebből a feltételezésből kiindulva egy kontrasztnövelő szerként használható szilárd részecske szórási keresztmetszete kb. 1,75 (lásd a fenti hivatkozás 325. oldala). Egy tisztán folyékony szóróanyag esetén az adiabatikus összenyomhatóság és sűrűség ezen anyagra nézve várhatóan kb. hasonló, mint a környező közegé és ez azt eredményezheti, hogy a folyadék szórási keresztmetszete zéró. Azonban a folyadék mutathat bizonyos visszaszórást, ha nagy térfogatban van jelen. Így például, ha egy folyékony szert juttatunk át egy igen kis edényből egy igen nagy edénybe úgy, hogy a folyadék lényegében az egész edényt kitöltse, a folyadék mérhető visszaszórást mutathat. Mindazonáltal a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a folyadékok relatíve nem hatásos szóróanyagok a szabad gáz mikrobuborékokhoz viszonyítva.

Sugárgyengítés: egy másik hatás, amely megfigyelhető, ha bizonyos kontrasztnövelő szerek jelen vannak, az ultrahanghullámok gyengülése (abszorpciója). Képkontrasztot lehet megfigyelni a szokásos leképezésnél, a helyi gyengülési (abszorpciós) különbségek miatt, amely a bizonyos szövettípusok között mutatkozik [K. J. Parker és R. C. Wang, „Measurement of Ultrasonic Attenuation Within Regions selected from

HU 226 584 Β1

B-Scan Images”, IEEE Traps. Biomed. Enar. BME 30(8), 431-37 (1983); K. J. Parker, R. C. Wang, és R. M. Lerner, „Attenuation of Ultrasound Magnitude and Frequency Dependence fór Tissue Characterization, Radiology, 153(3), 785-88 (1984)]. Feltételezték, hogy ha egy bizonyos szövetszakasz abszorpcióját egy szer infúzióval való bejuttatása előtt és után mérik, hangsúlyosabb képet nyernek. Azonban a folyékony szerek által kiváltott kontrasztnövelés mérésére szolgáló megoldások még nincsenek teljesen kifejlesztve, és még ha lennének is ilyen alkalmas módszerek, korlátozott azoknak a belső szerveknek vagy szerkezeteknek a száma, amelyeknél ez a módszer alkalmazható. így például nem valószínű, hogy egy folyékony kontrasztanyag által bekövetkezett gyengülés megfigyelhető egy kardiovaszkuláris rendszerben kialakított kép esetén, mivel a nagy térfogatú folyadék kontrasztanyag lenne szükséges, hogy jelen legyen az adott véredényben ahhoz, hogy lényeges különbség legyen mérhető az abszorpció mértékében.

A részecskék által kiváltott energiaabszorpció az úgynevezett „relatív mozgás mechanizmusa révén jön létre. A relatív mozgás által kiváltott abszorpcióváltozás lineárisan nő a részecskekoncentrációval és a részecskék és a környező közeg közötti sűrűség négyzetével [K. J. Parker és mtársai, „A Particulate Contrast Agent with Potential fór Ultrasound Imaging of Liver”, Ultrasound in Medicine & Biology, 13, No. 9, 555, 561 (1987)]. Ily módon, ahol lényeges mértékű szilárdrészecske-akkumuláció van, az abszorpciós kontraszt egy használható mechanizmus a leképezési kontraszt fokozódásának meghatározására, bár ez a hatás sokkal kisebb mértékű, mint a visszaszórási jelenség és a kardiovaszkuláris diagnózisnál úgy tűnik, a felhasználhatósága kicsi.

A hang terjedésének különbsége: egy további módszer az ultrahangos képek kontrasztjának fokozására azon alapszik, hogy a hang sebessége változik függően az adott közegtől, amelyen keresztülhatol. Ily módon, ha elegendően nagy térfogatú szert tudunk bejuttatni a kívánt területre, amely szeren a hang terjedése eltérő a környező szövetekétől, a hang terjedésének sebességében mutatkozott különbség mérhető lehet.

összefoglalva, az ultrahangos diagnosztika egy igen hatásos, nem invazív eszköz, amely felhasználható arra, hogy információkat nyerjünk a test belső szerveiről. A szürkeskálás leképezés és a színes Doppler megjelenése nagymértékben elősegítette és növelte a technikák körét. Bár a diagnosztikai célú ultrahangtechnikák jelentős mértékben fejlődtek, a kontrasztanyagok alkalmazása és előállítása terén még mindig nagy szükség van a feloldás fokozására kardiális perfúzió és szívkamrák, szilárd szervek, renális perfúziók, szilárd szerv perfúziók leképezésénél; valamint a véráram sebességének és irányának Doppler-jelekkel való vizsgálatánál a ténylegesidő-leképzésnél.

Különböző természetes és szintetikus polimereket alkalmaznak a kontrasztanyagok, így például levegő kapszulázására. Schneider és munkatársai [Schneider és mtársai, Invest. Rádiói., 27, 134-139 (1992)] három mikronos, levegővel töltött polimer részecskéket ismertetnek. Ezek a részecskék a leírás szerint stabilak a plazmában az alkalmazott nyomáson. Azonban, 2,5 MHz-nél az echogenicitásuk alacsony. Egy másik típusú mikrobuborékszuszpenziót állítanak elő ultrahangozott albuminból [Feinstein és mtársai, J. Am. Coll. Cardiol., 11,59-65 (1988)]. Eszerint a mikrobuborékkészítmények, amelyek megfelelő méretűek transzpulmonáris bevitelre, kiváló stabilitásúak in vitro. Azonban a mikrobuborékok élettartama in vivő rövid, felezési idejük néhány másodperc (amely kb. azonos egy cirkulációs átjutás idejével), mivel instabilak nyomás alatt [Gottlieb, S. és mtársai, J. Am. Soc. Echo., 3, 328 (1990), Abstract; és Shapiro, J. R. és mtársai, J. Am. Coll. Cardiol., 16, 1603-1607 (1990)]. Zselatinba kapszulázott levegőbuborékokat ismertetnek Carroll és munkatársai [Carroll, B. A. és mtársai, Invest. Rádiói., 15, 260-266 (1980), és Carroll, B. A. és mtársai, Radiology, 143, 747-750 (1982)], ezek azonban a nagy méretük miatt (12 pm és 80 pm) nem valószínű, hogy keresztüljutnak a pulmonáris kapillárisokon. Zselatinba kapszulázott mikrobuborékokat ismertetnek továbbá a PCT/US80/00502 számú nemzetközi bejelentésben (Rasor Associates, Inc.), ezeket zselatin „összeolvasztással” állítják elő.

Galaktóz mikrokristályokkal stabilizált mikrorészecskéket (SHU 454 és SHU 508) ismertetnek Fritz és munkatársai [Fritzch T. és mtársai, Invest. Rádiói. 23 (Suppl 1), 302-305 (1988); és Fritzsch, T. és mtársai, Invest. Rádiói., 25 (Suppl 1), 160-161 (1990)]. A mikrobuborékok in vitro élettartama 15 percig terjed, de in vivő kevesebb mint 20 másodperc [Rovai, D. és mtársai, J. Am. Coll. Cardiol., 10, 125-134 (1987); és Smith, M. és mtársai, J. Am. Coll. Cardiol., 13, 1622-1628 (1989)]. Egy fluortartalmú anyagba kapszulázott gázmikrogömböcskéket ismertetnek a WO 96/04018 számú közzétételi iratban (Molecular Biosystems, Inc.)

Az EP 90901933.5 számú szabadalmi bejelentésben (Schering Aktiengesellschaft) mikrokapszulázott gáz vagy illékony folyadék előállítását és alkalmazását ismertetik az ultrahangos leképezésnél, a mikrokapszulákat szintetikus polimerekből vagy poliszacharidokból állítják elő. Az EP 91810366.4 számú szabadalmi bejelentésben (Sintetica SA, EP 458 741 A1) levegő- vagy gázmikroballonokat ismertetnek, amelyek az érintkezési felületeiken egy polimer membránnal vannak bevonva, amely egy injekció céljára alkalmas vizes hordozóban diszpergálható és állatoknak adagolható vagy orális, rektális vagy uretális adagolású készítménnyé alakítható terápiás vagy diagnosztikai célra. A WO 92/18164 számú közzétételi iratban (Delta Biotechnology Limited) mikrorészecskék előállítását ismertetik porlasztva szárítással szigorúan szabályozott körülmények között, ezek a hőmérséklet, a porlasztás sebessége, részecskeméret és szárítási, a porlasztva szárításnál vizes proteinoldatot alkalmaznak, amely egy üreges gömbbé alakul, amely gázt foglal magában és ezt alkalmazzák leképezéshez. A WO 93/25242 számú közzétételi iratban mikroré3

HU 226 584 Β1 szecskék előállítását ismertetik ultrahangos leképezéshez, amely egy policianoakrilát- vagy poliészterburkolatban gázt tartalmaz. A WO 92/21382 számú szabadalmi leírásban mikrorészecske formájú kontrasztanyag előállítását ismertetik, amely egy kovalens kötésű mátrixban gázt tartalmaz, amely mátrixanyaga egy szénhidrát. Az US 5 334 381, 5 123 414 és 5 352 435 számú szabadalmi leírásokban ultrahangos kontrasztanyagként való felhasználásra liposzómákat ismertetnek, amelyek gázokat, gázprekurzorokat, így például pH-aktivált vagy fotoaktivált gáz formájú prekurzorokat, valamint más egyéb folyadékokat, vagy szilárd, kontrasztnövelő szereket tartalmaznak.

Az US 5 393 524 számú szabadalmi leírásban különböző szereket, így például fluorkarbonokat ismertetnek az ultrahangos leképezésnél kontrasztnövelő anyagként. Ezek a szerek adott gázokból álló igen kis buborékokat vagy mikrobuborékokat tartalmaznak, ezek hosszú élettartamúak oldatban és elegendően kis méretűek ahhoz, hogy a tüdőn átjussanak, és így lehetővé válik ultrahangos leképezőszerként való alkalmazásuk a kardiovaszkuláris rendszerben vagy más élő szervezetben. A WO 95/23615 számú közzétételi iratban leképezéshez alkalmas mikrokapszulákat ismertetnek, amelyek egy perfluorkarbont tartalmazó oldat, így például proteinoldat koacerválásával vannak előállítva. A PCT/US94/08416 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben (Massachusetts Institute of Technology) mikrorészecskéket ismertetnek, amely leképezőszert, így például gázokat, így például levegőt vagy perfluorkarbonokat magában foglaló polietilénglikol-poli(laktid-koglikolid) blokkpolimerekből vannak előállítva. Mint azt a WO 94/16739 számú közzétételi iratban említik, bár a szilárd anyagok és folyadékok hasonló mértékben verik vissza a hangot, köztudomásúlag a gázok hatásosabbak és ezért előnyösebb ultrahang kontrasztanyagként való alkalmazásuk. Ténylegesen, mint azt az említett PCT közzétételi irat 12. példájában bemutatják, a proteinmikrokapszulákat biztonsági meggondolásokból (valamint hatásossági szempontokból) elvetették, kis sertéseknél való alkalmazáskor, viszonyítva az emulzióhoz vagy kolloid szuszpenzióhoz.

Ezen ismert mikrorészecskék egyikét sem lehet azonban kimutatni más detektálásra szolgáló módszerekkel, így például röntgensugárral, pozitron- vagy fotonemissziós tomográfiával vagy mágneses rezonancia leképezéssel.

Ezen esetek mindegyikénél szükséges növelni a leképezőszer echogenicitását együttesen a stabilitás fokozásával és megtartásával, valamint a leképezőszer könnyű előállíthatóságával. Az egyik módszer a mikrorészecskék echogenicitásának növelésére az, hogy növelik azt az időt, amíg a kapszulázott gáz a cirkuláló mikrorészecskékben marad. Sajnos azonban a legtöbb esetben a gázok gyorsan kidiffundálnak, függetlenül a gáz vagy a kapszulázóanyag természetétől, különösen bekövetkezik ez az érrendszer vizes közegében.

A fentieknek alapján a találmányunk célja szignifikáns mértékben növelt echogenicitású mikrorészecskék biztosítása. A találmány további célja olyan mikrorészecskék biztosítása, amelyekben a leképezőszer több mint néhány cirkulációs időn túl is megmarad in vivő. A találmány célja továbbá mikrorészecskék biztosítása, amelyekben a gáz kapszulázva marad hosszabb ideig, ily módon növelhető az in vivő echogenicitásuk.

A találmány további célja leképezőszert tartalmazó mikrorészecskék biztosítása. A találmány további célja olyan leképezőszereket tartalmazó mikronizált részecskék biztosítása, amelyekkel megcélozhatok a test specifikus részei is. A találmány célja még tovább, eljárás biztosítása leképezőszereket magukban foglaló mikrorészecskék előállítási eljárásának biztosítása.

Felismertük, hogy gázok, különösen fluorozott gázok, így például perfluorkarbonok mikrorészecskékbe való beépítésével, amely mikrorészecskék természetes vagy szintetikus polimer és lipid kombinációjából állnak, jelentős mértékben megnövelt echogenicitással rendelkeznek viszonyítva a lipidet nem tartalmazó mikrorészecskékhez. Lipidektől eltérő anyagok, amelyek hidrofóbok és gátolják a víz diffúzióját a mikrorészecskékben szintén beépíthetők a mikrorészecskékbe az echogenicitás növelésére. Egy előnyös kiviteli formánál a polimer szintetikus, biológiailag lebomlani képes (biodegradálható) polimer. A mikrorészecskéket olyan átmérővel állítjuk elő, amelyek képesek bejutni a leképezni kívánt szövetbe, így például az átmérő 0,5-8 μιτι intravaszkulárís adagolásnál és 0,5-5 mm a gasztrointesztinális traktus vagy más szervek leképezésénél. Előnyös polimerek a polihidroxisavak, így például politejsav-o-glikolsav, polilaktid vagy poliglikolid, különösen előnyösen polietilénglikolhoz konjugálva vagy más egyéb anyagok, amelyek gátolják a retikuloendoteliális rendszer (RÉS) által való felvételt. Különösen előnyös lipidek közé tartoznak például a következők: foszfolipidek, előnyösen dipalmitoil-foszfatidil-kolin (DPPC), disztearoilfoszfatidil-kolin (DSPC), diarachidoil-foszfatidil-kolin (DAPC), dibehenoil-foszfatidil-kolin (DBPC), ditrikozanoil-foszfatidil-kolin (DTPC) és dilignoceroilfatidil-kolin (DLPC), ezek mennyisége előnyösen 0,01-30 (t lipid/t polimer), különösen előnyösen 0,1-10 (t lipid/t polimer).

Ezen mikrorészecskék adhéziója növelhető vagy csökkenthető a bioadhezív polimer megválasztásával, így például az adhézió növelhető abban az esetben, ha a polimert orális adagolásra alkalmazzuk. A célba való juttatást elérhetjük a polimer megválasztásával vagy a polimert olyan ligandumhoz kapcsoljuk, amely specifikusan kötődik egy adott szövettípushoz vagy egy sejtfelületi molekulához. Továbbá a ligandumot mikrorészecskékhez is csatlakoztathatjuk, amely befolyásolja a töltését, lipofilicitását vagy hidrofilicitását. A polimer mikrorészecskék alkalmasak a legkülönbözőbb diagnosztikai leképező eljárásoknál való felhasználásra, így például ultrahangos leképezésnél, mágneses rezonancia leképezésnél, fluoroszkópiánál, röntgenvizsgálatnál és komputertomográfiánál. A mikrorészecskék alkalmazhatók a legkülönbözőbb leképezési területeken, beleértve a kardiológiai felhasználást, vérperfúziós alkalmazást, valamint a szerv- vagy perifériális véna leképezést.

HU 226 584 Β1

Az 1. ábrán bemutatjuk a polimer mikrorészecskékbe beépített lipid lánchosszúságának hatását a visszaszórás mértékére az idő függvényében (perc) lecitin (tele kör), DPPC (üres négyzet), DSPC (üres rombusz) és DAPC (X) esetén.

A találmány szerinti eljárással polimer szállítórendszer előállítását biztosítjuk, amely rendszer gázokat, különösen perfluorkarbonokat tartalmazó polimer-lipid mikrorészecskéket tartalmaz. A mikrorészecskék alkalmazhatók a legkülönbözőbb diagnosztikai, ultrahangos leképező eljárásoknál, különösen a véredény leképezésére szolgáló ultrahangos eljárásoknál és az echokardiográfiában. A plusz lipidbeépítés szignifikáns mértékben növeli az echogenicitást viszonyítva ugyanazon polimer mikrorészecskékhez, amely nem tartalmaz lipidet.

Eljárások és reagensek a mikrorészecskék előállítására

A találmány értelmében a mikrorészecske magában foglalja a mikrogömböket és mikrokapszulákat, valamint mikrorészecskéket, hacsak másképp nem adjuk meg. A mikrorészecskék lehetnek gömb formájúak vagy nem gömb formájúak. A mikrokapszulák olyan mikrorészecskék, amelyek egy külső polimer burkolatból állnak, amely egy más anyagból álló magot, esetünkben gázt vesz körül. A mikrogömb általában szilárd polimer gömb, amely lehet méhsejtszerkezetű, amelyet a polimerben pórusok alakítanak ki, és ez van megtöltve a leképezési célra szolgáló gázzal, mint azt az alábbiakban majd ismertetjük.

Polimerek

A találmány szerinti megoldásnál mind nemdegradálható, mind degradálható mátrixok alkalmazhatók a lipidekkel elkeverve a gázok szállítására, bár előnyösek a biodegradálható mátrixok, különösen intravénás injekció céljára. A nemerrodálható polimereket orális adagolásra lehet alkalmazni. Előnyösek a szintetikus polimerek, a reprodukálható előállításuk és degradációjuk miatt. A polimereket azon az alapon választjuk ki, hogy milyen az in vivő stabilitási idejük, azaz az idő, amely szükséges a leképezni kívánt helyhez való eljutásukhoz és mennyi a leképezéshez szükséges idő. Egy megvalósítási formánál a mikrorészecskék in vivő stabilitása 20-30 perc vagy még több, például echokardiográfiánál, neurozonográfiánál, hiszterozalspingográfiánál, valamint szilárd szervek diagnosztikai eljárásainál való alkalmazásnál. A kontrasztanyagot kapszulázva tartalmazó mikrorészecskék in vivő stabilitását beállíthatjuk az előállítási eljárás alatt polimerekkel, így például polietilénglikollal (PEG) kopolimerizált poli(laktidkoglikolid)-dal. A PEG-t ha a külső felületen alkalmazzuk, ezen anyagok cirkulációs idejét meghosszabbíthatja, mivel hidrofil tulajdonságú.

A szintetikus polimerek néhány alkalmas képviselője például a következő: polihidroxisavak, így poli(tejsav)-koglikolsav, poliglikolidok, polilaktidok, poli(laktidkoglikolid) kopolimerek és keverékei, polianhidridek, poliortoészterek, poliamidok, polikarbonátok, polialkilének, így például polialkilén és polipropilén, polialkilénglikolok, így például polietilénglikol, polialkilénoxidok, így például poli(etilén-oxid), poli(alkiléntereftalát)-ok, így például poli(etilén-tetraftalát), poli(vinil-alkohol)-ok, polivinil-éterek, polivinil-észterek, polivinil-halogenidek, így például poli(vinil-klorid), poli(vinilpirrolidon), polisziloxánok, poli(vinil-alkohol)-ok, polivinil-acetátok, polisztriol, poliuretánok, és ezek kopolimerjei, cellulózszármazékok, így például alkil-cellulóz, hidroxi-alkil-cellulózok, cellulóz-éterek, cellulóz-észterek, nitrocellulózok, metil-cellulóz, etil-cellulóz, hidroxipropil-cellulóz, hidroxi-propil-metil-cellulóz, hidroxibutil-metil-cellulóz, cellulóz-acetát, cellulóz-propionát, cellulóz-acetát-butirát, cellulóz-acetát-ftalát, karboxiletil-cellulóz, cellulóz-triacetát, valamint cellulóz-szulfátnátriumsó (szintetikus cellulózként is említjük), akrilsav-polimerek, metakrilsav vagy ezek kopolimerjei vagy származékai, beleértve az észtereket, polimetilmetakrilát, poli(butil-metakrilát), poli(izobutil-metakrilát), poli(hexil-metakrilát) poli(izodecil-metakrilát), poli(lauril-metakrilát), poli(fenil-metakrilát), poli(metilakrilát), poli(izoporpil-akrilát), poli(izobutil-akrilát) és poli(oktadecil-akrilát) (ezeket poliakrilsavakként is említjük), polivajsav, polivalériánsav, polilaktid-kokaprolakton, és ezek kopolimerjei és keverékei. A „származékok” kifejezés magában foglal minden polimert, amelyek szubsztitúciós, addíciós vagy kémiai csoportokat tartalmaznak, így például alkil-, alkiléncsoportokat, amelyek hidroxilezve, oxidálva vagy más egyéb, a szakember számára ismert módon módosítva vannak.

A nem biodegradálható polimerek közül előnyös az etilén-vinil-acetát, poli(met)akrilsav, a poliamidok és ezek kopolimerjei és keverékei.

Az előnyös biodegradálható polimerek közé tartoznak például a következők: hidroxisavak, így például tejsav és glikolsav polimerjei, polilaktid, poliglikolid, poli(laktid-koglikolid) és ennek PEG-gel alkotott kopolimerjei, polianhidridek, poli(orto)észterek, poliuretánok, polivajsav, poli(laktid-kokaprolakton) és ezek keverékei és kopolimerjei.

Előnyös természetes polimerek közé tartoznak például a proteinek, így például albumin és prolaminok, így például zein, továbbá poliszacharidok, így például alginát, cellulóz és polihidroxi-alkanoátok, így például polihidroxi-butirát.

Különösen előnyös bioadhezív polimerek a nyálkahártya-felületek leképezéséhez, így például a gasztrointesztinális traktusban, például a polianhidridek, poliakrilsav, poli(metil-metakrilát)-ok, poli(etil-metakrilát)-ok, poli(butil-metakrilát)-ok, poli(izobutil-metakrilát)-ok, poli(hexil-metakrilát) poli(izodecil-metakrilát), poli(lauril-metakrilát), poli(fenil-metakrilát), poli(metilakrilát), poli(izopropil-akrilát), poli(izobutil-akrilát) és poli(oktadecil-akrilát).

Oldószerek

Mint már a fentiekben említettük, a polimer oldószer egy olyan szerves oldószer, amely illékony vagy amelynek relatíve alacsony a forráspontja vagy vákuumban eltávolítható és amely elfogadható humán alkalmazásnál, ha nyomokban van jelen, ilyen például a

HU 226 584 Β1 metilén-klorid. Más egyéb oldószerek, így például etilacetát, etanol, metanol, dimetil-formamid (DMF), aceton, acetonitril, tetrahidrofurán (THF), ecetsav, dimetilszulfoxid (DMSO) vagy kloroform szintén alkalmazható, ezek kombinációi szintén. Általában a polimert olyan mennyiségben oldjuk az oldószerben, hogy az oldat koncentrációja 0,1-60 t/tf%, még előnyösebben 0,25-30 t/tf% legyen.

Hidrofób vegyületek

Lipidek

Általában a hidrofób tulajdonságú vegyületek hatásos mennyiségének beépítésével gátoljuk a víz bejutását és/vagy felvételét a mikrorészecskék által, és így hatásosan növeljük a gázt kapszulázva tartalmazó polimer mikrorészecskék echogenicitását, különösen fluorozott gázok, így például perfluorkarbonok esetén. Az erre a célra alkalmazható lipidek, amelyek stabilizálják a gázt a polimer mikrorészecskéken belül, a korlátozás szándéka nélkül lehetnek például a következők: zsírsavak és ezek származékai, mono-, di- és trigliceridek, foszfolipidek, sfingolipidek, koleszterin és szteroidszármazékok, terpének és vitaminok. A zsírsavak és származékaik a korlátozás nélkül lehetnek például a következők: telített és telítetlen zsírsavak, páros és páratlan számú zsírsavak, cisz- és transz-izomerek, valamint zsírsavszármazékok, így például alkoholok, észterek, anhidridek, hidroxi-zsírsavak és prosztaglandinok. A telített és telítetlen zsírsavak lehetnek például a korlátozás szándéka nélkül a következők: 12-22 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú molekulák. A telített zsírsavak lehetnek például a korlátozás szándéka nélkül laurinsav, mirisztinsav, palmitinsav, vagy sztearinsav. A telítetlen zsírsavak lehetnek például a korlátozás szándéka nélkül laurinsav, fizeterinsav, mirisztoleinsav, palmitoleinsav, petrozelinsav és olajsav. Az alkalmas elágazó láncú zsírsavak közül említjük például a következőket: izolaurinsav, izomirisztinsav, izopalmitinsav, izosztearinsav és izoprenoidok. A zsírsavszármazékok közé tartoznak például a következők: dimetilkumarin-3-il)-karbonil)-metil-amino-oktadekoinsav; N-[12-(((7’-dietil-amino-kumarin-3-il)-karbonil)-metilamino)-oktadekanoil]-2-amino-palmitinsav, N-szukcinildioleiol-foszfatidil-etanol-amin és palmitoil-homocisztein; és/vagy ezek kombinációi. A mono-, di- és trigliceridek, valamint ezek származékai közé tartoznak például a molekulák, amelyek 6-24 szénatomos zsírsavakat vagy zsírsavak keverékét tartalmazzák, ilyenek például a digalaktozi-diglicerid, 1,2-dioleoil-sn-glicerin, 1,2-dipalmitoil-sn-3-szukcinil-glicerin, és 1,3-dipalmitoil-2-szukcinil-glicerin.

Az alkalmas foszfolipidek közé tartoznak például a következők: foszfatidinsavak, foszfatidil-kolinok, mind telített és telítetlen lipidek, kolinok telített vagy telítetlen lipidekkel, foszfatidil-etanol-aminok, foszfatidil-glicerinek, foszfatidil-szerinek, foszfatidil-inozitok, lizofoszfatidilszármazékok, kardiolipin és β-acil-y-alkil-foszfolipidek. A foszfolipidek közé tartoznak továbbá a foszfatidil-kolinok, így például a következők: dioleoil-foszfatidil-kolin, dimirisztoil-foszfatidil-kolin, dipentadekanoilfoszfatidil-kolin, dilauroil-foszfatidil-kolin, dipalmitoilfoszfatidil-kolin (DPPC), disztearoil-foszfatidil-kolin (DSPC), diarachidoil-foszfatidil-kolin (DAPC), dibehenoil-foszfatidil-kolin (DBPC), ditrikozanoil-foszfatidil-kolin (DTPC), dilignoceroilfatidil-kolin (DLPC), továbbá foszfatidil-etanol-aminok, így például dioleil-foszfatidiletanol-amin vagy 1-hexadecil-2-palmitoil-glicerofoszfoetanol-amin. A szintetikus foszfolipidek, amelyek aszimmetrikus acélláncot tartalmaznak (például az egyik 6 szénatomos, a másik 12 szénatomos) szintén alkalmazhatók.

A felhasználható sfingolipidek közé tartoznak például a következők: ceramidok, sfingomielinek, cerebrozidok, gangliozidok, szulfatidek és lizoszulfatidek. A sfingolipidek közül említjük például a gangliozid GM1 és GM2 anyagokat.

A felhasználható szteroidok közé tartoznak például a következők: koleszterin, koleszterin-szulfát, koleszterin-hemiszukcinát, 6-(5-koleszterol-3p-il-oxi)hexil-6amino-6-dezoxi-1-tio-a-D-galaktopiranozid, 6-(5-koleszten-38-tloxi)-hexil-6-amino-6-dezoxil-1-tio-a-Dmannopiranozid és koleszteril)-4'-trimetil-35-ammonio)butanoát.

Lipidként alkalmazhatunk még továbbá tokoferolt vagy ezek származékait, valamint olajokat és derivatizált olajokat, így például sztearil-amin.

A kationos lipidek közül említjük például a következőket: DOTMA, N-[1-(2,3-dioleoil-oxi)-propil-N,N,Ntrimetil-ammónium-klorid; DOTAP, 1,2-dioleoil-oxi-3(trimetil-ammonio)-propán; és DOTB, 1,2-dioleoil-3-(4’trimetil-ammonio)-butanoil-sn-glicerol.

Különösen előnyös lipidek a foszfolipidek, így például a következők: DPPC, DDSPC, DAPC, DSPC, DTPC, DBPC, DLPC és különösen előnyösen DPPC, DAPC és DBPC.

A lipidtartalom általában 0,01-30 (t lipid/t polimer), különösen előnyösen 0,1-10 (t lipid/t polimer).

További hidrofób vegyületek

Hidrofób vegyületként továbbá alkalmazhatunk még aminosavakat, így például triptofánt, tirozint, izoleucint, leucint és valint, aromás vegyületeket, így például alkil-parabent, például metil-parabent, valamint benzoesavat.

Leképezőszerek

Gázok

A találmány szerinti mikrorészecskékbe bármilyen biokompatibilis vagy farmakológiailag elfogadható gázt beépítünk. A gáz bármilyen olyan vegyületre utal, amely a leképezés hőmérsékletén gáz vagy gáz kialakítására képes. Az ilyen gáz lehet egyetlen vegyület, így például oxigén, nitrogén, fenol, argon vagy ezek keverékei, így például levegő. Előnyösek a fluorozott gázok. A fluorozott gázok közül említjük például a következőket: CF₄, C₂F₆, C₃F₈, C₄F₈, SF₆, C₂F₄, és C₃F₆.

A perfluorpropán különösen előnyös, mivel az oldhatatlan gáz és nem kondenzál az alkalmazás hőmérsékletén és farmakológiailag elfogadható.

HU 226 584 Β1

További leképezőszerek

Más egyéb leképezőszereket is alkalmazhatunk a gáz helyett vagy a gázzal kombinációban. Ilyenek például a kereskedelmi forgalomban beszerezhető szerek, amelyeket a pozitronemissziós tomográfiánál (PÉT), komputervezérlésű tomográfiánál (CAT), egyetlen foton emissziós komputerizált tomográfiánál, röntgenvizsgálatoknál, fluoroszkópiánál és mágneses rezonancia leképezésnél (MRI) alkalmazunk. Az ezen anyagokkal töltött mikrorészecskéket a szokásos technikákkal detektálhatjuk, amelyek hozzáférhetők és kereskedelmi forgalomban beszerezhetők.

Az MRI eljárásnál kontrasztanyagként felhasználható anyagok közé tartoznak például a gatalinium-kelátok, így például dietilén-triamin-pentaecetsav (DTPA), valamint gatopentotát-dimeglumin, tovább, vas, magnézium, mangán, réz és króm.

A CAT és röntgenvizsgálatoknál alkalmazható anyag közé tartoznak például a jódtartalmú anyagok intravénás adagolásra, így például ionos monomerek, például diatrizoát és iotalmát, nemionos monomerek, így például iopamidol, izohexol és ioverzol, nemionos dimerek, így például iotrol és iodixanol, és jódos dimerek, így például ioxagalte. További anyagok közé tartozik a bárium orális adagolásra.

Mikrorészecskék és eljárás előállításukra

Egy legelőnyösebb kiviteli formánál a mikrorészecskéket porlasztva szárítással állítjuk elő. Más módszert is alkalmazhatunk, így például oldószeres extrakciót, forró olvadékos kapszulázást és oldószerelpárologtatást, mint majd azt részletezzük. A legfontosabb kritérium, hogy a polimert fel kell oldani vagy meg kell ömleszteni a lipiddel együtt, mielőtt a mikrogömböcskéket kialakítjuk. Bár közelebbről a lipid beépítését ismertetjük, nyilvánvaló, hogy más egyéb hidrofób vegyületek is alkalmazhatók a lipid helyett. Egy előnyös kiviteli formánál ezután a gázt vezetjük be áram formájában vagy vákuumot alkalmazunk, majd a mikrokapszulákat megtöltjük a kívánt gázzal.

a. Oldószer-elpárologtatás

Ennél a módszernél a polimert és a lipidet egy illékony szerves oldószerben, például metilén-kloridban feloldjuk. Egy pórusképző anyagot szilárd anyag vagy oldat formájában szintén adagolhatunk az oldathoz olyan mikrokapszulák kialakítására, amelyek leképezőszerként gázt tartalmaznak. Ha más leképezőszert kívánunk beépíteni, a leképezőszert adagolhatjuk akár szilárd formában, akár oldat formájában a polimer oldathoz. A keveréket ezután ultrahanggal kezeljük vagy homogenizáljuk és a kapott diszperziót vagy emulziót adagoljuk egy vizes oldathoz, amely felületaktív anyagot [például Tween™ 20, Tween™ 80, PEG vagy poli(vinil-afkohol)] tartalmaz, majd az emulzió kialakítására homogenizálást végzünk. A kapott emulziót ezután addig keverjük, amíg a szerves oldószer túlnyomó része elpárolog és visszamaradnak a mikrorészecskék. Különböző polimerkoncentrációkat alkalmazhatunk (0,05-0,60 g/ml). Ezzel a módszerrel különböző méretű (1000 pm) és különböző morfológiájú részecskéket állíthatunk elő. Ez a módszer különösen stabil polimerek, így például poliészterek esetén alkalmas.

Az oldószer-elpárologtatást ismertetik például a következő irodalmi helyeken: [E. Mathiowitz, és mtársai, J. Scanning Microscopy, 4, 329 (1990); L. R. Beck, és mtársai, Fertil. Steril., 31, 545 (1979); és S. Benita, és mtársai, J. Farm. Sci., 73, 1721 (1984)].

Azonban labilis polimerek, így például polianhidridek degradálódhatnak az előállítási eljárás során a víz jelenléte miatt. Ezen polimereknél az alábbi két módszert alkalmazzuk, amelyet tisztán szerves oldószerben végzünk.

b. Forró olvadékos mikrokapszulázás

Ennél a módszernél a polimert és a lipidet először megömlesztjük, majd összekeverjük a pórusképző szerek vagy szilárd vagy folyékony diagnosztikai szer szilárd részecskéivel. A kapott keveréket ezután egy nem elkeverhető oldószerben (például szilikonolaj) szuszpendáljuk, majd keverés közben folyamatosan 5 °C-kal a polimer olvadáspontja feletti hőmérsékletre melegítjük. Ha egyszer az emulzió stabilizálódott, lehűtjük addig, amíg a polimer részecskék megszilárdulnak. A kapott mikrorészecskéket ezután mossuk, majd dekantáljuk, erre a célra polimert nem oldó oldószert, így például petróleum-étert alkalmazunk, így egy szabadon folyó poranyagot nyerünk. Ezzel a módszerrel 1 és 1000 pm közötti mikrorészecskéket tudunk előállítani. Az ezen módszerrel előállított részecskék külső felülete általában sima és sűrű. Ezt az eljárást alkalmazzuk poliészterekből és polianhidridekből álló mikrorészecskék előállítására. Azonban, a módszer 1000-50 000 közötti molekulatömegű polimerekre korlátozódik.

Forró olvadék mikrokapszulázást ismertetik E. Mathiowitz és munkatársai [E. Mathiowitz és mtársai, Reactive Polymers, 6, 275 (1987)]. Forró olvadékos mikrokapszulázással előállíthatók például polianhidridek, például bisz-karboxi-fenoxi-propán és szebacinsav 20:80 mólarányú keverékéből (P(CPP-SA) 20:80) (Mw 20,000), továbbá előállíthatók poli(furmársav-koszebacinsav) (20:80, Mw 15 000) mikrorészecskék is.

c. Oldószereltávolítás

Ezt az eljárást elsődlegesen polianhidrideknél alkalmazzák. A módszernél a pórusképző szert a kiválasztott polimer és lipid illékony szerves oldószerrel, például metilén-kloriddal képzett diszperziójához vagy oldatához adagoljuk, majd a kapott keveréket keverés közben egy szerves olajban (például szilikonolajban) szuszpendáljuk és emulzióvá alakítjuk. Eltérően az oldószerelpárologtatástól, ez a módszer alkalmazható magas olvadáspontú és különböző molekulatömegű polimerekből képzett mikrorészecskék előállítására is. Az ezzel az eljárással előállított részecskék külső morfológiája nagymértékben függ az alkalmazott polimertől.

d. A mikrorészecskék porlasztva szárítása

A mikrorészecskéket előállíthatjuk porlasztva szárítással is úgy, hogy a biokompatibilis polimert és a lipi7

HU 226 584 Β1 det egy megfelelő oldószerben oldjuk, a pórusképző anyagot ebben diszpergáljuk, majd a kapott oldatot porlasztva szárítjuk, így alakítjuk ki a mikrorészecskéket. A „porlasztva szárítás olyan eljárásra utal, amelynél a polimert és a pórusképző anyagot tartalmazó anyagot atomizáljuk, így egy finom ködöt képzőnk, majd ezt egy forró vivőgázzal való közvetlen érintkeztetéssel szárítjuk. A szakterületen használatos porlasztva szárítók alkalmazásánál a polimer oldatot a porlasztva szárító bevezető részénél beiktatjuk, keresztülvisszük a szárítón belül egy csövön, majd a kivezető résznél atomizáljuk. A hőmérséklet függ az alkalmazott gáztól vagy polimertől. A bemenő és kimenő rész hőmérsékletét szabályozhatjuk a kívánt termék előállítása érdekében.

A polimer oldatból kapott részecskék mérete függ az alkalmazott porlasztó fúvókájának méretétől, a fúvóka nyomásától, az áramlás sebességétől, az alkalmazott polimertől, a polimerkoncentrációjától, az oldószer típusától, valamint a porlasztás hőmérsékletétől (mind a bevezető, mind a kivezető hőmérsékletek), valamint a molekulatömegtől. Általában minél magasabb a molekulatömeg, annál nagyobb a részecskeméret azonos koncentráció esetén. A porlasztva szárítás tipikus paraméterei például a következők: polimerkoncentráció=O,005-0,20 g/l, bevezetés hőmérséklete=5-200 ml/perc, fúvókaátmérő=0,2-4 mm ID. 1-10 pm közötti mikrorészecskéket tudunk előállítani, amelyek morfológiája függ a választott polimertől, annak koncentrációjától, molekulatömegétől, valamint a porlasztási sebességtől.

Ha a leképezőszer egy szilárd anyag, ezt a szert kapszulázott szilárd részecskék formájában adagoljuk a polimer oldathoz a porlasztást megelőzően vagy a leképezőszerből vizes oldatot is előállíthatunk és ezt emulgeáljuk a polimer oldatban a porlasztás előtt, de eljárhatunk úgy is, hogy a szilárd anyagot együtt oldjuk a polimerrel egy alkalmas oldószerben a porlasztás előtt.

e. Hidrogél mikrorészecskék

A gél típusú polimerekből, így például polifoszfazánból vagy polimetil-metakrilátból álló mikrorészecskéket úgy állítjuk elő, hogy a polimerből egy vizes oldatot készítünk, ebben szuszpendáljuk kívánt esetben a pórusképző szert, majd a keverékben lipidet, a kapott keveréket homogenizáljuk, és egy mikrocseppképző szerszámon keresztül extrudáljuk, az így kapott mikrocseppecskéket egy keményítő fürdőbe ejtjük, amely ellenkező töltésű ionokat tartalmaz vagy az egy polielektrolitoldat, majd ezt lassan keverjük. A rendszer előnye az, hogy a mikrorészecskék felületét tovább módosíthatjuk, polikationos polimerrel, így például polilizinnel való bevonattal a gyártás után. A mikrorészecskék méretét különböző méretű extruder szerszámmal változtathatjuk.

A mikrorészecskék kialakulását elősegítő adalékok

A leképezőszer-tartalmú mikrorészecskék előállítása során különböző felületaktív anyagokat adagolhatunk. Például emulgeálószert vagy felületaktív anyagot alkalmazhatunk (0,1-5 tömeg%), ezek lehetnek bármilyen fiziológiailag elfogadható emulgeálószerek. Példaképpen említjük a természetes vagy szintetikus formájú epesókat vagy epesavakat, ezeket alkalmazhatjuk amínosavakhoz konjugálva vagy konjugálás nélkül, így például alkalmazhatunk taurodezoxikolátot vagy kolinsavat.

A pórusképző szerek mennyisége például 0,01-90 tömeg%, ezek növelik a pórusok kialakulását, így például porlasztva szárításnál, oldószer-elpárologtatásnál a pórusképző szer lehet egy illékony só, például ammónium-hidrogén-karbonát, ammónium-acetát, ammónium-klorid vagy ammónium-benzoát vagy más egyéb, liofilizálható só, ezeket először vízben oldjuk. A pórusképző anyagot tartalmazó oldatot ezután a polimer oldatban emulgeáljuk, így cseppecskéket képzőnk a polimerben a pórusképző anyagból. Ezt az emulziót ezután porlasztva szárítjuk vagy egy oldószer elpárologtatásának/extrakciónak vetjük alá. Miután a polimert kicsaptuk, a megkeményedett mikrorészecskéket megfagyasztjuk vagy liofilizáljuk, így távolítjuk el a pórusképző szert.

Mikrorészecskék mérete

Egy előnyös kiviteli formánál injekciózható mikrorészecskék előállításánál, amelyek képesek a pulmonáris kapillárisrendszeren keresztüljutni, a mikrorészecskék átmérője kb. 1 és 10 gm között kell, hogy legyen. Ennél nagyobb mikrorészecskék eltömik a pulmonáris vezetékeket, a kisebb részecskék pedig nem biztosítanak megfelelő echogenicitást. A nagyobb részecskék az injekciótól eltérő módszerrel történő adagolásra alkalmasak, így például orális adagolásra (a gasztrointesztinális traktus leképezésénél), más egyéb nyálkahártya-felületek esetén (rektális, vaginális, orális, nazális) vagy inhalálásnál. Az előnyös részecskeméret orális adagolásnál 0,5 pm-5 mm között érték. Az alkalmas, gyógyszerészetileg elfogadható hordozó például a sóoldat, amely glicerint és Tween™ 20 adalékot tartalmaz, valamint az izotóniás mannit, amely Tween™ 20 adalékot tartalmaz. A részecskeméret-analízist végezhetjük Coulter-számlálóval, fénymikroszkóppal, scanning elektronmikroszkópiával vagy transzmittancia elektronmikroszkóppal.

Kívánt helyre juttatás (célzás)

A mikrorészecskék kívánt helyre juttatását végezhetjük specifikusan vagy nemspecifikusan a polimer anyagának megválasztásával, a mikrorészecske méretének megválasztásával és/vagy a mikrorészecskéhez egy ligandum kötésével. így például a mikrorészecske felületéhez köthetünk biológiailag aktív molekulákat vagy a töltést befolyásoló molekulákat, a részecske lipofilicitását vagy hidrofilicitását befolyásoló molekulákat. Továbbá, a mikrorészecskékhez olyan molekulákat is köthetünk, amelyek minimalizálják a szövetadhéziót vagy amelyek elősegítik a mikrorészecskék specifikus célhoz juttatását in vivő. Az ilyen célzó molekulák lehetnek például antitestek, lecitinek, vagy más egyéb

HU 226 584 Β1 molekulák, amelyek specifikusan kötődnek egy adott sejttípus felületén lévő receptorokhoz.

A RÉS által történő felvétel gátlása

A mikrorészecskék felvételét és eltávolítását szintén minimalizálhatjuk a polimer megválasztásával és/vagy molekulák beépítésével vagy kapcsolásával, amelyek minimalizálják az adhéziót vagy a felvételt, (gy például a mikrorészecskék szövetadhézióját minimalizálhatjuk, ha felületükhöz kovalens kötéssel poli(alkilén-glikol) részeket kapcsolunk. A felületén lévő poli(alkilén-glikol) csoportok nagy affinitásúak a vízhez, ez csökkenti a részecske felületén a proteinabszorpciót. Ily módon csökkenthető a mikrorészecskék retikuloendoteliális rendszer (RÉS) által történő felismerése és felvétele.

[gy például a poli(alkilén-glikol) terminális hidroxilcsoportja alkalmazható, hogy a mikrorészecske felületéhez kovalens kötéssel biológiailag aktív molekulákat vagy a részecske töltését, lipofilicitását vagy hidrofilicitását befolyásoló molekulákat kössünk. A legkülönbözőbb ligandumoknak a mikrorészecskékhez való kötésére szolgáló módszerek a szakterületen ismertek, ezekkel az eljárásokkal fokozhatok a szállítási tulajdonságok, a stabilitás vagy a mikrorészecske más egyéb tulajdonságai in vivő.

Diagnosztikai alkalmazás

A mikrorészecskéket általában gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval, így például egy foszfát-pufferolt sóoldattal vagy sóoldattal vagy mannitoldattal keverjük el, majd a detektáláshoz a készítmény hatásos mennyiségét adagoljuk a betegnek a megfelelő módon, általában a véredénybe injekció révén (iv.) vagy orálisan. A kapszulázott leképezőanyagot tartalmazó mikrorészecskéket alkalmazhatjuk az érrendszer leképezésére, valamint a máj- és vesebetegségek kimutatására, a kardiológia területén, továbbá tumorok és szövetek detektálására, valamint a perifériális vér áramlási sebesség mérésére. A mikrorészecskék ligandumokkal is összeköthetők, ezek minimalizálják a szövetadhéziót, vagy a mikrorészecskéket célzottan juttatják el egy adott területre in vivő, mint azt a fentiekben említettük.

A találmány szerinti eljárást és készítményeket a következő példákkal mutatjuk be közelebbről a korlátozás szándéka nélkül.

1. példa

Oktafluorpropánt, PEG-PLGA/PLGA-t és lecitint tartalmazó álló mikrorészecskék

3,2 g PEG-PLGA-t (85:25) (IV=0,75 dl/g Birmingham Polymers), 6,4 g PLGA-t (50:50) (IV=0,4 dl/g Henley Chemicals), 23 g lecitint (Spectrum Chemicals) és 183 mg palmitinsavat (Spectrum Chemicals) feloldunk 190 ml metilén-kloridban oldjuk. 10,8 ml 0,70 g/ml ammónium-acetátot adunk a polimer oldathoz és a kapott keveréket 10 000 fordulat/percnél 1 percig homogenizáljuk (Virtis homogenizáló). Az oldatot ezután 20 ml/perc sebességgel egy porlasztva szárító berendezésbe (Bucchi Láb porlasztva szárító) szivattyúzzuk. A bevezetés hőmérséklete 40 °C. A mikrorészecske port összegyűjtjük és liofilizáljuk (FTS tányéros liofilizáló) 120 órán át. A mikrorészecskéket ezután 5 ml-es Purform-fiolákba osztjuk szét, butildugóval lezárjuk és beperemezzük. A fiolákat ezután oktofluorpropánnal megtöltjük 10 psig nyomáson és folyamatosan 3 percig gázatmoszférában öblítjük. Ezután a fiolákat 4 °C hőmérsékleten tároljuk felhasználásig. A részecskeátmérő 1-10 pm Coulter-számlálóval számolva, a szám szerinti átlagérték 2 pm. Scanning-elektronmikroszkóppal kimutatjuk, hogy a részecskék általában gömb formájúak, sima felületűek, esetenként felületükön enyhe redőzöttséggel.

2. példa

Oktofluorpropánt, PEG-PLGA/PLGA-t és dipalmitoil-foszfatidil-kolint (DPPC) tartalmazó mikrorészecskék

A mikrorészecskéket az 1. példában leírtak szerint állítjuk elő, kivéve, hogy a lecitin helyett 29,6 mg dipalmitoil-foszfatidil-kolint (Avanti, Birmingham A1) alkalmazunk.

3. példa

Oktofluorpropánt, PEG-PLGA/PLGA-t és disztearoil-foszfatidil-kolint (DSPC) tartalmazó mikrorészecskék

A mikrorészecskéket 2. példában leírtak szerint állítjuk elő, kivéve, hogy a lecitin helyett 29,9 mg disztearoil-foszfatidil-kolint (Avanti, Birmingham A1) alkalmazunk.

4. példa

Oktofluorpropánt, PEG-PLGA/PLGA-t és diarachidoil-foszfatidil-kolint (DAPC) tartalmazó mikrorészecskék

A mikrorészecskéket 2. példában leírtak szerint állítjuk elő, kivéve, hogy a lecitin helyett 29,9 mg diarachidoil-foszfatidil-kolint (Avanti, Birmingham A1) alkalmazunk.

5. példa

A mikrorészecske-visszaszórás mérése in vitro

Az 1-4. példák szerint előállított oktafluorpropánt tartalmazó polimer részecskék visszaszórását mértük úgy, hogy 10 μΙ mikrorészecskeszuszpenziót fókuszált ultrahangsugámak tettünk ki. A visszaszórt akusztikus teljesítményt a minta mélységének függvényében a következőképpen határoztuk meg. Egy pulzusvevőt (Panametrics® Model 5800) alkalmaztunk a fókuszált ultrahang átalakító (2,25 MHz) gerjesztésére, amely egy ultrahang pulzust küld a fiziológiai sóoldatban szuszpendált mikrorészecskékhez.

A szuszpenziót egy hengeres mintakamra (55 ml sóoldat) tartalmazza, amelyet egy hőmérséklet-szabályozott vízfürdőben helyezünk el, a hőmérsékletet 37 °C-ra állítjuk be. A kamrát 1,5 inch távolságra helyezzük el az átalakítótól úgy, hogy az átalakítót a kamra akusztikus ablakára fókuszáljuk. A kamrát 15 fordu9

HU 226 584 Β1 lat/perc sebességgel forgatjuk, hogy mikrorészecskéket szuszpenzióban tartsuk. A sóoldat oldott gáztartalmát kb. 90% levegőtelítettségen tartjuk, ezt oldott oxigén mérővel (Orion® Model 840) határozzuk meg. Az akusztikus vizsgáló rendszer működését PC-vel szabályozzuk a megfelelő program futtatásával (LacVIEW®, National Instruments®). A komputer vezérli a pulzusvevőt az ultrahang átvivő gerjesztésére.

A visszaszórt jelet ugyanazzal az átalakítóval érzékeljük, és a visszatért jelet egy pulzusvevő egységgel erősítjük. Az erősített jelet egy digitális oszcilloszkópra visszük (LeCroy® model 931OAM) digitalizálásra 100 MSa/s értéknél. A kapott digitalizált jelet tovább feldolgozzuk. A jelet négyzetesítjük, FFT-vel analizáljuk és egy 6 dB sávszélességű átalakítóval integráljuk. Az akusztikus adatokat összegyűjtjük, majd integrált visszaszórt teljesítménnyé alakítjuk egy tetszés szerinti egységben a mikrorészecskeszuszpenzió mélységének függvényében. Az IBP vs 50 pulzusból származó mélységadatokat átlagoljuk, meghatározzuk a legjobban egyező egyenes vonalat az átlagolt IBP adatok segítségével és meghatározzuk az y-metszeteket, amely arányos a visszaszórási koefficienssel. Mindegyik mintát 2,5 perces intervallumokban összesen 10 percen át vizsgáljuk.

Az 1. ábrán bemutatjuk négy különböző mikrorészecske esetén a visszaszórást az idő függvényében. A lecitin különböző lánchosszúságú foszfolipidek keveréke. Ahogy a foszfokolinhoz kapcsolt zsírsav lánchosszúsága nő, úgy a visszaszórás nagyságrendje hosszabb időn át megmarad, jelezve a mikrorészecskékben lévő oktafluorpropán megnövekedett stabilitását. Nagy tisztaságú foszfolipidek alkalmazásával még hatásosabb a gáz stabilizálása, viszonyítva a lecitinben lévő foszfolipidek keverékéhez.

Claims (24)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás diagnosztikai leképezés céljára alkalmas mikrorészecskék előállítására, amely mikrorészecskék mikrogömbök biokompatibilis polimerből kialakítva, amelyekbe fluorozott gáz van befoglalva, azzal jellemezve, hogy

   a) beépítünk a polimerbe egy hidrofób vegyületet vagy úgy, hogy a polimert és a hidrofób vegyületet egy szerves oldószerben oldjuk, vagy úgy, hogy a hidrofób vegyületet a polimerrel együtt megömlesztjük a mikrorészecskék kialakítása előtt, és

   b) kialakítjuk a mikrorészecskéket úgy, hogy eltávolítjuk a polimer oldószerét vagy a polimert lehűtjük, és amelynél a hidrofób vegyületet a mikrorészecskében olyan mennyiségben keverjük el a polimerrel, amely növeli a mikrorészecskék echogenicitását viszonyítva a hidrofób vegyület nélküli mikrorészecskék echogenicitásához, és amelynél hidrofób vegyületként valamely következő vegyületet alkalmazunk: valamely zsírsav, zsíralkohol, zsírsavanhidrid, hidroxi-zsírsav, prosztaglandin, foszfolipid, sfingolipid, koleszterin vagy szteroidszármazék, vitamin, terpén, triptofán, tirozin, izoleucin, leucin, valin, alkil-paraben, vagy benzoesav.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrofób vegyület és a polimer közötti arány 0,01-30 tömegrész hidrofób vegyület a polimer tömegrészéhez viszonyítva.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrofób vegyület lipid és a polimerbe épített lipid és a polimer közötti arány 0,01 és 30 közötti érték (tömeg lipid/tömeg polimer).
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lipidként valamely következő foszfolipidet alkalmazunk: valamely foszfatidinsav, foszfatidil-kolinok, mind telített vagy telítetlen lipidekkel, foszfatidil-etanolaminok, foszfatidil-glicerinek, foszfatidil-szerinek, foszfatidil-inozitolok, lizofoszfatidilszármazékok, kardiolipin vagy β-acil-y-alkil-foszfolipidek.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy foszfolipidként valamely következő anyagot alkalmazunk: dioleil-foszfatidil-kolin, dimirisztil-foszfatidilkolin, dipentadekanoil-foszfatidil-kolin, dilauiril-foszfatidil-kolin, dipalmitoil-foszfatidil-kolin, disztearoil-foszfatidil-kolin, diarachidoil-foszfatidil-kolin, dibehenoil-foszfatidil-kolin, ditrikozanoil-foszfatidil-kolin, dilignoceroilftalidil-kolin vagy foszfatidil-etanol-aminok.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gázként valamely következő vegyületet alkalmazunk: CF₄, C₂F₆, C₃F₈, C₄F₈, SF₆, C₂F₄, és C₃F₆.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gázként oktafluorpropánt alkalmazunk.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikrorészecskéket szintetikus polimerből alakítjuk ki.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikrorészecskéket természetes polimerből alakítjuk ki.
10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikrorészecskéket bioadhezív polimerből alakítjuk ki.
11. 11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikrorészecskéket valamely következő szintetikus polimerből alakítjuk ki: poli(hidroxisav)-ak, poli(anhidrid)-ek, poliortoészterek, poliamidok, polikarbonátok, polialkiléntereftalátok, poli(vinil-észter)-ek, poli(vinil-halogenid)-ek, polisziloxánok, poli(vinil-acetát), polisztirol, poliuretánok és ezek kopolimerjei, szintetikus cellulózok, poliakrilsavak, polivajsav, polivalerinsav, poli(laktid-kokaprolakton), etilén-vinil-acetát, és ezek kopolimerjei vagy keverékei.
12. 12. Diagnosztikai leképezésre szolgáló készítmény, amely fluorozott gázt magában foglaló biokompatibilis polimer mikrorészecskékből áll, amelyek mikrogömbök és amelyek a következő lépésekkel vannak előállítva:

    a) a polimert és egy hidrofób vegyületet egy szerves oldószerben oldjuk, vagy a hidrofób vegyületet a polimerrel együtt megömlesztjük, a mikrorészecskék kialakítása előtt, és

    b) kialakítjuk a mikrorészecskéket úgy, hogy eltávolítjuk a polimer oldószerét vagy a polimert lehűtjük,

    HU 226 584 Β1 és amelynél a hidrofób vegyületet a polimerrel a mikrorészecskében olyan mennyiségben keverjük el, amely növeli a mikrorészecskék echogenicitását viszonyítva a hidrofób vegyület nélküli mikrorészecskék echogenicitásához, és amelynél hidrofób vegyületként valamely következő vegyületet alkalmazunk: valamely zsírsav, zsíralkohol, zsírsavanhidrid, hidroxi-zsírsav, prosztaglandin, foszfolipid, sfingolipid, koleszterin vagy szteroidszármazék, vitamin, terpén, triptofán, tirozin, izoleucin, leucin, valin, alkil-paraben, vagy benzoesav.
13. 13. A 12. igénypont szerinti készítmény, amelyben a hidrofób vegyület és a polimer közötti arány 0,01 és 30 tömegrész közötti érték, hidrofób vegyületet a polimer tömegére vonatkoztatva.
14. 14. A 13. igénypont szerinti készítmény, amelynél a hidrofób vegyület egy lipid a polimerbe beépítve és az arány 0,01-30 (tömeg lipid/tömeg polimer).
15. 15. A 12. igénypont szerinti készítmény, amely lipidként valamely következő foszfolipidet tartalmaz:

    foszfatidinsav, foszfatidil-kolinok, mind telített vagy telítetlen lipidekkel, foszfatidil-etanol-aminok, foszfatidil-glicerinek, foszfatidil-szerinek, foszfatidil-inozitolok, lizofoszfatidilszármazékok, kardiolipin vagy β-acil-y-alkil-foszfolipidek.
16. 16. A 15. igénypont szerinti készítmény, amely lipidként valamely következő anyagot tartalmaz: dioleilfoszfatidil-kolin, dimirisztil-foszfatidil-kolin, dipentadekanoil-foszfatidil-kolin, dilauiril-foszfatidil-kolin, dipalmitoil-foszfatidil-kolin, disztearoil-foszfatidil-kolin, diarachidoil-foszfatidil-kolin, dibehenoil-foszfatidil-kolin, ditrikozanoil-foszfatidil-kolin, dilignoceroilftalidil-kolin és foszfatidil-etanol-aminok.
17. 17. A 12. igénypont szerinti készítmény, amelyben a gáz valamely következő vegyület: CF₄, C₂F₆, C₃F₈, C₄F ₈, SF θ, C₂F ₄, és C₃F g.
18. 18. A 17. igénypont szerinti készítmény, amely gázként oktafluorpropánt tartalmaz.
19. 19. A 12. igénypont szerinti készítmény, amely szintetikus polimerből van kialakítva.
20. 20. A 19. igénypont szerinti készítmény, amelyben a polimer valamely következő anyag: poli(hidroxisav)-ak, poli(anhidrid)-ek, poliortoészterek, poliamidok, polikarbonátok, polialkiléntereftalátok, poli(vinil-észter)-ek, poli(vinil-halogenid)-ek, polisziloxánok, poli(vinil-acetát), polisztirol, poliuretánok és ezek kopolimerjei, szintetikus cellulózok, poliakrilsavak, polivajsav, polivalerinsav, poli(laktid-kokaprolakton), etilén-vinil-acetát, és ezek kopolimerjei vagy keverékei.
21. 21. A 14. igénypont szerinti készítmény, amelynél a lipid a polimerrel folyadékká van alakítva a mikrorészecskék kialakítására.
22. 22. A 21. igénypont szerinti készítmény, amelyben a lipid és a polimer mindkettőt oldó oldószerben van feloldva, majd a mikrorészecskék ebből vannak kialakítva.
23. 23. A 21. igénypont szerinti készítmény, amelynél a gáz a mikrorészecskékbe a polimer és a lipid megszilárdulása után van beépítve.
24. 24. A 12. igénypont szerinti készítmény, amelynél a polimer természetes polimer, amely lehet protein vagy poliszacharid.