HU211927A9 - Modified tcf - Google Patents
Modified tcf Download PDFInfo
- Publication number
- HU211927A9 HU211927A9 HU95P/P00200P HU9500200P HU211927A9 HU 211927 A9 HU211927 A9 HU 211927A9 HU 9500200 P HU9500200 P HU 9500200P HU 211927 A9 HU211927 A9 HU 211927A9
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- tcf
- gly
- leu
- lys
- pro
- Prior art date
Links
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 claims abstract description 28
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 28
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 8
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 abstract 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 abstract 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 28
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 108050005285 Transcription factor 7-like 1 Proteins 0.000 description 16
- 102100038313 Transcription factor E2-alpha Human genes 0.000 description 16
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 description 15
- 101710152978 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Proteins 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 11
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 11
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- YNQMEIJEWSHOEO-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O YNQMEIJEWSHOEO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZUVDFJXRAICIAJ-BPUTZDHNSA-N Arg-Trp-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 ZUVDFJXRAICIAJ-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Pro zwitterion Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 6
- 108010020382 Hepatocyte Nuclear Factor 1-alpha Proteins 0.000 description 6
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 6
- YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 6
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 6
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- GHNDBBVSWOWYII-LPEHRKFASA-N Arg-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O GHNDBBVSWOWYII-LPEHRKFASA-N 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 102100022054 Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Human genes 0.000 description 5
- 108050004132 Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Proteins 0.000 description 5
- 101000800542 Homo sapiens Transcription factor 24 Proteins 0.000 description 5
- MWVUEPNEPWMFBD-SRVKXCTJSA-N Lys-Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MWVUEPNEPWMFBD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108010048992 Transcription Factor 4 Proteins 0.000 description 5
- 102100021123 Transcription factor 12 Human genes 0.000 description 5
- 101710119706 Transcription factor 12 Proteins 0.000 description 5
- 102100033122 Transcription factor 23 Human genes 0.000 description 5
- 101710119675 Transcription factor 23 Proteins 0.000 description 5
- 102100033125 Transcription factor 24 Human genes 0.000 description 5
- 102100023489 Transcription factor 4 Human genes 0.000 description 5
- DTPARJBMONKGGC-IHPCNDPISA-N Trp-Cys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N DTPARJBMONKGGC-IHPCNDPISA-N 0.000 description 5
- HXMJXDNSFVNSEH-IHPCNDPISA-N Trp-Cys-Tyr Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O)N HXMJXDNSFVNSEH-IHPCNDPISA-N 0.000 description 5
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- PBSQFBAJKPLRJY-BYULHYEWSA-N Asn-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PBSQFBAJKPLRJY-BYULHYEWSA-N 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AKXBNSZMYAOGLS-STQMWFEESA-N Tyr-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AKXBNSZMYAOGLS-STQMWFEESA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 4
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 4
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 4
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- PIDRBUDUWHBYSR-UHFFFAOYSA-N 1-[2-[[2-[(2-amino-4-methylpentanoyl)amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O PIDRBUDUWHBYSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PNIGSVZJNVUVJA-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PNIGSVZJNVUVJA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- RKQRHMKFNBYOTN-IHRRRGAJSA-N Arg-His-Lys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RKQRHMKFNBYOTN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- SYFHFLGAROUHNT-VEVYYDQMSA-N Arg-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SYFHFLGAROUHNT-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 3
- QCTOLCVIGRLMQS-HRCADAONSA-N Arg-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O QCTOLCVIGRLMQS-HRCADAONSA-N 0.000 description 3
- YJRORCOAFUZVKA-FXQIFTODSA-N Asn-Arg-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)CN=C(N)N YJRORCOAFUZVKA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- BXUHCIXDSWRSBS-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BXUHCIXDSWRSBS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- HMUKKNAMNSXDBB-CIUDSAMLSA-N Asn-Met-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HMUKKNAMNSXDBB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- YRTOMUMWSTUQAX-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Asp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YRTOMUMWSTUQAX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N Asn-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N 0.000 description 3
- YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N Asn-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- LXKLDWVHXNZQGB-SRVKXCTJSA-N Asp-Cys-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O LXKLDWVHXNZQGB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- IVPNEDNYYYFAGI-GARJFASQSA-N Asp-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N IVPNEDNYYYFAGI-GARJFASQSA-N 0.000 description 3
- LBOVBQONZJRWPV-YUMQZZPRSA-N Asp-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O LBOVBQONZJRWPV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- PRVVCRZLTJNPCS-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)CN=C(N)N PRVVCRZLTJNPCS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- WDQXKVCQXRNOSI-GHCJXIJMSA-N Cys-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WDQXKVCQXRNOSI-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 3
- BUXAPSQPMALTOY-WHFBIAKZSA-N Cys-Glu Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BUXAPSQPMALTOY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- GFMJUESGWILPEN-MELADBBJSA-N Cys-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CS)N)C(=O)O GFMJUESGWILPEN-MELADBBJSA-N 0.000 description 3
- LKHMGNHQULEPFY-ACZMJKKPSA-N Cys-Ser-Glu Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LKHMGNHQULEPFY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- VCPHQVQGVSKDHY-FXQIFTODSA-N Cys-Ser-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O VCPHQVQGVSKDHY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- JAHCWGSVNZXHRR-SVSWQMSJSA-N Cys-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)N JAHCWGSVNZXHRR-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- ZXLZWUQBRYGDNS-CIUDSAMLSA-N Glu-Cys-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZXLZWUQBRYGDNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- MTAOBYXRYJZRGQ-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MTAOBYXRYJZRGQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- GMVCSRBOSIUTFC-FXQIFTODSA-N Glu-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMVCSRBOSIUTFC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- HMJULNMJWOZNFI-XHNCKOQMSA-N Glu-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O HMJULNMJWOZNFI-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 3
- QOOFKCCZZWTCEP-AVGNSLFASA-N Glu-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O QOOFKCCZZWTCEP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- QSTLUOIOYLYLLF-WDSKDSINSA-N Gly-Asp-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QSTLUOIOYLYLLF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- QGZSAHIZRQHCEQ-QWRGUYRKSA-N Gly-Asp-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QGZSAHIZRQHCEQ-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N Gly-Glu-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N Gly-Glu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O XTQFHTHIAKKCTM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ORXZVPZCPMKHNR-IUCAKERBSA-N Gly-His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CNC=N1 ORXZVPZCPMKHNR-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N Gly-Leu-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 3
- BXICSAQLIHFDDL-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BXICSAQLIHFDDL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- LOEANKRDMMVOGZ-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LOEANKRDMMVOGZ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZIMTWPHIKZEHSE-UWVGGRQHSA-N His-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O ZIMTWPHIKZEHSE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- PYNUBZSXKQKAHL-UWVGGRQHSA-N His-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PYNUBZSXKQKAHL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- MFQVZYSPCIZFMR-MGHWNKPDSA-N His-Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N MFQVZYSPCIZFMR-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 3
- DPQIPEAHIYMUEJ-IHRRRGAJSA-N His-Lys-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N DPQIPEAHIYMUEJ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- BOTVMTSMOUSDRW-GMOBBJLQSA-N Ile-Arg-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BOTVMTSMOUSDRW-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 3
- PFTFEWHJSAXGED-ZKWXMUAHSA-N Ile-Cys-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)O)N PFTFEWHJSAXGED-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- RWYCOSAAAJBJQL-KCTSRDHCSA-N Ile-Gly-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N RWYCOSAAAJBJQL-KCTSRDHCSA-N 0.000 description 3
- UQXADIGYEYBJEI-DJFWLOJKSA-N Ile-His-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N UQXADIGYEYBJEI-DJFWLOJKSA-N 0.000 description 3
- YNMQUIVKEFRCPH-QSFUFRPTSA-N Ile-Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)O)N YNMQUIVKEFRCPH-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 3
- ADDYYRVQQZFIMW-MNXVOIDGSA-N Ile-Lys-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N ADDYYRVQQZFIMW-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 3
- XHBYEMIUENPZLY-GMOBBJLQSA-N Ile-Pro-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XHBYEMIUENPZLY-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 3
- XOZOSAUOGRPCES-STECZYCISA-N Ile-Pro-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XOZOSAUOGRPCES-STECZYCISA-N 0.000 description 3
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- VZBIUJURDLFFOE-IHRRRGAJSA-N Leu-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VZBIUJURDLFFOE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N Leu-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CN=CN1 CSFVADKICPDRRF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- FKQPWMZLIIATBA-AJNGGQMLSA-N Leu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FKQPWMZLIIATBA-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 3
- VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N Leu-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- LFXSPAIBSZSTEM-PMVMPFDFSA-N Leu-Trp-Phe Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CC3=CC=CC=C3)C(=O)O)N LFXSPAIBSZSTEM-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 3
- NTBFKPBULZGXQL-KKUMJFAQSA-N Lys-Asp-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NTBFKPBULZGXQL-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N Lys-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- IUWMQCZOTYRXPL-ZPFDUUQYSA-N Lys-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IUWMQCZOTYRXPL-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 3
- XDPLZVNMYQOFQZ-BJDJZHNGSA-N Lys-Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N XDPLZVNMYQOFQZ-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 3
- UQRZFMQQXXJTTF-AVGNSLFASA-N Lys-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UQRZFMQQXXJTTF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 3
- HSJIGJRZYUADSS-IHRRRGAJSA-N Met-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HSJIGJRZYUADSS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- XYVRXLDSCKEYES-JSGCOSHPSA-N Met-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 XYVRXLDSCKEYES-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 3
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- ZENDEDYRYVHBEG-SRVKXCTJSA-N Phe-Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ZENDEDYRYVHBEG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N Phe-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- WIVCOAKLPICYGY-KKUMJFAQSA-N Phe-Asp-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N WIVCOAKLPICYGY-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Pro Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- XWYXZPHPYKRYPA-GMOBBJLQSA-N Pro-Asn-Ile Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O XWYXZPHPYKRYPA-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 3
- LCWXSALTPTZKNM-CIUDSAMLSA-N Pro-Cys-Glu Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O LCWXSALTPTZKNM-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- VOZIBWWZSBIXQN-SRVKXCTJSA-N Pro-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O VOZIBWWZSBIXQN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- AJCRQOHDLCBHFA-SRVKXCTJSA-N Pro-His-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AJCRQOHDLCBHFA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- HFNPOYOKIPGAEI-SRVKXCTJSA-N Pro-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HFNPOYOKIPGAEI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- SPLBRAKYXGOFSO-UNQGMJICSA-N Pro-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O SPLBRAKYXGOFSO-UNQGMJICSA-N 0.000 description 3
- BNUKRHFCHHLIGR-JYJNAYRXSA-N Pro-Trp-Asp Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O BNUKRHFCHHLIGR-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- VPBQDHMASPJHGY-JYJNAYRXSA-N Pro-Trp-Ser Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O VPBQDHMASPJHGY-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N Ser-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- JUTGONBTALQWMK-NAKRPEOUSA-N Ser-Met-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CO)N JUTGONBTALQWMK-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 3
- FLMYSKVSDVHLEW-SVSWQMSJSA-N Ser-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FLMYSKVSDVHLEW-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 3
- FGBLCMLXHRPVOF-IHRRRGAJSA-N Ser-Tyr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FGBLCMLXHRPVOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- HKHCTNFKZXAMIF-KKUMJFAQSA-N Ser-Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CC1=CC=C(O)C=C1 HKHCTNFKZXAMIF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- JMZKMSTYXHFYAK-VEVYYDQMSA-N Thr-Arg-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)O JMZKMSTYXHFYAK-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 3
- CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N Thr-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 3
- VOGXLRKCWFLJBY-HSHDSVGOSA-N Thr-Arg-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N)O VOGXLRKCWFLJBY-HSHDSVGOSA-N 0.000 description 3
- XFTYVCHLARBHBQ-FOHZUACHSA-N Thr-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XFTYVCHLARBHBQ-FOHZUACHSA-N 0.000 description 3
- IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N Thr-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 3
- RRRRCRYTLZVCEN-HJGDQZAQSA-N Thr-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RRRRCRYTLZVCEN-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 3
- FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N Thr-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N 0.000 description 3
- SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N 0.000 description 3
- JAJOFWABAUKAEJ-QTKMDUPCSA-N Thr-Pro-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O JAJOFWABAUKAEJ-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 3
- NBIIPOKZPUGATB-BWBBJGPYSA-N Thr-Ser-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O NBIIPOKZPUGATB-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 3
- YRJOLUDFVAUXLI-GSSVUCPTSA-N Thr-Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O YRJOLUDFVAUXLI-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 3
- VBMOVTMNHWPZJR-SUSMZKCASA-N Thr-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VBMOVTMNHWPZJR-SUSMZKCASA-N 0.000 description 3
- ZESGVALRVJIVLZ-VFCFLDTKSA-N Thr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O ZESGVALRVJIVLZ-VFCFLDTKSA-N 0.000 description 3
- HJTYJQVRIQXMHM-XIRDDKMYSA-N Trp-Asp-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N HJTYJQVRIQXMHM-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 3
- KDWZQYUTMJSYRJ-BHYGNILZSA-N Trp-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N)C(=O)O KDWZQYUTMJSYRJ-BHYGNILZSA-N 0.000 description 3
- UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N Trp-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- GHUNBABNQPIETG-MELADBBJSA-N Tyr-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O GHUNBABNQPIETG-MELADBBJSA-N 0.000 description 3
- PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N Tyr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- LOOCQRRBKZTPKO-AVGNSLFASA-N Tyr-Glu-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 LOOCQRRBKZTPKO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- UBKKNELWDCBNCF-STQMWFEESA-N Tyr-Met-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 UBKKNELWDCBNCF-STQMWFEESA-N 0.000 description 3
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010006664 gamma-glutamyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 108010051307 glycyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010079413 glycyl-prolyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010008671 glycyl-tryptophyl-methionine Proteins 0.000 description 3
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 3
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 3
- 108010034507 methionyltryptophan Proteins 0.000 description 3
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- COEXAQSTZUWMRI-STQMWFEESA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 COEXAQSTZUWMRI-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KMGOBAQSCKTBGD-DLOVCJGASA-N Ala-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CN=CN1 KMGOBAQSCKTBGD-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZTKHZAXGTFXUDD-VEVYYDQMSA-N Arg-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZTKHZAXGTFXUDD-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 2
- OQCWXQJLCDPRHV-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OQCWXQJLCDPRHV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N Arg-Lys-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- XQQVCUIBGYFKDC-OLHMAJIHSA-N Asn-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XQQVCUIBGYFKDC-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 2
- OLGCWMNDJTWQAG-GUBZILKMSA-N Asn-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O OLGCWMNDJTWQAG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N Asn-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 2
- SKQTXVZTCGSRJS-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O SKQTXVZTCGSRJS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N Asp-Asn-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101000972324 Cynodon dactylon Leaf protein Proteins 0.000 description 2
- FMDCYTBSPZMPQE-JBDRJPRFSA-N Cys-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FMDCYTBSPZMPQE-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 2
- OIMUAKUQOUEPCZ-WHFBIAKZSA-N Cys-Asn-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIMUAKUQOUEPCZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- QYKJOVAXAKTKBR-FXQIFTODSA-N Cys-Asp-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N QYKJOVAXAKTKBR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- SBYVDRJAXWSXQL-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SBYVDRJAXWSXQL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- ZJFNRQHUIHKZJF-GUBZILKMSA-N Glu-His-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZJFNRQHUIHKZJF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N Glu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- WXONSNSSBYQGNN-AVGNSLFASA-N Glu-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O WXONSNSSBYQGNN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N Gly-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- WRFOZIJRODPLIA-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN)O WRFOZIJRODPLIA-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N Gly-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)CN)O GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 2
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108010061414 Hepatocyte Nuclear Factor 1-beta Proteins 0.000 description 2
- 102100022123 Hepatocyte nuclear factor 1-beta Human genes 0.000 description 2
- ZUPVLBAXUUGKKN-VHSXEESVSA-N His-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O ZUPVLBAXUUGKKN-VHSXEESVSA-N 0.000 description 2
- LDFWDDVELNOGII-MXAVVETBSA-N His-Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N LDFWDDVELNOGII-MXAVVETBSA-N 0.000 description 2
- YKLOMBNBQUTJDT-HVTMNAMFSA-N Ile-His-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N YKLOMBNBQUTJDT-HVTMNAMFSA-N 0.000 description 2
- PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N Ile-Leu-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- CKRFDMPBSWYOBT-PPCPHDFISA-N Ile-Lys-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N CKRFDMPBSWYOBT-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- JHNJNTMTZHEDLJ-NAKRPEOUSA-N Ile-Ser-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O JHNJNTMTZHEDLJ-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DLFAACQHIRSQGG-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DLFAACQHIRSQGG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- ZJSXCIMWLPSTMG-HSCHXYMDSA-N Lys-Trp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ZJSXCIMWLPSTMG-HSCHXYMDSA-N 0.000 description 2
- DRINJBAHUGXNFC-DCAQKATOSA-N Met-Asp-His Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(O)=O DRINJBAHUGXNFC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- PEFJUUYFEGBXFA-BZSNNMDCSA-N Phe-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 PEFJUUYFEGBXFA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- VPVHXWGPALPDGP-GUBZILKMSA-N Pro-Asn-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VPVHXWGPALPDGP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- FEPSEIDIPBMIOS-QXEWZRGKSA-N Pro-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 FEPSEIDIPBMIOS-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 2
- BRJGUPWVFXKBQI-XUXIUFHCSA-N Pro-Leu-Ile Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BRJGUPWVFXKBQI-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- VGVCNKSUVSZEIE-IHRRRGAJSA-N Pro-Phe-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VGVCNKSUVSZEIE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- DKKGAAJTDKHWOD-BIIVOSGPSA-N Ser-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O DKKGAAJTDKHWOD-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 2
- FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N Ser-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- QGAHMVHBORDHDC-YUMQZZPRSA-N Ser-His-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CN=CN1 QGAHMVHBORDHDC-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- ZOPISOXXPQNOCO-SVSWQMSJSA-N Ser-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N ZOPISOXXPQNOCO-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 2
- QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- XUDRHBPSPAPDJP-SRVKXCTJSA-N Ser-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CO XUDRHBPSPAPDJP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- VIIJCAQMJBHSJH-FXQIFTODSA-N Ser-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VIIJCAQMJBHSJH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N Thr-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 2
- BKIOKSLLAAZYTC-KKHAAJSZSA-N Thr-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BKIOKSLLAAZYTC-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 2
- MHNHRNHJMXAVHZ-AAEUAGOBSA-N Trp-Asn-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N MHNHRNHJMXAVHZ-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 2
- AKFLVKKWVZMFOT-IHRRRGAJSA-N Tyr-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AKFLVKKWVZMFOT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- ULHJJQYGMWONTD-HKUYNNGSSA-N Tyr-Gly-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O ULHJJQYGMWONTD-HKUYNNGSSA-N 0.000 description 2
- HFJJDMOFTCQGEI-STECZYCISA-N Tyr-Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N HFJJDMOFTCQGEI-STECZYCISA-N 0.000 description 2
- QHONGSVIVOFKAC-ULQDDVLXSA-N Tyr-Pro-His Chemical compound N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O QHONGSVIVOFKAC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 2
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GSCLWXDNIMNIJE-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GSCLWXDNIMNIJE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- OKEWAFFWMHBGPT-XPUUQOCRSA-N Ala-His-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CN=CN1 OKEWAFFWMHBGPT-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- JWUZOJXDJDEQEM-ZLIFDBKOSA-N Ala-Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 JWUZOJXDJDEQEM-ZLIFDBKOSA-N 0.000 description 1
- MUGAESARFRGOTQ-IGNZVWTISA-N Ala-Tyr-Tyr Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N MUGAESARFRGOTQ-IGNZVWTISA-N 0.000 description 1
- RKRSYHCNPFGMTA-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RKRSYHCNPFGMTA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BSYKSCBTTQKOJG-GUBZILKMSA-N Arg-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BSYKSCBTTQKOJG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HGKHPCFTRQDHCU-IUCAKERBSA-N Arg-Pro-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O HGKHPCFTRQDHCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- QMQZYILAWUOLPV-JYJNAYRXSA-N Arg-Tyr-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QMQZYILAWUOLPV-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- RZNAMKZJPBQWDJ-SRVKXCTJSA-N Asn-Lys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RZNAMKZJPBQWDJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NJIKKGUVGUBICV-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NJIKKGUVGUBICV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SCQIQCWLOMOEFP-DCAQKATOSA-N Asp-Leu-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O SCQIQCWLOMOEFP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IOXWDLNHXZOXQP-FXQIFTODSA-N Asp-Met-Ser Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N IOXWDLNHXZOXQP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SHBKFJNZNSGHDS-FGPLHTHASA-N Asp-Met-Thr-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O SHBKFJNZNSGHDS-FGPLHTHASA-N 0.000 description 1
- IWLZBRTUIVXZJD-OLHMAJIHSA-N Asp-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IWLZBRTUIVXZJD-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 101100004280 Caenorhabditis elegans best-2 gene Proteins 0.000 description 1
- AEJSNWMRPXAKCW-WHFBIAKZSA-N Cys-Ala-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O AEJSNWMRPXAKCW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QQOWCDCBFFBRQH-IXOXFDKPSA-N Cys-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CS)N)O QQOWCDCBFFBRQH-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 102100037815 Fas apoptotic inhibitory molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- -1 Gin Chemical class 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NZAFOTBEULLEQB-WDSKDSINSA-N Gly-Asn-Glu Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN NZAFOTBEULLEQB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 238000012752 Hepatectomy Methods 0.000 description 1
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 1
- XMENRVZYPBKBIL-AVGNSLFASA-N His-Glu-His Chemical compound N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O XMENRVZYPBKBIL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- WEIYKCOEVBUJQC-JYJNAYRXSA-N His-Glu-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N WEIYKCOEVBUJQC-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- KHUFDBQXGLEIHC-BZSNNMDCSA-N His-Leu-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 KHUFDBQXGLEIHC-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- DQZCEKQPSOBNMJ-NKIYYHGXSA-N His-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DQZCEKQPSOBNMJ-NKIYYHGXSA-N 0.000 description 1
- FFYYUUWROYYKFY-IHRRRGAJSA-N His-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FFYYUUWROYYKFY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 101000653735 Homo sapiens Transcriptional enhancer factor TEF-1 Proteins 0.000 description 1
- LEDRIAHEWDJRMF-CFMVVWHZSA-N Ile-Asn-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LEDRIAHEWDJRMF-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 1
- LOXMWQOKYBGCHF-JBDRJPRFSA-N Ile-Cys-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LOXMWQOKYBGCHF-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- YBGTWSFIGHUWQE-MXAVVETBSA-N Ile-His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)CC1=CN=CN1 YBGTWSFIGHUWQE-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- TWPSALMCEHCIOY-YTFOTSKYSA-N Ile-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N TWPSALMCEHCIOY-YTFOTSKYSA-N 0.000 description 1
- FJWALBCCVIHZBS-QXEWZRGKSA-N Ile-Met-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)O)N FJWALBCCVIHZBS-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HASRFYOMVPJRPU-SRVKXCTJSA-N Leu-Arg-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HASRFYOMVPJRPU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WXZOHBVPVKABQN-DCAQKATOSA-N Leu-Met-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N WXZOHBVPVKABQN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WMIOEVKKYIMVKI-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMIOEVKKYIMVKI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N Leu-Thr-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- CLBGMWIYPYAZPR-AVGNSLFASA-N Lys-Arg-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O CLBGMWIYPYAZPR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N Lys-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BYEBKXRNDLTGFW-CIUDSAMLSA-N Lys-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BYEBKXRNDLTGFW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IGRMTQMIDNDFAA-UWVGGRQHSA-N Lys-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 IGRMTQMIDNDFAA-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YDDDRTIPNTWGIG-SRVKXCTJSA-N Lys-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YDDDRTIPNTWGIG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- TVOOGUNBIWAURO-KATARQTJSA-N Lys-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O TVOOGUNBIWAURO-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- MIXPUVSPPOWTCR-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MIXPUVSPPOWTCR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LBSWWNKMVPAXOI-GUBZILKMSA-N Met-Val-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LBSWWNKMVPAXOI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- CDNPIRSCAFMMBE-SRVKXCTJSA-N Phe-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CDNPIRSCAFMMBE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- CJAHQEZWDZNSJO-KKUMJFAQSA-N Phe-Lys-Cys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 CJAHQEZWDZNSJO-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- WECYCNFPGZLOOU-FXQIFTODSA-N Pro-Asn-Cys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O WECYCNFPGZLOOU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KIPIKSXPPLABPN-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KIPIKSXPPLABPN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N Pro-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- JRBWMRUPXWPEID-JYJNAYRXSA-N Pro-Trp-Cys Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 JRBWMRUPXWPEID-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- JJKSSJVYOVRJMZ-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)CN=C(N)N JJKSSJVYOVRJMZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BGOWRLSWJCVYAQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BGOWRLSWJCVYAQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KCFKKAQKRZBWJB-ZLUOBGJFSA-N Ser-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KCFKKAQKRZBWJB-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N Thr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- XUGYQLFEJYZOKQ-NGTWOADLSA-N Thr-Ile-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N XUGYQLFEJYZOKQ-NGTWOADLSA-N 0.000 description 1
- YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N Thr-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- STUAPCLEDMKXKL-LKXGYXEUSA-N Thr-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O STUAPCLEDMKXKL-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- CJEHCEOXPLASCK-MEYUZBJRSA-N Thr-Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)CC1=CC=C(O)C=C1 CJEHCEOXPLASCK-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- WVHUFSCKCBQKJW-HKUYNNGSSA-N Trp-Gly-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WVHUFSCKCBQKJW-HKUYNNGSSA-N 0.000 description 1
- KLGFILUOTCBNLJ-IHRRRGAJSA-N Tyr-Cys-Arg Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O KLGFILUOTCBNLJ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- NQJDICVXXIMMMB-XDTLVQLUSA-N Tyr-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NQJDICVXXIMMMB-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- PMHLLBKTDHQMCY-ULQDDVLXSA-N Tyr-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PMHLLBKTDHQMCY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N Tyr-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- AGXGCFSECFQMKB-NHCYSSNCSA-N Val-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N AGXGCFSECFQMKB-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N Val-Tyr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(O)=O GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N benzenecarboximidamide;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].NC(=[NH2+])C1=CC=CC=C1 LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 108010069495 cysteinyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
1. A találmány területe
A találmány géntechnológiával módosított olyan TCFekre vonatkozik, amelyek - összehasonlítva a vad típusú TCF-fel - különböző számú, nitrogénen keresztül kapcsolódó oligoszacharid láncokat és új aminosavszekvenciákat tartalmaznak. Ezeknek a találmány szerint kapott TCF-eknek a felezési ideje a szérumban hosszabb, a hepatocitákra növekedést stimuláló hatást fejtenek ki és a tumor sejtekkel szemben citotoxikus aktivitással rendelkeznek. Ezért a módosított TCF-ek májbetegségek esetén gyógyszerekként, továbbá rákellenes szerekként is használhatók.
2. A találmány háttere
A humán fibroblaszt eredetű tumor citotoxikus faktor. a TCF-II. egy olyan új anti-tumor protein, amely minden más eddig közölt proteintől különbözik. Sikerrel járt e protein cDNS klónozása, levezettük teljes aminosav szekvenciáját és bizonyítottuk a hasznosságát. Ezen új anti-tumor proteint és a megfelelő cDNS-t tárgyalja a WO 90/10 651 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés. Ezt TCF-Il-vel jelöltük. Ebben a leírásban azt a glükoproteinl, amelynek az aminosav szekvenciája a WO 90/10 651 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben szerepel, TCFnek nevezzük. ATCF tehát az az anyag, amelyet előzőleg TCF-II-nek neveztünk.
A TCF erős citotoxikus aktivitással rendelkezik tumor sejtekkel szemben és növekedést stimuláló hatást fejt ki normál sejtekre. Megállapítottuk, hogy a TCF egy olyan család tagja, amelyhez a HGF, a hepatocita növekedési faktor is tartozik. A TCF molekulatömege 78 000±2000 dalton és/vagy 74 000+2000 dalton SDS poliakrilamid-gél elektroforézissel meghatározva. Redukáló körülmények között egy A láncnak nevezett polipeptid sáv jelenik meg, amelynek molekulatömege 52 000+2000 dalton és két további polipeptid sáv, nevük B lánc és/vagy C lánc, amelyeknek a molekulatömege 30 00±2000 dalton, illetve 26 000±2000 dalton.
Minthogy a TCF hepatocita növekedési faktor, hepatektómia után megvizsgáltuk máj regenerálásra történő alkalmazását. Minthogy a TCF biológiai felezési ideje nagyon rövid, megkíséreltük hatásosabb, meghosszabbított biológiai felezési idejű módosított TCF-ek előállítását.
Bizonyos glükoproteinek esetén - beleértve az eritroproteint is - tanulmányozták az oligoszacharid láncok és a szérum felezési idők közötti összefüggést. A vizsgálatok kimutatták, hogy ugyanabból a génből különböző számú oligoszacharid láncokat tartalmazó és különböző biológiai aktivitású glükoproteinek szintetizálhatók. Ismeretes volt, hogy a glükolizált eritroproteinnek mások a biológiai tulajdonságai, mint a nem glükolizáltnak. Azonban a TCF oligoszacharid láncai és biológiai aktivitásai közölt fennálló összefüggésről keveset tudtunk.
3. Λ találmány leírása
A jelen feltalálók megállapították a TCF használhatóságát és tanulmányozták a TCF alkalmazását tumorok vagy májbetegségek kezelésére, valamint betegségek esetén diagnosztikumként való felhasználását. A TCF-nek nagyon rövid a felezési ideje, körülbelül 2 perc. Azért, hogy meghosszabbított felezési idejű, módosított proteinekhez jussunk, a feltalálók számos, genetikailag manipulált TCF-et szerkesztettek a polipeptid részben végrehajtott mutációk révén és analizálták ezeket. Kitűnt azonban, hogy a legtöbb módosított protein elvesztette biológiai aktivitását. Ezután, hogy meghosszabbítsák a biológiai felezési időt anélkül, hogy a biológiai aktivitás elveszne, a feltalálók figyelmüket a TCF-hez nitrogénen keresztül kapcsolódó négy oligoszacharid lánc felé fordították és megkíséreltek olyan új, módosított TCF-eket szerkeszteni, amelyekből egy vagy több oligoszacharid láncot töröltek.
A találmány célja, hogy új, módosított TCF-eket nyújtson, amelyeknek a vad típusú TCF-hez képest eltérő aminosav szekvenciái vannak, kevesebb a nitrogénen keresztül kapcsolt oligoszacharid láncok száma és amelyeknek hosszabb a biológiai felezési ideje, mint a vad típusú TCF-é. Ezeket a módosított TCF-eket úgy állíthatjuk elő, hogy az N-glükozileződésért felelős aminosavcsoportokat kódoló TCF cDNS nukleotid szekvenciáját megváltoztatjuk és a genetikailag mutagenizált TCF cDNS-t kifejezzük. A találmány szerinti módosított TCF-ekből a vad típusú TCF-ben lévő, nitrogénen keresztül kapcsolt négy oligoszacharid lánc közül egyet vagy többet toriunk. Ezek az első olyan módosított, meghosszabbított felezési idejű TCF-ek, amelyek biológiai aktivitásukból semmit nem vesztettek és amelyeket a vad típusú TCF aminosavcsoportjainak a megváltoztatása révén állítottunk elő.
Az 1. ábrán a vad típusú TCF teljes aminosav szekvenciája látható, amelyet cDNS szekvenciájából vezettünk le (1. sz. szekvenciavázlat). Az N-glükozileződésért felelős aminosavcsoportokat aláhúztuk. Feltételeztük, hogy a szignál szekvencia eltávolított és hogy a 32. helyzetben lévő glutamincsoport a TCF N-terminális aminosava. Négy oligoszacharid lánc kapcsolódik nitrogénen keresztül az N-terminális aminosavtól számított 258., 366., 530. és 617. helyzetű aszparaginhoz. Ezek az aszparagincsoportok az 1. ábrán látható 289., 397.. 561. és 648. helyzetű aszparagin-csoportoknak felelnek meg.
A 2. ábra az aminosavszekvenciát kódoló cDNS szekvenciát mutatja be. A kódoló szakasz az ATG kodonnál kezdődik, amelyet az ábrán bekarikáztunk.
N-glükozileződésért felelős aminosavcsoport az Asn-X-Thr vagy az Asn-X-Ser (az aminosavcsoportokat hárombetűs kóddal jelöljük és az X bármilyen aminosavcsoportot jelenthet). Specifikus oligoszacharid lánc(ok) nélküli módosított TCF-et úgy állíthatunk elő, hogy a nukleotid szekvenciát, amelyben az Asn, Ser vagy Thr kodon deletált, vagy ezeket egy másik aminosav helyettesíti, eukarióta sejtekben, előnyösen emlős sejtekben fejezzük ki. Specifikus oligoszacharid láncok nélküli módosított TCF-et úgy kaphatunk, hogy az Asn kodonokat más aminosavakat meghatározó kodonra, például Gin kodonra, cseréljük ki, ez a szubsztitúció a TCF konformációját kevéssé érinti. A Gin a legelőnyö2
HU 211 927 A9 sebb olyan aminosav, amely az Asn-t szubsztituálja. Az Asp, Glu, His, Ser vagy Thr szintén elfogadható. Specifikus oligoszacharid lánc(ok) nélküli módosított TCF-et előállíthatunk úgy is, hogy a Ser kodonokat más aminosavakat meghatározó kodonra, ilyen például az Alá kodon, cseréljük ki, ez a szubsztitúció is csekély hatással van a TCF konformációjára. Az Alá a legelőnyösebb aminosav, amely helyettesíti a Ser-t. A Pro, Gly vagy Asn szintén elfogadható. Olyan módosított TCF-et, amelyből hiányzik (hiányoznak) a specifikus oligoszacharid lánc(ok), úgy állíthatunk elő, hogy ha a Thr kodonokat kiejtjük vagy más aminosav kodonokkal helyettesítjük. Az Alá a legelőnyösebb olyan aminosav, amely a Thr-t helyettesíti. A Val, His vagy Asn szintén elfogadható.
A 3. ábrán bemutatjuk a TCF sematikus szerkezetét, amelyben megjelöltük az N-glükozileződés helyeit. Az N-glükozileződés helyeit az N-terminális végtől 1-es, 2-es, 3-as és 4-es számmal számoztuk. Ezek a számok határozzák meg az N-glükozileződési helyek pozícióját.
Annak érdekében, hogy az N-glükozileződésért felelős aminosavszekvenciákat olyanokra változtassuk, amelyek nem glükozileződnek, a cDNS-t PCR-rel (polymerase chain reaction = polimeráz láncreakció) hely-specifikusan mutagenizáljuk. A reakcióban templátként használjuk a vad típusú TCF cDNS-t és primerekként szintetikus oligo-nukleotidokat használunk. A primerek szekvenciáit úgy tervezzük meg, hogy deletálják vagy szubsztituálják a DNS szekvenciát, amint azt a fentiekben leírtuk. Más módszerek is alkalmasak mutagenezis céljára.
Módosított TCF-eket termelő sejtvonalakat úgy készíthetünk. hogy az ilyen mutáns cDNS-eket tartalmazó expressziós vektorokkal transzformálunk gazdasejteket. A transzformált sejtvonalak levestenyészetéből izolálhatjuk a módosított TCF-eket.
Például a 289. helyen (1. ábra) lévő Asn - ez az 1-es oligoszacharid lánc kötési helye - szubsztitúciója céljából a cDNS-t in vitro mutagenizáltuk. Ezekhez a mutagenizáló reakciókhoz a WO 90/10 651 számon közzétett nemzetközi bejelentésben ismertetett, vad típusú TCF-et kódoló cDNS-t használtuk templátként és a TCF-1R 5'-TCAGTGTCCTGCATAGTAT-3' oligonukleotidot használtuk primer gyanánt. Amutagenizált cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral eukarióta sejtvonalakat - beleértve emlős sejtvonalakat is - transzficiálhatunk. A módosított TCF-eket a transzficiált sejttenyészetek felülúszóiból izolálhatjuk,
A módosított TCF-ek expressziőjához az eukarióta sejtek számára megfelelő bármilyen típusú gazda-vektor rendszer alkalmas. A legkedvezőbb a citomegalovírus és a Namalwa sejtek kombinációja, amely a WO 92/1053 számon közzétett nemzetközi bejelentésben szerepel. Az általánosan használt rendszerek közül megemlítjük azt a génsokszorozási rendszert, amely az SV40 promoterből, DHFR génből és a CHO sejtvonalból álló kombinációt használja, vagy olyan expressziós rendszert, amely a bovin papilloma vírus replikációs origó és az egér C127 sejtvonal kombinációját használja.
A módosított TCF-ek tisztítására bármelyik, a biológiailag aktív proteinek tisztítására általánosan használt módszert használhatjuk, például a szerves oldószeres kicsapást, a kisózást, a gél-kizárásos kromatográfiát, a monoklonális antitest használatával végzett affinitáskromográfiát vagy az elektroforézist. A 3-177 236 számú japán szabadalmi bejelentésben szereplő vad típusú TCF-fel szembeni monoklonális antitesteket fel lehet használni a módosított TCF affinitás kromatográfiájához.
A módosított TCF-ek liofilizált vagy fagyasztott állapotban tárolhatók.
Tizenöt módosított TCF-et kaphatunk az oligoszacharid láncok eltávolításának kombinációival. Amódosított TCF-eket az eltávolított láncok számával azonosíthatjuk. Például: azt a módosított TCF-et, amelyből az 1-es oligoszacharid lánc hiányzik, TCF-l-nek nevezzük, azt a TCF-et, amelyből mind a négy oligoszacharid lánc hiányzik TCF-1234-nek nevezzük és annak a TCF-nek a neve, amelyből a 2-es és a 3-as oligoszacharid lánc hiányzik, TCF-23. A 4. ábra sematikusan ábrázolja a módosított TCF-hez nitrogénen keresztül kapcsolódó oligoszacharidokat. Mindegyik módosított TCF-nek más a molekulatömege, az eltávolított oligoszacharid láncoknak megfelelően.
4. Az ábrák rövid leírása
Az 1. ábra a vad típusú TCF cDNS szekvenciájából levezetett teljes aminosavaszekvenciát mutatja be. A nitrogénen keresztül kapcsolódó oligoszacharid láncok kötéséért felelős aminosavcsoportokat aláhúztuk.
A 2. ábrán a vad típusú TCF cDNS szekvenciája látható. A találmány szerint szubsztituált kodonokat aláhúztuk. A kódoló szekvencia a bekarikázott ATG kodonnál kezdődik.
A 3. ábrán sematikusan ábrázoljuk a vad típusú TCF primer szerkezetét. A körök az N-glükozilező helyeket mutatják és a nyilak az A lánc és a B lánc közötti hasítási helyet.
A 4. ábrán a TCF-hez kapcsolódó oligoszacharid láncok és a módosított TCF semaúkus rajza látható.
Az 5. ábra a módosított TCF-eket meghatározó, plazmid tartalmú cDNS-ek szerkesztését mutatja be.
A 6. ábra a TCF-et és a módosított TCF-et kifejező expressziós vektorok szerkesztését mutatja be.
A 7. ábra egy jellegzetes módosított TCF SDS políakrilamid-gél-elektroforézissel végzett analízisét mutatja be.
A 8. ábra a módosított TCF-nek a hepatociták növekedésére kifejtett stimuláló hatását ábrázolja. Az ábrák az alábbi módosított TCF-ek aktivitását mutatják:
(1) TCF, TCF-1, TCF-2, TCF-3 és TCF-4 (2) TCF-12, TCF-13, TCF-14, TCF-23, TCF-24 és TCF-34
HU 211 927 A9 (3) TCF-123, TCF-124, TCF-1234. TCF-134 és TCF-234.
A 9. ábra a módosított TCF tumor citotoxikus aktivitását mutatja be.
A 10. ábra a módosított TCF plazma koncentrációit mutatja azokban a patkányokban, amelyekbe az említett TCF-eket intravénásán injiciáltuk.
Az új, módosított TCF-eket a találmány felhasználásával állítjuk elő. A találmány szerinti TCF-ek előállítását úgy végezzük, hogy kifejezzük az olyan cDNSeket, amelyekben az N-glükozileződésért felelős aminosavcsoportokat meghatározó kodonokat vagy más aminosavakat meghatározó kodonokkal szubsztituáljuk vagy deletáljuk. A módosított TCF-ek felezési ideje hosszabb, ami annak köszönhető, hogy a nitrogénen keresztül kapcsolt oligoszacharid láncok kötési helyeinek számát megszabjuk.
5. A találmány legjobb megvalósítási módja
A találmányt az alábbi példákkal részletesebben szemléltetjük
1. példa
Módosított TCF-ek előállítása
A módosított TCF-ek előállítása céljából a DNSeket lényegében a .Molecular Cloning; A Laboratory Manual” (2. kiadás; J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) című kiadványban leírtak szerint manipuláltuk, mint alább leírjuk.
11) A TCF cDNS klónozása
Az alábbi leírás szerint hely-specifikus mutációkat vezettünk be a TCF cDNS-be egy 6.3 kb méretű expressziós plazmid, a pcDTCF II plazmid révén, amelyet a WO 92/01053 számon közzétett nemzetközi bejelentésben ismertetett módszer szerint állítottunk elő. A pcDTCF Il-t tartalmazó E. coli törzset letétbe helyeztük a National Institute of Bioscience and Humán Technology intézményben FERM BP-3479 számon.
(2) Hely-specifikus mutációk bevezetésére szolgáló módszerek
l. !. Módszer íj A TCF cDNS klónozása Ml3mpl8-ban
A pcDTCF II (6,3 kb) úgy állítjuk elő, hogy a humán TCF cDNS teljes kódoló szakaszát bevisszük a BamHI és Sphí enzimekkel (Takara Co.) emésztett pcDNS I plazmidba (Invitrogen Co.) (Minden restrikciós enzimet és módosító enzimet a Takara Co. cégtől szereztünk be.) A pcDTCF ΙΙ-t BamHI-gyel és Sphlgyel emésztjük 1 órán ál 37 C-on, etanollal kicsapjuk, majd 1%-os agaróz gélben elektroforetizáljuk. A 2,3 kb méretű TCF cDNS fragmentumot a gélből tisztítjuk Gene Clean (Bio 101 Co.) segítségével.
Emellett az M13mpl8 (Takara Co.) fág DNS replikatív formáját BamHI-gyel és SphI-gyel emésztjük, etanollal csapjuk ki és vízben feloldjuk. így kapjuk a vektor-DNS oldatát. A vektor-DNS oldatot összekeverjük a TCF cDNS-sel, majd DNA Ligation Kit (Takara Co.) segítségével ligáljuk. A ligációs keverék egy részét használjuk az E. coli DH5 α sejtek transzformálására. A transzformált sejteket E. coli MN522 indikátor törzs (Invitrogen Co.) sejtjeivel keverjük össze és LB lágy agar lemezekre öntjük ki, hogy plakkokat kapjunk. Az LB táptalaj 1% Bacto Tryptone-t, 0,5% Bacto élesztő kivonatot, 1% nátrium-kloridot és 1% IPTG-t (izopropil-P-D-tiogalaktozid; Takara Co.), továbbá 1% Xgal-t (5-bróm-4-klór-3-indolil-|3-D-galaktozid; Takara Co.) tartalmaz. A kétszálú fág DNS-t egy tiszta plakkból izoláltuk, és elkészítettük az egyszálú DNS-t, amelyet templátként használtunk a hely-specifikus mutációk bevezetéséhez.
ii) Hely-specifikus mutációk bevezetése
Egy, az N-glükozilezésre elfogadott Asn-X-Thr aminosavszekvenciában, a 289. aminosavat meghatározó Asn kodont Gin kodonnal cseréltünk ki, ez nem képez N-glükozilezéshez alkalmas aminosavszekvenciát.
Az aminosavak számozásának alapja a vad típusú TCF N-terminális végén lévő Met. mint első aminosav. A TCF-1R oligonukleotidot - 5'-TCAGTGTCCTGCATAGTAT-3' - DNS szintetizátorban (Applied Biosystems Co.) szintetizáltuk. Minden oligonukleotidot szintetizátor használatával szintetizáltunk, hacsak másként nem jelezzük.
A hely-specifikus mutációt oligonukleotidra-irányuló in vitro mutagenezis rendszerrel (Amersham Co.) végeztük, a gyártó cég előirata szerint. Az NM522 E. coli sejteket a reakcióeleggyel transzformáltuk és TCF-1 printerrel, plakk hibridizációs technikával szűrtük.
Az egyszálú DNS-t egy pozitív plakkból izoláltuk és a szekvenciát a Sanger által leírt didezoxi lánctemninációs módszerrel határoztuk meg abból a célból, hogy meggyőződjünk arról, hogy a 289. helyen az Asn aminosavat meghatározó AAT kodon kicserélődött-e a Gln-t meghatározó CAG kodonra. Az 1,4 kb méretű Pstl-HindlII DNS fragmentumot, amelyet a pozitív klón kétszálú DNS-éből készítettünk, a Pstl-HindlIImal emésztett pBluescript SK+ (Stratagene Co.) plazmiddal ligáltuk, s így kaptuk a pSKTCFPH-1 plazmidot.
2. 2. módszer
A 399., 563. és 650. aminosavakat meghatározó kodonokba lényegében az R. Higuchi (R. Higuchi, PCR Protocols, 177-183. old., Academic Press, 1990.) által leírtak szerint vittük be a hely-specifikus mutációkat, polimeráz láncreakció (PCR) segítségével. Az Nglükozilezésre általánosan elfogadott Asn-X-Ser aminosav szekvenciában a Ser-t meghatározó kodont Alá kodonnal cseréltük ki minden mutagenizálásnál.
A 399. helyen lévő Ser kodon mutagenizálásához 25 PCR ciklust végeztünk. A reakcióban egy mutáns prímért, a TCF-2R-t - 5'-CCAGATCTTGTTTGAGCTAAGTTGCCC-3' - és egy vad tí4
HU 2)1 927 A9 pusú prímért, a TCF701F-et - 5'-GCTGGGATCATCAGACACCAC-3' - használtunk, továbbá az AmliTaq polimerázt (Takara Co.) és templátként a pcDTCF II plazmidból 4 ng-ot. A PCR termékeket Centricon 100 készülékben (Amicon Co.) tisztítottuk a primerek eltávolítása végett. A kapott termékeket BglII és EcoRI restrikciós enzimekkel (Takara Co.) emésztettük és a BglII-EcoRI-gyel emésztett pSKCFPH plazmid 4,1 kb méretű DNS fragmentumához ligáltuk. A pSKTCFPH plazmidhoz úgy jutottunk, hogy a Pstl-HindlII-mal emésztett pBluescript SK+plazmidot és a Pstl-HindlIImal emésztett pcDTCF ΙΙ-t előzőleg ligáltuk. A ligációs elegy egy részével E. coli DH5 sejteket transzformáltunk. A plazmid DNS-eket ampicillin rezisztens transzformáit sejtekből izoláltuk, majd meghatároztuk a DNS szekvenciákat. Kiszűrtük a pSKTCFPH-12 plazmidot, amelyben a TCC Ser kodont a 399. helyen a GCT Alá kodon helyettesítette. A pSKTCFPH-12 plazmid úgy készült, hogy a PCR termékeket a BglII-EcoRI-gyel emésztett pSKTCFPH-Ι plazmid 4,1 kb méretű fragmentumához ligáltuk, hasonló módon. A PCR termékekből származó DNS részletek DNS szekvenciáit minden plazmidban meghatároztuk, szekvenciáik igazolása végett. Az ampicillint a Sigma Co.-tól szereztük be.
Az 563. helyen lévő Ser-t meghatározó kodon mulagenizálását PCR-rel végeztük, 25 ciklusban, A reakcióban egy mutáns prímért, a TCF-3R-t - 5'ATACCAGCTGGGCAACATTGAGAAC-3' - és a TCF1202F vad típusú prímért - 5'-GGCAACTTATCCCAAACAAGATCTGG-3 - használtuk, továbbá AmpliTaq polimerázt (Takara Co.) és templátként a pcDTCF II plazmidból 4 ng-ot. A PCR termékeket Centricon 100 készülékben (Amicon Co.) tisztítottuk, hogy eltávolítsuk a primereket. A tisztított termékeket Xhol és Pvull restrikciós enzimekkel (Takara Co.) emésztettük. A pcDTCF ΙΙ-t Xhol-gyel emésztettük, majd ligáltuk. így jutottunk a pcDTCF AXho plazmidhoz, amelyből hiányzik az 1,1 kb méretű Xhol DNS fragmentum. A pcDTCF AXho plazmidot SphI-gyel és PvuII-vel emésztettük. A kapott 4,8 kb méretű XholSphl DNS fragmentumot és a 0,5 kb méretű PvuIISphl fragmentumot tisztítottuk és az XhoI-PvuII-vel emésztett, fent leírt PCR termékekhez ligáltuk DNA Ligation Kit segítségével. A ligációs keverék egy részével MC1061/P3 E. coli sejteket (Invitrogen Co.) transzformáltunk.
A plazmid DNS-eket ampicillin és tetracíklin rezisztens transzformált sejtekből izoláltuk és hasonló módon szelektáltuk a pcDTCF AXhoI-3 plazmidot, amelyben az 563. helyen lévő Ser-t meghatározó kodont a GCC Alá kodon helyettesíti. A tetraciklint a Sigma Co.-tól szereztük be.
Két PCR menetben mutagenizáltuk a 650. helyen lévő Ser-t meghatározó kodont. Az első PCR-eket egymástól függetlenül valósítottuk meg, AmpliTaq polimerázzal (Takara Co.) és a 4 ng pcDTCF II plazmiddal mint templáttal és a TCF-4F 5'-ACTCTGAATGAGGCTGAAATATGTG-3' mutáns primer és a TCF2203R 5'GGCATGCACAGTTGTATTGGTGGGTGCTTCAG-3' vad típusú primer párral vagy a TCF-4R 5'-CACATATTTCAGCCTCATTCAG-AGT-3' mutáns primer és a TCF1685F 5'-AACAGGTTCTCAATGTTTCCCAG3' vad típusú primer párral. A PCR termékeket DE81 papírral (Whatman Co.) tisztítottuk és ezek egytizedét használtuk a második PCR-hez a TCF2203R és TCF1685F primerek mellett. A PCR termékeket agaróz gélben választottuk el, DE81 papíron tisztítottuk és BglII-vei és SphI-gyel emésztettük. Másrészt a pcDTCF AXhoI-et és a pcDTCF ΔΧΗΙ-3-at szintén Bglll-vel és SphI-gyel emésztettük, majd a 4,9 kb méretű fragmentumokat tisztítottuk, amelyeket a fent leírt BglII-Sphl-gyel emésztett PCR fragmentumhoz ligáltunk DNA Ligation Kit segítségével. A ligációs elegy egytizedét használtuk az MC1061/P3 E. coli sejtek transzformálására. A plazmid DNS-eket az ampicillin- és tetraciklin-rezisztens transzformáit sejtekből izoláltuk, majd hasonló módon szelektáltuk a pcDTCF AXhoI-4 plazmidot, amelyben a 650. helyen lévő Ser-t meghatározó TCT kodon az Alá GCT kodonjára cserélődött és a pcDTCF AXhoI-34 plazmidot, amelyben az 563. helyen és a 650. helyen lévő Ser kodonokat az Alá kodonok helyettesítették.
(3) Expressziós vektorok szerkesztése
1. Vektorok szerkesztése tranziens expresszióhoz
A pSKTCFPH, pSKTCFPH-Ι, pSKTCFPH-2 és pSKTCFPH-12 plazmidokat Xhol-gyel emésztettük és az 1,1 kb méretű DNS fragmentumokat tisztítottuk. A pcDTCF ÁXhoI, pcDTCF ÁXhoI-3, pcDTCF ÁXhoI34 plazmidokat Xhol-gyel emésztettük és négyféle fent leírt 1,1 kb méretű DNS fragmentumhoz ligáltuk. Tizenöt ligációs elegyet - kivéve a pSKTCFPH 1,1 kb és pcDTCF ÁXhoI kombinációt - használtunk MC1O61/P3 E. coli sejtek transzformálásához. Tizenöt expressziós vektort szelektáltunk: pcDTCF-1, pcDTCF-2, pcDTCF-3, pcDTCF-4, pcDTCF-12, pcDTCF-13, pcDTCF-14, pcDTCF-23, pcDTCF-24, pcDTCF-34, pcDTCF-123, pcDTCF-124. pcDTCF134, pcDTCF-234 és pcDTCF-1234. Restrikciós enzimes analízissel igazoltuk e vektorok szerkezetét. Ha ezekkel a plazmidokkal emlős sejteket transzfíciálunk, például COS sejteket, a TCF-et és a módosított TCF-et meghatározó gének a citomegalovírus (CMV) promoter szabályozása alatt kifejeződnek. Ezeknek a plazmidoknak a szerkezetét az 5. ábrán mutatjuk be.
2. Vektorok szerkesztése stabil expresszióhoz
A pHSG396 plazmidot (Takara Co.) HindlII-mal emésztettük, tompa végeket alakítottunk ki a DNA Blunting Kit (Takara Co.) segítségével, Gene Cleannel tisztítottuk és a 8mer 5'-GCGGCCGC-3' Notl linkerhez (Takara Co.) ligáltuk. Ezzel transzformáltunk DH5a E. coli sejteket. A plazmid DNS-eket kloramfenikol rezisztens transzformált sejtekből izoláltuk, majd szelektáltuk a pHSG Notl plazmidot, amely HindlII helyet nem, de Notl helyet tartalmazott. A pHSG-Notl plazmidot Sall-gyel és SphI-gyel emésztettük és a S all gyei és SphI-gyel emésztett 2,3 kb méretű teljes hoszszúságú TCF cDNS-hez ligáltuk. így kaptuk a pHSG N-TCF plazmidot. A pHSG N-TCF plazmidból deletál5
HU 211 927 A9 tűk az 1,1 kb méretű Xhol-Xhol fragmentumot, így kaptuk a pHSG N-TCFII ΔΧ plazmidot. A pHXG NTCFII ΔΧ plazmidot BstPI-gyel és SPhI-gyel emésztettük és a 2,3 kb méretű DNS fragmentumot tisztítottuk, majd DNA Ligation Kit segítségével a BstPI-gyel és SphI-gyel emésztett alábbi 15 plazmidhoz ligáltuk pcDTCF-1, pcDTCF-2, pcDTCF-3, pcDTCF-4, pcDTCF-12, pcDTCF-13, pcDTCF-14, pcDTCF-23, pcDTCF-24, pcDTCF-34, pcDTCF-123, pcDTCF124, pcDTCF-134. pcDTCF-234 és pcDTCF-1234, valamint a vad típusú TCF cDNS-t tartalmazó BstPISphl-gyel emésztett pcDTCF-hez ligáltuk. Ezekkel a plazmidokkal E. coli DH5a sejteket transzformáltunk. A plazmid DNS-eket kloramfenikol rezisztens transzformáit sejtekből preparáltuk és 16 olyan plazmidot szelektáltunk, amelyek a 2,3 kb méretű vad típusú TCF cDNS-t vagy a pHSG NotI plazmidban lévő egyes mutáns TCF cDNS-eket tartalmazták.
Ezeket a plazmidokat a következőképpen neveztük el: pHSGN-TCF, pHSGN-TCF-1, pHSGN-TCF2, pHSGN-TCF-3, pHSGN-TCF-4, pHSGN-TCF12. pHSGN-TCF-13, pHSGN-TCF-14, pHSGNTCF-23, pHSGN-TCF-24, pHSGN-TCF-34, pHSGN-TCF-123. pHSGN-TCF-124, pHSGNTCF- 134, pHSGN-TCF-234 és pHSGN-TCF-1234. Ezt a 16 plazmidot Sall-gyel és Notl-gyel emésztettük. az XhoI-Notl-gyel emésztett BCMGSneo expressziós vektorba ligáltuk és DH5a E. coli sejtek transzformálására használtuk. A BCMGSneo egy olyan plazmid, amely tartalmazza a bovin papillóma vírus (BPV) replikációs origót és a citomegalovírus promotert, továbbá képes E. coliban replikálódni. A BCMGSneo plazmidot dr. H. Karasuyama (Basel Immunological Institute) bocsátotta rendelkezésünkre, leírását az Idenshikohgaku című kézikönyv (297299. old.. Yohdo Co., 1991.) tartalmazza. A plazmid DNS-eket ampicillin rezisztens transzformált sejtekből izoláltuk és 16 olyan expressziós vektort szelektáltunk. amelyek a BCMGSneo-ban a 2.3 kb méretű vad típusú TCF cDNS-t vagy az egyes mutáns TCF cDNS-eket tartalmazták. Ezeket a plazmidokat a következőképpen jelöltük: pBPV-TCF, pBPV-TCF-1, pBPV-TCF-2, pBPV-TCF-3, pBPV-TCF-4, pBPVTCF-12, pBPV-TCF-13, pBPV-TCF-14, pBPVTCF-23, pBPV-TCF-24, pBPV-TCF-34, pBPVTCF-123, pBPV-TCF-124, pBPV-TCF-134, pBPVTCF-234, pBPV-TCF-1234. Az antibiotikumokat, így a kloramfenikolt a Sigma Co.-tól szereztük be. A pBPV-TCF-3 vagy pBPV-TCF-13 plazmidot tartalmazó E. coli törzsekei a National Institute of Bioscience and Humán Technology intézménynél helyeztük letétbe FERM BP-4454 és FERM BP-4455 számon.
(4) A TCF- és módosítón TCF-expressziós plazmidok izolálása és tisztítása
A 16. E. coli törzset, amelyek a pBPV-TCF-1, pBPV-TCF-2, pBPV-TCF-3, pBPV-TCF-4, pBPVTCF-12, pBPV-TCF-13, pBPV-TCF-14, pBPVTCF-23, pBPV-TCF-24, pBPV-TCF-34, pBPVTCF-123, pBPV-TCF-124, pBPV-TCF-134, pBPVTCF-234 és pBPV-TCF-1234 expressziós vektorokat tartalmazták, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó 400 ml táptalajban tenyésztettük 37 C-on. Ha a tenyészlevek 600 nm-en mért abszorpciója elérte a 0,8 értéket, a levestenyészelekhez annyi kloramfenikolt adtunk, hogy 170 pg/ml legyen a végső koncentrációja, majd egy éjszakán át tovább tenyésztettünk. Ezt a 16 plazmidot alkáli-SDS módszerrel preparáltuk és céziumklorid sűrűség grádiens ultracentrifugálással tisztítottuk Maniatis és munkatársai leírása szerint (Molecular Cloning, 2. kiadás).
(5) TCF- és módosított TCF-expressziós plazmidok transzfekciója állati sejtvonal tenyészetekbe A C127 egér sejtvonalat a 16 expressziós plazmiddal TRANSFECTAM készítménnyel (IBF Co., Maryland, USA) - amely tenyésztett emlős sejtvonalakhoz alkalmas DNS transzfekciós reagens - transzferáltunk, az alább leírtak szerint. A transzfekciót megelőző napon körülbelül 104 * 6 Cl27 egér sejtet szuszpendálunk 10% fetális borjú szérumot tartalmazó DME táptalajban (Gibco Co.). A sejteket 37 “C-on inkubáljuk szén-dioxid inkubátorban (5-7% széndioxidot tartalmazó nedves atmoszférájú inkubátor), 25 cm2-es tenyésztő palackokban (Sumitomo Bakelité: adherens sejtek számára). (A sejteket 37 °C-on, 5-7% szén-dioxid tartalmú nedves atmoszférájú inkubátorban tenyésztjük, hacsak másként nem jelezzük.) Transzfekció előtt a sejteket kétszer mossuk Opti. MÉM táptalajjal (Gibco Co.). Miután az egysejtréteghez 2 ml Opti. MÉM tápoldatot adtunk, a transzfekciót 10 pg plazmid DNS-sel végezzük a gyártó cég előirata szerint. Hat órás inkubálás után 7,5 ml DME táptalajt adunk minden palackhoz. Ezután a sejteket további 2 napig inkubáljuk 37 ”C-on. Az első nap a táptalajt friss DME táptalajjal cseréljük le. A sejteket tripszinnel kezeljük, egyszer mossuk DME táptalajjal és 50 ml lOOpg/ml G418-at tartalmazó DMS táptalajban szuszpendáljuk. A szuszpenzióból lOOpl-t mérünk 96 tartályos (lapos fenekű) lemezek minden tartályába, a lemezeket 37 ‘C-on inkubáljuk. Egy héttel később 100 pg/ml G418-at tartalmazó DME táptalajból 100 pl-t adunk minden tartályhoz, majd a lemezeket 37 “C-on inkubáljuk. Egy hét múlva a TCF vagy a módosított TCF-ek expresszióját úgy mutaljuk ki, hogy a tenyészlé 100 pl-ében mérjük a TCF vagy a módosított TCF-ek koncentrációját enzim-immunassay segítségével, anti-TCF monoklonális antitestek [N. Shima et al., Gastroenterologia Japonica, 26, 477/482 (1990)] alkalmazásával. A TCF-et vagy módosított TCF-eket kifejező sejtvonalakat 37 ”C-on tenyésztjük vagy )2-tartályos szövettenyésztő lemezen vagy 25 cm2-es palackban, a sejtszámnak megfelelően. Olyan setjvonalakat kaptunk, amelyek módosított TCF-eket fejeztek ki (az összesen 15 módosított TCF-et a következőképpen jelöltük: TCF-1, TCF-2, TCF-3, TCF-4, TCF-12, TCF13, TCF-14, TCF-23, TCF-24, TCF-34, TCF-123, TCF-124, TCF-134, TCF-234 és TCF-1234).
HU 211 927 A9 (6) A TCF-et vagy a módosított TCF-eket termelő sejtvonalak nagybani tenyésztése A 75 cm2-es szövettenyésztő palackokban a TCFet vagy a módosított TCF-eket termelő sejtvonalak összefolyt sejtjeit tripszines kezeléssel arattuk le, majd a sejtekkel három 225 cm2-es szövettenyésztő palackot oltottunk be. Minden palackhoz 100 ml DME táptalajt adtunk és a tenyészeteket 37 “C-on inkubáltuk. Négy nap múlva az összefolyt sejteket tripszineztük és DME táptalajban szuszpendáltuk. A sejt szuszpenziót tízszeresére hígítottuk DME táptalajjal (az összmennyiség 3 liter). A hígított sejtszuszpenzióból 100 ml-rel újabb 225 cm2-es szövettenyésztő palackot oltottunk be. Harminc 225 cm2-es szövettenyésztő palackban 5 napig 37 ”C-on tenyésztettük a sejteket. A tenyészetek felülúszóját (összesen 3 liter) összegyűjtöttük. A sejteket 6 palackból arattuk le. s a sejtekkel ezután hatvan 225 cm2-es szövettenyésztő palackot oltottunk be. Minden palackhoz 100 ml táptalajt adtunk, és a palackokat 5 napig 37 ’C-on inkubáltuk. A tenyészetek felülúszóját (összesen 6 liter) összegyűjtöttük. Ilyen módon 9 liter olyan felülúszót kaptunk, amely a TCF-et és a módosított TCF-eket tartalmazta.
(7j A TCF és a módosított TCF-ek tisztítása
Egy háromlépéses tisztítási módszert alkalmaztunk az alábbiak szerint
/. Heparm-Sepharose CL-bB
A 9 liter tenyészet-felülúszót. amely az összes módosított TCF-et tartalmazta, 6000 ford./perc mellett 30 percig centrifugáltuk az oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából. A felülúszót körülbelül 200 ml/óra átfolyási sebességgel egy olyan heparin Sepharose CL-6B oszlopra (2,5x12 cm) (Pharmacia Co. i vittük fel, amelyet előzőleg 300 ml kiegyensúlyozó pufferrel (0.5 M nátriumklorid. 0,01% Tween 20 tartalmú 10 mM trisz.HCl puffer: pH = 7,5) hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot ezután körülbelül 700 ml kiegyensúlyozó pufferrel mostuk. A TCF-et vagy a módosított TCF-eket 2 M nátrium-klorid és 0,01% Tween 20 tartalmú trisz.HCl pufferrel (pH = 7,5) eluáltuk és 3 ml-es frakciókat szedtünk. A frakciókat a 280 nm-en mért abszorpció révén figyeltük. A TCF vagy a módosított TCF tartalmú frakciókat (körülbelül 100 ml) összegyűjtöttük.
2. Mono-S-FPLC
A TFC-el vagy a módosított TCF-eket tartalmazó eluátumot 0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó 10 nM foszfát pufferrel (pH = 6,5) szemben dializáltuk, majd 12 000 ford./perc mellett 90 percig centrifugáltuk az oldhatatlan részek eltávolítása céljából. A felülúszót 1 ml/perc átfolyási sebességgel olyan MonoS oszlopra (0,5x5 cm: Pharmacia Co.: FPLC) vittük fel, amelyet előzőleg körülbelül 20 ml 0,15 M nátrium-kloridot és 0,01 % Tween 20-at tartalmazó 10 mM foszfát pufferrel (pH = 7,0) (A puffer) hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot egyszer mostuk körülbelül 30 ml
A pufferrel. Ezután a TCF-et vagy a módosított TCFeket 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett eluáltuk az oszlopról, nátrium-klorid lineáris grádiensében (1,0 M-ig) és 0,5 ml-es frakciókat szedtünk. A TCF vagy módosított TCF-eket tartalmazó frakciók (körülbelül 4 ml) 0,7-0.8 M nátrium-klorid mellett oldódtak le.
3. Heparin 5-PW-FPLC
Két térfogat (8 ml) 0,01% Tween 20-at tartalmazó 10 mM trisz.HCl puffért (pH = 7,5) adtunk a TCF-et vagy módosított TCF-eket tartalmazó eluátumhoz. A hígított oldatot 1 ml/perc átfolyási sebességgel olyan heparin 5-PW oszlopra (0,5x7,5 cm: TOSO Co., FPLC) vittük fel, melyet előzőleg körülbelül 20 ml 0,3 M nátrium-kloridot és 0,01% Tween 20-at tartalmazó 10 mM trisz.HCl pufferrel (pH = 7,5) (B puffer) hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot körülbelül 30 ml B pufferrel mostuk. Ezután a TCF-et vagy a módosított TCF-eket 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett, nátrium-klorid lineáris grádiensében (2,0 M-ig) eluáltuk és 0,5 ml-es frakciókat szedtünk. A TCF-et vagy a módosított TCF-eket tartalmazó frakciókat (amelyek körülbelül 1.3 M nátrium-klorid-nál oldódtak ki, összmenynyiségük 3 ml) összegyűjtöttük. Ezeket a frakciókat ionmentesített vízzel szemben dializáltuk. liofilizáltuk és 0,001% Tween 20 tartalmú foszfáttal pufferolt konyhasó oldatban (PBS) oldottuk fel. A tisztított végtermék TCF-ek kinyert mennyiségét és kihozatalál az 1. táblázat mutatja be, A kinyert mennyiségeket poliklonális EIA segítségével határoztuk meg. a következő fejezetben leírtak szerint.
1. táblázat
A végső, tisztított, módosított TCF-ek hozama és kitermelése
| Név | Kinyeri mennyiség tg! | -, Kihozatal (%) |
| TCF | 2760 | 31 |
| TCF-1 | 872 | 17 |
| TCF-2 | 920 | 40 |
| TCF-3 | 253 | 16 |
| TCF-4 | 560 | 16 |
| TCF-12 | 688 | 33 |
| TCF-13 | 1088 | 23 |
| TCF-14 | 350 | 27 |
| TCF-23 | 810 | 28 |
| TCF-24 | 648 | 19 |
| TCF-34 | 668 | 34 |
| TCF-123 | 340 | 11 |
| TCF-124 | 400 | 23 |
| TCF-134 | 187 | 22 |
| TCF-234 | 400 | 15 |
| TCF-1234 | 155 | 8 |
HU 211 927 A9 (8) A tisztított módosított TCF-ek mennyiségi meghatározása
1. Poliklonális antitestek előállítása és az antitestek jelzése
Anti-TCF antiszérumot TCF-fel immunizált nyulakból nyertünk. Az anti-TCF IgG-t az antiszérumból tisztítottuk Affi-gel protein A Sepharose (BioRad Co.) használatával, a gyártó cég előirata szerint. A tisztított IgG-t egy éjszakán át dializáltuk PBS-sel szemben, majd 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett TCF affinitás oszlopra vittük, amelyben a TCF-et Affi-gel 10-en (BioRad Co.) immobilizáltuk. Az immobilizált oszlopot PBS-sel mostuk és az anti-TCF IgG-t 0,1 M glicin.HCl pufferral (pH = 2,5) eluáltuk. Az eluátumot PBS-sel szemben dializáltuk és így tisztított anti-TCF poliklonális antitesteket kaptunk. Aperoxidázzal jelzett antitesteket Ishikawa és munkatársai [J. Immunoassay,
4. 209-237 (1983)] szerint készítettük.
2. A tisztított, módosított TCF-ek mennyiségi meghatározása
Anti-TCF antitesteket oldottunk 10 pg/ml koncentrációban, 0,1 M nátrium-hidrogén-karbonát oldatban. Az antitest oldatot 96 tartályos mikrotitráló lemezekre (NUNC Co.. 100 μΙ/tartály) vittük. A Snow Brand Milk Products Ltd. Co. Block Ace készítményét kétszeresére hígítottuk ionmentesített vízzel és hozzáadtuk az antitesttel fedett mikrotitráló lemezek tartályaihoz (2000 μΙ/ml). A lemezeket egy órán át szobahőmérsékleten tartottuk a tartályok blokkolása céljából. A lemezeket ezután háromszor mostuk 0,1% Tween 20 tartalmú PBS-sel (mosó puffer). A módosított TCF-et megfelelő mennyiségű első pufferrel (0,2 M Trisz.HCl. pH = 7,4. mely 40% Block Ace készítményt és 0,1% Tween 20-at tartalmaz) hígítottuk a módosított TCF minták elkészítése céljából. Standard TCF oldatot úgy kaptunk, hogy a 10 ng/ml koncentrációjú TCF oldatból sorozathígílást készítettünk. A módosított TCF mintákból 100 μΙ-t mértünk a tartályokba, a lemezeket 3 órán át 37 ’C-on tartottuk, majd háromszor mostuk a mosó pufferrel. A peroxidázzal konjugált antitest oldatot 400-szorosra hígítottuk a második pufferrel (0,1 M trisz.HCl, pH = 7,4, mely 20% Block Ace készítményt, 0,1% Tween 20-at és 0,5 mg/ml egér IgG-t tartalmaz). A hígított, peroxidázzal jelzett antitest oldatból 100 μΐ-ι mértünk a tartályokba, a lemezeket 2 óra hosszat 37 ‘C-on tartottuk, majd háromszor mostuk a mosó pufferrel. Ezután 100 μΐ szubsztrátum oldatot (0,4 mg/ml o-fenilén-diamin-dihidroklorid és 0,006% hidrogén-peroxid 0,1 M citrát-foszfát pufferben: pH = 4,5) adtunk a tartályokhoz és a lemezeket 30 percig 37 C-on sötét helyen inkubáltuk. Az enzimreakciót 50 μΙ 6 m kénsav bemérésével állítottuk le. Az abszorpciót 492 nm-en, Immuno Reader (Corona Co.) készülékkel mértük.
(9) A tisztított TCF vagy a módosított TCF-ek analízise SDS-poliakrilamid-gé!-e!ektroforézissei
A tisztított, módosított TCF-ekbő) 5 pg-ot vittünk
SDS-poliakrilamid gélre. A nagyobb felezési idejű módosított TCF-eket (TCF-3 és TCF-13) - lásd később és a vad típusú TCF-et SDS-poliakrilamid gélben elektroforetizáltuk. Az eredményeket a 7. ábra mutatja. Az elektroforézist β-merkapto-etanol jelenlétében (redukáló körülmények) is és β-merkapto-etanol nélkül (nem redukáló körülmények) is elvégeztük. A 7. ábrán látható, hogy a TCF két egymás mellett lévő sávot mutat, körülbelüli molekulatömegük 78 000, illetve 74 000, nem redukáló körülmények mellett. A TCF-3 két sávja gyorsabban vándorolt, mint a TCF sávok, és a TCF-13 gyorsabban vándorolt, mint a TCF-3 sávjai, nemredukáló körülmények mellett. Redukáló körülmények mellett a TCF esetében három protein sávot észleltünk, melyek molekulatömege 52 000, 30 000 és 26 000 volt. Ehhez hasonlóan a TCF-3-nál három, 52 000, 26 000 és 22 000 molekulatömegű sávot, a TCF-13-nál szintén három, 48 000, 6 000 és 22 000 molekulatömegű sávot észleltünk. E TCF-ek molekulatömegében mutatkozó csökkenés valószínűleg az oligoszacharid láncok eltávolításának tudható be. Az eredmények arra engednek következtetni, hogy a kívánt, módosított TCF-eket kaptuk meg. Más protein sávokat nem észleltünk, kivéve azokat, amelyek a két módosított protein szerkezetéből következtek.
2. példa
A TCF és a módosított TCF-ek biológiai aktivitása in vitro (1) Növekedést stimuláló hatás májsejtekre
A májsejtekre gyakorolt növekedési stimuláló hatást a következőképpen határoztuk meg. Wister patkányokból (testtömegük körülbelül 200 g) patkány hepatocitákat izoláltunk Seglen módszerével (Methods in Cell Biology, 13, kötet, 29. oldal., Academic Press, New York). A sejtlenyésztéshez Williams E alap-táptalajt (FLOW laboratories Co.) használtunk, amely 10% fetális borjú szérumot és 10 μΜ dexametazont tartalmazott. Egy 96 tartályos (lapos fenekű tartályok) lemez (Falcon Co.) minden tartályába 10 μ! LOxlO4 sejtet tartalmazó alaptáplalajt mértünk be és a lemezeket 37 ’C-on inkubáltuk. Huszonnégy órás inkubálás után a tartályokba 100 pl TCF-et vagy módosított TCF-eket mértünk be, majd 22 órán át 37 ‘C-on inkubáltuk a lemezeket. Minden tartályt 1 pCi 3H-timidinnel (Amersham Co.) egészítettünk ki és tovább inkubáltunk 2 óra hosszat 37 ’C-on. Ezután hideg PBS-sel háromszor mostuk a lemezeket, majd a sejteket 0,5%os tripszin oldattal kezeltük. Végül a sejteket sejtlearató készülék (cell harvester) segítségével üveg szűrőlemezre gyűjtöttük össze. Az egyes tartályokban lévő sejtek által felvett radioaktivitást Mátrix 96 készülékben (Packard Co.) számoltuk. A 8. ábrán látható, hogy mindegyik módosított TCF megtartotta növekedést stimuláló hatását a patkány hepatocitáknál.
(2) Tumor citotoxikus aktivitás
A TCF, TCF-3 és TCF-13 tumor citotoxikus aktivitását mértük. Meth A szarkóma sejteket használtunk
HU 211 927 A9 célsejtek gyanánt. A sejteket 10% FCS tartalmú RPMI táptalajban (Gibco Co.) szuszpendáltuk 2xl04 sejt/ml végső sejt sűrűségben. Ezután 96 tartályos (lapos fenekű tartályok) mikrotitráló lemezek tartályait a sejtszuszpenziők 50 μΐ-eivel oltottuk be. A tisztított TCF, TCF-3 és TCF-13 50 ng/ml koncentrációjú oldataiból sorozathígításokat készítettünk RPMI táptalajjal, majd minden hígításból 50 μΙ-t mértünk a tartályokba. A lemezeket 5 napig inkubáltuk 37 ’C-on, majd annyi MTT-t [tiazolil kék: 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolium-bromid] adtunk a tartályokhoz, hogy végső koncentrációja 0,5 mg/ml legyen. Ezután a lemezeket 37 ’C-on inkubáltuk. Négy órával később 10% SDS és 0,01 M ammónium-klorid tartalmú oldatból minden tartályba 100 μΙ-t mértünk be és egy éjszakán át szobahőmérsékleten tartottuk a lemezeket. A következő nap minden tartályban 620 nm-en mértük az abszorpciót, mint az élő sejtszám paraméterét. A 9. ábra mutatja be a kísérlet eredményét. A TCF, TCF-3 és TCF-13 citotoxikus aktivitását dózis függő módon fejti ki a Meth A sejtekre.
3. példa
A TCF és a módosított TCF-ek biológiai felezési idejének mérése in vivő
Anti-TCF poliklonális antitest oldatot készítettünk 0.1 M nátrium-hidrogén-karbonát oldatban úgy. hogy végső koncentrációja 10 pg/ml legyen. Az antitest oldatból 100 μΙ-t mértünk a lemezeken lévő tartályokba és a lemezeket szobahőmérsékleten tartottuk egy éjszakán át. A tartályokat megtöltöttük Block Ace 50%-os vizes oldatával. 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd háromszor mostuk mosó oldattal (0.1% Tween 20-at tartalmazó PBS). Patkányokból, amelyeket intravénásán oltottunk TCF-fel vagy módosított TCF-ekkcl időközönként plazma mintákat vettünk. A plazmákat normál patkány szérummal hígítottuk. ha ez szükséges volt. Normál patkány szérummal sorozat hígítást készítettünk a TCF oldatokból (10 ng/ml-től). s ezt használtuk standard TCF oldatként. Minden tartályhoz hozzáadtunk egy keveréket, mely 50 μ] minta oldatból és 50 μΐ első pufferből (50% Block Ace, 0,2 M nátrium-klorid, 0,1% Tween 20. 0,2% CHAPS, 20 mM benzamidin-hidroklorid és 10 mM EDTA tartalmú 0,2 M trisz.HCl, pH = 7,3) állt. A lemezeket 3 órán át 37 ’C-on tartottuk, majd háromszor mostuk a mosó pufferrel. A tartályokhoz hozzáadtunk 100 μΐ peroxidázzal konjugált anti-TCF oldatot, melyet 400-szorosára hígítottunk 10% Block Ace, 0,15 M nátrium-klorid, 0,1% Tween 20, 4% patkány szérum és 0,5% egér IgG tartalmú 0,1 M foszfát pufferrel (pH = 7,0). A lemezeket 2 órán át 37 ’C-on inkubáltuk, ezután háromszor mostuk mosó pufferrel. Ezután minden tartályba 100 μ] szubsztrátum oldatot (0,4 mg/ml o-fenilén-diamindihidroklorid és 0.006% hidrogén-peroxid 0,1 M citrátfoszfát pufferben: pH = 4,5) mértünk és a lemezeket sötét helyen 37 ’C-on 30 percig inkubáltuk. Az enzimreakciót 50 μΐ 6 n kénsav hozzáadásával állítottuk le. Az abszorpciót 492 nm-en mértük Immuno
Reader (Corona Co.) készülékben, fgy határoztuk meg a TCF vagy a módosított TCF-ek koncentrációját a patkány szérumokban.
A plazma szintek időben való változását EIA-val mértük patkányokban, egyetlen TCF vagy módosított TCF intravénás injekciója után. Körülbelül 200 g-os hím Wister patkányokat használtunk. A patkányokba intravénásán beoltott TCF plazma-szintje bioexponenciálisan csökken, melyet egy kétkompartmentumos modell jól leír. Ötven pg/kg TCF injekciója után a patkányok plazmájában a felezési idő a gyors fázisban és a lassú fázisban a következő volt: 2,4±2,5 perc (t'/2a), illetve 15,6±4,6 perc (t'/2a). A módosított TCF plazma szintek profilja hasonló volt a vad típusú TCFéhez, de ezeknél a plazma szintek lassabban csökkentek, mint a vad típusú TCF-nél, azonos dózisok intravénás injekciója után.
A 2. táblázat mutatja, hogy a TCF-3 és a TCF-13 plazma felezési ideje hosszabb és teljes klirenszük csökkent. A TCF-3 és a TCF-13 esetén szélesebb az AUC (the area under the plasma concentration - time curve = a plazma-koncentráció alatti terület - idő görbe), összehasonlítva a vad típusú TCF-fel.
2. táblázat
A módosított TCF-ek farmakokinetikai paraméterei
| Minta | t’/2a (perc) | t'/2a (perc) |
| TCF | 2,4±O,5 | 15.6±4,6 |
| TCF-i | 2,4±0,3 | 19.6+0.3 |
| TCF-2 | 2,2±0.6 | 18,2+2,5 |
| TCF-3 | 2,9+0,3 | S4.2±8,3** |
| TCF-4 | 2.7+Ο.1 | 20.613.3 |
| TCF-12 | 2,7±0.3 | 18.111,6 |
| TCF-13 | 3.8+0.5** | 24,9+3,1* |
| TCF-14 | i,9±0,4 | 18,812,9 |
| TCF-23 | 2.4+05 | 15.4+05 |
| TCF-24 | 2.3+0.1 | 16.911.7 |
| TCF-34 | 2,2±O,5 | 18,0+2,1 |
| TCF-123 | 2,2±O,l | 17,210,8 |
| TCF-124 | 2,3+0,1 | 15,7+2,7 |
| TCF-134 | 2,3+0,4 | 19,1+3,2 |
| TCF-234 | 2,6+0.6 | 16,8+1,6 |
| TCF-1234 | 2.9+0,1 * | 24,2±5,5* 1 |
Középérték: ±SD
A vad típusú TCF-töl szignifikánsan különbözik (*P<0,05, ••P<0,01)
3. táblázat
A módosított TCF-ek farmakokinetikai paraméterei
| Minta | AUC (ng.perc/ml) | ΓΙ '-^összes (ml/perc/kg) |
| TCF | 1030,0+257.9 | 51,5113,9 |
| TCF-1 | 811,6+158,3 | 63,2+12,2 |
| TCF-2 | 1143,7+551,7 | 49,8118,9 |
HU 211 927 A9
| Minta | AUC (ng.perc/ml) | CLösszes (ml/perc/kg) |
| TCF-3 | 2679,5±292,1** | 18,8±2,1“ |
| TCF-4 | 897,8+263,5 | 58,6±14,7 |
| TCF-12 | 1246,4+290,8 | 41,7±10,6 |
| TCF-13 | 8301,0+279,7*» | 6,0±0,2‘* |
| TCF-14 | 972,5±162,2 | 52,5±9,5 |
| TCF-23 | 1223,0+356,7 | 43,6+14,3 |
| TCF-24 | 1017,8+210,0 | 51,0+8.3 |
| TCF-34 | 983,0+61,0 | 51,0+3,2 |
| TCF-123 | 963,8+66,2 | 52.0±3,5 |
| TCF-124 | 1126,3±265,O | 45,9±9,5 |
| TCF-134 | 960.9+279,7 | 55,2±16,7 |
| TCF-234 | 892.9+119,7 | 56,6±7,1 |
| TCF-1234 | 1266,5±78,9 | 39,6+2,6 |
Középérték ±SD
A vad típusú TCF-től szignifikánsan különbözik (*P<0.05.
-PSO.OI)
Az eredmények azt mutatják, hogy a TCF-3 és a TCF-13 lassabban metabolizálódik, mint a vad típusú TCF és szélesebb a biológiai hozzáférhetősége. 25 mint a vad típusú TCF-é. A TCF-3 aminosavszekvenciáját a 2. sz. szekvenciavázlal tartalmazza és a TCF-13 szekvenciáját a 3. sz. szekvenciavázlat tartalmazza
A találmány szerinti módosított TCF-ek biológiai 30 felezési ideje hosszabb, amellett megtartották növekedést stimuláló aktivitásukat a hepatocitákra és citotoxikus aktivitásukat a tumor sejtekkel szemben. Ennélfogva májbetegségeknél mint gyógyszerek, továbbá mint rákellenes szerek használhatók.
Letétbe helyezett mikroorganizmusok (1) pcTCF(S)MCl 061/P3 Letét helye:
National Institute of Bioscience and Humán Technology,
Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry Címe:
1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japán
Letéti szám: FERM BP-3479 (2) pBVP-TCF-3 20 Letét helye:
National Institute of Bioscience and Humán Technology.
Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry Letéti szám: FERM BP-4454
Szekvenciák
1. sz. szekvenciavázlal A szekvencia hossza: 723 aminosav A szekvencia típusa: aminosavszekvencia Molekula típus: protein
| Met | Trp | Val | Thr | Lys | Leu | Leu | Pro | Alá | Leu | Leu | Leu | Gin | His | Val | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Leu | His | Leu | Leu | Leu | Leu | Pro | Ile | Alá | Ile | Pro | Tyr | Alá | Glu | Gly | Gin |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ara | Lys | Arg | Arg | Asn | Thr | Ile | His | Glu | Phe | Lys | Lys | Ser | Alá | Lys | Thr |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Thr | Leu | Ile | Lys | Ile | Asp | Pro | Alá | Leu | Lys | Ile | Lys | Thr | Lys | Lys | Val |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn | Thr | Alá | Asp | Gin | Cys | Alá | Asn | Arg | Cys | Thr | Arg | Asn | Lys | Gly | Leu |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Pro | Phe | Thr | Cys | Lys | Alá | Phe | Val | Phe | Asp | Lys | Alá | Arg | Lys | Gin | Cys |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Leu | Trp | Phe | Pro | Phe | Asn | Ser | Met | Ser | Ser | Gly | Val | Lys | Lys | Glu | Phe |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Gly | His | Glu | Phe | Asp | Leu | Tyr | Glu | Asn | Lys | Asp | Tyr | Ile | Arg | Asn | Cys |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ile | Ile | Gly | Lys | Gly | Arg | Ser | Tyr | Lys | Gly | Thr | Val | Ser | Ile | Thr | Lys |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Ser | Gly | Ile | Lys | Cys | Gin | Pro | Trp | Ser | Ser | Met | Ile | Pro | His | Glu | His |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ser | Tyr | Arg | Gly | Lys | Asp | Leu | Gin | Glu | Asn | Tyr | Cys | Arg | Asn | Pro | Arg |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Gly | Glu | Glu | Gly | Gly | Pro | Trp | Cys | Phe | Thr | Ser | Asn | Pro | Glu | Val | Arg |
| 180 | 1B5 | 190 | |||||||||||||
| Tyr | Glu | Val | Cys | Asp | Ile | Pro | Gin | Cys | Ser | Glu | Val | Glu | Cys | Met | Thr |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Cys | Asn | Gly | Glu | Ser | Tyr | Arg | Gly | Leu | Met | Asp | His | Thr | Glu | Ser | Gly |
| 210 | 215 | 220 |
HU 211 927 A9
| Lys | íle | Cys | Gin | Arg | Trp Asp His | Gin | Thr | Pro | His | Arg | His | Lys | Phe |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||
| Leu | Pro | Glu | Arg | Tyr | Pro Asp Lys | Gly | Phe | Asp | Asp | Asn | Tyr | Cys | Arg |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||
| Asn | Pro | Asp | Gly | Gin | Pro Arg Pro | Trp | Cys | Tyr | Thr | Leu | Asp | Pro | His |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||
| Thr | Arg | Trp | Glu | Tyr | Cys Ala íle | Lys | Thr | Cys | Ala | Asp | Asn | Thr | Met |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||
| Asn | Asp | Thr | Asp | Val | Pro Leu Glu | Thr | Thr | Glu | Cys | íle | Gin | Gly | Gin |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||
| Gly | Glu | Gly | Tyr | Arg | Gly Thr Val | Asn | Thr | He | Trp | Asn | Gly | íle | Pro |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||
| Cys | Gin | Arg | Trp | Asp | Ser Gin Tyr | Pro | His | Glu | His | Asp | Met | Thr | Pro |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||
| Glu | Asn | Phe | Lys | Cys | Lys Asp Leu | Arg | Glu | Asn | Tyr | Cys | Arg | Asn | Pro |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||
| Asp | Gly | Ser | Glu | Ser | Pro Trp Cys | Phe | Thr | Thr | Asp | Pro | Asn | íle | Arg |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||
| Val | Gly | Tyr | Cys | Ser | Gin He Pro | Asn | Cys | Asp | Met | Ser | His | Gly | Gin |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||
| Asp | Cys | Tyr | Arg | Gly | Asn Gly Lys | Asn | Tyr | Met | Gly | Asn | Leu | Ser | Gin |
| 3 85 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||
| Thr | Arg | Ser | Gly | Leu | Thr Cys Ser | Met | Trp | Asp | Lys | Asn | Met | Glu | Asp |
| 405 | 41C | 415 | |||||||||||
| Leu | His | Arg | His | íle | Phe Trp Glu | Pro | Asp | Ala | Ser | Lys | Leu | Asn | Glu |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||
| Asn | Tyr | Cys | Arg | Asn | Pro Asp Asp | Asp | Ala | His | Gly | Pro | Trp | Cys | Tyr |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||
| Thr | Gly | Asn | Pro | Leu | He Pro Trp | Asp | Tyr | Cys | Pro | He | Ser | Arg | Cys |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||
| Glu | Gly | Asp | Thr | Thr | Pro Thr He | Val | Asn | Leu | Asp | His | Pro | Val | íle |
| 155 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||
| Ser | Cys | Ala | Lys | Thr | Lys Gin Leu | Arg | Val | Val | Asn | Gly | íle | Pro | Thr |
| 485 | 490' | 495 | |||||||||||
| Arg | Thr | Asn | íle | Gly | Trp Met Val | Ser | Leu | Arg | Tyr | Arg | Asn | Lys | His |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||
| íle | Cys | Gly | Gly | Ser | Leu íle Lys | Glu | Ser | Trp | Val | Leu | Thr | Ala | Arg |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||
| Gin | Cys | Phe | Pro | Ser | Arg Asp Leu | Lys | Asp | Tyr | Glu | Ala | Trp | Leu | Gly |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||
| íle | His | Asp | Val | His | Gly Arg Gly | Asp | Glu | Lys | Cys | Lys | Gin | Val | Leu |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||
| Asn | Val | Ser | Gin | Leu | Val Tyr Gly | Pro | Glu | Gly | Ser | Asp | Leu | Val | Leu |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||
| Met | Lys | Leu | Ala | Arg | Pro Ala Val | Leu | Asp | Asp | Phe | Val | Ser | Thr | íle |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||
| Asp | Leu | Pro | Asn | Tyr | Gly Cys Thr | íle | Pro | Glu | Lys | Thr | Ser | Cys | Ser |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||
| Val | Tyr | Gly | Trp | Gly | Tyr Thr Gly | Leu | íle | Asn | Tyr | Asp | Gly | Leu | Leu |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||
| Arg | Val | Ala | His | Leu | Tyr íle Met | Gly | Asn | Glu | Lys | Cys | Ser | Gin | His |
| 625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||
| His | Arg | Gly | Lys | Val | Thr Leu Asn | Glu | Ser | Glu | íle | Cys | Ala | Gly | Ala |
| 645 | 650 | 655 | |||||||||||
| Glu | Lys | He | Gly | Ser | Gly Pro Cys | Glu | Gly | Asp | Tyr | Gly | Gly | Pro | Leu |
| 660 | 665 | 670 | |||||||||||
| Val | Cys | Glu | Gin | His | Lys Met Arg | Met | Val | Leu | Gly | Val | íle | Val | Pro |
| 675 | 680 | 685 | |||||||||||
| Gly | Arg | Gly | Cys | Ala | íle Pro Asn | Arg | Pro | Gly | íle | Phe | Val | Arg | Val |
| 690 | 695 | 700 |
HU 211 927 A9
Alá Tyr Tyr Alá Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val 705 710 715 720
Pro Gin Ser
2. sz. szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 723 aminosav A szekvencia típusa: aminosavszekvencia
Molekula típus: protein
| Met | Trp | Val | Thr | Lys | Leu | Leu | Pro Alá | Leu | Leu | Leu Gin His Val | Leu | ||||
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Leu | His | Leu | Leu | Leu | Leu | Pro | Ile | Alá | Ile | Pro | Tyr | Alá | Glu | Gly | Gin |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Arg | Lys | Arg | Arg | Asn | Thr | Ile | His | Glu | Phe | Lys | Lys | Ser | Alá | Lys | Thr |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Thr | Leu | Ile | Lys | Ile | Asp | Pro | Alá | Leu | Lys | Ile | Lys | Thr | Lys | Lys | Val |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn | Thr | Alá | Asp | Gin | Cys | Alá | Asn | Arg | Cys | Thr | Arg | Asn | Lys | Gly | Leu |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Pro | Phe | Thr | Cys | Lys | Alá | Phe | Val | Phe | Asp | Lys | Alá | Arg | Lys | Gin | Cys |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Leu | Trp | Phe | Prc | Phe | Asn | Ser | Met | Ser | Ser | Gly | Val | Lys | Lys | Glu | Phe |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Gly | His | Glu | Phe | Asp | Leu | Tyr | Glu | Asn | Lys | Asp | Tyr | Ile | Arg | Asn | Cys |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ile | Ile | Gly | Lys | Gly | Arg | Ser | Tyr | Lys | Gly | Thr | Val | Ser | Ile | Thr | Lys |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Ser | Gly | Ile | Lys | Cys | Gin | Pro | Trp | Ser | Ser | Met | Ile | Pro | His | Glu | His |
| 145 | 15C | 155 | 16C | ||||||||||||
| Ser | Tyr | Arg | Gly | Lys | Asp | Leu | Gin | Glu | Asn | Tyr | Cys | Arg | Asn | Pro | Arg |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Gly | Glu | Glu | Gly | Gly | Pro | Trp | Cys | Phe | Thr | Ser | Asn | Pro | Glu | Val | Arg |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Tyr | Glu | Val | Cys | Asp | Ile | Pro | Gin | Cys | Ser | Glu | Val | Glu | Cys | Met | Thr |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Cys | Asr. | Gly | Glu | Ser | Tyr | Arg | Gly | Leu | Met | Asp | His | Thr | Glu | Ser | Gly |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Lys | Ile | Cys | Gin | Arg | Trp | Asp | His | Gin | Thr | Pro | His | Arg | His | Lys | Phe |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Leu | Pro | Glu | Arg | Tyr | Pro | Asp | Lys | Gly | Phe | Asp | Asp | Asn | Tyr | Cys | Arg |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Asn | Pro | Asp | Gly | Gin | Pro | Arg | Pro | Trp | Cys | Tyr | Thr | Leu | Asp | Pro | His |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Thr | Arg | Trp | Glu | Tyr | Cys | Alá | Ile | Lys | Thr | Cys | Alá | Asp | Asn | Thr | Met |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Asn | Asp | Thr | Asp | Val | Pro | Leu | Glu | Thr | Thr | Glu | Cys | Ile | Gin | Gly | Gin |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Gly | Glu | Gly | Tyr | Arg | Gly | Thr | Val | Asn | Thr | Ile | Trp | Asn | Gly | Ile | Pro |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Cys | Gin | Arg | Trp | Asp | Ser | Gin | Tyr | Pro | His | Glu | His | Asp | Met | Thr | Pro |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Glu | Asn | Phe | Lys | Cys | Lys | Asp | Leu | Arg | Glu | Asn | Tyr | Cys | Arg | Asn | Pro |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Asp | Gly | Ser | Glu | Ser | Pro | Trp | Cys | Phe | Thr | Thr | Asp | Pro | Asn | Ile | Arg |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Val | Gly | Tyr | Cys | Ser | Gin | Ile | Pro | Asn | Cys | Asp | Met | Ser | His | Gly | Gin |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Asp | Cys | Tyr | Arg | Gly | Asn | Gly | Lys | Asn | Tyr | Met | Gly | Asn | Leu | Ser | Gin |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Thr | Arg | Ser | Gly | Leu | Thr | Cys | Ser | Met | Trp | Asp | Lys | Asn | Met | Glu | Asp |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Leu | His | Arg | His | Ile | Phe | Trp | Glu | Pro | Asp | Alá | Ser | Lys | Leu | Asn | Glu |
HU 211 927 A9
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Asn | Tyr | Cys | Arg | Asn | Pro | Asp | Asp | Asp | Alá | His | Gly | Pro | Trp | Cys | Tyr |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Thr | Gly | Asn | Pro | Leu | Ile | Pro | Trp | Asp | Tyr | Cys | Pro | Ile | Ser | Arg | Cys |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Glu | Gly | Asp | Thr | Thr | Pro | Thr | Ile | Val | Asn | Leu | Asp | His | Pro | Val | Ile |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Ser | Cys | Alá | Lys | Thr | Lys | Gin | Leu | Arg | Val | Val | Asn | Gly | Ile | Pro | Thr |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Arg | Thr | Asn | Ile | Gly | Trp | Met | Val | Ser | Leu | Arg | Tyr | Arg | Asn | Lys | His |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Ile | Cys | Gly | Gly | Ser | Leu | Ile | Lys | Glu | Ser | Trp | Val | Leu | Thr | Alá | Arg |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Gin | Cys | Phe | Pro | Ser | Arg | Asp | Leu | Lys | Asp | Tyr | Glu | Alá | Trp | Leu | Gly |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| Ile | His | Asp | Val | His | Gly | Arg | Gly | Asp | Glu | Lys | Cys | Lys | Gin | Val | Leu |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| Asn | Val | Alá | Gin | Leu | Val | Tyr | Gly | Pro | Glu | Gly | Ser | Asp | Leu | Val | Leu |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| Met | Lys | Leu | Alá | Arg | Pro | Alá | Val | Leu | Asp | Asp | Phe | Val | Ser | Thr | Ile |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| Asp | Leu | Pro | Asn | Tyr | Gly | Cys | Thr | Ile | Pro | Glu | Lys | Thr | Ser | Cys | Ser |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| Val | Tyr | Gly | Trp | Gly | Tyr | Thr | Gly | Leu | Ile | Asn | Tyr | Asp | Gly | Leu | Leu |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| Arg | Val | Alá | His | Leu | Tyr | Ile | Met | Gly | Asn | Glu | Lys | Cys | Ser | Gin | His |
| 625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
| His | Arg | Gly | Lys | Val | Thr | Leu | Asn | Glu | Ser | Glu | Ile | Cys | Alá | Gly | Alá |
| 645 | 650 | 655 | |||||||||||||
| Glu | Lys | Ile | Gly | Ser | Gly | Pro | Cys | Glu | Gly | Asp | Tyr | Gly | Gly | Pro | Leu |
| 660 | 665 | 670 | |||||||||||||
| Val | Cys | Glu | Gin | His | Lys | Met | Arg | Met | Val | Leu | Gly | Val | Ile | Val | Pro |
| 675 | 680 | 685 | |||||||||||||
| Gly | Arg | Gly | Cys | Alá | Ile | Pro | Asn | Arg | Pro | Gly | Ile | Phe | Val | Arg | Val |
| 690 | 695 | 700 | |||||||||||||
| Alá | Tyr | Tyr | Alá | Lys | Trp | Ile | His | Lys | Ile | Ile | Leu | Thr | Tyr | Lys | Val |
| ^05 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
| Pro | Gin | Ser |
3. sz. szckvenciavázlat A szekvencia hossza: 723 aminosav
A szekvencia típusa: aminosavszekvencia Molekula típus: protein
| Met | Trp | Val | Thr | Lys | Leu | Leu | Pro | Alá | Leu | Leu | Leu | Gin | His | Val | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Leu | His | Leu | Leu | Leu | Leu | Pro | Ile | Alá | Ile | Pro | Tyr | Alá | Glu | Gly | Gin |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Arg | Lys | Arg | Arg | Asn | Thr | Ile | His | Glu | Phe | Lys | Lys | Ser | Alá | Lys | Thr |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Thr | Leu | Ile | Lys | Ile | Asp | Pro | Alá | Leu | Lys | Ile | Lys | Thr | Lys | Lys | Val |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn | Thr | Alá | Asp | Gin | Cys | Alá | Asn | Arg | Cys | Thr | Arg | Asn | Lys | Gly | Leu |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Pro | Phe | Thr | Cys | Lys | Alá | Phe | Val | Phe | Asp | Lys | Alá | Arg | Lys | Gin | Cys |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Leu | Trp | Phe | Pro | Phe | Asn | Ser | Met | Ser | Ser | Gly | Val | Lys | Lys | Glu | Phe |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Gly | His | Glu | Phe | Asp | Leu | Tyr | Glu | Asn | Lys | Asp | Tyr | Ile | Arg | Asn | Cys |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ile | Ile | Gly | Lys | Gly | Arg | Ser | Tyr | Lys | Gly | Thr | Val | Ser | Ile | Thr | Lys |
| 130 | 135 | 140 |
HU 211 927 A9
| Ser | Gly | Ile | Lys | Cys | Gin | Pro | Trp | Ser | Ser | Met | Ile | Pro | His | Glu | His |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ser | Tyr | Arg | Gly | Lys | Asp | Leu | Gin | Glu | Asn | Tyr | Cys | Arg | Asn | Pro | Arg |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Gly | Glu | Glu | Gly | Gly | Pro | Trp | Cys | Phe | Thr | Ser | Asn | Pro | Glu | Val | Arg |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Tyr | Glu | Val | Cys | Asp | Ile | Pro | Gin | Cys | Ser | Glu | Val | Glu | Cys | Met | Thr |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Cys | Asn | Gly | Glu | Ser | Tyr | Arg | Gly | Leu | Met | Asp | His | Thr | Glu | Ser | Gly |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Lys | Ile | Cys | Gin | Arg | Trp | Asp | His | Gin | Thr | Pro | His | Arg | His | Lys | Phe |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Leu | Pro | Glu | Arg | Tyr | Pro | Asp | Lys | Gly | Phe | Asp | Asp | Asn | Tyr | Cys | Arg |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Asn | Pro | Asp | Gly | Gin | Pro | Arg | Pro | Trp | Cys | Tyr | Thr | Leu | Asp | Pro | His |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Thr | Arg | Trp | Glu | Tyr | Cys | Alá | Ile | Lys | Thr | Cys | Alá | Asp | Asn | Thr | Met |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Gin | Asp | Thr | Asp | Val | Pro | Leu | Glu | Thr | Thr | Glu | Cys | Ile | Gin | Gly | Gin |
290 295 300
Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro 305 310 315 320
| Cys | Gin | Arg | Trp | Asp 325 | Ser | Gin | Tyr | Pro | His 330 | Glu | His | Asp | Met | Thr 335 | Pro |
| Glu | Asn | Phe | Lys | Cys | Lys | Asp | Leu | Arg | Glu | Asn | Tyr | Cys | Arg | Asn | Pro |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Asp | Gly | Ser | Glu | Ser | Pro | Trp | Cys | Phe | Thr | Thr | Asp | Pro | Asn | Ile | Arg |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Val | Gly | Tyr | Cys | Ser | Gin | Ile | Pro | Asn | Cys | Asp | Met | Ser | His | Gly | Gin |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Asp | Cys | Tyr | Arg | Gly | Asn | Gly | Lys | Asn | Tyr | Met | Gly | Asn | Leu | Ser | Gin |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Thr | Arg | Ser | Gly | Leu | Thr | Cys | Ser | Met | Trp | Asp | Lys | Asn | Met | Glu | Asp |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Leu | His | Arg | His | Ile | Phe | Trp | Glu | Pro | Asp | Alá | Ser | Lys | Leu | Asn | Glu |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Asn | Tyr | Cys | Arg | Asn | Pro | Asp | Asp | Asp | Alá | His | Gly | Pro | Trp | Cys | Tyr |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Thr | Gly | Asn | Pro | Leu | Ile | Pro | Trp | Asp | Tyr | Cys | Pro | Ile | Ser | Arg | Cys |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Glu | Gly | Asp | Thr | Thr | Pro | Thr | Ile | Val | Asn | Leu | Asp | His | Pro | Val | Ile |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Ser | Cys | Alá | Lys | Thr | Lys | Gin | Leu | Arg | Val | Val | Asn | Gly | Ile | Pro | Thr |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Arg | Thr | Asn | Ile | Gly | Trp | Met | Val | Ser | Leu | Arg | Tyr | Arg | Asn | Lys | His |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Ile | Cys | Gly | Gly | Ser | Leu | Ile | Lys | Glu | Ser | Trp | Val | Leu | Thr | Alá | Arg |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Gin | Cys | Phe | Pro | Ser | Arg | Asp | Leu | Lys | Asp | Tyr | Glu | Alá | Trp | Leu | Gly |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| Ile | His | Asp | Val | His | Gly | Arg | Gly | Asp | Glu | Lys | Cys | Lys | Gin | Val | Leu |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| Asn | Val | Alá | Gin | Leu | Val | Tyr | Gly | Pro | Glu | Gly | Ser | Asp | Leu | Val | Leu |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| Met | Lys | Leu | Alá | Arg | Pro | Alá | Val | Leu | Asp | Asp | Phe | Val | Ser | Thr | Ile |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| Asp | Leu | Pro | Asn | Tyr | Gly | Cys | Thr | Ile | Pro | Glu | Lys | Thr | Ser | Cys | Ser |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| Val | Tyr | Gly | Trp | Gly | Tyr | Thr | Gly | Leu | Ile | Asn | Tyr | Asp | Gly | Leu | Leu |
| 610 | 615 | 620 |
HU 211 927 A9
| Arg | Val | Ala | His | Leu | Tyr | íle | Met | Gly | Asn | Glu | Lys | Cys | Ser | Gin | His |
| 625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
| His | Arg | Gly | Lys | Val | Thr | Leu | Asn | Glu | Ser | Glu | He | Cys | Ala | Gly | Ala |
| 645 | 650 | 655 | |||||||||||||
| Glu | Lys | íle | Gly | Ser | Gly | Pro | Cys | Glu | Gly | Asp | Tyr | Gly | Gly | Pro | Leu |
| 660 | 665 | 670 | |||||||||||||
| Val | Cys | Glu | Gin | His | Lys | Met | Arg | Met | Val | Leu | Gly | Val | íle | Val | Pro |
| 675 | 680 | 685 | |||||||||||||
| Gly | Arg | Gly | Cys | Ala | íle | Pro | Asn | Arg | Pro | Gly | íle | Phe | Val | Arg | Val |
| 690 | 695 | 700 | |||||||||||||
| Ala | Tyr | Tyr | Ala | Lys | Trp | íle | His | Lys | íle | íle | Leu | Thr | Tyr | Lys | Val |
| 705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
| Pro | Gin | Ser |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (6)
1. Módosított TCF, azzal jellemezve, hogy a vad típusú TCF-ben jelenlévő és a nitrogénen keresztül kapcsoló- 20 dó oligoszacharid láncok vad típusú TCF-en való megkötéséért felelős aminosavcsoporlok közül legalább egy úgy van módosítva, hogy legalább egy ilyen, nitrogénen keresztül kapcsolódó oligoszacharid lánc TCF-hez való kötődése meg van gátolva. 25
2. Az 1. igénypont szerinü módosított TCF, azzal jellemezve. hogy az 1. sz. szekvenciavázlat szerinti aminosavszekvencia N-terminális végétől számított 289., 397., 561. és/vagy 648. helyen lévő Asn csoport egy másik aminosavcsoporttal van szubsztituálva oly módon, hogy a legalább 30 egy. nitrogénen keresztül kapcsolódó oligoszacharid lánc meg van gátolva abban, hogy a TCF-hez kötődjön.
3. Az 1, igénypont szerinti módosított TCF, azzal jellemezve, hogy az 1. sz. szekvenciavázlat szerinti aminosavszekvencia N-terminális végétől számított 563. helyen lévő Ser csoport Ala csoporttal van szubsztituálva oly módon, hogy legalább egy oligoszacharid lánc meg van gátolva abban, hogy a TCF-hez kötődjön.
4. A 2. és 3. igénypont szerinti módosított TCF, azzal jellemezve, hogy a 289. helyen lévő Asn csoport Gin csoporttal és az 563. helyen lévő Ser csoport Ala csoporttal van szubsztituálva.
5. Módosított TCF, azzal jellemezve, hogy a 2. sz. szekvenciavázlat szerinti aminosavszekvenciája van.
6. Módosított TCF. azzal jellemezve, hogy a 3. sz. szekvenciavázlat szerinti aminosavszekvenciája van.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35974792 | 1992-12-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU211927A9 true HU211927A9 (en) | 1996-01-29 |
Family
ID=18466096
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9402417A HUT68170A (en) | 1992-12-28 | 1993-12-27 | Modified tumor cytotoxic factor /tcf/ |
| HU95P/P00200P HU211927A9 (en) | 1992-12-28 | 1995-06-14 | Modified tcf |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9402417A HUT68170A (en) | 1992-12-28 | 1993-12-27 | Modified tumor cytotoxic factor /tcf/ |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5648233A (hu) |
| EP (1) | EP0628055A1 (hu) |
| JP (1) | JPH07507328A (hu) |
| KR (1) | KR950700330A (hu) |
| AU (1) | AU5716594A (hu) |
| CA (1) | CA2130561A1 (hu) |
| FI (1) | FI943880A (hu) |
| HU (2) | HUT68170A (hu) |
| NO (1) | NO943167L (hu) |
| WO (1) | WO1994014845A1 (hu) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5821223A (en) * | 1990-09-14 | 1998-10-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of stimulating cell growth with a novel broad spectrum human lung fibroblast-derived mitogen |
| DE69330960T2 (de) * | 1992-07-16 | 2002-04-11 | Snow Brand Milk Products Co Ltd | Normalisierer der blutkoagulation enthaltend tcf-ii als aktiven bestandteil |
| US5648233A (en) * | 1992-12-28 | 1997-07-15 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Modified tumor cytotoxic factor (TCF) and DNA encoding such |
| ZA9510982B (en) * | 1994-12-27 | 1996-08-22 | Snow Brand Milk Products Co Ltd | TCF mutant |
| JP4006058B2 (ja) | 1997-03-11 | 2007-11-14 | 第一三共株式会社 | 多臓器不全予防及び／又は治療剤 |
| US20020041863A1 (en) | 1997-03-14 | 2002-04-11 | Masamichi Kojiro | Preventive and/or therapeutic agent for cachexia |
| WO2000071716A2 (en) * | 1999-05-20 | 2000-11-30 | Scios Inc. | Vascular endothelial growth factor dimers |
| CA2373822A1 (en) * | 1999-05-20 | 2000-11-30 | Scios Inc. | Vascular endothelial growth factor variants |
| US7629317B2 (en) | 2001-03-29 | 2009-12-08 | The University Of Chicago | Control of growth and repair of gastro-intestinal tissues by gastrokines and inhibitors |
| JP4728807B2 (ja) * | 2003-09-03 | 2011-07-20 | 敏一 中村 | ヒト組換えｈｇｆを含有する皮膚潰瘍予防治癒剤 |
| CN102351952B (zh) * | 2011-10-19 | 2015-07-01 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种低糖化突变体干扰素-λ1、其表达、纯化方法及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ232813A (en) * | 1989-03-10 | 1992-08-26 | Snow Brand Milk Products Co Ltd | Human fibroblast glycoprotein, cell differentiation, blood vessel endothelial cell growth factor, cellular immunology inforcing factor of 78 or 74 thousand daltons plus or minus two thousand daltons |
| DE69130494T2 (de) * | 1990-06-11 | 1999-07-08 | Toshikazu Nakamura | Rekombinanter menschlicher Hepatozytwachstumsfaktor und Verfahren zu seiner Herstellung |
| US5648233A (en) * | 1992-12-28 | 1997-07-15 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Modified tumor cytotoxic factor (TCF) and DNA encoding such |
-
1993
- 1993-12-27 US US08/290,937 patent/US5648233A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-12-27 WO PCT/JP1993/001905 patent/WO1994014845A1/en not_active Application Discontinuation
- 1993-12-27 AU AU57165/94A patent/AU5716594A/en not_active Abandoned
- 1993-12-27 JP JP6515016A patent/JPH07507328A/ja active Pending
- 1993-12-27 EP EP94903079A patent/EP0628055A1/en not_active Withdrawn
- 1993-12-27 HU HU9402417A patent/HUT68170A/hu unknown
- 1993-12-27 CA CA002130561A patent/CA2130561A1/en not_active Abandoned
-
1994
- 1994-08-24 FI FI943880A patent/FI943880A/fi not_active Application Discontinuation
- 1994-08-26 NO NO943167A patent/NO943167L/no unknown
- 1994-08-26 KR KR1019940702993A patent/KR950700330A/ko not_active Application Discontinuation
-
1995
- 1995-06-14 HU HU95P/P00200P patent/HU211927A9/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07507328A (ja) | 1995-08-10 |
| US5648233A (en) | 1997-07-15 |
| NO943167D0 (no) | 1994-08-26 |
| EP0628055A1 (en) | 1994-12-14 |
| FI943880A (fi) | 1994-10-18 |
| FI943880A0 (fi) | 1994-08-24 |
| AU5716594A (en) | 1994-07-19 |
| CA2130561A1 (en) | 1994-07-07 |
| HUT68170A (en) | 1995-03-21 |
| NO943167L (no) | 1994-10-24 |
| HU9402417D0 (en) | 1994-10-28 |
| WO1994014845A1 (en) | 1994-07-07 |
| KR950700330A (ko) | 1995-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7217689B1 (en) | Glycosylation analogs of erythropoietin | |
| JP3115318B2 (ja) | Ｇｍ―ｃｓｆ及びｉｌ―３を含む融合タンパク質 | |
| JP2708099B2 (ja) | エリスロポエチン類縁体 | |
| JP3705732B2 (ja) | 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞 | |
| JP2682858B2 (ja) | 白血病抑制性因子 | |
| EP0640619B1 (en) | Erythropoietin analogs with additional glycosylation sites | |
| CA2311681A1 (en) | Human interferon-epsilon: a type i interferon | |
| HU211927A9 (en) | Modified tcf | |
| EP0337799B1 (en) | 14-Beta-gal mammalian lectins | |
| NO893452L (no) | Rekombinant naturlig dreper-celleaktivator. | |
| JPH03503524A (ja) | ミュレル管阻害物質様ポリペプチドの開裂二量体 | |
| US6399744B1 (en) | TCF mutant | |
| JP3287869B2 (ja) | ヒト神経成長因子２の製造法 | |
| EP0511816B1 (en) | Neurotrophic peptide derivative | |
| US5759991A (en) | Neurotrophic peptide derivatives | |
| JP2763026B2 (ja) | ヒトｂ細胞分化因子をコードする遺伝子系 | |
| JP3580836B2 (ja) | 好中球減少症治療剤 | |
| CA2123251A1 (en) | Polypeptide and dnas encoding it | |
| CA2123252A1 (en) | Polypeptide and dnas encoding it | |
| JPH1146777A (ja) | ヒトｂ細胞分化因子の製造方法 | |
| EP0619371A1 (en) | Polypeptide derived from a glioblastoma cell line, its use and DNAs encoding it | |
| CA2123250A1 (en) | Polypeptide and dnas encoding it | |
| JPH10295382A (ja) | インターフェロンτ改変体 | |
| JPH07145199A (ja) | 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのポリペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物 | |
| JPH06340697A (ja) | 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのポリペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物 |