HU219304B - Recombinant adenovirus derived vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, pharmaceutical preparations containing them and processes for their production - Google Patents
Recombinant adenovirus derived vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, pharmaceutical preparations containing them and processes for their production Download PDFInfo
- Publication number
- HU219304B HU219304B HU9500870A HU9500870A HU219304B HU 219304 B HU219304 B HU 219304B HU 9500870 A HU9500870 A HU 9500870A HU 9500870 A HU9500870 A HU 9500870A HU 219304 B HU219304 B HU 219304B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- nucleotide sequence
- adenovirus
- recombinant vector
- recombinant
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 89
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 160
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 40
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 28
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 46
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 24
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 claims description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 16
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 10
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 3
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 101150016456 Hexa gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 2
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 claims 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 2
- 101150030072 CNTF gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims 1
- 150000002306 glutamic acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 claims 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 claims 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims 1
- -1 pylons Proteins 0.000 claims 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 36
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 36
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 34
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 22
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 21
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 12
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 11
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 11
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 9
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 9
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 7
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N [9-(dimethylamino)-10-methylbenzo[a]phenoxazin-5-ylidene]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].O1C2=CC(=[NH2+])C3=CC=CC=C3C2=NC2=C1C=C(N(C)C)C(C)=C2 ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 5
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 5
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 5
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 4
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 102100023460 Choline O-acetyltransferase Human genes 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 4
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 description 4
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 4
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 4
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-LAAFWIJESA-N (2s)-2-amino-3-(4-hydroxy-3,5-ditritiophenyl)propanoic acid Chemical compound [3H]C1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC([3H])=C1O OUYCCCASQSFEME-LAAFWIJESA-N 0.000 description 3
- 102100022548 Beta-hexosaminidase subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 3
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 3
- 101001045440 Homo sapiens Beta-hexosaminidase subunit alpha Proteins 0.000 description 3
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 210000004002 dopaminergic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 3
- 230000007433 nerve pathway Effects 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N (S)-amphetamine Chemical compound C[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- GSEGBPHJMPRLKA-UHFFFAOYSA-N 4-(4-aminophenyl)cyclohexa-3,5-diene-1,1,2-triamine Chemical compound C1=CC(N)(N)C(N)C=C1C1=CC=C(N)C=C1 GSEGBPHJMPRLKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010058699 Choline O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108700005000 Glial Fibrillary Acidic Proteins 0.000 description 2
- 108010053317 Hexosaminidase A Proteins 0.000 description 2
- 102000016871 Hexosaminidase A Human genes 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 102000005506 Tryptophan Hydroxylase Human genes 0.000 description 2
- 108010031944 Tryptophan Hydroxylase Proteins 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 2
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 2
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 229960000632 dexamfetamine Drugs 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 2
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 201000010901 lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 229960004502 levodopa Drugs 0.000 description 2
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 description 2
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 2
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000036441 nociceptive stimulation Effects 0.000 description 2
- DIVDFFZHCJEHGG-UHFFFAOYSA-N oxidopamine Chemical compound NCCC1=CC(O)=C(O)C=C1O DIVDFFZHCJEHGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000012302 perinuclear staining Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 210000002763 pyramidal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000004515 ventral tegmental area Anatomy 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- SKYZYDSNJIOXRL-BTQNPOSSSA-N (6ar)-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4h-dibenzo[de,g]quinoline-10,11-diol;hydrochloride Chemical compound Cl.C([C@H]1N(C)CC2)C3=CC=C(O)C(O)=C3C3=C1C2=CC=C3 SKYZYDSNJIOXRL-BTQNPOSSSA-N 0.000 description 1
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWOZEJJVUCALGB-UHFFFAOYSA-N 6-Methyltetrahydropterin Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1NCC(C)N2 HWOZEJJVUCALGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 1
- 108020004519 Antisense Oligoribonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 102100022146 Arylsulfatase A Human genes 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006418 Brown reaction Methods 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108010036867 Cerebroside-Sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000015554 Dopamine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050004812 Dopamine receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010067601 Dysmyelination Diseases 0.000 description 1
- 108010092674 Enkephalins Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 206010019899 Hereditary retinal dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 108010000540 Hexosaminidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002268 Hexosaminidases Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 101150102264 IE gene Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 1
- 208000033868 Lysosomal disease Diseases 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 201000011442 Metachromatic leukodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000019430 Motor disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002678 Mucopolysaccharidoses Diseases 0.000 description 1
- 101000993359 Mus musculus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010826 Nissl staining Methods 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010067130 Spastic diplegia Diseases 0.000 description 1
- 208000029033 Spinal Cord disease Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 101150076211 TH gene Proteins 0.000 description 1
- 206010046996 Varicose vein Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXFBCFUQKFJLTM-UHFFFAOYSA-L [Fe+].[Fe+].[O-]S([O-])(=O)=O Chemical compound [Fe+].[Fe+].[O-]S([O-])(=O)=O UXFBCFUQKFJLTM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 1
- 239000002825 antisense oligoribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 229960004046 apomorphine Drugs 0.000 description 1
- VMWNQDUVQKEIOC-CYBMUJFWSA-N apomorphine Chemical compound C([C@H]1N(C)CC2)C3=CC=C(O)C(O)=C3C3=C1C2=CC=C3 VMWNQDUVQKEIOC-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 1
- 229960003990 apomorphine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001084 basket cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000768 catecholaminergic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 210000004289 cerebral ventricle Anatomy 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000330 cholinergic fiber Anatomy 0.000 description 1
- 210000002932 cholinergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 1
- 230000002638 denervation Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005110 dorsal hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 208000017532 inherited retinal dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- FKHVEXUWEQFKCJ-UHFFFAOYSA-L magnesium;sodium;5-ethyl-5-pentan-2-yl-1,3-diazinane-2,4,6-trione;2,2,2-trichloroethane-1,1-diol;sulfate Chemical compound [Na+].[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O.OC(O)C(Cl)(Cl)Cl.CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FKHVEXUWEQFKCJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000002052 molecular layer Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 206010028093 mucopolysaccharidosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 230000001016 myotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000956 myotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000000063 presynaptic terminal Anatomy 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007101 progressive neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 238000013223 sprague-dawley female rat Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027185 varicose disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000007484 viral process Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/44—Oxidoreductases (1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/16—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced pteridine as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.16)
- C12Y114/16002—Tyrosine 3-monooxygenase (1.14.16.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01051—Alpha-L-fucosidase (3.2.1.51)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány rekombináns adenovirális DNS-vektorra vonatkozik génekneka központi idegrendszer sejtjeibe, különösen az agy sejtjeibe történőbejuttatására, és az említett sejtekben való expresszálására, melyrejellemző, hogy tartalmaz (i) legalább egy részt egy adenovírusgenomjából, beleértve azokat a régiókat, amelyek ezen adenovírussalnormál körülmények között megfertőzhető sejtekbe történő behatoláshozszükségesek, és (ii) egy kiválasztott nukleotidszekvenciát, mely azadenovírus genomjának említett részébe van beépítve egy, az említettsejtekben működőképes promoter szabályozása alá, amely vagy jelen vanaz említett genomrészben, vagy abba be van építve, ahol anukleotidszekvencia transzkripciós vagy expressziós terméke a központiidegrendszer sejtjeire fejti ki hatását, vagy ezekben a sejtekbentermelődik. A találmány szerinti rekombináns vektorok elsősorban aközponti idegrendszer betegségeinek kezelésében és a génterápiábannyernek felhasználást. ŕ
Description
A találmány rekombináns adenovirális DNS-vektorokra vonatkozik géneknek a központi idegrendszer sejtjeibe, különösen az agy sejtjeibe történő bejuttatására.
Terápiás DNS biztonságos és eredményes bejuttatása a központi idegrendszerbe félelmetes kihívást jelent az agybetegségek aktív terápiájának fejlesztése számára.
Számos vektorral, főként retrovirális vektorokkal és Herpes simplex eredetű (WO 92/07945) vektorokkal végeztek ez ideig vizsgálatokat. Azonban az ilyen géntranszportot biztosító hordozók használhatósága mindeddig korlátozott volt.
A legtöbb esetben azért nem használhatók a retrovirális vektorok, mivel nem képesek megfertőzni a posztmitotikus sejteket, beleértve a legtöbb idegsejtet [W. C. Culver et al., Science, 256, 1550-1552 (1992)]. A Herpes simplex eredetű vektorok megfertőzték az idegsejteket, de a patogenitással és a génexpresszió stabilitásával kapcsolatos problémák megoldatlanok maradtak [P. A. Johnson, A. Miyanohara, F. Levine, T. Cahill, T. Friedman, Virol., 66, 2952-2965 (1992); K. D. Fink et al., Hűm. Gene Ther., 3, 11-19 (1992)]. Ezenkívül a Herpes simplex eredetű vektorokra eddig az a megállapítás volt érvényes, hogy expressziójuk csak korlátozott. Egy legújabb közleményben [J. H. Wolfe, S. L. Deshmane, N. W. Fraser, Natúré genetics, I, 379-384 (1992)] a szerzők a korábban ismertetett HSV-1 eredetű vektorok vonatkozásában megemlítették a rövid ideig tartó expressziót, ugyanis a legtöbb használt promoter csak a vírusfertőzés akut fázisa folyamán volt aktív (a fertőzést követő 10 napnál rövidebb ideig). Vizsgálták a központi idegrendszer egy sejtjében egy β-glükuronidáz génexpresszióját a LAT promoter szabályozása alatt, amely rendes körülmények között a vírus latenciaasszociált átirata (latency-associated-transcript=LAT) szekvenciájával társul. A szerzők azonban azt is közölték, miszerint kísérleteik bebizonyították, hogy a fertőzött sejtekben a genetikai enzimhiányosság kijavítása érdekében használt LAT promoter a központi idegrendszer sejtjeiben az idegen gének hosszú ideig tartó expresszióját tudta biztosítani, mégis túl kevés sejt javítódott ki ahhoz, hogy a betegség fenotípusát megváltoztassa. Ennélfogva vektorrendszerüket tökéletesíteniük kellett, hogy elégséges sejt javitódjék ki a klinikailag szignifikáns hatás eléréséhez.
A találmány célul tűzte ki ezen nehézségek leküzdését, valamint sokkal hatékonyabb olyan vektorrendszerek előállítását, amelyek képesek idegen gének szállítására, és ahol szükséges, transzkripciós termékeiknek vagy expressziós termékeiknek a központi idegrendszer sejtjeihez - elsősorban a proliferációra képtelen, végső differenciáltságú (posztmitotikus) sejtekhez - való szállítására.
A találmány további célja olyan vektorrendszerek előállítása, amelyek megfelelően biztonságosak ahhoz, hogy lehetővé tegyék a klónozott géneknek in vitro tanulmányozását és szabályozását az ilyen sejtekben vagy kísérleti állatokban, továbbá e klónozott gének használatával végzett terápiát - beleértve a génterápiát - amikor is emberben vagy állatban egy kiválasztott expressziós termék in situ termelődik.
A találmány azon a felismerésen alapul, hogy az adenovírus eredetű vektorok, különösen a nem replikálódó adenovírus-vektorok, képesek ezeknek a céloknak a teljesítésére mind in vitro, mind in vivő. Hatékony szállítórendszereket biztosítanak a géneknek a központi idegrendszer sejtjeibe, főként az agysejtekbe való szállításához. Megfelelően erős fertőzőképességi fokozat jellemzi ezeket a vírusokat, és ez jelentékeny sejtpopuláció megfertőzését biztosítja. A következőkben ismertetett biológiai vizsgálatok bemutatják, hogy az adenovírus eredetű vektorok (vagy adenovírus-vektorok) eredményesen képesek megfertőzni az idegsejteket, elsősorban a neuronokat mind in vitro, mind in vivő.
Adenovírus-vektorokat ez ideig csak nem osztódó, posztmitotikus izomsejtekbe történő géntranszferhez alkalmaztak [B. Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89 (7), 2581-84 (1992)]. A találmány tehát eljárást ismertet rekombináns adenovirális DNS-vektor előállítására, amely vektort egy olyan eljárásban használjuk, amelyben egy kiválasztott polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia transzkripciós terméke vagy expressziós terméke a központi idegrendszer sejtjeiben - ilyenek például az agysejtek, elsősorban a neurális, a glia- vagy ependymasejtek - fejti ki hatását, vagy ezekben a sejtekben termelődik. Az említett rekombináns vektor ezekben a sejtekben egy olyan adenovírus-vektor, amely egy adenovírus genomjának legalább egy részét tartalmazza, és a genom azon részeit foglalja magában, amelyek azzal a genetikai információval rendelkeznek, amely ahhoz szükséges, hogy az adenovírus az ezzel normálkörülmények között megfertőzhető sejtekbe behatoljon, és az említett nukleotidszekvenciát az említett genomrészbe építjük be egy olyan promoter szabályozása alá, amely vagy jelen van a szóban forgó adenovirális vektorban, vagy abba be van építve, és ez a promoter az említett sejtben működőképes.
Pontosabban a találmány tehát egy olyan adenovírus eredetű vektor használatára vonatkozik, amely egy kiválasztott nukleotidot fejez ki a központi idegrendszer sejtjeiben.
A találmány egy olyan rekombináns adenovirális DNS-vektorra is vonatkozik, amely képes egy kiválasztott nukleotidszekvencia expressziójának és/vagy transzkripciójának az irányítására a központi idegrendszer sejtjeiben, és jellemzően (i) egy adenovírus genomjának legalább egy részét tartalmazza, beleértve azokat a szakaszokat, amelyek ahhoz szükségesek, hogy ez az adenovírus behatolhasson a központi idegrendszer sejtjeibe, és (ii) az említett nukleotidszekvencia, amely az adenovírus említett részébe van beépítve egy olyan promoter szabályozása alatt áll, amely működőképes az említett sejtben, és vagy jelen van az említett genomrészben vagy abba be van építve.
Az adenovírus-vektoroknak azon különleges adottságát, miszerint génffagmentumokat képesek bevinni nyugvó idegsejtekbe, a későbbiekben ismertetett kísérletekkel szemléltetjük, amelyeket kifejlett patkányok idegsejtjeiben végeztünk egy olyan adenovírus-vektorral, amely az E. coli LacZ génjét vagy a humán tirozinhidroxiláz gént hordozza. Az idegsejtek (beleértve a
HU 219 304 Β neuronokat, asztrocitákat, a mikroglia- és ependymasejteket) nagy számában fejeződtek ki ezek a transzgének, az agy különböző területeire való beoltásuk után legalább 60 nappal. Nem okozott észlelhető citopátiás hatásokat 10 μΐ 3 χ 105 pfu bevitele, ilyen hatásokat magasabb fertőző titereknél (>107 pfu/10 μΐ) figyeltünk meg, és nagyon valószínű, hogy ez az injekció helyéhez közeli idegsejtekben a vírusrészecskék masszív endocitózisával függött össze.
Ezenkívül úgy manipulálhatjuk az adenovírusok genomját, hogy 7,5 kb hosszú vagy ennél hosszabb idegen géneket tudjunk bennük elhelyezni. Széles a vírus gazdasejtspektruma, emberre alacsony a patogenitása és a vírust magas titerekben tudjuk izolálni [L. D. Stratford-Perricaudet, M. Levrero, J. F. Chase, M. Peiricaudet P. Briand, Hűm. Gene Ther., 1, 241-256 (1990)].
Könnyen felmérhető, hogy ezek az eredmények erősen alátámasztják azt a feltételezést, hogy az adenovírus mint vektor egy új és figyelemre méltó eszközt kínál az idegrendszer nyugvó sejtjeinek genetikai módosításához, nagy fertőzőképessége, hosszú ideig tartó expressziója, széles gazdasejtspektruma és alacsony toxieitása miatt. Tehát az adenovírust be kell iktatni a klónozott géntermékek funkciójának tanulmányozásába, ezek fiziológiai és anatómiai összefüggését tekintve. Az a képessége, hogy megfertőzi a hippokampust (később tárgyaljuk), nagy jelentőségű az integrált jelenségek - ilyen a hosszú ideig tartó működőképesség - állatokban való tanulmányozása szempontjából.
Ezenkívül világosan kitűnik, hogy az adenovírus hatékony eszköz az idegen géneknek az agyba terápiás céllal való bejuttatásához. Az adenovírus-vektorok komoly lehetőséget teremtenek az idegrendszer betegségeinek génterápiájában, például degeneratív betegségek esetén a növekedési faktorok és neurotranszmitterek bevitele révén, és még inkább a megfelelő sejtekben a hibás gének helyettesítése révén. Viszonylag alacsony titerű adenovírus-vektorok is eredményesen tudnak idegen géneket átvinni jelentős mennyiségű agysejtbe anélkül, hogy kóros hatásokat váltanának ki. Az agysejtekbe beviendő idegen géneket tartalmazó rekombináns adenovírus-vektorok, dózisaik optimalizálása mellett, új utakat nyitnak számos genetikai és szerzett neurológiai betegség kezelésében, következésképpen más megoldást nyújtanak a gyógyszeres kezelés vagy a fetális szövetek agyi transzplantációja helyett.
Az adenovírusok, elsősorban a 2. vagy 5. típusú (Ad2 vagy Ad5) adenovírusok különösen előnyösek. Ezek viszonylag stabilak, könnyen tenyészthetők, és gyorsan (a víruscíklus körülbelül 30 óra) magas titereket eredményeznek, fertőzött sejtenként 104-105 plakk-képző egységet (pfu=plaque forming unit). Ezek a típusok nem onkogének. Virális genomjuk teljes szekvenciáját meghatározták [J. Chroboezek et al, Virology, 186, 280-285 (1992)], és molekuláris biológiájukat behatóan tanulmányozták. Számos mutánst, főként deléciós mutánsokat állítottak elő, amelyek nagyméretű fragmentumoknak a vírusba való beépítését tették lehetővé [K. L. Berkner, Biotechniques, 6, 612-629 (1988)].
Előnyös, ha a találmány szerint használt rekombináns vektorok hibás (defektív) adenovírusok, amelyeknek a genomja már nem tartalmazza azokat a nukleinsavszekvenciákat, amelyek a vírusnak a normálkörülmények között vele fertőzhető sejtekben (nem agysejtekben) való replikációjához szükségesek. Pontosabban, nem tartalmazzák az El szakaszt, beleértve a korai Ela szakaszt, amely a vírus replikációjához szükséges további korai transzkripciós egységeket aktiválja, továbbá az Elb szakaszt, amely a teljesen transzformált fenotípus kialakításában és a virális infekció folyamán a DNS-szekvenciák védelmében vesz részt, és amely az infekció későbbi szakaszában a virális folyamatok normál előrehaladásához szükséges.
Ugyancsak előnyös, hogy ezekből a vektorokból hiányzik az E3 szakasz, amely az in vivő sejtes immunitásban játszik szerepet, és teljesen nélkülözhető az in vitro növekedés szempontjából.
Előnyös mégis, ha a találmányhoz felhasznált rekombináns vektor minden olyan szekvenciát tartalmaz, amelyek az adenovírus kapszidképzéséhez szükségesek.
A promoter, amely a kívánt vagy a központi idegrendszer sejtjeiben termelt, kiválasztott polipeptidet kódoló szekvenciát szabályozza, lehet akár endogén, akár exogén, figyelembe véve a rekombináns vektor adenovirális részeit.
Bármelyik olyan homológ promoter előnyös, amelyet valószínűleg felismernek az ilyen adenovírusokkal fertőzött emberi vagy állati sejtek polimerázai, gyakorlatilag az RNS-polimeráz II. Különösen előnyös endogén promoter a 2. típusú humán adenovírus [M. Levrero et al., Gene, 101, 195-202 (1991)] erős fő késői promotere (major laté strong promoter=MLP). Egy másik használható promoter az adenovírus Ela szakaszának korai promotere. Ez utóbbi esetben az előnyös hibás adenovírus nem tartalmazza 5’-szakaszát, amely a korai promoterhez képest rendes körülmények között 5’-irányban helyezkedik el, és ekkor az Ela szakaszt helyettesítjük az idegsejtekbe bevinni kívánt nukleotidszekvenciával.
Az adenovírusok endogén promotereit más, heterológ vagy exogén eredetű, bárhol előforduló promoterrel is helyettesíthetjük, például:
- a Rous-szarkóma-vírus (RSV) hosszú ismétlődő végszakaszában (LTR=long terminál repeat) lévő promoter vagy a fent ismertetett LAT promoter,
- a citomagalovírus IE génjének egy promotere,
- indukálható MMTV promoterek [egér-emlőtumorvírus (mouse mammary tumorvírus=MMTV) eredetű promoterek] vagy metallotionin promoterek.
Más promotereket is használhatunk. Elsősorban a neurális és gliális promoterek az előnyösek, különösen olyan esetekben, amikor az adenovirális vektorba beépített nukleotidszekvenciával inkább az idegsejtek speciálisabb osztályait célozzuk meg. Megemlítjük például a következő promotereket, főként azokat, amelyek a neurotranszmitter-szintetizáló enzimeket kódoló génekben találhatók:
HU 219 304 Β
ΤΗ (tirozin-hidroxiláz)
CHAT (kolin-acetil-transzferáz)
TPH (triptofán-hidroxiláz)
GFAP (gliális fíbrilláris savanyú protein) (glial Fiblillary acidic protein)
Enoláz g (neuron protein marker)
Aldoláz C
A találmány olyan rekombináns vektorok előállítására alkalmas eljárásra is vonatkozik, mely eljárás abból áll, hogy a kiindulási vektorokba beépítjük azt a nukleotidszekvenciát, amelynek az expresszióját kívánjuk, és a megfertőzhető sejteket az említett vektorokkal transzformáljuk. Ahol a vektor teljes élő vírus, a rekombináns vírusok a sejttenyésztő táptalajból izolálhatok. Ha a rekombináns vektor hibás vírus, egy előnyös eljárás szerint, ezzel olyan transzformálható eukarióta sejtvonalat (előnyösen emberi vagy állati eredetű sejtvonalat) transzformálunk, amely maga is tartalmaz egy megkülönböztethető nukleotidszekvenciát. Ez a szekvencia képes az adenovírus-genom azon részét kiegészíteni, amely a vírus replikációja szempontjából lényeges, és amely az említett vektorból hiányzik. Előnyös, ha a kiegészítő szekvenciát az említett sejtvonal genomjába visszük be.
Az ilyen előnyös sejtvonalakkal kapcsolatban meg kell említenünk a humán embrionális vese eredetű úgynevezett „293 sejtvonalat”, amely genomjába integrálva tartalmazza az AD5 vírus genom 5’-szakaszának első 11%-át. Az Ad5 genomjának ez a darabja biztosítja, hogy a rekombináns vírusok ezen hibás szakaszban - e szakasz egy részének deléciója miatt - megfelelően kiegészüljenek. Hibás vírusok termelésére alkalmas eljárás leírását részletesebben tartalmazza az EP 185573 számú európai szabadalmi bejelentés (benyújtva: 1985. november 20-án).
Ilyen sejtvonalak transzformációja után a hibás rekombináns vírusokat szaporítjuk, izoláljuk és tisztítjuk.
Szükségtelen megemlíteni, hogy ugyanez az eljárás alkalmazható más hiányos adenovírusok előállítására, amelyekben a deléció nem a fent említett 5'-szakaszban jön létre, és magától értetődik, hogy az ilyen eljárásban használt sejtvonalaknak tartalmazniuk kell saját genomjukban az adenovírus genomból származó deletált szekvenciát, hogy lehetővé váljék ezáltal az ilyen hibás adenovírusok kiegészülése.
A találmány először bocsát rendelkezésre komoly megoldást arra, hogy injekcióval olyan sejteket - például az aktuális genetikai információt hordozó embrionális sejteket - juttassunk az agyba, amelyek a génterápiában a célsejtekben - elsősorban a posztmitotikus neuronokbán - meglévő metabolikus hiányosságok vagy hibák kijavítását célozzák. Mindez az adenovírusok jelentékeny fertőzőerejének a következménye, amely a megfelelő hibás adenovírus eredetű vektorban megmarad, és így e vírusok képesek szétszóródni az érintett neurális vagy idegszövetekben, miközben lényegében meg is maradnak a kiválasztott szöveten belül, ha speciálisan ebbe voltak beoltva, továbbá képesek a hosszú ideig tartó transzkripcióra, és a legtöbb esetben az ilyen adenovirális vektorok által az idegszövetbe bevitt nukleotidszekvencia expressziójára.
A nukleotidszekvencia, amelynek a központi idegrendszer sejtjeibe való bevezetésére törekszünk, bármilyen olyan szekvenciából állhat, amely e sejtek anyagcseréjével kölcsönhatásba lépő molekulákat képes szolgáltatni. Ezek a molekulák olyan kiválasztott antiszensz RNS-ekből vagy antiszensz oligoribonukleotidokból állhatnak, amelyek képesek hibás messzendzser RNS-ekkel reagálni, és így e hibás mRNS-ek további működését - ami a megfelelő betegségeket eredményezi - képesek blokkolni, például számos neuropszichiátriai betegségben, epilepsziában stb. Úgy tűnik, hogy ez a metodológia különös érdeklődésre tarthat számot az Alzheimer-szindróma kezelésében. Az antiszensz módszert használhatnánk - csak a példa kedvéért - egy βamiloid-prekurzor-blokád bevezetésére, hogy megelőzzük a szenilis plakkokban a β-amiloid-peptid felhalmozódását. Olyan antiszensz oligonukleotidot is fel lehetne használni, amely képes meggátolni az Alzheimerbetegségben szerepet játszó proteinek, például a TAU protein rendellenes foszforilációjában részt vevő enzimek expresszióját. Ugyancsak más eljárás szerint, a nukleotidszekvencia lenne az, amely eltávolítaná a specifikusan kötődő proteineket, önmaga pedig normálisan részt venne azon DNS- vagy RNS-szekvencia feldolgozásában, amelynek a transzkripcióját vagy expresszióját óhajtjuk meggátolni.
Az a nukleotidszekvencia, amelyet a központi idegrendszer sejtjeibe kívánunk bevezetni, olyan expressziós terméket kódolhat, amely biológiai tulajdonsággal rendelkezik. Az említett expressziós tennék képes lehet például (1) egy megfelelő hibás természetes polipeptidet tartalmazó olyan terméket kompenzálni, amelyet egy hibás megfelelő nukleotidszekvencia kódol, vagy (2) a megfelelő természetes endogénpolipeptidet tartalmazó termék célsejtekben való endogéntermelésének a hiányát kompenzálni, vagy (3) új terápiás hatásokat bevezetni a fertőzött sejtekbe. Hibás polipeptidet tartalmazó termékek lehetnek például a neurotranszmitter-szintetizáló enzimek és a növekedési faktorok. Például a Parkinson-szindróma esetében (amelyet a dopaminergsejtek sebezhetősége jellemez) lokális DOPA (3,4-dihidroxi-fenilalanin) vagy dopamintermelést lehet elérni tirozinhidroxilázt vagy növekedési faktort - ilyen a BDNF (brain derived neurotrophic factor=agyi eredetű neurotrof faktor) - kódoló cDNS kifejeződése révén, ami kedvező lehet a dopaminerg neuronok túlélése szempontjából. Hasonló a helyzet az Alzheimer-szindrómánál, ahol az egyik hiányzó neurotranszmitter az acetil-kolin, amelyet a kolin-acetil-transzferáz szintetizál. Ezenfelül az NGF (nerve growth faktor=idegnövekedési faktor) tudná megelőzni a kolinerg neuronok degenerációját.
Egy másik potenciálisan hasznos kifejezendő faktor a CNTF (ciliary neurotrophic factor=ciliáris neurotrof faktor), amely megelőzheti a neuronok elhalását. A CNTF az agyban is jelentős hatást fejt ki, blokkolja például a perifériás idegek romlását (amely valószínűleg diabéteszben szenvedő betegekben indukálódik). További trofikus faktorok - amelyeknek a kifejeződését meg lehet kísérelni - például a következők: IGF, GMF, aFGF, βΕΟΕ, NT3 és NT5.
HU 219 304 Β
Növekedési faktorok termelését általában olyan betegek idegsejtjeiben indíthatjuk meg, akik neuropátiáktól, hűdésektől szenvednek, akiknél gerincvelő-sérülés, miotrofiás laterális szklerózis, Huntington-chorea, Alzheimer- és Parkinson-kór, valamint központi bénulás (little-kór) áll fenn. Más lehetőségek mellett, az epilepsziát a GABA (gamma-amino-vajsav) neurotranszmitter központi idegrendszerben való helyi termelésével - a glutaminsav-dekarboxiláz expressziójának eredménye - lehetne kezelni.
A találmány különösen lényeges az öröklött betegségek kezelésére használt olyan készítmények előállítása szempontjából is, amelyek a mutáns gén hibás vagy hiányos termékét befolyásolják: a lizoszomáiis enzimeket a lizoszomáiis betegségekben [például: hexóz-aminidázok a Tay-Sachs és Sandhoff-szindrómában, aril-szulfatáz a metakromatikus leukodisztrofiában, glükocerebrozidáz a Gaucher-szindrómában, b-glükuronidáz a mukopoliszacharidózisban és a HGPRT (hipoxantin-guanin-foszfo-ribozil-transzferáz) a Lesh-Nyhan-szindrómában stb...]. Az öröklött progresszív neurondegenerációkat a betegséget okozó gén normál változatának adenovírus-vektorok révén való átvitelével kezelhetjük, vagy - mint előbb tárgyaltuk - növekedési faktorok helyi termelésének megindításával. Kimutatták például, hogy a CNTF-termelés lelassítja egerekben a progresszív motoneuron degenerációt (pmd) [Sendtner et al., Natúré, 358, 502-504 (1992)], megfigyelték, hogy patkánynál, öröklött retinadisztrofiában az aFGF ugyanilyen hatással volt a fotoreceptor degenerációjára [Faktorovich et al., Natúré, 347, 83-86 (1990)]. A szerzett gerincvelő-betegségeknél - ilyen a gyakori és mindig halálos miotrof laterális szklerózis (ALS=Amyotrophic Lateral Sclerosis) - talán ugyanígy hasznos lehetne a CNTF lokális termelése, mint ahogyan a motoneuronok védelménél is jó hatásúnak bizonyult.
Az öröklött diszmielinizációs betegségeken szintén lehetne javítani úgy, hogy a mielinszintetizáló sejtekbe adenovírus közvetítésével gént vinnénk be.
Végül a potenciális terápiás szerek bizonyos más típusait is elő lehetne állítani a központi idegrendszerben, így például enkefalinokat az erős fájdalmak csillapítására, például rákos betegekben.
A találmány továbbá a rekombináns adenovírusvektorokat tartalmazó gyógyszerkészítményekre is vonatkozik, amely vektorok az előbbiekben meghatározott szekvenciákat tartalmazzák olyan gyógyszerészetileg elfogadott hordozóval társítva, amely a kiválasztott alkalmazási módhoz, például az aktuális idegszövetben előállított vírusszuszpenzió közvetlen in situ alkalmazásához megfelelő, vagy - bár a legkevésbé előnyös, főként, ha az adenovírus-vektor olyan promotert is tartalmaz, amely szelektíven működik a meghatározott idegszövetben vagy sejtekben - az általánosan használt módon, például intravénásán adjuk be.
A találmány nem korlátozódik az adenovírus-vektorok előbb említett terápiás felhasználására. Az adenovírus-vektorok, erős fertőzőképességüknek köszönhetően, felhasználhatók az idegsejtek meghatározott populációinak in vitro vizsgálataiban, például egy promoter kapacitásának tanulmányozására (amelyet ezután megfelelő „marker”-hez - ilyen a b-gal - kötünk), hogy vajon a szóban forgó idegsejtek polimerázai felismerik-e. Ezeket az adenovírus-vektorokat felhasználhatjuk még arra, hogy kimutassuk vagy kiértékeljük a rekombináns vírus (a nukleotidszekvencia kifejeződése az ilyen sejtekben egy működőképes promoter szabályozása alatt történik) kölcsönhatását az idegsejtek egy adott populációjával vagy egy összetettebb idegszövettel. Egy ilyen kiértékelés vagy kimutatás például arra irányulhat, hogy lokalizálja az összetett szövet azon sejtjeit, amelyek receptort hordoznak a vírus számára. A kimutatáshoz bármelyik megfelelő klasszikus jelzési módszer használható. Használhatunk például jelzett antitesteket a vizsgált nukleotidszekvencia expressziós termékének a kimutatására. E vizsgálatoknak jelentős jövője lehet a neuroanatómia területén.
A találmány szerinti rekombináns vektor egy olyan módszerben is felhasználható, amelyben egy kiválasztott polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia transzkripciós terméke vagy expressziós terméke egy állat központi idegrendszerének sejtjeiben - például az agy és gerincvelő sejtjeiben, elsősorban a neurális, glia- vagy ependymasejtekben - fejti ki hatását, vagy ezekben termelődik, és az említett állatban vizsgáljuk az észlelt fiziológiai és viselkedésbeli módosulásokat, amelyeket az említett transzkripciós termék vagy az említett expressziós termék indukált.
Például a szeptohippokampális rostköteg sérülése esetén, amely kimeríti a hippocampusban az acetilkolint, lehetőség nyílna a kolin-cetil-transzferázt (CHAT) kódoló gén hippocampusba való bevitele hatásának a tanulmányozására. Ennek a génnek a célzott bevezetése a kolinergrostok (amelyeket a sérülés vágott el) belsejében megindíthatja a rendelkezésre álló acetilkolin mennyiségi növekedését, következésképpen megszüntetheti hiányát. A hiányt a memorizálási viselkedési vizsgálatokkal állapíthatjuk meg. Például az „uszodába” dobott egerek meg tudják tanulni, hogy újból hogyan találják meg azt a platót, amelynek a segítségével kimenekülhetnek a vízből (Morris-féle uszoda). Azok az állatok azonban, amelyekben a septo-hippocampus rostkötegét károsodás érte, ennél a műveletnél nagy hátrányban vannak. Hogy az acetil-kolin-termelés a génexpresszió következtében megnövekedett-e, abból ítélhető meg, hogy az állatok újból könnyen meg tudják találni a platót.
Egy másik példa szerint, a találmány lehetővé teszi a motoros megnyilvánulásban mutatkozó zavaroknál - amelyet a striatum denervációja okoz, különösen a középagy dopaminerg belsejének (substantia nigra) sérülés esetén - a kompenzáció fokának az analízisét. A tirozinhidroxilázt (TH) kódoló gén bevezetése a striatumba ki tudja javítani a hiányt. A kompenzáció a patkányok rotációs tesztben való viselkedésének a tanulmányozásával állapítható meg: az egyik oldalon megsebzett állatok csak repetitív módon forognak (percenként több mint tíz forgás), ha apomorfminjekciót kapnak. Ebben a viselkedési tesztben állapítható meg a dopamintermelés (amely a TH gén bevezetéséhez kapcsolódik).
HU 219 304 Β
Egy további példa mutatja, hogy a találmány más esetekben is elősegíti az elektrofizikai és viselkedési vizsgálatokat. Például a háti gerincvelőszerv, amely a nociceptív stimulációhoz kötött információkat közvetíti (fájdalomcsatomák), érzékeny morfinra, amely aktivitás csökkenését okozza. Egy endomorfinkódoló gén bevezetése a gerincvelőbe előidézheti ennek az anyagnak a szekrécióját, amely - mint a morfin - hatást gyakorol ezekre a sejtekre. Egy ilyen hatás viselkedési tesztekkel (az állatok reakcióküszöbe nociceptív stimulációra) értékelhető ki, valamint magának a gerincvelő neuronjain végzett elektrofiziológiai vizsgálatokkal. E sejtek aktivitásának a megfigyelése lehetővé teszi az átvitt gén expressziója által indukált változás értékelését.
A találmány által nyújtott lehetőségeket a későbbiekben szemléltetjük, ugyanakkor példák leírásával, amelyeket a jelen leíráshoz csatolt ábrák részben alátámasztanak, nem kolátozzuk a találmány oltalmi körét. Elsősorban az Ad.RSVb-gal használható sokat ígérő eszköz gyanánt az agy speciális területein a neuron- és gliamorfológia analízisénél, ugyanis az injekció helyén a sejtek Golgi-szerű festődését teszi lehetővé. Az axonok enzimmel való feldarabolása további módozatokat nyújt az elkülöníthető neuronpopulációk kihatásainak tanulmányozásához. Vagy megfordítva, a vírus felvétele a terminálok által és ezt követően visszairányuló transzportja a neuron sejttest felé, lehetővé teszi, hogy az afferens idegpályák egyes csoportjait egy speciális területhez rendeljük.
Ennek a technikának a fő előnye a neuroanatómia számára abban van, hogy az X-gal festés könnyen kombinálható minden más jelzési technikával, főként immunkémiai technikákkal. A vektorok használata az nls(nuclear localization signal) szekvencia elhagyásával, javíthatja egy ilyen technika eredményességét.
A adenovirális vektor alapul szolgál továbbá az RSV LTR promotert helyettesítő - tekintetbe véve a különböző idegsejt-populációkat - más promoterek hatásainak tanulmányozásához.
A találmányt az alábbi, nem korlátozó jellegű példákkal közelebbről ismertetjük.
1. példa
Az Ad.RSVb-gal jelű, replikációhibás adenovírust használtuk, amely egy magra irányuló β-galaktozidázt (b-gal) fejez ki a Rous-szarkóma-vírus hosszú ismétlődő végszakasz (RSV LTR) promoter által szabályozottan [L. D. Stratford-Perricaudet, I. Makeh, M. Perricaudet, P. Briand; J. Clin. Invest., 90, 626 (1992)]. Az említett vektorban az SV40 nls (nuclear localization signal) gondoskodott a vektor sejtmagokhoz történő irányításáról. Vizsgáltuk, hogy a vektor képes-e megfertőzni a ganglion cervicale superiusokból (superior cervical gangba=SCG) származó szimpatikus neuronok és a szimpatikus asztrociták primer tenyészeteit. A ligái aktivitását hisztokémiai módszerrel tettük láthatóvá, amikor is szubsztrátumként 5-bróm-4-klór-3-indoΙίΙ-β-D-galaktozidázt (X-gal) használtunk [J. R. Sanes, J. L. Rubinstein, J. F. Nicolas; Embo. J., 5, 3133 (1986)]. Az antimitotikus szer jelenlétében tenyésztett
SCG alkalmas eszközül szolgál arra, hogy tiszta és homogén neuronkészítményt kapjunk [L. D. Stratford-Perricaudet, M. Perricaudet; Humán Gene Transfer, (szerkesztő: O. Cohen-Haguenauer, M. Boiron;
J. Libbey; Eurotext Ltd., 1991) 51. oldal].
Tehát az Ad.RSVb-gal adeno vírussal való inkubálás után a szimpatikus neuronokbán és asztrocitákban a b-gal expressziója a következőképpen megy végbe.
Kétnapos Wistar-patkányokból eltávolítjuk az SCG-t, szétválasztjuk, 16 mm-es kollagénnel bevont lemezekre visszük, és az előbb említett „Humán Gene Transfer” (1991) című kiadványban leírt módon tenyésztjük. A tenyészethez az első hét folyamán citozinarabino-fúranozidot (10 μΜ) adunk, hogy megakadályozzuk a ganglion eredetű nem idegsejtek proliferációját. 6 nap múlva a sejttenyészeteket vagy kontrollként csak a táptalajt, 106 plakk-képző egység (pfu) Ad.RSVb-gal vírussal oltjuk be. 24 óra múlva a vírust eltávolítjuk, és a sejteket 2 napon át a táptalajban hagyjuk. A sejteket mossuk, paraformaldehiddel fixáljuk, majd a b-gal-aktivitást hisztokémiai festéssel mutatjuk ki [lásd előbb, J. R. Sanes, J. L. Rubinstein, (1986)].
napig tartó tenyésztés után a következő megfigyeléseket tettük: látszólag minden sejt b-gal-pozitív volt, nyilvánvaló toxikus hatás vagy morfológiai változás nélkül. Ha beoltatlan párhuzamos tenyészetben végeztük a festési reakciót, pozitívan jelzett sejteket nem észleltünk.
Asztrocitákban dúsított patkányhippocampus primer szövettenyészetben is vizsgáltuk az adenovírus fertőzőképességét. Az oltás a sejtek körülbelül kétharmad részében eredményezett kék magfestődést. A b-gal-pozitív sejtek asztrocitákként való azonosítását úgy igazoltuk, hogy további festést végeztünk gliális fibrilláris savanyú protein (GFAP=glial fibrillary acidic protein) elleni antitesttel.
A vizsgálatot pontosabban a következőképpen végeztük. Dúsított asztrocita primer tenyészeteket készítettünk újszülött patkány hippocampus szövetből McCarthy és DeVellis [K. D. McCarthy, J. De Vellis; J. Cell Bioi., 85, 890 (1980)] leírása szerint. A sejteket 35 mm átmérőjű műanyag csészékre vittük, ahol 5 napig tenyésztettük Dulbecco által módosított, kiegészített Eagle táptalajban (DMEM). Minden csészét 2 μΐ adenovírus-oldattal (titer: 108 pfu/ml) oltottunk be, majd 24 óra múlva a sejteket mostuk, paraformaldehidben fixáltuk. A b-gal kifejező sejteket X-gal hisztokémiai vizsgálat alkalmazásával analizáltuk. Megfigyeltük, hogy a két jelzés egymás fölé helyeződött (nem mutattuk be).
2. példa
Az adenovírus alkalmazhatóságát agysejtek in vivő fertőzésére számos jellemző struktúrában vizsgáltuk meg.
Tizenhét hím Wistar-patkányba (10 hetes korú) mély anesztéziában 1010 pfú/ml titerű nagymértékben tisztított vírust tartalmazó 1-5 μΐ táptalajt oltottunk sztereotaxis berendezésben vagy a hippocampusba vagy a substantia nigrába. Az állatokat a beoltás után
HU 219 304 Β
1, 2, 3, 5, 7, 30 és 60 nap múlva leöltük. A pozitív sejtekben a b-gal-aktivitást hisztokémiai módszerrel mutattuk ki, X-gal-szubsztrátum használatával és protein elleni antitesttel [az antitest egy affinitással tisztított bgal elleni nyúl IgG frakció volt (Cappel, 1:800 hígítás), amelyet azután egy sztreptavidin-biotinezett peroxidázkomplexhez (Amersham) kötöttünk diaminobenzidinnel, mint kromogénnel, nikkellel aktiválva]. Az utóbbi módszer érzékenyebb, és bizonyos esetekben kimutatta a b-gal-t finom citoplazmatikus folyamatokban is, ami az átvitt gén intenzív expressziójának tudható be.
Mindegyik oltott állat magas b-gal-aktivitást mutatott. Az expressziót korán, az oltás után már 24 óra múlva ki tudtuk mutatni, de fennmaradt a 2 hónap múlva vizsgált állatokban is. A vírus diffúziója erősebb volt a hippocampusban, mint a substantia nigrában, és szétterjedt az egész dorzális hippocampusban. A substantia nigrában az infekció teljes képe korlátozottabb volt, és egy mediolaterális irány mentén oszlott el. Ez a különbség valószínűleg visszatükrözi a vírusnak azt a hajlamát, hogy inkább az alacsony tapadóképességű olyan szövetekben szóródjon, mint a fissura hippocampalis és mint a gyrus dentatus szemcsesejtrétege és az ezt körülvevő szövetek közötti határréteg.
A hippocampusban a fertőzött terület kiterjedése az alkalmazott vírusoldat térfogatával korrelált. A hippocampusba való oltás után a 3. és 7. nap között elölt patkányokban a fertőzött terület általában 1 -4 mm3 * * * *-t tett ki, 3-5 μΐ beoltott vírus (1010 pfu/ml) esetén. Érdekes módon a vizsgálati idő folyamán a hippokampális metszetek gondos vizsgálata a jelzés mintázatában változást mutatott ki. Míg az oltás utáni első hét alatt csak csekély különbségeket észleltünk, 1 hónap múlva a jelzett sejtek eloszlásában jelentős átalakulás ment végbe. Ez az új mintázat 2 hónapig megmaradt. Ebben a hosszú ideig tartó mintázatban a b-gal-pozitív sejtek eloszlása kevésbé volt diffúz, és úgy tűnt, hogy egy meghatározott sejtrétegre korlátozódik.
A beoltott állatokban nem észleltünk nyilvánvaló toxikus hatást, mindegyik túlélte az oltást szemmel látható viselkedési rendellenességek nélkül. A vírussal fertőzött agy vizsgálata kimutatta, hogy az oldalkamra (ventriculum laterális) nem nagyobbodott meg, és a struktúrák sejtszerkezete nem bomlott fel. Az egyetlen észrevehető változás egy helyi szövetelhalás és reaktív gliosis volt, amely az oltás helyére korlátozódott. Ez a jelenség túlnyomórészt magának az injekciónak tudható be, ugyanis hasonló hatást figyeltünk meg a fiziológiás konyhasóoldattal oltott állatoknál is. Végül a hippokampális metszetek Nissl-festéssel sejtszinten végzett analízise sem sejtveszteséget, sem citolízisre utaló bizonyítékot nem tárt fel sem a piramissejtrétegekben, sem a gyrus dentatus szemcsesejt rétegében.
3. példa
A megelőző eredményekből leszűrhető, hogy az adenovírus képes megfertőzni az agysejteket. A következő kísérlet részletesebben szemlélteti a neuronok in vivő fertőzhetőségét.
Gliasejteket és neuronsejteket fertőztünk Ad.RSVbgal adenovírussal közvetlen in vivő injekcióval. A mikroglia sejtekben b-gal expressziót immunhisztokémiai módszerrel mutattuk ki az oltás helyéhez közeli területen egy olyan patkánynál, amely a leölés előtt 5 nappal kapott intrahippokampális injekciót. Az immunhisztokémiai reakciót nikkellel aktivált peroxidázzal végeztük és fluoreszceinnel konjugált második antitesttel.
Röviddel az injekció után sok b-gal-pozitív sejt tipikus mikroglia sejt morfológiát mutatott. Ezek a kis sejtek a sejttestről körös-körül kinyúló, erősen elágazó finom nyúlványokat mutatnak. Bár 1 héten át a mikroglia sejtek képezték a b-gal kifejező sejtek nagy részét, számuk drasztikusan csökkent az injekciót követő hosszabb idő folyamán. A korai időpontokban kettős festéssel, X-gal szubsztrátum használatával és asztrogliális gliális fibrilláris savanyú protein (GRAP=glial fibrillary acidid protein) elleni antitest segítségével más fertőzött sejtekről kimutattuk, hogy asztrociták (az eredményeket nem mutatjuk be).
Mindkét beoltott agyi struktúránál meggyőző bizonyítékot találtunk arra, hogy néhány fertőzött sejt neuron volt. A substantia nigra esetében a b-gal jelenlétét a dopaminergsejtekben egy tirozin-hidroxiláz (TH) - a katekolaminerg neuronok klasszikus markere - ellenes antitest használatával tudtuk bizonyítani. Nagyobb nagyítással világosan látszott, hogy a TH antitestekkel jelzett sejtek kék sejtmagot is mutattak. Ezek a sejtek a bgal-pozitív sejtek körülbelül 50%-át tették ki a fertőzött dopaminerg sejtállományon belül. A hippocampusban számos jelzett sejtet kétségtelenül mint neuront azonosítottunk mind morfológiai, mind anatómiai jellemzők alapján (1. ábra). Néhány sejtben a festés Golgi-szerű képet mutatott a b-gal diffúziójának eredményeként, és ez az enzim nagyon intenzív expressziójának tudható be. Ezt a mintázatot jórészt a 48. órától számított 1 hétig figyeltük meg. Piramissejteket, szemcsesejteket és hilus intemeuronokat (pyramidal neurons, granule cells and hilar intemeurons) láttunk a CA1 piramissejtrétegben, a szemcsesejtrétegben és a gyrus dentatus hilusában. Ez utóbbi sejtek könnyen azonosíthatók a hippocampus jellemző sejtszerkezete miatt, amely megkülönböztethetően elkülönített és réteges sejtalcsoportokból áll. Ritkán, hosszú festett nyúlványokat figyeltünk meg a sejttesttől több mint 400 pm távolságra, ami ezeknek a sejteknek idegi természetét erősíti meg. Ezenkívül láttuk, hogy több óriás visszeres csomó fut át a hiluson, ami azt jelenti, hogy a puha rostok is jelölődtek.
Mint fent kihangsúlyoztuk, az oltás után 1 vagy 2 hónappal, mindegyik leölt patkánynál a pozitív b-gal sejtek eloszlása és száma jelentősen különbözött a korábbi időpontokban megfigyeltektől. A b-gal-pozitív sejtek eloszlását a gyrus dentatusban az Ad.RSVb-gal adenovírussal való oltás után 1 hónappal, X-gal hisztokémiai vizsgálattal értékeltük. Azt találtuk, hogy a beoltott hippocampusban a kékre festódött sejtek a bal oldali gyrus dentatusban koncentrálódtak, összehasonlítva a nem oltott ellenkező oldallal (2. ábra; skálabeosztás 1 mm). A fetőzött sejtek elhelyezkedését a gyrus
HU 219 304 Β dentatusban immunhisztokémiai b-gal kimutatással igazoltuk (festés peroxidáz plusz nikkel használatával). Nagy nagyításban (40x) a gyrus dentatus szemcsesejt rétegében nagy számban sűrűn összezsúfolódott b-gal jelzett sejtmagok voltak láthatók (3. ábra, skálabeosztás 300 pm).
Abból a molekularétegből, amely az oltás után már rövidebb időn belül erősen fertőzött volt, eltávolítottuk a festődött sejteket. Krezil-ibolyával utánfestett metszeteknél (az adatokat nem mutatjuk be) azt találtuk, hogy a b-gal-pozitív sejtek a szemcsesejtréteg sejtjeivel estek egybe, és pozitív sejteket nem lehetett látni a réteg legbelső részében, amely a kosársejtek nagy részét tartalmazza és kevés gliasejtet. A 2 hónap múlva leölt patkányban a kék színeződés kifejezetten a szemcsesejtrétegben koncentrálódott.
4. példa
A következőkben ismertetett kísérletek eredményei ugyancsak azt mutatják, hogy az idegsejt eredményesen fertőzhető adenovírussal.
Módszerek:
LacZ gént tartalmazó adenovírus-vektorokat szerkesztettünk már előbb leírt eljárások szerint [lásd előbb, Stratford-Perricaudet et al., (1990)]. Tizenhárom kifejlett Sprague-Dawley-patkányt (Charles River, Franciaország) klorál-hidráttal (400 mg/kg; ip.) érzéstelenítettünk, majd az állatokat sztereotaxis berendezésbe helyeztük. Vírusszuszpenziót (3,3χ101θ-10Η pfu/ml) injektáltunk Hamilton-fecskendővel (10 pl, összesen 3,3 χ 108-l9 pfú) 10 percen át a XII. idegmagba (nucleus) (n=6) vagy az előagy különböző területeibe (n=7). Négynapos túlélés után a patkányokat újból érzéstelenítettük, és transzkardiálisan 4%-os paraformaldehiddel - 0,1 M foszfátpufferben, pH 7,4 - perfúndáltunk. A központi idegrendszert eltávolítottuk, 4 órán át utófixálást végeztünk, majd 30%-os szacharózban fagyasztottuk egy éjszakán át. Kriosztátban paraszagittális metszeteket (vastagság: 48 pm) készítettünk. Minden negyedik metszetet 4-12 órán át 28-30 °C-on X-gal színezékkel inkubáltunk, az előzőekben leírtak szerint [J. R. Sanes et al., (1986)]. Három patkánynál az X-gal kezelt metszeteket foszfátpufferben öblítettük, majd a továbbiakban klasszikus immunkémiai technikákkal, Vectastain-készletekkel (Vector Labs) kezeltük vagy GFAP elleni nyúl polikonális antitest (1/500) vagy az OX-42 egér monoklonális antitest használatával, amely specifikusan festi a patkány központi idegrendszerben a mikrogliasejteket. A metszeteket zselatinezett tárgylemezre vittük, és minden második metszetet krezil-ibolyával utánfestettünk mielőtt végül toluolból fedőlemezzel lezártuk.
A 4. ábrán a patkányagy különböző sejtpopulációiban a fent említett adenovírus injekció után a b-galaktozidáz hisztokémai festésének mikrofotói láthatók. Az a. és b. festődést a tizenkettedik (XII.) idegmagba (nukleuszba) való injekció után figyeltük meg. A XII. nukleuszban gyakorlatilag minden neuron megfertőződött, a festődés minden neuronnyúlványra, beleértve az axonokat (nyíl az a. képen), kiterjedt, és ez „Golgiszerű” megjelenést adott a sejteknek. Néhány fertőzött sejtet asztrocitaként azonosítottunk (nyílhegyek) a barna reakciótermék révén, ami a GFAP-vel szembeni immunreaktivitást mutatja. A d. képen egy intraventrikuláris injekciót követően, az ependymasejtek (ep) festődése látható. Az a., b. és d. metszeteket krezilibolyával utánfestettük.
Az alábbiakat figyeltük meg.
Az oltás nem okozott látható mellékreakciókat az állat egészségében és viselkedésében az oltás után 60 napig tartó megfigyelés alatt (a leghosszabb vizsgálati idő). Mindegyik esetben a sejtek nagy száma festődött hisztokémiailag. Az idegsejtek, beleértve a neuronokat, megfertőződtek (4a. és 4b. ábra), és a gliasejteket asztrocitákként (4c. ábra) vagy mikrogliasejtekként (nem láthatók) azonosítottuk a kettős festéssel végzett kísérletekben, specifikus immunkémiai markerek használatával. Ha az injekciók célja a ventrikuláris rendszer volt, az ependymasejtek sokasága fejezte ki a gént (4d. ábra).
Jelzett sejteket az agyparenchimában főként a tű nyomától 500-1000 pm-en belül találtunk. Úgy tűnik, hogy a fertőzött sejteket tartalmazó terület pereme tekintetbe veszi az anatómiai határokat, például a nagyrostos idegpályákat vagy lemezeket (lamellák). Azok az injekciók például, amelyek a XII. nukleuszt (idegmagot) vették célba (4a. és 4b. ábra) gyakorlatilag a nukleuszon belüli összes neuron teljes és intenzív festődését okozták, míg a körülvevő területek csak elszórtan tartalmaztak fertőzött sejteket. Ehhez hasonlóan a kamrába adott injekciók után, több milliméteren keresztül, fertőzött ependymasejteket figyeltünk meg, míg a szomszédos idegszövet egyáltalán nem tartalmazott festődött sejteket (4d. ábra). Valószínű tehát, hogy az injekció helyén a b-galaktozidáz kifejező sejtek topográfiája megfelel a vírus partikukák szöveten belüli korlátozott szóródásának, és az anatómiai határok, így például a nagyrostos idegpályák vagy a glia limitans, megakadályozzák a diffúziójukat.
5. példa
A tűnyom körüli festődött sejteken kívül - ahol a vírusrészecskék endocitózisa hasonló volt a perikariális szinten megfigyelt endocitózishoz - olyan neuroncsoportok is megfestődtek, amelyek axonnyúlványokat bocsátottak ki az injekciós területre, mint például a substantia nigra neuronjai a striatumba való injekció után (5b. ábra).
Az 5. ábra tulajdonképpen olyan mikrofotókat mutat be, amelyek a striatumba adott adenovírus injekció után b-galaktozidáz hisztokémiai festést mutatnak. A módszerek a 4. példában ismertetett vizsgálatokkal azonosak voltak, (a) Az injekció helyét környező sejtekben lévő reakciótermék. Reakciótermék főként a nukieáris-perinukleáris területen volt látható, és intenzitása a nagyon gyengétől (nyílhegyek) az erősig változott, a substantia nigrában (sn) a neuronokba és a ventrális tegmentális területre (vta=ventral tegmental area) terjed ki, amelyek a virális vektort a striatumtól visszafelé szállították (20-szoros nagyítás).
HU 219 304 Β
A nigra sejtekben a festődés nukleáris-perinukleáris helyzete, valamint a nigro-striatalis axon pályában az erős festődés hiánya arra mutat, hogy inkább a vírusrészecskéket és nem az enzimet vették fel az axon termináljai, és szállították vissza a striatumból a substantia nigrához. Ezzel szemben nem észleltünk biokémiai festődést azokban a neuronokbán, amelyek axonjai keresztezték az injekció helyét (de nem végződtek benne), és ebből arra lehetett következtetni, hogy vírusrészecskéket nem kebeleztek be endocitózis révén az átmenő axonok.
6. példa
Az előző eredmények megerősítik, hogy az idegsejtek nagyon erősen fertőződnek adenovírussal. Ezt az alábbiak szerint végzett kísérletek is igazolják.
Módszerek: 3,3 χ 101θ pfu/ml titerű szuszpenziót injektáltunk közvetlenül vagy az oltás előtt fiziológiás konyhasóoldattal hígítva 10 patkány agyába. A további módszerek megegyeztek a 4. példában leírtakkal, kivéve, hogy a metszeteket koronális síkban (coraonal pláne) készítettük.
A különböző hígítású adenovírus-szuszpenziók talamuszba való oltása után 1 héttel készített mikrofotók a következő eredményeket mutatják (a metszeteket krezil-ibolyával utánfestettük). (a) 3,3 χ 101θ pfu/ml vírusszuszpenzióból 10 μΐ (összesen 3,3 χ 108 pfu) beoltása után citolítikus hatást figyeltünk meg, továbbá sejtveszteséget és gliosisos területeket (a nyilak a vírus injekció által okozott sejtpusztulást mutatják; 20-szoros nagyítás; X-gal-lal nem kezelt metszet, (b) Összesen 3,3 xlO5 pfu injekciója utáni festődés. Több ezer sejt még mindig kifejezi a gént, ezek főként nukleáris-perinukleáris festést mutatnak, kivéve néhány rövid neuritet (nyílhegy). Nem látható citolítikus hatás. (200-szoros nagyítás), (c) 3,3 χ 103 pfu injekciója utáni festődés. Kevés sejt még mindig kifejezi a gént (nyílhegyek) egy kis területen, amely megfelel a tűhegynyomnak. Nincs nyilvánvaló citolítikus hatás (400-szoros nagyítás).
Magas titerű vírusszuszpenziókkal való oltás után a sejtek jelentékeny része fertőződött, de sok sejt fertőződött akkor is, ha sokkal alacsonyabb titereket használtunk. Azokban a patkányokban, amelyeket 10 μΐ 3,3 χ 107 pfu/ml titerű (maximálisan 3,3 χ 105 fertőző részecske) szuszpenzióval oltottunk, több ezer idegsejt fejezte ki a LacZ gént még 8 nappal az oltás után is (6b. ábra); alacsony, mintegy 3300 pfu titerű injekciók közel 100 sejt festődését eredményezték (6c. ábra). A jelzés intenzitása egy másik bizonyítéka az idegsejtek kiváló fertőzhetőségének. Amikor magas titerű vírusszuszpenziót használtunk (109 pfu/ml titemél magasabbat), a festődés intenzitása rendszerint nagyon erős volt az injekció helye körüli területen, ahol a sejtek a vírusrészecskék legnagyobb koncentrációjával érintkeztek. A b-galaktozidázhoz adott nls-szekvencia ellenére a jelzés olyan intenzív volt, hogy az nemcsak az egyes sejtek magjára korlátozódott, hanem bediffundált a citoplazmába és a nyúlványokba (például a neuronok dendritéibe és axonjaiba), ami a sejtek teljes „Golgi-szerű” festődését okozta (6a., b. és 5a. ábra). Ezzel szemben, az injekció helyének peremén elhelyezkedő legtöbb sejtben és a retrográd módon fertőződött sejtekben csak a nukleuszok voltak jelzettek (5a., b. ábra). Hasonlóan, az enzim magban való elhelyezkedése volt az általános, ha alacsony titetű vírusszuszpenziókat alkalmaztunk (6b., c. ábra).
Egyetlen idegsejt - különösen egy neuron - masszív mennyiségű vírusrészecskét képes endocitózis révén bekebelezni. Ez a nagyfokú fertőzhetőség a legvalószínűbb magyarázat a citopatogenitásra (neuronpusztulás, gliózis, vaszkuláris gyulladásos válasz és szövetveszteség jellemzi), amelyet a magas titetű szuszpenziók oltásakor az injekció helyén megfigyeltünk (6a. ábra). Az alacsony titetű vírusszuszpenzióknál a citopatogenitás nyilvánvaló hiánya (<107 pfu/ml) alátámasztja ezt a feltevést. Nagyon valószínű tehát, hogy a citopatogenitás az injekció helyéhez egészen közel elhelyezkedő sejtek által endocitózissal bekebelezett roppant mennyiségű vírusrészecskével függ össze.
7. példa
Az adenovírus-fertőzésnek nincs szisztémás citopátiás hatása, ugyanis az oltás után 45 nappal még jól működő, LacZ gént kifejező idegsejteket figyeltünk meg. Kilenc patkányt oltottunk be, és az injekció után minden második héten leöltünk (n=3) egyet. A 4. példában leírt sebészi és szövettani módszereket alkalmaztuk, kivéve, hogy a metszeteket a koronális síkban készítettük. A mikrofotók b-galaktozidáz hisztokémiai rakcióterméket mutattak egy olyan patkányban, amelyet 45 napig élve hagytunk a XII. idegmagba (XII.) adott adenovírus injekció után. Néhány sejtben még kifejeződött a gén, amint ezt a nukleáris-perinukleáris hisztokémiai festődés kimutatta. Ezek között voltak motoneuronok is, ahogy ezt a 7. ábra szélén lévő kisebb kép szemlélteti (krezil-ibolyával utánfestve). Néhány axon is tartalmazott enzimet (nyíl) (a 7. ábra 40-szeres nagyítású, a betétkép 1000-szeres nyagyítású).
Ezek az eredmények bizonyítják, hogy a központi idegrendszer sejtjeibe; köztük a neuronokba, eredményesen lehet nagyszámú replikációhiányos adenovírust beoltani, amely ezután kifejezi az átvitt idegen gént.
A találmány kihatása a génterápiára jelentős. Jóllehet a találmány, mint előbb említettük, arra törekszik, hogy arra az esetre, amikor egy betegbe, akinek a sejtjei genetikailag hibás gént hordoznak, és az említett genetikai hiba kompenzálására főként embrióból származó nukleinsavszekvenciát tartalmazó teljes idegsejteket ültetnek át, egy más megoldást biztosítson, magától értetődik, hogy az ilyen átültetési technikákra a továbbiakban még lehet találni tökéletesebb megoldást. Pontosabban, az átültetendő sejteket fel lehet „dúsítani” a kívánt nukleinsavszekvenciával, vagy el lehet látni ezekkel úgy, hogy a sejteket in vitro transzformáljuk egy, a kívánt nukleinsavszekvenciát tartalmazó adenovírus-vektorral, még mielőtt ezeket a sejteket a sejtterápiában már használt technikáknak megfelelően átültetnénk. Ez a tökéletesítés különösen jelentős lehet olyan neuronok primer tenyészeteinek esetében, amelyek nem mentek át változáson.
HU 219 304 Β
8. példa
Ez a példa a humán tirozin-hidroxiláz (hTH) cDNS-t kifejező rekombináns hibás adenovirális vektor AdLTR.hTH - szerkesztését ismerteti.
Az AdLTR.hTH adenovírus szerkesztésénél úgy jártunk el, hogy 293 sejteket pLTR-IX-hTH plazmiddal és Ad-dll324 adenovírus deléciós mutánssal [Thimmappaya et al., Cell, 31, 543 (1982)] kotranszfektáltunk.
1. A pLTR-IX-hTH plazmid szerkesztése.
A pLTR-IX-hTH plazmidot úgy szerkesztettük, hogy a hTH-Ι cDNS-t tartalmazó pSP6 HTH-1 [Horellou et al.; J. Neurochem., 51,652 (1988)] 1769 bp méretű Sall-BstXI fragmentumát beépítettük a pLTR-IX plazmid egyetlen Sáli helye és EcoRV helye közé az RSVLTR promoterhez képest 3’ irányban. A beépítés érdekében a BstXI restrikciós helyet T4 DNSpolimeráz segítségével tompa végűvé alakítottuk.
A pLTR-IX plazmidot a pLTRp-gal plazmidból [Stratford-Perricaudet et al.; J. Clin. Invest., 90, 626 (1992)] úgy kaptuk, hogy a β-gal gént tartalmazó Clal-Xhol helyet töröltük, Klenow-enzimmel emésztettünk, és T4 DNS-ligázzal ligáltunk.
2. Az AdLTR.hTH hibás rekombináns adenovírus szerkesztése.
A pLTR-IX-hTH plazmidot és az Ad-dl 1324 adenovírus deléciós mutánst Clal-gyel linearizáltuk, és ezekkel kotranszfektáltuk a 293 sejtvonalat kalciumfoszfát jelenlétében, ami a homológ rekombinációt segíti elő. Rekombináció után az adenovírusokat szelektáltuk, a 293 sejtvonalban elszaporítottuk, és cézium-kloridos centrifugálással izoláltuk [Graham et al.; Virology, 52, 456 (1973)].
9. példa
Ebben a példában a hTH in vitro és in vivő termelését ismertetjük AdLTR.hTH adenovírus használatával.
9.1. A hTH in vitro termelése.
A 8. példa szerinti AdLTR.hTH adenovírus rekombináns vektort használtuk a 293 sejtvonal fertőzéséhez. A fertőzés után 24-48 órával a tenyészetet lecentrifugáltuk (1000 fordulat/perc; 5 perc), és az így kapott sejtüledéket használtuk a TH enzimaktivitás in vitro meghatározásához (a) és Westem-analíziséhez (b).
(a) TH enzimaktivitás meghatározása.
A TH enzimaktivitást a Reinhard és munkatársai [Life Sci., 39,2185 (1986)] által módosított módszerrel határoztuk meg. A lefagyasztott sejtüledéket 30 másodpercig ultrahanggal kezeljük jéghideg 0,2%/100 mM NaHEPES-pufferben (pH 6,99), majd centrifugáljuk (10 000 g; 10 perc). A felülúszó egy részét (10 μΐ) használjuk TH-aktivitás-vizsgálathoz, amikor is 100 μΐ reakcióelegyben [100 mM NaHEPES, pH 6,99, 50 pg kataláz (Sigma), 25 μΜ L-tirozin (szabad bázis; Sigma), 0,2 pCi L-[3,5-3H]tirozin (Amersham), 1 mM vas(I)szulfát, 0,5 mM DL-6-metil-5,6,7,8-tetrahidropterin, 5 mM ditiotreitol] való inkubálás (10 perc; 37 °C) alatt az L-[3,5-3H]tirozinból felszabaduló 3H2O mennyiségét méijiik. A reakciót 1 ml 7,5%-os (tömeg/térfogat) aktív szén (Sigma) - 1 M sósavban - hozzáadásával állítjuk le. A keveréket ezután Vortex-keverővel homogenizáljuk (3 másodperc), majd centrifugáljuk (10 000 g; 10 perc). A felülúszóból 100 μΐ alikvot mennyiségeket mérünk 10 ml szcintillációs koktélt (aqueous counting scintillant; Amersham) tartalmazó szcintillációs fiolákba, a képződött 3H2O mennyiségének mérése céljából. L-tirozin törzsoldat készítéséhez az L-[3,5-3H]tirozint először vákuumban (speed-vacuum) szárítjuk a 3H2O szennyezés eltávolítására, mielőtt hozzáadunk 500 μΐ 500 mM hideg L-tirozint. Az eredményeket az 1 mg proteinből 1 óra alatt a [3H]tirozin hidroxilezése révén képződött 3H2O mennyiségével adjuk meg, pMban kifejezve. A protein mennyiségi meghatározását Bradford és munkatársai módszere szerint végezzük.
Ez a vizsgálat azt mutatja, hogy az Ad.LTR.hTHval fertőzött 293 sejtek olyan TH-aktivitást fejtenek ki, amely 5 μΜ DOPA/óra/mg protein képzésére képes, míg a nem fertőzött 293 sejteknek nincs TH-aktivitása.
(b) Westem-analízis.
A Westem-alanízist úgy végezzük, hogy a proteinkivonatokat SDS-PAGE (10% akrilamid) gélre visszük, és az elvándorolt proteint nitrocellulóz membránra visszük át. A nitro-cellulóz membránokat 48 órán át 4 °C-on 1:1000 hígítású anti-TH szérummal (Institut Jacques Boy) inkubáljuk. A hígítást 2% NS/0,05 Triton Χ-100-tartalmú PBS-sel végezzük (NS=normál szérum). Háromszori öblítés után a membránokat 2,5 órán át PBS/0,0% Triton X-100/2 NS oldattal 1:50-re hígított sertés antinyúl-IgG-vel (Dakopatts, Dánia) inkubáljuk. További háromszori öblítés után a membránokat 0,05 Triton Χ-100-tartalmú PBS-sel százszorosára hígított nyúlperoxidáz-antiperoxidázzal (Dakopatts) inkubáljuk, majd 3,4-diamino-benzidinnel (Sigma) és hidrogén-peroxiddal festjük. Ezután mikroszkópos analízishez készítjük elő.
Az Ad.LTR.hTH-val fertőzött 293 sejtekben az anti-TH antitestek egy, a TH molekulatömegének megfelelő 62 kD sávot mutattak ki, ugyanakkor a nem fertőzött 293 sejtekben sáv nem mutatkozott.
9.2. hTH-termelés in vivő.
Fiatal, kifejlett nőstény Sprague-Dawley-patkányokat (ALAB, Stockholm, Svédország) használtunk minden kísérletben. Equithesin anesztézia alatt (3 ml/kg ip.) sztereotaxis berendezésben (agycélzó készülék) 12 patkányba a jobb leszálló mezostriatális DA pályába 6-OHDA-t injektáltunk.
A forgási viselkedést először a 6-OHDA okozta léziót követően 10 nap múlva monitoroztuk, apomorfin vagy d-amfetamin alkalmazása után. A motor aszimmetriát d-amfetamin (5 mg/kg ip.) injekció vagy apomorfin-hidroklorid (0,05 mg/kg, s. c. a nyakba) injekció után automata forgórudas készülékben (Ugerstedt and Arbuthnott, 1970) 40 percig monitoroztuk. A 6OHDA lézió után 11 nap múlva Ad.LTR.hTH (6 patkány) vagy Ad.RSVp-gal (6 patkány kontrollként) rekombináns adenovírus-vektort injektáltunk a striatumba, 3 különböző helyre (injekciónként 3 μΐ-ben 107 pfu). A forgási viselkedés (lásd előbb) vizsgálatát és a szövettani vizsgálatot a 20. és 27. napon végeztük. Az eredmények a következők.
HU 219 304 Β
- Az Ad.LTR.hTH nem volt toxikus a patkányokra (a dopaminreceptor működőképes maradt);
- Az Ad.LTR.hTH-val oltott patkányok TH-proteint termeltek, amit immunológiai reaktivitásuk bizonyított: az agyakat 100 mM kálium-foszfát-tartalmú 20%-os szacharózoldatba merítettük 1-2 napig, ezután 40 pm vastag metszeteket készítettünk fagyasztó mikrotommal. Minden harmadik metszetet krezil-ibolyával festettünk meg, és a szomszédos metszetet a TH immunkémiai vizsgálatához készítettük elő egy előző leírás (Doucet et al, 1990) szerint. Röviden kifejtve, foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal (PBS végzett 3-4-szeri öblítés után az úsztatott metszeteket 1 órán át 10% normál sertésszérumot (NSS=normal seine serum) és 0,5% Triton Χ-100-at tartalmazó PBS-ben előinkubáltunk, majd ezután 1000-szeresre hígított antiTH szérummal (Institut Jaques Boy) inkubáltuk. (A hígítást 5% NSS és 0,5% Triton X- 100-tartalmú PBS-sel végeztük). Háromszori öblítés után a metszeteket 2,5 órán át 50-szeresére hígított sertés-antinyúl-IgG-vel (Dakopatts, Dánia) inkubáltuk. (A hígítást 0,5% Triton X-100 és 5% NSS-tartalmú PBS-sel végeztük). Újbóli háromszori öblítés után a metszeteket Triton Χ-100-at tartalmazó PBS-sel 1:100 hígítású nyúlperoxidáz-antiperoxidázzal (Dakopatts) inkubáltuk, majd 3,4-diamino-benzidinnel (Sigma) és hidrogén-peroxiddal kezeltük, végül tárgylemezre montíroztuk.
- Az Ad.LTR.hTH-val oltott patkányok forgási viselkedése volt jobb, ami az Ad.LTR.hTH injekció jótékony hatását igazolta.
10. példa
Ebben a példában az Ad.LTR.CNTF rekombináns hibás adenovirális vektor szerkesztését ismertetjük, amely az egérfélék ciliáris neurotrof faktorát (murine ciliary neurotrophic factor=CNTF) fejezi ki.
Az Ad.LTR.CNTF adenovirust úgy szerkesztettük, hogy 293 sejteket a pLTR-IX-CNTF plazmiddal és az Ad-dll324 adenovírus deléciós mutánssal [Thimmappaya et al.; Cell, 31, 543 (1982)] kotranszfektáltuk.
1. A pLTR-IX-CNTF plazmid szerkesztése.
A pLTR-IX-CNTF plazmid szerkesztésénél úgy jártunk el, hogy az egér CNTF cDNS-t (exon 1 és 2, intron 1) és az NGF vezérszekvenciát tartalmazó pRC.CMV.CNTF plazmid [Sendtner et al., Natúré, 358, 502 (1992)] 1800 bp méretű HindlII-Xbal fragmentumát beépítettük a pLTR-IX plazmid egyetlen EcoRV helyére, az RSVLTR promoterhez képest 3’ irányban. A beépítéshez az 1800 bp hosszú HindlII-Xbal fragmentumot tompa végűvé alakítottuk Klenow-DNS-polimeráz segítségével.
Az LTR-IX plazmidot a pLTRp-gal plazmidból [Stratford-Perricaudet et al.; J. Clin. Invest., 90, 626 (1992)] kaptuk, a β-gal gént hordozó Clal-Xhol fragmentum törlése, továbbá Klenow-enzimmel való emésztés és T4 DNS-ligázzal végzett ligálás révén.
2. Az Ad.LTR.CNTF hibás rekombináns adenovírus szerkesztése.
293 sejtvonalat kotranszfektáltunk Eagl-gyel linearizált pLTR-IX-CNTF DNS-sel és Clal-gyel linearizált
Ad-dll324 adenovírus deléciós mutánssal kalciumfoszfát jelenlétében, ami a homológ rekombinciót segíti elő. Rekombináció után az adenovírusokat szelektáltuk, a 293 sejtvonalban elszaporítottuk, és cézium-kloridos centrifugálással izoláltuk [Graham et al.; Virology, 52,456 (1973)].
11. példa
A példa a hexózaminidáz A a-láncát kódoló cDNS-t tartalmazó Ad.LTR.HEXA rekombináns hibás adenovirális vektor szerkesztésének leírását tartalmazza. A HEXA génben lévő genetikai hibák felelősek a Tay-Sachs lizoszómális szindrómáért.
Az Ad.LTR.HEXA adenovírus szerkesztésekor úgy jártunk el, hogy 293 sejteket pLTR-IX-HEXA plazmiddal és ad-dll324 adenovírus deléciós mutánssal [Thimmappaya et al.; Cell, 31, 543 (1982)] kotranszfektáltunk.
1. A pLTR-IX-HEXA plazmid szerkesztése.
A pLTR-IX-HEXA plazmidot úgy szerkesztettük, hogy az lgt máj cDNS-tár szűrése révén kapott hexózaminidáz A a-láncát kódoló cDNS-t [lásd még: Proia et al.; J. Bioi. Chem., 262, 5677 (1987)] tartalmazó egy 2000 bp hosszú EcoRI fragmentumot beépítettünk a pLTR-IX plazmid egyetlen EcoRV helyére, az RSVLTR promoterhez viszonyítva 3’-irányban. Ehhez a beépítéshez a 2000 bp méretű fragmentumot tompa végűvé alakítottuk T4 DNS-polimeráz segítségével.
A pLTR-IX plazmidot a ρίΤΚβ^Ι plazmidból [Stratford-Perricaudet et al.; J. Clin. Invest,, 90, 626 (1992)] kaptuk egy, a β-gal gént hordozó Clal-Xhol fragmentum törlése révén, valamint Klenow-enzimes emésztés és T4 DNS-ligázzal való ligálás segítségével.
2. Az Ad.LTR.HEXA hibás rekombináns adenovírus szerkesztése.
A sejtvonalat Asel-gyel linearizált pLTR-IX-HEXA DNS-sel és Clal-gyel linearizált Ad-dll324 adenovírus deléciós mutánssal kotranszfektáltuk kalcium-foszfát jelenlétében, amely elősegíti a homológ rekombinációt. Rekombináció után az adenovírust szelektáltuk, 293 sejtvonalban elszaporítottuk, és cézium-kloridos centrifugálással izoláltuk [Graham et al.; Virology, 52, 456 (1973)].
12. példa
Ez a példa az egérfélék idegnövekedési faktor (mNGF=murine Nerve Growth Factor) cDNS-ét (Prepro NGF) kifejező AdLTR.NGF rekombináns hibás adenovirális vektor szerkesztését tartalmazza.
Az Ad.LTR.NGF adenovirust úgy szerkesztettük, hogy a 293 sejteket a pLTR-IX-NGF plazmiddal és az Ad-dll324 adenovírus deléciós mutánssal [Thimmappaya et al.; Cell, 31, 543 (1982)] kotranszfektáltuk.
1. A pLTR-IX-NGF plazmid szerkesztése.
A pLTR-IX-NGF plazmid szerkesztését úgy végeztük, hogy egy Prepro NGF cDNS-t tartalmazó 1 kb méretű EcoRI-PstI fragmentumot beépítettünk a Bluescript plazmid (Stratagene) megfelelő helyére. E cDNS-t ezután mint Clal-BamHI fragmentumot izoláltuk, a fragmentumot Klenow-enzimmel tompa végűvé
HU 219 304 Β konvertáltuk, és beépítettük a pLTR-IX plazmid egyetlen Clal és EcoRV helye közé, az RSVLTR promoterhez viszonyítva 3’-irányban.
A pLTR-IX plazmidot a pLTR β-gal plazmidból [Stratford-Perricaudet et al.; J. Clin. Invest., 90, 626 (1992)] kaptuk a β-gal gént hordozó Clal-Xhol fragmentum törlése révén, továbbá Klenow-enzimmel való emésztés és T4 DNS-ligázzal végzett ligálás révén.
2. Az Ad.LTR.NGF hibás rekombináns adenovírus szerkesztése.
A pLTR-IX-NGF plazmidot és az Ad-dll324 deléciós mutáns adenovírust Clal-gyel linearizáltuk, és ezekkel kotranszfektáltuk a 293 sejtvonalat kalciumfoszfát jelenlétében, ami elősegíti a homológ rekombinációt. Rekombináció után az adenovírust szelektáltuk, 293 sejtvonalban elszaporítottuk, és cézium-kloridos centrifugálással izoláltuk [Graham et al.; Virology, 52, 456 (1973)].
Claims (31)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Rekombináns adenovirális DNS-vektor géneknek a központi idegrendszer sejtjeibe, különösen az agy sejtjeibe történő bejuttatására és az említett sejtekben való expresszálására, azzal jellemezve, hogy tartalmaz (i) legalább egy részt egy adenovírus genomjából, beleértve azokat a régiókat, amelyek ezen adenovírussal normál körülmények között megfertőzhető sejtekbe történő behatoláshoz szükségesek, és (ii) egy kiválasztott nukleotidszekvenciát, mely az adenovírus genomjának említett részébe van beépítve egy, az említett sejtekben működőképes promoter szabályozása alá, amely vagy jelen van az említett genomrészben, vagy abba be van építve, ahol a nukleotidszekvencia transzkripciós vagy expressziós terméke a központi idegrendszer sejtjeire fejti ki hatását vagy ezekben a sejtekben termelődik.
- 2. Az 1. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy olyan hibás adenovírus, amely az adenovirális genomból minden olyan szekvenciát tartalmaz, amely az ilyen adenovírussal megfertőzött sejtekben az adenovírus kapszidképzéséhez szükséges.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy hiányzik az Ela és Elb régió, és adott esetben az adenovírus genom E3 régiója.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a promoter az adenovirális genomra nézve exogén.
- 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a promoter képes a nukleotidszekvencia expresszióját a neurális sejtek még specifikusabb osztályaiba irányítani.
- 6. Az 5. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a promoter neuron-, glia- vagy ependymasejt promoter.
- 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a promoter képes a nukleotidszekvencia expresszióját az agyba és a gerincvelősejtekbe, különösen a neuron-, glia- vagy ependymasejtekbe irányítani.
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvencia egy neurotranszmittert vagy egy neurotranszmitter-szintetizáló enzimet, vagy az említett neurotranszmitter vagy neurotranszmitter-enzim egy részét kódolja, amely olyan aktivitást fejt ki, mint az említett neurotranszmitter vagy neurotranszmitter-szintetizáló enzim.
- 9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvencia egy transzmitter-prekurzort vagy ennek egy részét kódolja, melynek biológiai aktivitása megegyezik az említett prekurzoréval.
- 10. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvencia egy trofikus faktort vagy ennek egy részét kódolja, melynek biológiai aktivitása megegyezik az említett trofikus faktoréval.
- 11. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvencia egy növekedési faktort vagy ennek egy részét kódolja, amelynek tulajdonságai megegyeznek az említett növekedési faktor tulajdonságaival.
- 12. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvencia egy antiszensz szekvencia.
- 13. A 12. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvencia egy olyan antiszensz szekvencia, amelynek transzkripciós terméke azoknak a toxikus proteineknek, beleértve a pilonokat, kinázokat, TAU proteineket és β-amyloidot, vagy enzimeknek a blokkolására képes, amelyek az említett toxikus proteinek vagy glutamátok bioszintézisében részt vesznek.
- 14. A 12. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvencia képes olyan antiszensz RNS-sé vagy antiszensz oligonukleotiddá átíródni, amelyek egy kiválasztott messzendzser RNS-sel kölcsönhatást tudnak létesíteni.
- 15. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy egy, az 1 -14. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns vektort tartalmaz a gyógyszergyártásban elfogadott segédanyagokkal együtt.
- 16. A 15. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a központi idegrendszer rendellenességeinek kezelésére alkalmas formában van.
- 17. Eljárás egy, az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy kiválasztott nukleotidszekvenciát beépítünk egy adenovírus genomjának legalább egy részébe - amely tartalmazza azokat a régiókat, amelyek ezen adenovírussal normálkörülmények között megfertőzhető sejtekbe történő behatoláshoz szükségesek - egy promoter szabályozása alá, amely vagy jelen van az említett genomrészben vagy abba be van építve, ahol a nukleotidszekvencia transzkripciós vagy expressziós terméke a központi idegrendszer sejtjeire fejti ki hatását, vagy ezekben a sejtekben termelődik.HU 219 304 Β
- 18. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 17. igénypont szerinti eljárással előállított rekombináns vektort egy gyógyszergyártásban elfogadható segédanyaggal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
- 19. Eljárás rekombináns polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan idegsejteket tenyésztünk, amelyek egy, az 1 -14. igénypontok bármelyike szerinti vektort tartalmaznak, és e vektorban a kiválasztott nukleotidszekvencia az előállítandó polipeptidet kódolja.
- 20. Módszer egy promoter hatékonyságának vagy működőképességének kimutatására valamely idegsejtpopuláció egy részében vagy minden sejtjében, azzal jellemezve, hogy- megfertőzzük az említett idegsejt-populációt egy rekombináns adenovirális vektorral, amely vektor a megfelelő adenovírus azon szakaszait tartalmazza, amelyek az adenovírus által normálkörülmények között megfertőzhető sejtekbe való behatoláshoz szükséges genetikai információval rendelkeznek; a vektor tartalmaz továbbá egy markert kódoló nukleotidszekvenciát beépítve az adenovírus említett szakaszába; és a vizsgált promotert is genetikai szerkesztéssel építjük be a rekombináns vektorba oly módon, hogy az említett nukleotidszekvencia a promoter szabályozása alá kerüljön; és- kimutatjuk a megfertőzött idegsejt-populációból azokat a sejteket, amelyekben a marker expressziója megtörténik.
- 21. Patológiás állatmodell, azzal jellemezve, hogy egy nem emberszabású állatot foglal magában, amelynek idegsejtjei vagy ezek közül legalább néhány sejt egy, 1 -14. igénypont szerinti rekombináns vektort tartalmaz, melyet az állatba vagy egy ősébe bevezettünk.
- 22. A 21. igénypont szerinti patológiás állatmodell, azzal jellemezve, hogy neurodegeneratív betegségek modellje.
- 23. Központi idegrendszer egy sejtpopulációja, főként agy- vagy gerincvelősejtek, elsősorban ideg-, gliavagy ependymasejtek, azzal jellemezve, hogy egy, az 1-14. igénypont szerinti rekombináns vektorral transzformált.
- 24. A 23. igénypont szerinti sejtpopuláció, azzal jellemezve, hogy alkalmas formában van ahhoz, hogy egy gazdaszervezetbe - főként abba, amelyből származik - átültessük.
- 25. Eljárás terápiás értékű protein vagy polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 23. igénypontban meghatározott sejtpopulációt - ahol a rekombináns vektorban a kiválasztott nukleotidszekvencia az előállítandó proteint vagy polipeptidet kódolja - tenyésztjük.
- 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiválasztott nukleotidszekvencia a 8-11. igénypontok bármelyikében meghatározott.
- 27. Az 1. igénypont szerinti rekombináns adenovirális vektor, azzal jellemezve, hogy a vektor egy replikációhiányos rekombináns adenovírus.
- 28. A 27. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a kiválasztott nukleotidszekvencia a humán tirozin-hidroxiláz gént kódolja.
- 29. A 27. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a kiválasztott nukleotidszekvencia a CNTF gént kódolja.
- 30. A 27. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a kiválasztott nukleotidszekvencia a HEXA gént kódolja.
- 31. A 27. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a kiválasztott nukleotidszekvencia az NFG gént kódolja.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP92402644 | 1992-09-25 | ||
| PCT/EP1993/002519 WO1994008026A1 (en) | 1992-09-25 | 1993-09-17 | Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9500870D0 HU9500870D0 (en) | 1995-05-29 |
| HUT72987A HUT72987A (en) | 1996-06-28 |
| HU219304B true HU219304B (en) | 2001-03-28 |
Family
ID=8211713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9500870A HU219304B (en) | 1992-09-25 | 1993-09-17 | Recombinant adenovirus derived vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, pharmaceutical preparations containing them and processes for their production |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6458529B1 (hu) |
| EP (1) | EP0669987B1 (hu) |
| JP (1) | JPH08501686A (hu) |
| AT (1) | ATE404683T1 (hu) |
| AU (1) | AU692423B2 (hu) |
| CA (1) | CA2145535C (hu) |
| DE (1) | DE69334238D1 (hu) |
| ES (1) | ES2312164T3 (hu) |
| FI (1) | FI951404A0 (hu) |
| HU (1) | HU219304B (hu) |
| NO (1) | NO951121D0 (hu) |
| NZ (1) | NZ256018A (hu) |
| WO (1) | WO1994008026A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA937051B (hu) |
Families Citing this family (134)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5747469A (en) | 1991-03-06 | 1998-05-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53 |
| US6410010B1 (en) | 1992-10-13 | 2002-06-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant P53 adenovirus compositions |
| WO1992015680A1 (en) | 1991-03-06 | 1992-09-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression |
| FR2717496B1 (fr) * | 1994-03-18 | 1996-04-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. |
| US6472178B1 (en) * | 1998-02-27 | 2002-10-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acids encoding a modified ciliary neurotrophic factor and method of making thereof |
| FR2705686B1 (fr) * | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| AU710962B2 (en) * | 1993-05-28 | 1999-09-30 | Transgene S.A. | Defective adenoviruses and corresponding complementation lines |
| US6730507B1 (en) | 1993-06-24 | 2004-05-04 | Merck & Co., Inc. | Use of helper-dependent adenoviral vectors of alternative serotypes permits repeat vector administration |
| ATE304604T1 (de) * | 1993-06-24 | 2005-09-15 | Frank L Graham | Adenovirus vektoren für gentherapie |
| US6120764A (en) * | 1993-06-24 | 2000-09-19 | Advec, Inc. | Adenoviruses for control of gene expression |
| US7045347B2 (en) | 1993-06-24 | 2006-05-16 | Advec, Inc. | Helper dependent adenovirus vectors based on integrase family site-specific recombinases |
| US6140087A (en) * | 1993-06-24 | 2000-10-31 | Advec, Inc. | Adenovirus vectors for gene therapy |
| US6080569A (en) | 1993-06-24 | 2000-06-27 | Merck & Co., Inc. | Adenovirus vectors generated from helper viruses and helper-dependent vectors |
| US5919676A (en) * | 1993-06-24 | 1999-07-06 | Advec, Inc. | Adenoviral vector system comprising Cre-loxP recombination |
| US20020136708A1 (en) | 1993-06-24 | 2002-09-26 | Graham Frank L. | System for production of helper dependent adenovirus vectors based on use of endonucleases |
| FR2716460B1 (fr) * | 1994-02-21 | 2002-08-09 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Modèle animal de la maladie d'Alzheimer, préparation et utilisations. |
| FR2717495B1 (fr) * | 1994-03-18 | 1996-04-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. |
| FR2717497B1 (fr) * | 1994-03-18 | 1996-04-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. |
| IL113052A0 (en) * | 1994-03-23 | 1995-06-29 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Recombinant viruses, their preparation and their use in gene therapy |
| FR2726575B1 (fr) * | 1994-11-09 | 1996-12-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique |
| FR2717823B1 (fr) * | 1994-03-23 | 1996-04-26 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. |
| FR2717824B1 (fr) * | 1994-03-25 | 1996-04-26 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. |
| FR2718150B1 (fr) | 1994-03-29 | 1996-04-26 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. |
| EP0763103A4 (en) * | 1994-04-28 | 1998-07-15 | Univ Michigan | GENE DELIVERY VECTOR USING PLASMID DNA ENCAPSULATED IN ADENOVIRUS AND CELL LINE OF ENCAPSIDATION |
| US6379943B1 (en) | 1999-03-05 | 2002-04-30 | Merck & Co., Inc. | High-efficiency Cre/loxp based system for construction of adenovirus vectors |
| US5851806A (en) * | 1994-06-10 | 1998-12-22 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral systems and cell lines |
| EP0784690B1 (en) | 1994-06-10 | 2006-08-16 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral vector systems and cell lines |
| GB9506466D0 (en) * | 1994-08-26 | 1995-05-17 | Prolifix Ltd | Cell cycle regulated repressor and dna element |
| US6465253B1 (en) | 1994-09-08 | 2002-10-15 | Genvec, Inc. | Vectors and methods for gene transfer to cells |
| US5846782A (en) | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
| ATE293701T1 (de) | 1994-10-28 | 2005-05-15 | Univ Pennsylvania | Rekombinanter adenovirus und methoden zu dessen verwendung |
| FR2727867B1 (fr) * | 1994-12-13 | 1997-01-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux |
| US5780296A (en) * | 1995-01-17 | 1998-07-14 | Thomas Jefferson University | Compositions and methods to promote homologous recombination in eukaryotic cells and organisms |
| US5770442A (en) * | 1995-02-21 | 1998-06-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same |
| US6127525A (en) * | 1995-02-21 | 2000-10-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same |
| US6974694B2 (en) | 1995-06-07 | 2005-12-13 | Advec, Inc. | Adenoviruses for control of gene expression |
| US6783980B2 (en) | 1995-06-15 | 2004-08-31 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| DE69633565T3 (de) | 1995-06-15 | 2013-01-17 | Crucell Holland B.V. | Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie |
| WO1997017090A1 (en) * | 1995-11-07 | 1997-05-15 | Baylor College Of Medicine | Adenovirus-mediated production of bioactive proteins by mammalian cells and animals |
| US6132989A (en) * | 1996-06-03 | 2000-10-17 | University Of Washington | Methods and compositions for enhanced stability of non-adenoviral DNA |
| FR2753379B1 (fr) * | 1996-09-13 | 1998-10-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Methode de traitement de la sclerose laterale amyotrophique |
| US6544523B1 (en) | 1996-11-13 | 2003-04-08 | Chiron Corporation | Mutant forms of Fas ligand and uses thereof |
| US6696423B1 (en) | 1997-08-29 | 2004-02-24 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for therapies using genes encoding secreted proteins such as interferon-beta |
| DE69841807D1 (de) | 1997-11-06 | 2010-09-16 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Neisseriale antigene |
| WO1999036559A1 (en) * | 1998-01-13 | 1999-07-22 | Julien Jean Pierre | Viral vectors expressing self-polymerizing neuronal intermediate filaments and their use |
| WO1999036558A2 (en) * | 1998-01-13 | 1999-07-22 | Julien Jean Pierre | Viral vectors encoding neurofilament heavy proteins and their use |
| AU1956599A (en) * | 1998-01-13 | 1999-08-02 | Claude Gravel | Viral vectors encoding neurofilament light proteins and their use |
| SG123535A1 (en) | 1998-01-14 | 2006-07-26 | Chiron Srl | Neisseria meningitidis antigens |
| NZ508366A (en) | 1998-05-01 | 2004-03-26 | Chiron Corp | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
| US20030017138A1 (en) | 1998-07-08 | 2003-01-23 | Menzo Havenga | Chimeric adenoviruses |
| US6929946B1 (en) | 1998-11-20 | 2005-08-16 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells |
| JP2003518363A (ja) | 1999-04-30 | 2003-06-10 | カイロン エセ．ピー．アー． | 保存されたナイセリア抗原 |
| US6913922B1 (en) | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| US6492169B1 (en) | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
| GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| US8734812B1 (en) | 1999-10-29 | 2014-05-27 | Novartis Ag | Neisserial antigenic peptides |
| PT1248647E (pt) | 2000-01-17 | 2010-11-18 | Novartis Vaccines & Diagnostics Srl | Vacina de vesícula da membrana externa (omv) compreendendo proteínas de membrana externa de n. meningitidis do serogrupo b |
| EP1274717B1 (en) * | 2000-04-06 | 2008-02-27 | Kos Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for lowering cholesterol levels without inducing hypertriglyceridemia |
| US20020123093A1 (en) * | 2000-04-06 | 2002-09-05 | Zannis Vassilis I. | Compounds and methods for lowering cholesterol levels without inducing hypertrigylceridemia |
| US7235233B2 (en) | 2000-09-26 | 2007-06-26 | Crucell Holland B.V. | Serotype 5 adenoviral vectors with chimeric fibers for gene delivery in skeletal muscle cells or myoblasts |
| EP2189473A3 (en) | 2000-10-27 | 2010-08-11 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Nucleic and proteins from streptococcus groups A & B |
| GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
| GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
| FR2825372B1 (fr) * | 2001-06-01 | 2004-06-18 | Centre Nat Rech Scient | Pseudotypage des vecteurs vih-1 par des enveloppes de rhabdovirus |
| EP2335724A1 (en) | 2001-12-12 | 2011-06-22 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Immunisation against chlamydia trachomatis |
| US20030158112A1 (en) | 2002-02-15 | 2003-08-21 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Selective induction of apoptosis to treat ocular disease |
| CA2482903A1 (en) | 2002-04-18 | 2003-10-23 | Lynkeus Biotech Gmbh | Means and methods for the specific inhibition of genes in cells and tissue of the cns and/or eye |
| SI1497438T1 (sl) | 2002-04-25 | 2010-03-31 | Crucell Holland Bv | Sredstva in postopki za pripravo adenovirusnih vektorjev |
| US7148342B2 (en) | 2002-07-24 | 2006-12-12 | The Trustees Of The University Of Pennyslvania | Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis |
| GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
| WO2005012538A2 (en) * | 2003-08-01 | 2005-02-10 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Accelerated vaccination |
| CA2561696C (en) | 2004-03-29 | 2013-09-03 | Galpharma Co., Ltd. | Novel modified galectin 9 proteins and use thereof |
| US7309606B2 (en) * | 2004-09-07 | 2007-12-18 | The Trustees Of Boston University | Methods and compositions for treating hypercholesterolemia |
| AR051446A1 (es) * | 2004-09-23 | 2007-01-17 | Bristol Myers Squibb Co | Glucosidos de c-arilo como inhibidores selectivos de transportadores de glucosa (sglt2) |
| US20070134204A1 (en) * | 2005-12-09 | 2007-06-14 | Henrich Cheng | Method for treating nerve injury and vector construct for the same |
| DK2054431T3 (da) | 2006-06-09 | 2012-01-02 | Novartis Ag | Konformere af bakterielle adhæsiner |
| SG171952A1 (en) | 2008-12-04 | 2011-07-28 | Opko Ophthalmics Llc | Compositions and methods for selective inhibition of pro-angiogenic vegf isoforms |
| EP2396408B1 (en) | 2009-02-12 | 2017-09-20 | CuRNA, Inc. | Treatment of glial cell derived neurotrophic factor (gdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to gdnf |
| JP5766126B2 (ja) | 2009-02-12 | 2015-08-19 | クルナ・インコーポレーテッド | 脳由来神経栄養因子（ｂｄｎｆ）関連疾病の、ｂｄｎｆに対する天然アンチセンス転写物の抑制による治療 |
| WO2010102058A2 (en) | 2009-03-04 | 2010-09-10 | Curna, Inc. | Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt 1 |
| CN102482677B (zh) | 2009-03-16 | 2017-10-17 | 库尔纳公司 | 通过抑制nrf2的天然反义转录物治疗核因子(红细胞衍生2)‑样2(nrf2)相关疾病 |
| EP2408920B1 (en) | 2009-03-17 | 2017-03-08 | CuRNA, Inc. | Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1 |
| KR101722541B1 (ko) | 2009-05-06 | 2017-04-04 | 큐알엔에이, 인크. | Ｔｔｐ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 트리스테트라프롤린 관련된 질환의 치료 |
| CN102459596B (zh) | 2009-05-06 | 2016-09-07 | 库尔纳公司 | 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病 |
| CA2762369C (en) | 2009-05-18 | 2021-12-28 | Joseph Collard | Treatment of reprogramming factor related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a reprogramming factor |
| KR101703695B1 (ko) | 2009-05-22 | 2017-02-08 | 큐알엔에이, 인크. | 전사 인자 ｅ3(ｔｆｅ3)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 ｔｆｅ3 및 인슐린 수용체 기질 2(ｉｒｓ2)의 치료 |
| KR20120024819A (ko) | 2009-05-28 | 2012-03-14 | 오피케이오 큐알엔에이, 엘엘씨 | 항바이러스 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 트리스테트라프롤린 관련된 질환의 치료 |
| JP6128846B2 (ja) | 2009-06-16 | 2017-05-17 | クルナ・インコーポレーテッド | パラオキソナーゼ（ｐｏｎ１）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｐｏｎ１遺伝子関連疾患の治療 |
| WO2010148050A2 (en) | 2009-06-16 | 2010-12-23 | Curna, Inc. | Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene |
| KR101807323B1 (ko) | 2009-06-24 | 2017-12-08 | 큐알엔에이, 인크. | Ｔｎｆｒ2에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 종양 괴사 인자 수용체 2(ｔｎｆｒ2) 관련된 질환의 치료 |
| US8921330B2 (en) | 2009-06-26 | 2014-12-30 | Curna, Inc. | Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene |
| JP6128848B2 (ja) | 2009-08-05 | 2017-05-17 | クルナ・インコーポレーテッド | インスリン遺伝子（ｉｎｓ）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるインスリン遺伝子（ｉｎｓ）関連疾患の治療 |
| US9023822B2 (en) | 2009-08-25 | 2015-05-05 | Curna, Inc. | Treatment of 'IQ motif containing GTPase activating protein' (IQGAP) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IQGAP |
| CN102712927B (zh) | 2009-12-16 | 2017-12-01 | 库尔纳公司 | 通过抑制膜结合转录因子肽酶，位点1(mbtps1)的天然反义转录物来治疗mbtps1相关疾病 |
| DK2516648T3 (en) | 2009-12-23 | 2018-02-12 | Curna Inc | TREATMENT OF HEPATOCYTE GROWTH FACTOR (HGF) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT AGAINST HGF |
| EP2515947B1 (en) | 2009-12-23 | 2021-10-06 | CuRNA, Inc. | Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2 |
| CN102782134B (zh) | 2009-12-29 | 2017-11-24 | 库尔纳公司 | 通过抑制核呼吸因子1(nrf1)的天然反义转录物而治疗nrf1相关疾病 |
| JP5982288B2 (ja) | 2009-12-29 | 2016-08-31 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | 腫瘍タンパク質６３（ｐ６３）に対する天然アンチセンス転写物の阻害による腫瘍タンパク質６３関連疾患の治療 |
| ES2664605T3 (es) | 2010-01-04 | 2018-04-20 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con el factor 8 regulador del interferón (irf8) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen irf8 |
| CA2786056C (en) | 2010-01-06 | 2023-03-14 | Curna, Inc. | Treatment of pancreatic developmental gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene |
| NO2524039T3 (hu) | 2010-01-11 | 2018-04-28 | ||
| ES2671877T3 (es) | 2010-01-25 | 2018-06-11 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con la RNASA (H1) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a RNASA H1 |
| US8962586B2 (en) | 2010-02-22 | 2015-02-24 | Curna, Inc. | Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (PYCR1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to PYCR1 |
| JP5978203B2 (ja) | 2010-04-09 | 2016-08-24 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | Ｆｇｆ２１に対する天然アンチセンス転写物の阻害による線維芽細胞増殖因子（ｆｇｆ２１）線維芽細胞増殖因子ｆｇｆ２１）関連疾患の治療 |
| CN102933711B (zh) | 2010-05-03 | 2018-01-02 | 库尔纳公司 | 通过抑制沉默调节蛋白(sirt)的天然反义转录物而治疗沉默调节蛋白(sirt)相关疾病 |
| TWI586356B (zh) | 2010-05-14 | 2017-06-11 | 可娜公司 | 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病 |
| KR20180053419A (ko) | 2010-05-26 | 2018-05-21 | 큐알엔에이, 인크. | 무조(無調)의 동소체 1 (atoh1)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 atoh1 관련된 질환의 치료 |
| CA2805318A1 (en) | 2010-07-14 | 2012-01-19 | Curna, Inc. | Treatment of discs large homolog (dlg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlg |
| JP5986998B2 (ja) | 2010-10-06 | 2016-09-06 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | シアリダーゼ４（ｎｅｕ４）への天然アンチセンス転写物の阻害によるｎｅｕ４関連疾患の治療 |
| RU2597972C2 (ru) | 2010-10-22 | 2016-09-20 | Курна Инк. | Лечение заболеваний, связанных с геном альфа-l-идуронидазы (idua), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена idua |
| KR101913232B1 (ko) | 2010-10-27 | 2018-10-30 | 큐알엔에이, 인크. | 인터페론-관련된 발달성 조절물질 1 (ifrd1)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 ifrd1 관련된 질환의 치료 |
| CA2818824A1 (en) | 2010-11-23 | 2012-05-31 | Joseph Collard | Treatment of nanog related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nanog |
| CA2838588C (en) | 2011-06-09 | 2021-09-14 | Curna, Inc. | Treatment of frataxin (fxn) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to fxn |
| PT2825648T (pt) | 2012-03-15 | 2018-11-09 | Scripps Research Inst | Tratamento de doenças relacionadas ao fator neurotrófico derivado do cerebro (bdnf) por inibição da transcrição anti-sentido natural ao bdnf |
| WO2015171918A2 (en) | 2014-05-07 | 2015-11-12 | Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Compositions and uses for treatment thereof |
| GB201410693D0 (en) | 2014-06-16 | 2014-07-30 | Univ Southampton | Splicing modulation |
| EP3201339A4 (en) | 2014-10-03 | 2018-09-19 | Cold Spring Harbor Laboratory | Targeted augmentation of nuclear gene output |
| WO2016172155A1 (en) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | University Of Massachusetts | Modulation of aav vector transgene expression |
| SG11201802870RA (en) | 2015-10-09 | 2018-05-30 | Univ Southampton | Modulation of gene expression and screening for deregulated protein expression |
| CA3005245A1 (en) | 2015-12-14 | 2017-06-22 | Cold Spring Harbor Laboratory | Antisense oligomers for treatment of alagille syndrome |
| EP3389672A4 (en) | 2015-12-14 | 2019-08-14 | Cold Spring Harbor Laboratory | COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HEPATIC DISEASES |
| EP4104867A3 (en) | 2015-12-14 | 2023-03-01 | Cold Spring Harbor Laboratory | Compositions and methods for treatment of central nervous system diseases |
| US11096956B2 (en) | 2015-12-14 | 2021-08-24 | Stoke Therapeutics, Inc. | Antisense oligomers and uses thereof |
| EP3390642B1 (en) | 2015-12-14 | 2021-11-24 | Cold Spring Harbor Laboratory | Compositions for treatment of retinitis pigmentosa 13 |
| SG11201804443UA (en) | 2015-12-14 | 2018-06-28 | Cold Spring Harbor Laboratory | Antisense oligomers for treatment of autosomal dominant mental retardation-5 and dravet syndrome |
| RS65031B1 (sr) | 2017-08-25 | 2024-02-29 | Stoke Therapeutics Inc | Antisens oligomeri za lečenje stanja i bolesti |
| GB2610100B (en) | 2017-10-23 | 2023-08-16 | Stoke Therapeutics Inc | Antisense oligomers for treatment of non-sense mediated RNA decay based conditions and diseases |
| WO2019213525A1 (en) | 2018-05-04 | 2019-11-07 | Stoke Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for treatment of cholesteryl ester storage disease |
| WO2020010250A2 (en) | 2018-07-03 | 2020-01-09 | Elstar Therapeutics, Inc. | Anti-tcr antibody molecules and uses thereof |
| JPWO2020026968A1 (ja) | 2018-07-30 | 2021-08-12 | 株式会社遺伝子治療研究所 | Ａａｖベクターによる遺伝子発現を増強する方法 |
| MX2022014151A (es) | 2020-05-11 | 2022-11-30 | Stoke Therapeutics Inc | Oligomeros antisentido de opa1 para tratamiento de afecciones y enfermedades. |
| CA3214757A1 (en) | 2021-04-08 | 2022-10-13 | Andreas Loew | Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof |
| AU2022261124A1 (en) | 2021-04-22 | 2023-10-05 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for treating cancer |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA858044B (en) * | 1984-11-01 | 1987-05-27 | American Home Prod | Oral vaccines |
| WO1990005781A1 (en) * | 1988-11-23 | 1990-05-31 | Baylor College Of Medicine | Neural cell transplantation |
| US5082670A (en) * | 1988-12-15 | 1992-01-21 | The Regents Of The University Of California | Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage or the central nervous system |
| WO1990009441A1 (en) * | 1989-02-01 | 1990-08-23 | The General Hospital Corporation | Herpes simplex virus type i expression vector |
| GB8918616D0 (en) * | 1989-08-15 | 1989-09-27 | Univ Glasgow | Herpes simplex virus type 1 mutant |
| IE903130A1 (en) * | 1989-09-15 | 1991-03-27 | Regeneron Pharma | Ciliary neurotrophic factor |
| IE20010427A1 (en) | 1990-04-10 | 2003-03-05 | Canji Inc | Gene therapy for cell proliferative diseases |
| JPH06501160A (ja) | 1990-09-17 | 1994-02-10 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 細胞の増殖をコントロールするための方法及び組成物 |
| WO1992007945A1 (en) * | 1990-10-30 | 1992-05-14 | Dana Farber Cancer Institute | Cell type specific alteration of levels of gene products in neural cells |
| CA2107789A1 (en) | 1991-04-05 | 1992-10-06 | Thomas E. Wagner | Retrovirus inhibition with antisense nucleic acids complementary to packaging sequences |
| FR2717824B1 (fr) * | 1994-03-25 | 1996-04-26 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. |
| US7769626B2 (en) * | 2003-08-25 | 2010-08-03 | Tom Reynolds | Determining strategies for increasing loyalty of a population to an entity |
-
1993
- 1993-09-17 CA CA002145535A patent/CA2145535C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-17 NZ NZ256018A patent/NZ256018A/en unknown
- 1993-09-17 AU AU48180/93A patent/AU692423B2/en not_active Ceased
- 1993-09-17 JP JP6506643A patent/JPH08501686A/ja active Pending
- 1993-09-17 ES ES93920753T patent/ES2312164T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-17 EP EP93920753A patent/EP0669987B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-17 DE DE69334238T patent/DE69334238D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-17 WO PCT/EP1993/002519 patent/WO1994008026A1/en active IP Right Grant
- 1993-09-17 HU HU9500870A patent/HU219304B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-09-17 AT AT93920753T patent/ATE404683T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-09-23 ZA ZA937051A patent/ZA937051B/xx unknown
-
1995
- 1995-03-23 NO NO951121A patent/NO951121D0/no not_active Application Discontinuation
- 1995-03-24 FI FI951404A patent/FI951404A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1995-06-02 US US08/459,994 patent/US6458529B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-02 US US08/460,478 patent/US6756523B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI951404A (fi) | 1995-03-24 |
| CA2145535A1 (en) | 1994-04-14 |
| ES2312164T3 (es) | 2009-02-16 |
| HU9500870D0 (en) | 1995-05-29 |
| FI951404A0 (fi) | 1995-03-24 |
| HUT72987A (en) | 1996-06-28 |
| NO951121L (no) | 1995-03-23 |
| ATE404683T1 (de) | 2008-08-15 |
| ZA937051B (en) | 1995-03-17 |
| WO1994008026A1 (en) | 1994-04-14 |
| EP0669987B1 (en) | 2008-08-13 |
| AU692423B2 (en) | 1998-06-11 |
| JPH08501686A (ja) | 1996-02-27 |
| NO951121D0 (no) | 1995-03-23 |
| AU4818093A (en) | 1994-04-26 |
| CA2145535C (en) | 2007-07-17 |
| DE69334238D1 (de) | 2008-09-25 |
| US6458529B1 (en) | 2002-10-01 |
| NZ256018A (en) | 1997-07-27 |
| US6756523B1 (en) | 2004-06-29 |
| EP0669987A1 (en) | 1995-09-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU219304B (en) | Recombinant adenovirus derived vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, pharmaceutical preparations containing them and processes for their production | |
| US5650148A (en) | Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage of the central nervous system | |
| JP4843663B2 (ja) | 神経系の細胞へのｄｎａのａａｖ仲介送達 | |
| US6103226A (en) | Genetically engineered cells that produce produce L. Dopa | |
| KR100403707B1 (ko) | 글리아세포-유도 향신경인자(gdnf)를 암호화하는 재조합 아데노 바이러스 | |
| EP0698109A1 (en) | Gene transfer into pancreatic and biliary epithelial cells | |
| CA2095300C (en) | Use of genetically modified cells to treat defects, disease or damage of the central nervous system | |
| Lisovoski et al. | Phenotypic alteration of astrocytes induced by ciliary neurotrophic factor in the intact adult brain, as revealed by adenovirus-mediated gene transfer | |
| Castell et al. | Adenovirus-mediated gene transfer into human hepatocytes: analysis of the biochemical functionality of transduced cells | |
| Horellou et al. | Gene therapy for Parkinson's disease | |
| Peltola et al. | Adenovirus-mediated gene transfer results in decreased lysosomal storage in brain and total correction in liver of aspartylglucosaminuria (AGU) mouse | |
| Robert et al. | Adenovirus-mediated transfer of a functional GAD gene into nerve cells: potential for the treatment of neurological diseases | |
| Horellou et al. | Adenovirus-mediated gene transfer to the central nervous system for Parkinson's disease | |
| KR100403893B1 (ko) | 글루타메이트 디 카르복실라제(gad) 활성을 암호화하는 재조합바이러스 | |
| US20050069523A1 (en) | Recombinant adenoviruses encoding glial cell neurotrophic factor (GDNF) | |
| WO1994016080A1 (en) | An in vitro/in vivo method for identifying anti-neoplastic drugs | |
| Sortwell et al. | Effects of ex vivo transduction of mesencephalic reaggregates with bcl-2 on grafted dopamine neuron survival | |
| US6106827A (en) | Method of producing genetically modified astrocytes and uses thereof | |
| Arnhold et al. | Intracerebral transplantation and successful integration of astrocytes following genetic modification with a high-capacity adenoviral vector | |
| Horellou et al. | Gene transfer in situ and in cells for intracerebral transplantation | |
| Hurtado-Lorenzo | Adenovirus-mediated Gene Therapy for Parkinson's Disease: Neuroprotective Properties of Sonic Hedgehog Signalling Pathways | |
| Geldmacher et al. | Long Term Genetic Modification of Neurons, Astrocytes and Ependymocytes In Vivo using a High Capacity Adenovirus Vector | |
| JPH0928378A (ja) | 神経細胞特異的に発現するアデノウイルスベクター | |
| AU4233499A (en) | Recombinant viruses coding for a glutamate decarboxylase (GAD) activity | |
| AU2928402A (en) | Recombinant viruses coding for a glutamate decarboxylase (GAD) activity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |