HU209519B - Process for preparing monoclonal antibodies having specificity for tumor, hybridomas produced them and vaccines - Google Patents

Description

A találmány olyan monoklonális antitestekre vonatkozik, melyeket saját tumor-antigénnel immunizált rákbetegek B-sejtjeiből származó hibridóma vagy transzformáit B-sejtvonalak termelnek. Ezek a monoklonális antitestek a humán rák-terápiában, illetve diagnosztikában alkalmazhatók. A találmány tárgya az ilyen monoklonális antitesteket hasznosító diagnosztikai és terápiás eljárásokra is kiterjed.

Közelebbről megjelölve a találmány olyan új humán monoklonális antitestekre vonatkozik, amelyek egyes rákfajtákkal kapcsolatos antigénekkel specifikusan reagálnak, vonatkozik továbbá az ezeket termelő hibridóma vagy transzformált B-setvonalakra, melyeket aktívan immunizált betegek perifériás véráramából származó B-limfocitákból nyernek. A találmány tárgya kiterjed azokra az eljárásokra is, amelyek általánosan alkamazhatók hibridómák és monoklonális antitestek kemény daganatokból történő előállítására, valamint az ilyen monoklonális antitesteket alkalmazó rák-diagnosztikai és terápiás eljárásokra.

A jelenleg rendelkezésre álló rák-kezelési módok, elsősorban a sugárkezelés és a kemoterápia, azon a megfigyelésen alapulnak, hogy a rákos sejtek a normális sejteknél sokkal érzékenyebbek ezekre a kezelésekre. Azonban a normális sejteken mutatkozó súlyos toxicitás erősen behatárolja e gyógymódok alkalmazását. Ezzel szemben az antitest molekulák hatása teljesen antigén-specifikus. Ezért a kutatók rákos sejtekre specifikus antitestek izolálására törekedtek, hogy megtalálják a rák-terápia csodafegyverét (Science, 1982. 216-283.).

Az antitestek B-limfociták által szintetizált proteinmolekulák. A B-limfocitákat a csonvelő termeli és a véráram hordozza. Minden, a szervezetbe kerülő antigén, azaz idegen anyag, amely egyszerű szerves anyagtól az összetett fehérjéig bármi lehet, antitest (ellenanyag) képződést vált ki, melyek az antigént felismerik és az adott szerkezetű szerves anyagot megkötik. Az antigénre jellemző kémiai szerkezetet, melyhez egy antitest kötődhet, antigéndetennináns csoportnak vagy epitopnak nevezzük. A szervezetben lévő B-limfocitákat B-sejteknek, limfocitáknak vagy leukocitáknak nevezzük, s ezek több százmillió, genetikailag különböző programmal rendelkező sejt formájában léteznek, s mindegyik különböző detemninánsra specifikus antitestet tennel. Az ellenanyag-termelést fokozó antigén felületén számos determináns van. Ha az antigén egy olyan B-sejttel találkozik, amely felületén az adott antigén determinánsra specifikus ellenanyagot hordoz, akkor az sokszorozódni fog. Ez a klonális növekedés számos leány-sejtet eredményez, melyek az kérdéses ellenanyagot kiválasztják és a véráramba juttatják.

Minthogy az ellenanyagok specifikus antigén felismerő- és megkötő-képességgel rendelkeznek, próbálkozások történtek megfelelő mennyiségű olyan ellenanyag termelésére, amely egyetlen determinánsra specifikus, tehát csak olyan antigénhez vagy szövetekhez kötődik, amely az adott determinánssal rendelkezik.

A B-sejtek nem nőnek folytonos tenyészetben, kivéve, ha egy úgynevezett „halhatatlan” („immortal”) sejttel hibridizálják, vagy egy akár vírus-, akár tumoreredetű DNS-sel transzformálják őket. Kohler és Milstein (Natúré, 1975., 256-495) igazolta, hogy limfocita- és mielóma-sejtek között szomatikus sejtfúzió lehetséges, és az így kapott hibrid sejtek tenyészthetők és olyan ellenanyagokat termelnek, amelyek egyetlen determinánsra specifikusak. Ezeket a hibrideket hibridóma sejteknek nevezzük. Hibridóma sejtek úgy állíthatók elő, hogy adott ellenanyag termlésére aktivált limfocitákat mielóma-sejtekkel kapcsolnak össze. Ha a hibridómákat tenyésztjük, azok egy adott antigén egyetlen determinánsára specifikus ellenyagot (antitesteket) termelnek. Az ilyen ellenanyagokat monoklonális antitesteknek nevezzük.

Monoklonális antitestek termelésére olyan B-limfocita sejtvonalak is képesek, amelyek akár a tenyészetbe helyezés előtt, akár azután spontán tarnszformáción estek át. Ezeknek a sejteknek, ellentétben a hibridómasejtekkel, normál humán diploid kromoszóma-számuk (46) van. A találmány monoklonális antitesteket termelő hibridómák és tarnszformált B-sejtvonalak izolálására egyaránt vonatkozik. Egyszerűség kedvéért, a továbbiakban mindkét sejttípust monoklonális antitesteket (ellenanyagot) termelő sejteknek nevezzük.

A monoklonális antitesteket egyéb immunglobulin szennyezést nem tartalmazó, monoklonális antitesteket termelő kultúrák szintetizálják tiszta formában. Egy ilyen sejtkultúrában lényegében bármilyen mennyiségű olyan ellenanyag termelhető, amely egy adott antigén egyetlen determinánsára specifikus.

Munkahipotézisünk az volt, hogy ha egy adott rákfajta sejtjeire specifikus ellenanyag állna rendelkezésre, akkor az különböző kezelési és diagnosztikai eljárásokban lenne hasznosítható. Az ilyen antitestek ugyanis inaktiválni vagy megölni képesek az adott daganatos setjeket pusztán azáltal, hogy a sejthez azon a determinánson át kötődnek, amelyre specifikusak. Vagy alternatív megoldásként, ezek az antitestek az effektor-limfociták vagy makrofágok felületén megkötődve, azokat tumorantigén-specifikus killer-sejtekké alakíthatják.

A monoklonális antitestek a kemoterápiás szerek, toxinok és radioaktív izotópok specifitátást is fokozhatják, növelve ezzel azok hatékonyságát miközben azok toxicitása csökken. A monoklonális antitest toxinnal, radioizotóppal vagy kemoterápiás szerrel társítható; a konjugátum irányított lövedéknek tekinthető, melyben az antitest a vezérlő egység és a gyógyszer a robbanófej. Továbbá a radioizotóppal vagy nyomjelző fémmel konjugált antitestek proton emissziós (PÉT) és mag-mágneses rezonancia (NMR) adatok felvitelére is lehetőséget adnak, melyek in vivő diagnosztizálásra és a metasztázis lokalizálására használhatók. Antitestekkel a vérben a tumor-antigének jelenléte kimutatható, s így a rák diagnosztizálásának és/vagy prognosztikai vizsgálatának egyik tesztelési lehetőségét biztosítják. A monoklonális antitestek tumor-antigének izolálására is felhasználhatók, és ezáltal potenciális lehetőség nyílik azok standardizált vakcinában történő alkalmazására.

Állati tumorok és antigének közti kapcsolat létezését már a múlt században, a humán rák-fajták antigén2

HU 209 519 B jellegét elsősorban a monoklonális antitestekkel kapcsolatos újabb kutatásokkal igazolták. Azonban az a jelen találmányt eredményező kutatásokig csak néhány rák-antigént jellemeztek ténylegesen molekuláris értelemben, és mindössze egy olyan antigéndetermináns csoportot írtak le, amely humán rákkal kapcsolatos (B-sejtes daganatok immunglobulinos idiotípusai) és egyedülállóan tumor-specifikus, azaz a daganat-sejtekben igen gyakori, a normális szövetekben pedig nem, vagy nem-szignifikáns gyakorisággal fordul elő (Oldham és Smalley: J. Bioi. Response Modifiers, 1983; Sratte és munkatársai: J. Bioi. Response Modifiers, 1. kötet, 1982). A humán rák-fajtákra specifikus monoklonális antitestek előállítására irányuló kísérletek Bsejtek vonatkozásában két úton haladtak: 1. humán daganat ellen immunizált egerek lépéből B-sejteket extraháltak (4172124 számú amerikai szabadalmi leírás), és 2. rák-betegek perifériás véréből, vagy a nyirokcsomókat behálózó daganatokból extraháltak emberi B-sejteket. Ez utóbbi módszer azonban csak az alábbi közleményben jelent meg: Proc. Natl. Acad. Sci. 77 (9), 5429-5431. (1990). Egyik megközelítési mód sem vezetett azonban megfelelő eredményre.

A humán daganatok ellen immunizált egerek antitestjeniek reaktivitása nem elég szelektív. Azaz az egerekben kifejlődött monoklonális antitestek nagyrésze nemcsak azokkal a humán antigénekkel reagál, amelyek a daganatos szövetekben vannak jelen, hanem a normál szövetekben levőkkel is. A rendkívül sokféle termelt antitest közül nehéz olyan ellenanyagot szelektálni, amely csak a daganatsejtekkel reagál. így például humán eredetű kissejtes tüdőrákkal immunizált egerekből származó 20000 hibridómát szkrineltek daganatsejtekkel szembeni reaktivitás tekintetében (Science, 1982, 216-283.). Ellentétben az ennél a kísérletnél talált igen kis gyakorisággal (0,4% alatt), a jelen találmány szerinti (immunizált) vastagbélrák-betegekből származó hibridómák 16%-a termel olyan monoklonális antitesteket, amelyek specifikusan daganatsejtekkel reagálnak. Ezenkívül az egér B-sejtes eredetű monoklonális antitestek kevéssé aktívak ahhoz, hogy a rák-terápiában alkalmazhatók legyenek. Ismételt beadás után ugyanis az emberi immunrendszert „egérellenes” antitestek termelésére serkentik, és a klinikai kipróbálás folyamán azt találták, hogy a két tendencia kioltja egymás hatását. Az általunk elállított humán monoklonális antitestek alkalmazásával ezek a nehézségek elkerülhetők.

Egy másik szembeötlő különbség az emberi és egér-eredetű monoklonális antitestek között jelölhetőségi módjukban van. Korábbi, egér-ellenanyagokkal kapcsolatos vizsgálatok során a daganatos részen belül a sejtek heterogén jelölhetőségét figyelték meg. Néhány szerző a daganatsejtek antigén-heterogenitásával magyarázza ezt a jelenséget (Hand és munkatársai: Cancer Research, 43:728-735., 1983). A mi kutatási stratégiánkkal kifejlesztett humán, monoklonális antitestek viszont homogén reaktivitást mutattak azzal a tumorral szemben, amellyel reagáltak.

Az egér-eredetű monoklonális antitestek heterogén festődése azzal magyarázható, hogy az inkább a tumorsejteken bőségesen fellelhető antigének fázis- vagy sejtciklus-specifikus differenciálódására, mint a vélt, tumorhoz kötött antigénre adott, egérre jellemző immunreakció. Nem alaptalan az az elképzelés, hogy ha az emberi tumorsejtekkel egereket immunizálunk, akkor az antigének közti versengésben a nagyobb menynyiségű, domináló szövet-típusú és differenciálódó antigének sikerrel veszik föl a versenyt a viszonylag kevés, tumorhoz kötött antigénnel szemben a gazdaszervezet immunválaszáért. így emberek autológ immunizációjakor előfordulhat, hogy az antigéncsoport olyan ellenanyagok válaszát váltja ki, amelyek egérben normális körülmények között nem adnak immunválaszt. Ez a bizonyíték azt sugallja, hogy emberek és egerek különböző tumorantigénekkel reagálnak. Ezzel a hipotézissel összhangban áll az a tapasztalatunk, hogy az általunk előállított 36 humán monoklonális antitest közül egy sem reagál karcinoembrionális antigénnel (CEA), amelyet a humán tumor-sejtek ellen készített egér eredetű monoklonális antitestek gyakran felismernek.

A humán monoklonális antitestek előállítására irányuló korábbi kísérleteknél daganatos betegek nyirokcsomóiból vagy perifériás véréből extrahált B-sejteket használtak. Az volt a kiinduló feltevés, hogy egy antigénes tumor jelenléte a daganatot hordozó beteget saját tumorával szemben immunválaszra készteti és kifejezetten immunis B-sejteket termel. Ezért vettek tehát B-sejteket a rákbetegek nyirokcsomóit behálózó daganatokból vagy a perifériás vérben cirkuláló limfocitákból. Azonban a jelen találmányt megelőzően igen szerény eredményt értek csak el tumorspecifikus monoklonális antitestek előállításában.

A humán tumor antigénre specifikus monoklonális antitestek előállításánál a fő problémát az jelentette, hogy nem sikerült specifikusan immunis B-sejteket tartalmazó forrást találni (Science, 1982., 216:285.). Emberben a kezdeti ráksejtgócok hosszú időn át, akár az átlagos emberi életkor 1-10%-át kitevő időn át is növekedhetnek, mielőtt a betegség klinikailag észlelhető bizonyítéka megvolna.

Ekkorra a betegek tumorral szembeni immunválasza csökkent mértékű, vagy esetleg immuntolerancia lép fel. így a jelen találmányt megelőzően nem tudtak tumorsejtekkel reagáló humán monoklonális antitesteket reprodukálhatóan előállítani. Mi több, a csekély számú, rákbetegből nyert monoklonális antitest közül alig néhány reagált a daganatsejt felületén található determinánsokkal, a többi a sejten belüli determinánsokhoz kötődött (R. J. Cote és munkatársai: PNAS, 1983., 80:2026.). A jelen találmány lehetővé teszi felületi antigénekkel reagáló olyan monoklonális antitestek kifejlesztését, amelyek daganatfeltérképezés és -terápia céljára megfelelő aktivitással rendelkeznek.

A jelen találmány tárgya tumorspecifikus antigénekkel reagáló olyan monoklonális antitestek előállítása, amelyek bizonyos rákbetegségekben szenvedő betegekben immunválaszt idéznek elő. Tumorral szemben immunizált betegekben a tumorspecifikus antigé3

HU 209 519 Β nek immunválaszt kiváltó képességének kimutatására egy in vivő kipróbált mód a késleltetett, bőrön jelentkező túlérzékenység. Az ilyen antitestek lehetőséget adnak daganatok diagnosztizálására és kimutatására. A találmány tárgya továbbá olyan monoklonális antitestek előállítása, amelyek bizonyos rákfajtákban szenvedő betegek kezelésében hatásosak lehetnek.

Saját tumorból nyert sejtekkel immunizált betegek perifériás véréből származó B-sejtek segítségével előállított monoklonális antitestek specifikus vakcina preparátummá alakítva egy új, és az eddigieknél hatékonyabb terápiás megközelítést fejlesztettünk ki. Aktív és specifikus immunterápia érdekében, a betegeket saját daganatukból származó setjekkel immunizáltuk. Ez a megközelítés saját elméletünkön alapul, amely szerint a daganatsejtek tumorspecifikus antigéneket termelnek.

Állatokon végzett modellkísérletek támasztották alá ezt az elképzelést egyrészt azzal, hogy tumorokban gyakran találhatók olyan antigének, amelyek normális, érett szövetekben nem fordulnak elő, másrészt azzal, hogy mind a normális, mint a daganatos gazdaszervekben ezeknek a tumorsejteknek az immunválaszt kiváltó képessége kifejezett, sőt fokozható. Ezek a kísérleti eredmények igazolták, hogy az aktív specifikus immunterápia humán neoplazia esetében jogosan alkalmazható.

Azok az emberek, akik daganatsejtekkel szemben megfelelő immuválaszt adnak, különösen jó alanyok aktivált B-sejtek kinyerésére. Saját daganatukkal szemben aktívan immunizált betegek perifériás vérében bőségesen találhatók ilyen aktivált B-sejtek a klinikai vizsgálatok tanulsága szerint.

A klinikai vizsgálatok azt mutatták, hogy bőrteszttel, bizonyos rákfajtákban szenvedő betegek kezelésekor megfelelő immunválasz mutatható ki késleltetett, bőrön észlelhető túlérzékenység formájában. így, immunizált betegek saját vastag- és végbél rákjukra késleltetett, bőrön jelentkező túlérzékenységgel reagáltak. Ezen túlmenően, az immunizált betegek B-sejtjeiből származó monoklonális antitestek más betegek azonos szövettípusú daganataival is reagáltak. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a betegeknél jelentkező humorális immunválasz, az antitest termelés, nem egyedül az immunizált beteg saját daganatával, hanem általában a vastagbél-, végbélrákkal szemben fellépő reakció. Ez az átlalánosan jelentkező immunválasz különösen a standardizált vakcina kifejlesztése szempontjából fontos.

Maga a kezelés is nagyon hatásosnak bizonyult. Az első betegek immunizálása után 42 hónappal tényleges és szignifikáns javulás következett be mind a sebészeti beavatkozást követő panaszmentes periódus hosszát, mind a túlélési adatokat illetően. 20 kezelt beteg közül csak háromnál volt kiújult panasz és egyikük sem halt meg. Ugyanakkor a kontrollcsoportokban 20 beteg közül 9 betegnek újult ki a panasza és négyen meghaltak.

Tumorsejtantigének, főként sejtfelületi antigének iránt specifikus reaktivitást mutató antitesteket termelő

B-sejtek képződése szintén olyan kedvező eredmény, amelyre vonatkozólag legfeljebb spekulatív feltevések voltak az immunázicós kísérletek kezdetén. A humán immun izációs eljárásokat megalapozó állatkísérleteknél ugyanis csak az immunizációs kezelés eredményét mérték, illetve kísérték figyelemmel, a daganatspecifikus antitestképződést azonban nem.

Az általános immunválasz, amelyet a kísérleti alany állapotának javulása kísért, egyúttal a sejten belüli immunválasz jele is volt, amely abban állt, hogy a daganatsejt-antigének jelenlétében aktiválódott makrofágok és T-sejtek elpusztították a tumorsejteket. Noha az a legtöbb esetben előre megjósolható, hogy az immun izáció antitestválaszt vált ki, az antitesten és sejten belüli válasz időbeli lefolyása legtöbbször különböző.

A setjen belüli és a humorális immunválasz egymástól függetlenül is bekövetkezhet. így például előfordulhat, hogy a humorális válasz kifejezetté válik, és ugyanakkor celluláris immunitás nem észlelhető. Vagy fordítva: minimális antitestválasz ellenére is erős sejten belüli immunitás, főként késleltetett, bőrön jelentkező túlérzékenység fejlődhet ki.

Éppen ezért meglepő volt, hogy az aktív immunterápiára pozitívan reagáló egyedek egyúttal tumorspecifikus antitesteket, különösen setjfelületi antitesteket termelő B-sejtek forrásai is.

A találmány tárgyát képezi továbbá a standardizált vakcina előállítása, mellyel a lakosság bizonyos rákfajták vonatkozásában általánosan kezelhető és diagnosztizálható anélkül, hogy egyedi, „testre szabott” immunogén preparátumra lenne szükség egyes beteg számára. Standardizált vakcina hiányában ugyanis minden beteg csak a saját tumorszöveteiből preparált vakcinával volna kezelhető, illetve csak limitált számú, már diagnosztizált rákbeteg kezelésére volna lehetőség nagyobb intézményekben. Semmiképpen sem volna azonban lehetőség arra, hogy az Egyesült Államokban évenként felismert, közel 139 000 végbél-, illetve vastagbélrákos beteg mindegyike számára egyedi preparátumot állítsanak elő.

A találmány kiterjed az aktív specifikus immunizációra alkalmas vakcina előállítására, az immunizált Bsejtek extrakciós eljárásaira, illetve a monoklonális antitestet termelő sejtek, továbbá a monoklonális antitestek előállítására. E célból a rosszindulatú daganatos sejteket enzimesen feltárják. Az így kapott sejteket tumort nem képező, de megfelelően életképes tumorsejtekké alakítják, amelyeket azután vakcina formájában adnak be ugyanannak az alanynak, akitől a tumor származott. A beoltott személytől előre meghatározott idő elteltével perifériás vérből számlázó B-sejteket vesznek, ezeket mielóma sejtekkel egyesítik, és így monoklonális antitesteket termelő sejteket kapnak, majd ezeket a fuzionált sejteket immunglobulin szintézisre való képesség szempontjából szkrinelik. Azokat a sejteket, amelyek immunglobulint szintetizálnak, tovább vizsgálják olyan szempontból, hogy termelnek-e a malignus szövetre jellemző antigénnel reagáló antitesteket. Az így szelektált sejteket tenyésztik tovább,

HU 209 519 Β hogy azzal a tumorral, amelytől a kísérleti alany szenved, reagáló monoklonális antitesteket nyerjenek.

A jelen találmányt eredményező kutatásban hibridómák előállítására egér mielóma sejttenyészetet használtunk. Azonban mihelyt sikerül olyan könnyen növeszthető humán mielóma sejtvonalat kifejleszteni, amely saját antitestet nem termel, akkor a találmány szerinti hibridómák előállítására a humán mielóma lesz az előnyös.

A találmány megvalósításához a következő kulcskérdések megoldása szükséges:

1. Aktív, specifikus immunizáció eléréséhez szükséges vakcina előállítási és alkalmazási feltételeinek kidolgozása, éspedig:

Daganatsejtek, melyeket a szövetből enzimatikus disszociáció útján, teljes sejtek alakjában nyernek ki, majd fagyasztásos tartósítással és röntgenbesugárzással tumort nem képező sejtekké alakítanak.

Adjuváns, mely egy olyan immunmodulátor, amely a daganatsejtekkel szemben az immunválaszt kiváltó képességet előidézi.

Komponensek és beadásmód, beleértve az optimális daganatsejtdózist, az adjuváns: tumorsejt arányt és a vakcina beadási rendjét.

Beteg, akinél az oltást követő első 21 napban az oltás helyén regionális nyirokcsomóduzzanat képződik.

2. Annak tisztázása, hogy a betegből (donorból) mikor és hogyan lehet immunizált B-sejteket extrahálni.

3. Hibridómák, transzformált limfociták termelési módjainak, valamint a monoklonális antitesttermelés körülményeinek tisztázása.

Emberi rosszindulatú daganatok feltárását több különböző enzim-preparátummal is sikeresen el tudtuk végezni. A disszociált tumorsejteket az 1 g szövetből nyert sejtek száma, a kinyert sejtek típusa, életképessége, mérete és sterilitása szempontjából teszteltük.

Az aktív specifikus terápia elérését biztosító vakcinajellemzőit a következő 1. táblázat mutatja.

1. táblázat

Aktív specifikus immunterápiában alkalmazható vakcina adatai

Adjuváns

a) BCG (Bacillus Calmette-Baerin, adjuvánsként az attennált formát alkalmazzák) (Phipps, Tice, Connaught); liofilizált, fagyasztott; dózisfüggő hatás 10⁶ sejt fölött (10⁷-10⁸),

b) Corynebacterium parvum (Wellcome Labs); dózisfüggő hatás 7 μg felett (70-700 pg).

Daganatsejtek

a) Enzimatikus disszociáció

1. Kollagenáz-1 enzimmel (1,5-2,0 E/ml Hanksoldat) (HBSS, lásd Proc. Soc. Bioi. Med., 1949, 71, 106. old.)

2. Dezoxi-ribonukleinázzal (450 D. E/ml Hanksoldat).

3. Műveleti hőfok: 37 °C, keverés közben.

b) Fagyasztásos tartósítás

1. Szabályozott sebességgel (-1 °C/perc) történő fagyasztás (7,5% dimetil-szulfoxid, 5% humán szérumalbumin, Hanks-oldat).

2. Életképesség 80%.

c) Röntgen besugárzás

12000-20000 rád sugárdózissal átalakítás tumort nem képzővé.

Komponensek és beadásmód*

a) Optimális adjuváns - daganatsejt arány 10:1 és

1:1 között.

b) 10⁷ daganatsejt (optimum).

c) 2-3 alkalommal intradermális oltás egyhetes szünetekkel. A 3. oltásnál a vakcina adjuvánst nem tartalmaz.

* Adott esetben a BCG-fertőzés megelőzésére izoniazid.

Kemény daganatos rákbetegségben szenvedő alanyoktól daganatszövetet vettünk, hogy az adott daganat kezeléséhez antitesteket állítsunk elő. A tumorszövetet sebészeti úton távolítottuk el, elválasztottuk a nem-tumoros szövetektől és apróra vagdaltuk. A 2-3 mm átmérőjű vagdalt tumorszövet fragmensméretet megfelelőnek találtuk. A fragmenseket enzimoldatban való inkubálással tártuk fel, így szabaddá váltak az egyes daganatsejtek.

Feltárás után a kapott sejteket összegyűjtöttük, megszámoltuk és életképesség szempontjából teszteltük. Tripánkék festés segítségével végzett kizárásos teszttel elfogadható biztonsággal lehetett a sejt életképességet vizsgálni. A daganatsejteket fagyasztással tartósítottuk és folyékony nitrogénben tároltuk.

Injekciós vakcina készítéséhez a fagyasztással tartósított sejteket gyorsan felolvasztottuk, hígítottuk, Hanks-oldattal mostuk, újra szuszpenzióba vittük, megszámláltuk és életképességüket megállapítottuk.

Az életképes daganatsejteket besugárzással tumort nem képzővé alakítottuk. 4020 rad/perc aktivitású besugárzással adott 20000 rád összsugárdózis további tumort nem képező, de életképes tumorsejteket eredményezett. A Hanks-oldatban lévő szuszpenzió térfogatát úgy állítottuk be, hogy a próbacsőben 10⁷ életképes tumorsejt legyen. A sejteket centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítottuk, és 0,1 ml-ben 10⁷ életképes BCG-t adtunk hozzá. A végtérfogatot Hanks-oldattal 0,2 ml-re állították be. A harmadik vakcina hasonlóan, de BCG hozzáadása nélkül készült.

A betegek immunizálása

Kemény daganatos rákban szenvedő betegeket, akiknek a daganata ellen antitesteket akartunk előállítani, intra-dermálisan oltottunk be a daganatsejtes vakcinával. Az első két oltásnál 10⁷ életképes daganatsejtet BCG-vel keverten, a harmadik oltásnál csak 10⁷ tumorsejtet tartalmazó vakcinát alkalmaztunk. Egyhetes időközökkel történő oltás bizonyult legmegfelelőbbnek ahhoz, hogy a beteg perifériás nyirokszerveiben levő limfociták antitest termelését előidézzük.

Az immunizált B-sejtek összegyűjtése

Az egyes oltások után 1-1 héttel vénás vért vettünk az immunizált betegektől, abból a perifériás vér eredetű limfocitákat hibridóma termelés céljára izoláltuk.

HU 209 519 B

A limfocitáknak vérből való izolálására két módot is alkalmaztunk. Az egyik megoldás szerint a mintát kalcium- és magnéziummentes Hanks-oldattal hígítottuk, limfocita leválasztó közegre rétegeztük, centrifugáltuk és a határfelületről a sejteket eltávolítottuk. Az így kapott sejteket Hanks-oldattal hígítottuk, majd granuláltuk. A limfocita granulátumot N-(-2-hidroxi-etilpiperazin)-N’-(2-etán-szulfonsav)-val pufferolt, Dulbecco-szerint módosított Eagle-oldattal (a továbbiakban: DNEM) újra szuszpenzióba vittük, megszámláltuk, életképességre teszteltük (GIBCO Biologics, Grand Island, New York).

A másik megoldás szerint T-limfocitákat rozetta-elrendeződésükre aggregáltunk 2-[(amino-etil)-izotiouronium]-bromid-hidrobromiddal kezelt birka-eritrocitákkal, a kezelés után kapott T-limfocita aggregátumot perifériás vér-eredetű B-limfocitákhoz kevertük, a keveréket cenrifugáltuk, és a kapott granulátumot jégen inkubáltuk. A granulátumot újra szuszpenzióba vittük, limfocita leválasztó közegre (LSM, Litton Bionetics) rétegeztük és az aggregálódott sejteket centrifugáltuk. A határfelületen összegyűlt, és T-sejtek által legyengített perifériás nyirokszervi eredetű limfocitákat mostuk és granuláltuk. A B-sejtekben feldúsult perifériás vér eredetű limfocitákat számlálás és életképességi vizsgálat után hibridómák előállítására használtuk.

Daganattal szemben alkalmazható monoklonális antitesteket termelő' humán hibridómák előállítása

Perifériás vér eredetű limfocitákat és tenyészetből nyert mielómasejteket összekevertünk, granuláltunk és szérummentes tápközegben szuszpendáltunk. A granulálási polietilén-glikol hozzáadásával, a szuszpenzió készítést HT-tápoldattal (20% borjúembrió-szérumot, hipoxantint és timidint tartalmazó DNEM) végeztük, majd a kapott preparátumot mikro-térfogatú tenyésztőedényekbe osztottuk szét. 24 óra elteltével HAT-tápoldatot (amino-pterint tartalmazó HT-oldat) adtunk minden tenyésztőedénybe, és a közeg felét 3 naponként erre a tápoldatra cseréltük. A sejttenyésztést 14 napig HAT tápoldatban, további két hétig HT tápoldatban és ezt követően 20% borjúembrió-szérumot tartalmazó DNEM-tápoldatban végeztük.

Standard enzimes immunvizsgálattal előzetesen szkrineltük a hibridómákat, hogy azok szintetizálnak-e humán immunglobulint. Azokat a hibridómákat, amelyek elegendő mennyiségben szintetizáltak humán immunglobulint, ezután szöveteken teszteltük úgy, hogy bizonyos szövetmintákat a hibridóma felülúszó folyadékával inkubáltunk. Ha az adott felülúszó reagált a tumorszövettel, ez azt jelezte, hogy a kérdéses tenyésztőedényben levő hibridóma, melyből a felülúszó származott, tumorspecifikus antitesteket termel. Ha ugyanez a felülúszó normális szövetmintával kiteqedt szkrinelés után sem reagált, akkor a kérdéses tartályban lévő hibridómákat tumorspecifikusnak tekintettük. Ezeket a tumorspecifikus hibridómákat karcinoembrionális antigénnel szemben tovább teszteltük, hogy bizonyos legyen, hogy a specifitás szűk határok között érvényesül.

A hibridómákon kívül transzformált humán B-sejteket (diploid sejtek) is előállítottunk a fenti eljárással, és ezek szintén tumorspecifikus antitesteket termeltek. A transzformált B-sejtek tesztelése ugyanúgy történt, mint a tumorspecifikus antitesteket termelő hibridómáké. Azaz, azokból a tartályokból vett felülúszók, amelyek daganatszövettel pozitívan, és normál szövettel, illetve karcioembrionális antigénnel szemben negatívan reagáltak, akár hibridómákat, akár transzformált B-sejteket tartalmazhattak. A két sejttípust kromoszómaszám alapján különböztettük meg: a transzformált B-sejtek 46 humán kromoszómát, a hibridómák ennél több kromoszómát tartalmaztak, s ezek nem mind humán típusú kromoszómák voltak.

Az eljárás folyamán létrejött transzformált B-sejtek képződési mechanizmusa még nem teljesen tisztázott.

Az ábrák rövid ismertetése

Az 1A ábra XI600 hibridómákra jellemző növekedési típusba tartozó sejt kromoszómaszerelvényét mutatja. LiCo 21B27-et 2 órán át colcemiddel (0,05 μg/ml) együtt inkubáltuk, majd 3 percig hipertóniás (0,075 M) kálium-kloriddal kezeltük, ezután a sejteket 3:1 arányú metanol-ecetsav eleggyel fixáltuk, mikroszkóp tárgylemezére cseppentettük, levegőn szárítottuk és Giemsa-festékkel megfestettük. Humán és egérkromoszómák együtt láthatók.

Az 1B ábrán X270-es sejtvonal által termelt (LiCo 1815), csokorszerűen rendeződött monoklonális antitestek fáziskontrasztos fénymikroszkópos képe látható. Figyelemre méltó a sejtek szabálytalan alakja és aggregációja.

Az IC ábra az 1D ábra szerinti X1360-as sejtvonal Gcsoportos kromoszómaszerelvényét mutatja. Figyelemre méltó, hogy a kromoszómák között nincs egérkromoszóma. A sejteket egy éjszakán át 0,01 ^g/ml colcemid jelenlétében inkubáltuk. A kromoszómaszerelvényt a fenti módon állítottuk elő, festetlen tárgylemezen 10 napig érleltük. A kromoszómákat 30 percig szobahőmérsékleten tripszinnel (0,19%) kezeltük, etanollal víztelenítettük, majd Giemsa-festékkel megfestettük.

Az 1D ábra formaiinnal (10%) rögzített, paraffinba ágyazott vastagbéldaganat metszet és LiCo 16-88 (4 gg/ml IgM, X380) reakciójában keletkezett sejtvonalat mutatja. Felületre és citoplazmára jellemző festődés is mutatkozik. A metszetet paraffinmentesítettük, szobahőmérsékleten 20 percig 7,3 pH-értékű, 0,75 M L-lizint és 1% borjúszérum-albumint tartalmazó foszfát pufferrel tompított sóoldattal (PBS) blokkoltuk és egy éjszakán át 4 °C-on LiCo 16-88 jelelenlétében inkubáltuk. Ezután a metszetet PBS-oldattal mostuk, és 60 percig 37 °C-on affinitás szempontjából tiszta perixidázzal jelzett, humán immunglobulinokra (IgG + IgA + IgM) specifikus kecske-antitesttel inkubáltuk. Ezután a preparátumot mostuk, 15 percig szobahőmérsékleten 7,6 pH-értékű és 0,1% hid6

HU 209 519 B rogén-peroxidot tartalmazó PBS-oldatban 0,5 mg/ml diamino-benzidinnel reagáltattuk, A metszetet hematoxilinnel megfestettük, víztelenítettük és derítés után mikroszkóp tárgylemezén agglutináltuk.

Az 1E ábra az 1D ábrához hasonlóan vastagbéltumorral reagáltatott normál humán immunglobulint (IgM, 4 pg/ml, X380) mutat. Festődést nem észleltünk.

Az 1F ábra LiCo 16-88 (X640)-val megfestett, fagyasztott vastagbél tumormetszetet mutat. A tumorsejtek szélén, a nyilakkal jelölt helyeken intenzív festődés látszik. A metszetet levegőn szárítottuk és -30 °C-on tartottuk. Az így kezelt metszetet utólag 4 °C hőmérsékleten 20 percen át foszfát pufferrel tompított sóoldatban (PBS) 0,5%-os paraformaldehiddel, amely 0,075 mól L-lizint és 0,01 mól nátrium-peroxidot tartalmaz (a továbbiakban a rögzítő oldat neve: PLP), rögzítettük, és a továbbiakban az 1D ábránál leírt módon jártunk el, azzal az eltéréssel, hogy humán μ nehézláncra specifikus, peroxidázzal jelzett kecske antitestet használtunk.

Az 1G ábra az 1F ábránál leírt fagyasztott vastagbél tumormetszet és normál humán immunglobulin (X640) reakciójának eredményét mutatja. A daganatsejteken festődés nem észlelhető.

Az 1H ábra LiCo 16-88 (4 pg/ml; X280)-val megfestett SW1463 sejtek rögzítetlen, levegőn szárított és citocentrifugált (citospin) preparátuma látható. A vastagbéltumor sejvonalat 0,02%-os etilén-diamin-tetraecetsavval kezeltük, mostuk és 1% borjúszérumalbumint tartalmazó tápoldatban szuszpendáltuk. A sejteket (2xl0⁴/0,l ml) citocentrifuga segítségével üveglemezekre tömörítettük, levegőn szárítottuk és -30 °C-on tartottuk. A kapott sejteket monoklonális antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten, majd egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten inkubáltuk, mostuk és a továbbiakban a fent leírt módon jártunk el.

A 2. ábra paraffinba ágyazott vastagbéltumor metszet antigén megoszlását mutatja. 15 daganatmetszetet tízféle monoklonális antitesttel reagáltattunk, és a diagramon beárnyékolt területtel jeleztük azokat az eseteket, melyeknél pozitív, indirekt immunperoxidáz színeződés volt észlelhető.

3. ábra két monoklonális antitest a vastagbél-, illetve végbéltumorok többségével reagált. A két monoklonális antitest és a 15 daganatsejt metszet reakciójának eredményét mutatja az ábra 9 betegtől származó tumordisszociátum levegőn szárított citospin preparátumával összehasonlításban. A beárnyékolt területek itt is a pozitív, indirekt peroxidáz-festődéses eseteket jelzik.

A 4. ábra azt mutatja, hogy az aktív, specifikus immunterápiás klinikai kísérletekben részt vett immunizált betegek, illetve a kontrollcsoport tagjai között milyen volt a tumor helye, illetve a betegség stádiuma szerinti megoszlás.

Az 5A ábra az összes beteg tünetmentes periódusait mutatja.

Az 5B ábra az összes beteg túlélési adatait mutatja.

A 6A ábra azoknak a betegeknek a tünetmentes peródusait mutatja, akiknél regionális nyirokcsomó megnagyobbodást észleltünk (AstlerColler C).

A 6B ábra azoknak a betegekben a túlélési adatait mutatja, akiknél regionális nyirokcsomó megnagyobbodást észleltünk (Astler-Coller C).

A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük.

/. példa

Immunizált B-sejtek előállítása

A) A beteganyag megválasztása

Az aktív-specifikus immunterápia randomizációs rendszerű kipróbálására vastagbélrák, illetve végbélrák műtéti eltávolítására váró betegeket választottunk. A randomizáció a betegség stádiuma szerinti rétegeződés alakján történt, és a tumort mindazon betegekből eltávolítottuk, akik a klinikai feltételeknek megfeleltek. A terápia kipróbálására jelentkezett betegeknek nem volt rákos előzményük, korábban sem kemoterápiás, sem sugárkezelésben nem részesültek és egészségi állapotuk megfelelő volt ahhoz, hogy járóbetegként legyenek kezelhetők. Kísérletre alkalmas betegnek tekintettük azokat, akiknek a daganata a bélfalon átterjedt (AstlerColler B2), akiknél duzzadt a nyirokcsomó (Cl és C2 stádium) vagy akiknek áttételük volt (D stádium). Besorolási kategóriájukon belül a betegeket randomizációs rendszer szerint osztottuk be a kezelt vagy a kontrollcsoportba. A randomizációs kártyákat computerrel fejlesztettük és minden kategóriából a műtétet követően húztuk ki a kártyákat.

B) Daganat-preparálás

A beteg bélrészletet a sebészeti eltávolítás után azonnal a kórház pathológiai osztályára vittük és ott steril körülmények között felnyitottuk. A daganatos szövetet kimetszettük, 50 pg/ml gentamicint tartalmazó Hanks-oldattal töltött steril csövekbe tettük és bejegelve azonnal a laboratóriumba vittük feldolgozásra és fagyasztásra.

C) A kemény daganat és a bélnyálkahártya disszociációja

Peters és munkatársai [Cancer Research, 39, 1353— 1360., (1979)] szövet-disszociációs módszerét alkalmaztuk, mindvégig steril technikát használva, lamináris áramlású elszívó alatt dolgoztunk. A szöveteket gentamicint és Hanks-oldatot tartalmazó centrifuga csövekben háromszor átöblítettük, majd jegelt Petricsészébe tettük. A daganatról a külső szövetet szikével eltávolítottuk, és a tumort 2-3 mm átmérőjű darabokra aprítottuk. A szövetdarabokat 37 °C-ra előmelegített 0,14% (200 egység/ml) kollagenáz-l (Sigma C-0130)

HU 209 519 B és 0,1% (500 Kunitz-egység/ml) dezoxiribonukleáz-1 enzimet tartalmazó 20-40 ml oldattal töltött 75 ml-es lombikba tettük (Dezoxiribonukleáz-1, Sigma D-876). A lombikokat 37 ’C-os vízfürdőn bemerülő mágneses keverővei kevertük úgy, hogy a keverés sebessége megfelelően intenzív legyen, de habzást ne okozzon. 30 perces inkubáció után a szabaddá vált sejteket háromrétegű steril, közepesen nedvesített nejlon szitán át (166t: Martin Supply Co., Baltimore, Maryland), 50 ml-es centrifuga csövekbe dekantáltuk. A sejteket hűtött centrifugával (1200 furdulat/perc; 250 g) 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót leöntöttük és a sejteket

5-10 ml 0,1% dezoxiribonukleázt tartalmazó Hanksoldatban 5-10 percig, 37 ’C hőmérsékleten tartottuk. A csöveket ezután Hanks-oldattal feltöltöttük, centrifugálással mostuk, majd 15 ml jegelt Hanks-oldattal újra szuszpenzióba vittük. A folyamatot addig ismételtük míg elegendő tumorsejtet kaptunk (általában 3 ismétlés tumorsejtek esetében). A különböző enzimes feltárásokból származó sejteket egyesítettük, megszámláltuk és életképesség szempontjából tripán-kéket alkalmazó kizárásos teszttel megvizsgáltuk. A sejteket a fagyasztásos tartósítás előtt még egy utolsó alkalommal mostuk a centrifugában.

D) Fagyasztásos tartósítás

Az optimális fagyasztásos tartósítás kulcsfontosságú kérdés. Vakcina előállításához 5-8xlO⁷ disszociált tumorsejt/1 ml Hanks-oldat koncentrációt állítottunk be, és egyenlő térfogatú részleteket adtunk a hűtött, kétszeres mennyiségű fagyasztó közeghez, amely 15% dimetilszulfoxidot és 4% humán szérumalbumint tartalmazott. A2-4X10⁷ sejt/ml végkoncentrációjú szuszpenziót 1,2 ml-es Nunc-féle fagyasztó fiolába tettük. Késleltetett, bőrön jelentkező túlérzékenység teszteléséhez a sejteket ugyanígy preparáltuk, azzal az eltéréssel, hogy a fagyasztó közeg humán szérumalbumint nem tartalmazott. Mindkét célra készült preparátumot fagyasztáskor Nunc-fiolában, jegelten 990 típusú Cryo-Med biológiai fagyasztó készülékbe tettük, amely 700-as típusú szabályozóval és 500-as típusú hőmérsékletregisztráló egységgel van ellátva a szabályozott sebességgel végrehajtható fagyasztás érdekében. Ügyeltünk rá, hogy az egyes fiolák, beleértve a jelzőampullát (monitor vial) is, induló hőmérséklete a fagyasztás megkezdésekor egyforma legyen. A fiolákat -1 °C/perces szabályozott ütemű hűtéssel -80 ’C hőmérsékletre hűtöttük le. A fiolákat folyékony nitrogénben szállítottuk a tárolóba, ahol folyékony nitrogénben tartottuk azokat.

E) A klinikai kezelés leírása

Az azonos patológiai stádiumban levő tumoros betegek randomizációs rendszerben kerültek vagy abba a betegcsoportba, amely saját tumorsejt és BCG kombinációját kapta vakcinában, vagy abba a csoportba, amely további kezelést nem kapott. Minden D-stádiumban levő beteg részesült 5-fluor-uracilos kemoterápiás kezelésben, és minden olyan beteg, akinél a kóros elváltozás a hashártya alatti testtájra lokálizálódott (végbélrák), részesült medence besugárzásban (5040 rád) két héttel azután, hogy az immunterápia befejeződött. A vakcina beadást a tumor kivétel után 4—5 héttel kezdtük meg, hogy elegendő idő álljon rendelkezésre ahhoz, hogy az altatás és sebészeti beavatkozás által megzavart immundrendszer egyensúlya helyreálljon.

3-4 héttel a műtét után mind a kontrollcsoportba, mind a kezelt csoportba tartozó betegek bőrteszten estek át (standard memória-antigén-teszt és emelkedő dózisban saját tumorsejt-teszt). A következő memória-antigéneket használtuk: Mumps bőrteszt antigén, USP, Eli Lilly, Indianapolis, Indiana; Aplisol, (Tuberculin, tisztított fehérjeszármazék), Parker-Davis, Detroit, Michigan; Trichophyton, 1: 30 arányban hígított, Center Laboratories, Port Washington, New York; és Candida albicans, 1:100 arányban hígított, Center Laboratories, Port Washington, New York. A felsorolt standard készítményekből 0,1 ml-t az alkaron levő bőrbe juttattuk és a beadás helyét a 24. és 48. órában bőrpír és keménység szempontjából vizsgáltuk.

A kezelt csoportba tartozó betegek 3 hetenként bőrbe adott injekcióban olyan vakcinát kaptak, amelyek közül az első két alkalommal adott vakcina 10⁷ sugárkezelt saját tumorsejtet és 10⁷ BCG sejtet, harmadik alkalommal adott vakcina pedig csak 10⁷ tumorsejtet tartalmazott. A dr. Ray Cripsentől kapott, frissen fagyasztott Tice BCG-preparátumot (University of Illinois Medical Center, Chicago, Illionis) -70 ’C-on tároltuk. Az első vakcinát a bal comb elülső részébe, körülbelül 10 cm-rel az ágyékhajlat alatt, a másodikat a jobb comb azonos helyére és a harmadikat a jobb vállízületi tájékra adtuk be.

F) A vakcina előállítása

Azon a napon, amikor az első és a második oltás történt, a fiolát 37 ’C-os vízfürdőn gyorsan felolvasztottuk, a tumorsejteket Hanks-oldattal lassan 15 ml-re hígítottuk, 1200 fordulat/perc sebességű centrifugálással egyszer mostuk, és 15 ml Hanks-oldattal újra szuszpendáltuk, majd sejtszámlálást végeztünk és tripán-kék alkalmazásán alapuló kizárásos teszttel a sejtek életképességét megvizsgáltuk. Az életképesség 70-90% között mozog, azaz átlagosan 80%. A sejteket centrifugálás közben egyszer mostuk (1200 fordulat/perc), és 15 ml Hanks-oldattal újra szuszpendáltuk. A daganatsejt szuszpenziót jégre tettük, 20 000 rád összsugárdózis eléréséig 4020 rad/perc sebességgel besugároztuk. A sejtszuszpenzió térfogatát úgy állítottuk be, hogy a cső 10⁷ életképes sejtet tartalmazzon (l,3xl0⁷ életképes sejt volt a tényleges induló érték, hogy a csőben és fecskendőben visszamaradó sejteket, valamint a limfoidsejtek esetleges téves azonosításából adódó mintegy 20%-os veszteséget kompenzálják). A sejteket centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítottuk és a sejtekhez 10⁷ BCG-t adtunk 0,1 ml térfogatban. A végtérfogatot (0,2 ml) Hanks-oldattal állítottuk be. A harmadik vakcina hasonlóan, de BCG hozzáadása nélkül készült.

A vakcina szuszpenziót 20-as méretű tűvel 1 ml-es tuberkulin-fecskendőbe szívattuk, majd az intrakután injekcióhoz a 20-as tűt 27-esre cseréltük, és a fecskendőt jégen tartva szállítottuk a klinikára.

A betegeket minden vakcinabeadás után alapos megfigyelés alatt tartottuk; figyeltük az injekció helyén

HU 209 519 Β jelentkező bőrpírt és keményedést, észrevételezték az esetleges lázat, nyirokcsomó-nagyobbodást és bármely kedvezőtlen reakciót. Két hét elteltével az első két injekció helyén fekély képződött, ez azonban 10-12 hét alatt minden esetben meggyógyult.

G) Az immunizáció eredményei

Standard memória-antigénekkel szembeni reakció Kezdetben minden beteg legalább egy standard memória-antigénre pozitívan reagált. A 19-ből kettő candidára, 26 mumpsra, 16 tuberkulinra (tisztított fehérjeszármazék, PDP) és 3 trichophytonra. A reaktivitást illetően a későbbiekben sem volt szignifikáns változás kivéve, hogy PDP-re az immunizált betegek - kettő kivételével - mind pozitívan reagáltak.

H) Tumorsejtekkel szembeni késői típusú bőrallergiás reakció

Az adatokat a 2. táblázat mutatja.

2. táblázat

Késői típusú bőrallergia saját tumorsejtekkel szemben

	Stádium	A betegek száma	Immunizáció előtti reaktivitás*	Reaktivitás 6 hét és/vagy 6 hónap után
Immunizált betegek	B2	8	0	4
C1,C2	9	2	6
D	7	2	6
Összesen (%)		24	4 (17%)	16 (67%)
Nem immunizált betegek	B2	4	1	0
C1.C2	5	0	1
D	2	0	0
Összesen (%)		11	1 (9%)	1 (9%)

* A reakciót akkor tekintettük pozitívnak, ha a 48. órában a keményedés 5 mm-nél nagyobb átmérőjű (2 átmérő átlaga).

A 2. táblázat 24 immunizált és 11 nem-immunizált (kontroll) beteg 10⁶ daganatsejttel szemben mutatott késleltetett, bőrön jelentkező túlérzékenységi adatait foglalja össze. Pozitív reakciónak azt tekintettük, ha 48 óra elteltével a keményedés mértéke az 5 mm-t meghaladta. 24 betegből 4 (17%) már az immunizálást megelőzően is pozitívan reagált a 10⁶ sejttel végzett bőrpróbára. Ez nem különbözik szignifikánsan attól, hogy a nem-immunizált (kontroll) csoportban 11 betegből egy (9%) szintén pozitívan reagált. Az viszont már szignifikáns eredmény (p<0,01), hogy az eredetileg pozitívan reagáló 4, és az eredetileg nem reagáló betegekből 12 reagált, illetve erősebben reagált az immunterápia következő menetében (67% lett pozitív). Ezek közül hét beteget egy év elteltével újra teszteltünk, és közülük háromnál volt pozitív a reakció. A 16 ténylegesen immunizált kezelt beteg közül csak három reagált pozitívan 10⁵ tumorsejtre, és egyikük sem reagált 10⁴ daganatsejtre.

2. példa

Humán monoklonális antitesteket termelő hibridómák előállítása

A) Immunizált B-sejtek kinyerése és feldolgozása

A betegektől a második immunizáció időpontjában (egy héttel az első immunizáció után) és a harmadik oltáskor (egy héttel a második immunizáció után) vért vettünk. A vénás vért aszeptikus körülmények között, 17 egység/ml végkoncentrációjú heparin (O’Neill, Jones és Feldman, St. Louis, Missouri) jelenlétében gyűjtöttük. A vért szobahőmérsékleten tartottuk és a vérvételt követő néhány órán belül laboratóriumba szállítottuk.

A vérmintát 1:2 arányban kalcium- és magnéziummentes Hanks-oldattal hígítottuk, 3 ml limfocita leválasztó közegre (LSM, Litton Bionetics) rétegezténk és 15 ml-es centrifugacsőben 30 percig centrifugáltuk (400 g). A hatásfelületről a sejteket eltávolítottak, Hanks-oldattal háromszorosra hígítottak és granuláltak (10 perc centrifugálás, 1000 fordulat/perc). Aperifériás vér eredetű limfocitákat 10 ml szérummentes, N-(2hidroxi-etil)-piperazin-N’-(2-etánszulfonsav)-val pufferolt DNEM-oldattal újra szuszpenzióba vittük, megszámláltak és életképességüket megvizsgáltuk.

Alternatív megoldásként egy másik módszert is alkalmaztunk immunizált B-sejtek kinyerésére. 2-[(amino-etil)-izotiourónium]-bromiddal (AET) kezelt birka eritrociták segítségével T-limfocitákat aggregáltattank. Alsever-oldatban levő birka eritrocitákat háromszor kiegyenlítő sóoldattal mostunk és 37 °C-on 20 percig a sejttérfogat négyszeresének megfelelő mennyiségű 0,14 mólos AET-oldattal (Sigma) inkubáltak. Az így kezelt sejteket háromszor Hanks-oldattal mostak, majd 10%-os szuszpenziót készítettünk. A kezelt eritrocitákat limfocita leválasztó közegre rétegeztük, 2500 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk, és a granulátumot összegyűjtöttük. Hanks-oldattal háromszor mostuk, a birka-eritrocitákból újra 10%-os szuszpenziót készítettünk hígítatlan borjúembrió-szérummal, és azt két héten belül felhasználtuk. A perifériás vér eredetű limfocitákat (közel 80 millió sejt) AET-reagenssel kezelt 1 ml birka eritrocita szuszpenzióhoz kevertük és 1000 fordulat/perc sebességgel 10 percig, 4 °C-on cenrifugálással granuláltuk. A granulátumot 45 percig jégen inkubáltak, széles szájú pipettával finoman szuszpenzióba vittük és 3 ml limfocita leválasztó közegre rétegeztük. A rozetta elrendeződésben aggregálódott sejteket 40 percig szobahőmérsékleten 400 g értéken centrifugáltak. A T-sejtek által legyengített nyirok vér eredetű limfocitákat a határfelületről összegyűjtöttük, háromszoros térfogatú Hanks-oldattal mostak és granuláltuk. Számlálást és életképességi vizsgálatot követően a B-sejtekben feldúsult nyirok eredetű limfocitákat hibridóma előállítására használtuk.

B) Humán hibridómák előállítása

NS-1 egér-mileómasejteket 20 pg/ml 8-aza-guanint tartalmazó tápközegben tenyésztettünk. 3 nappal a sejtfuzionálás előtt a sejteket granuláltuk és tápközegmentes 8-aza-guaninon tenyésztettük tovább. Egy nappal a fúzió előtt a sejteket újra passzáltak és logarit9

HU 209 519 B musos szaporodási fázisban tartottuk. Amileóma-sejteket szérummentes oldattal mostuk, megszámláltuk és életképességüket meghatároztuk. A nyirok eredetű limfocitákat és a mileóma-sejteket 3:1 arányban összekevertük és 1000 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót gondosan eltávolítottuk és a sejt-granulátumot 100 μΐ-t meg nem haladó térfogatú szérummentes oldattal újra szuszpenzióba vittük. Ezután a cső állandó keverése közben, egy perc alatt, 37 °C-ra előmelegített 1 ml 50%-os polietilén-glikolt adunk a sejt-szuszpenzióhoz. Ezután 1 perc alatt újra előmelegített szérummentes oldatot adunk a sejtszuszpenzióhoz (az előzőleg hozzáadotthoz képest dupla térfogatú mennyiség) mindaddig, míg az 50 ml-es cső megtelik. A sejteket 800 fordulat/perc sebességgel 15 percig centrifugáltuk, és a szemcsés sejttömeget HT tápközegben (20% borjúembrió-szérumot, 13,6 μg/ml hipoxantint és 3,9 μg/ml timidint tartalmazó DNEM) eloszlattuk oly módon, hogy a koncentráció 2,5xl0⁶ sejt/ml legyen (fúzió előtti sejtszám), majd 100 μΐ-es részletekben mikrotiterű sejttenyésztő edényekbe osztottuk szét. 24 óra elteltével minden tenyésztő edénybe 100 μΐ HAT-tápoldatot adtunk (0,18 μg/ml amino-pterint tartalmazó HT-tápközeg). A tápközeg felét 5 naponként friss HAT-tápoldatra cseréltük. 14 nap elteltével a sejttenyészetet HT-tápközegre vittük át további kéthetes tenyésztésre, majd ezután a tenyésztést 20% borjúembrió-szérumot tartalmazó DNEM-tápközegbe folyattuk.

A perifériás vér eredetű limfociták és mileómasejtek együtt-tenyésztésével transzformált diploid B-sejtek is képződhetnek. A perifériás vér eredetű limfocitákat és a mileómasejteket 3 :1 arányban összekevertük, 800 fordulat/perc sebességű centrifugálással granuláltuk és HAT-tápoldatban való tenyésztés után a fent leírt módon szelektáltuk a transzformált sejteket.

C) Ahibridómák szkrinelése

A hibridómák mennyiségének meghatározása után az általuk szintetizált humán immunglobulin izotípusát (IgA, IgG és IgM) állapítottuk meg enzimhez kötött immunszorbens elemzéssel (ELISA). E célból a 10-300 ng/ml koncentrációtartományra érzékeny standard EnzaBead-gyöngyös módszert használtunk. A 0,3-9 μg/ml koncentrációjú hibridóma felülúszókat 1:30 arányban hígítottuk. Miután az antitest izotípusát (IgA, IgG vagy IgM) meghatároztuk, csak azokat a hibridómákat teszteltük szövettenyészetben immunperoxidázos módszerrel, amelyek legalább 1 μg/ml koncentrációban termeltek humán immunglobulint.

Polikarbonáttal bevont Bio-EnzaBead^R (Litton Bionetics) fémgyöngyöket humán immunglobulinokra (IgG + IgA + IgM) specifikus kecske antitestekkel egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltunk, majd - a nem specifikus kötődés elkerülése érdekében - a tenyészetet 30 percig szobahőmérsékleten 2,5%-os 2,2’-azino-di(3etil-benztiazolin-6-szulfonsav)-val gátoltuk. A gyöngyöket levegőn megszárítottuk és 4 ’C-on tartottuk. Az immunglobulin kimutatást ELISA-módszerrel a következőképpen végeztük: 96 tenyésztőedényben levő kultúra felülúszóját hígítottuk, 1 órán át 37 ’C-on az antitestet megkötő gyöngyökkel inkubáltuk, mostuk majd egy órán át 37 °C-on peroxidázzal jelzett, affinitás tekintetében tiszta, humán immunglobulinokra (IgG + IgA + IgM) specifikus kecske antitesttel inkubáltuk. A gyöngyöket mostuk, és 10 percig szobahőmérsékleten 2,2’ -azino-di(3-etil-benztiazolin-6-szulfonsav)-val tovább inkubáltuk, majd 405 nm-nél az optikai sűrűséget meghatároztuk. 30-1000 ng/ml tartományban standard humán gammaglobulinnal felvett kalibrációs görbe lineáris szakaszáról leolvasással és interpolálással határoztuk meg az immunglobulin koncentrációkat. Az 1 pg/ml-nél több immunglobulint tartalmazó felülúszókat ELISA-módszerrel izotípusokba soroltuk peroxidázzal jelzett, humán γ, a és μ láncokra specifikus kecske antitestek segítségével. Ezt követően kvantitatív elemzést végeztünk az antitest izotípusának megfelelő immunglobulin standard segítségével. Egér-immunglobulinokat kecske-antiegér IgG + IgM (nezéz + könnyű lánc)-mel bevont Bio-EnzaBead segítségével és peroxidázhoz kötött kecske-antiegér IgG + IgM (nehéz + könnyű lánc)-mel elemeztünk. Más kísérletekben a felülúszó folyadékokat antihumán Ig-vel bevont gyöngyökkel és peroxidázhoz kötött kecske-antiegér IgG + IgM (könnyű + nehéz lánc) inkubáltuk.

Normális és daganatos, -30 ’C-on fagyasztókamrában tárolt szövetmetszeteket 0,5% paraformaldehidet, 0,075 mól L-lizint és 0,01 mól nátrium-perjodádot tartalmazó fixálószenei 20 percig 4 ’C-on utókezeltünk, majd a metszeteket kimostuk. A 10%-os formaiinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszeteket közvetlenül a felhasználás előtt paraffinmentesítettük. A fagyasztásos és paraffinos eredetű metszeteket ezután 20 percig szobahőmérsékleten 1% boqúszérumalbumint és 0,075 mól L-lizint tartalmazó foszfáttal pufferezett sóoldatban (PBS) inkubáltuk, majd a metszeteket egy éjszakán át 4 ’C hőmérsékleten a hibridómák felülúszóival inkubáltuk. Ezután a szöveteket háromszor PBS-oldattal mostuk, majd a megfelelő, peroxidázzal jelzett, antihumán reagenssel 60 percig 37 ’C-on inkubáltuk, újra mostuk és 15 percig, szobahőmérsékleten 0,5 mg/ml diamino-benzidint és 0,1% hidrogén-peroxidot tartalmazó PBS-oldattal 7,6 pH értéken inkubáltuk. A metszeteket PBS-oldattal mostuk, hematoxilinnel festettük, dehidratáltuk, és mikroszkóp tárgylemezére rendeztük.

Ezek a módszerek széles körű, azaz mind a sejtfelületi, mind a citoplazmában levő antigénekkel reagáló antitest-detektálást tettek lehetővé.

A reakciókészség minél szélesebb körű felismerését lehetővé tevő antitest-izolálás érdekében a felülúszó folyadékokat nagyszámú daganatmetszettel szemben szkrineltük. A monoklonális antitesteket termelő sejtvonalakat limitáló hígítással klónoztuk. 10 betegtől származó perifériás vér eredetű limfocitákkal 22 sejtfúziót hajtottunk végre, és további két sejtfúziót végeztünk még nem-immunizált betegektől származó limfocitákkal. Az eredményeket a 8. táblázatban mutatja.

HU 209 519 Β

8. táblázat

Vastagbélrák- és végbélrák-szövettel reagáló humán monoklonális antitestek izolálása

Immunizáció előtt	A betegek száma	Elemzett mikrote- nyészet	Ig-pozitív sejtvonalak	Szövet-pozitív sejtvonalak	Sejtfelület-pozitív sejtvonaalak	Izotípusd	A tenyészet típusáé
száma	(%)b	száma	(%)	száma	(%)c	IgG	IgM	Diploid	Hibridó- ma
Immunizáció előtt	2	25	4		0	(0%)	0	(0%)	0	0
1.	9	441	65	(15%)	10/65	(15%)	4/10	(40%)	2	8	8	2
2.	10	573	154	(27%)	25/154	(9%)	16/25	(64%)	9	16	16	9
3.	3	112	11	(10%)	1/11	(10%)	0/1	(0%)		1		1

a = Perifériás vér eredetű limfociták vétele 7 nappal az egyes vakcina beadások után b = 1 mg/ml vagy annál több termelt humán immunglobulin esetében ELISA módszerrel mérve c = immunperoxidáz festődés SW1463, HT-29 vagy enzimatikusan disszociált tumorsejt preparátumokon (nem fixált, levegőn szárított) d = izotípusok meghatározása ELISA módszerrel e = diploid sejtek; sejtnövekedés csokorszerű elrendeződésben hibridómasejtek; sejtnövekedés szétszórt sejtek formájában

A táblázatból látható, hogy optimális eredményt olyan limfociták alkalmazása esetén kaptunk, amelyeket egy héttel a második immunizációt követően izoláltunk.

A második immunizáció után kétszer akkora az 25 immunglobulinokat termelő kiónok előfordulási gyakorisága, mint az első immunizációt követően. Fagyasztva tárolt szövetmetszetekkel 36 monoklonális antitest adott pozitív reakciót, s közülük 7 paraffinba ágyazott szövetekkel nem reagált. Ez megfigyelés is 30 azt támasztja alá, hogy széles körű szkrinre van szükség. A kiónok több mint kétharmada, valószínűleg a limfociták eredetéből (perifériás vér) következtében IgM-et termelt.

A setj vonalak egyharmada hibridómákra jellemző 35 morfológiát mutatott és szétszórt sejtek formájában növekedett. Hat kiválasztott hibrid analízise alapján azok ember-egér heterohibridómáknak bizonyultak (1A ábra). Ezzel ellentétben, a sejtvonalakat szintetizáló monoklonális antitestek többsége (24 és 36-ból) morfoló- 40 giai szempontból atipikus (1B ábra). E sejtek zöme szabálytalan alakú és nagy aggregátumok alakjában növekedett. Ezeket a csokorszerű alakzatban növekedő sejteket 10 vastagbél rákbeteg közül 7-nek a perifériás véréből nyert limfocitákkal végzett hét fúziós kísérlet 45 alkalmával izoláltuk. Ezek tehát gyakorinak tekinthetők. Négy betegtől származó limfocitákkal végzett 5 sejtfúziós kísérletnél kapott 6 sejtvonalat elemezve, ezek mindegyike 46 kromoszómát tartalmazott. A kromoszómák G-csoportos elrendeződése is azok humán 50 eredetét igazolja (IC ábra). Tehát, sejt-morfológiai jellemzők alapján a monoklonális antitesteket termelő sejtvonalak többsége nem hibridóma, hanem transzformáit humán B-sejtnek (diploid sejtnek) tekinthető. A spontán transzformáció mechanizmusa nem ismeretes, 55 de az immunizációs folyamattal kapcsolatos lehet.

A kiválasztott immunglobulin izotípusa és a szövetfestődés jellege tekintetében a két sejtféleség között nincs jól elhatárolható különbség. A két sejttípus által kiválasztott immunglobulin mennyisége is összemér- 60 hető (1-60 gg/ml), és a humán sejtek legtöbbje 220 gg/ml-t termel. Mint az várható volt, a diploid sejtek immunglobulin termelése állandóbb. Ezeket a sejteket egészen 9 hónapig tenyésztettük folytonos kultúrában anélkül, hogy az antitest termelés csökkenő vagy befejeződésre utaló tendenciát mutatott volna. Sőt néhány diploid sejtvonal hosszú időn át fenntartott tenyészetében nőtt az antitest termelés. Azok a kiónok, amelyek a sokszoros setjpasszálás során nem-termelővé váltak, hibridómákra jellemző tulajdonságokat vettek fel. Azonban a legtöbb hibrid elegendően stabil volt ahhoz, hogy hasznosítható mennyiségben termeljen antitestet. így például a 7a2 humán-egér heterohibridómát több mint 20 generáción át passszálással fenn tudtuk tartani egy, az utóbbi időben klónozott 5xl0⁶ sejtet tartalmazó oltótenyészetből kiindulva anélkül, hogy az antitest termelés csökkent volna. így a sejtek száma elvben 7xl0¹³ sejtre növelhető. Ez a hibrid közel 30 pg/ml/lO^ sejtet termel, 7xl0¹³ sejt tehát 2 kg-ot meghaladó mennyiségű antitestet hozhat létre.

D) Monoklonális antitestek termelése

Humán monoklonális antitestek termelő sejteket

10% borjúembrió-szérum, 3 mmól L-glutamin és 5 pg/ml gentamicin adalékot is tartalmazó RPMI1640 táptalajon (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) tenyésztettünk. Néhány esetben még 25% D-glukóz adalékot (0,25%-os végkoncentráció) is adtunk a táptalajhoz. A sejteket 37 °C körüli (35-38 ’C) hőmérsékleten, 7,5% széndioxidot tartalmazó nedvesített levegő atmoszférában tenyésztettük. A nagymértékben metabolizált, kimerült táptalajtól a képződött antitestet például 15 percig tartó 500 fordulat/perc sebességű centrifugálással választjuk el, amikoris a granulált táptalaj sejtmentesen különül el.

3. példa

A monoklonális antitestek normális és daganatszövettel szembeni reakciókészsége Az antitestek többsége lényegében csökkent mértékben kötődött normális vastagbél-nyálkahártyához. A

HU 209 519 B paraffinos metszetekkel reagáló antitesteket normális emlő-, tüdő-, epehólyag- és májszövettel szembeni reaktivitás tekintetében is vizsgáltuk, és a vizsgálat eredménye negatív volt.

betegtől származó vastagbél-, illetve végbéladenokarcinóma metszettel szemben 10-féle humán monoklonális antitest reaktivitás típusát a 2. ábra mutatja. A tesztelt antitestek reaktivitását szemléltető mátrix szerint az egyes antitestek a vizsgált daganatfajták 47-80%-ával reagáltak. Egyetlen olyan antitest sem volt, amely mind a 15 tumorral reagált volna. A szövetmetszetek reaktivitása donoronként változó. Volt olyan donor, akinek a szövetmetszetei mind a 10 antitesttel, és volt olyan, akinek a szövetmetszetei csak 1-2 antigénnel reagáltak. A monoklonális antitestek reaktivitást tesztjeihez használt szövetminták más donoroktól származtak, mint az eredeti sejtfúzióhoz használt humán B-sejtek.

A tesztelt tumorokat patológiai stádium szerinti csoportosításban a monoklonális antitestekkel szemben mutatott %-os reaktivitás szempontjából vizsgálva azt találtuk, hogy a mérsékelttől a jól differenciálódott adenokarcinómás daganatok mutatták a legszélesebb körű reaktivitást, a ritkábban előforduló, alig differenciálódott adenokarcinómás szövetek pedig általában nem reagáltak. Az áttételes daganatos szövetekkel az antitestek tipikusan reagáltak.

A LiCo 16-88 jelű, előzőek szerint előállított egyik monoklonális antitest reakcióba lépett egy, a paraffinba ágyazott vastagbél-, illetve végbélrákos szöveti metszetben konzerválódott olyan antigénnel, amely normális vastagbél-nyálkahártyán nem, vagy igen ritkán fordul elő. A citoplazmában jelentkező festődés mellett ezeken a tumorsejteken felületre jellemző festődés is mutatkozott (1D ábra). Ez a kötődés specifikus, mert az antitest-koncentráció és izotípus tekintetében hasonló normális immunglobulin esetében ilyen festődés nem volt észlelhető. Ugyancsak említésre méltó az a megfigyelés, hogy ez az antitest mind primer, mind áttételes daganatokkal reagált. A LiCo 16-88 antitest fagyasztott metszetekkel is reagált. Mint azt az 1E ábra mutatja, LiCo 16-88 antitesttel a tumor sejtek szélein intenzív festődés közben reagált a normális humán immunglobulinnan viszont nem (1F ábra).

A humán eredetű monoklonális antitest fő előnye az egér eredetűhöz képest az in vivő diagnosztizálás és gyógykezelés esetén mutatkozik meg. Ezt megelőzően a daganatos betegek tumoraiból izolált humán monoklonális antitesteknek kevesebb mint 1%-a reagált sejtfelületi antigénekkel [Cote és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci., 80., 2026-2030. (1983)]. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a rákbetegek a tumorsejtek felületi antigénjeivel szemben toleránsak lehetnek. Éppen ezért jelentős az a megfigyelés, hogy az immunizált betegektől izolált szövet-pozitív antitestek fele a későbbiekben a tumorsejtek felületén kötődött meg (a már tárgyalt 8. és a későbbiekben részletezésre kerülő

3. és 4. táblázatok). Mint azt az 1G ábra mutatja, a 16-88-as monoklonális antitest az SW-1463 sejtek felületéhez kötődik. Az, hogy néhány sejten festődés nem látszik, az az antigén(eke)t kifejező klonális, vagy sejtciklus jellegű variáció következménye lehet. A találmány legfőbb előnye tehát az, hogy immunizált betegektől származó érzékenyített B-sejtek felhasználásával rendkívül nagy az előállított antitestek között az olyanok gyakorisága, amelyek sejtfelületi antigénekkel reagálnak. A találmány szerint elállított antitestekkel van még a legjobb esély a rák kezelésére és diagnosztizálására.

SW-1463 ATCC CCL 234 és HT-29 ATCC HTB 38 daganatsejtekből proteinkivonatot (foszfáttal pufferolt sóoldat és 3,0 M kálium-klorid-oldat), valamint lipidkivonatot (kloroform-metanol) készítettünk. A vizsgált antitestek közül 13 reagált ezekkel a kivonatokkal. A legmegfelelőbb eredmény az volt, hogy az összes olyan antitest esetében, amelyek a protein kivonatokkal reagáltak, a kötődés mértéke proteázzal való kezelés hatására csökkent. Ezek az eredmények nagymértékben eltérnek azoktól, amelyeket olyan egér eredetű monoklonális antitestek esetében kaptak, amelyeket gyakran alkalmaznak vastagbéltumorok glikolipid antigénjével szemben [Morgan és munkatársai: Hybridoma, 3 (3), 233. (1984)., valamint Lindholm és munkatársai: Int. Arch. Allergy Appl. Immuno., 71, 178— 181. (1983)].

A protein kivonatok elkészítésére olyan módszerre, az egerek immunizálásához pedig olyan immunadszorbens, specifikus szerelógiai reakciót adó anyagokra van szükség, hogy vastagbéltumor eredetű protein-antigéneket megkötő monoklonális antitestek képződjenek. így az emberi autológ immunizáció reaktívvá teszi az antitesteket az antigének egy olyan csoportjával szemben, amelyek normális körülmények között alig váltanak ki immunválaszt egerek esetében. Könnyen lehet ugyanis, hogy emberek és egerek különböző tumorhoz kötött antigénre adnak immunválaszt. Ezzel a feltevéssel összhangban van az az eredmény, hogy a 28 vizsgált monoklonális antitest közül egy sem reagált tisztított karcinoembrionális antigénnel, melyet a vastagbél tumor ellen készített egér eredetű monoklonális antitestek gyakran felismernek (Koprowski és munkatársai: Somát. Cell. Génét., 5, 957-972 (1979)], valamint Morgan és munkatársai előbb már említett cikke). Meglepő, hogy a humán monoklonális antitestek olyan antigéneket is felismertek, melyek a kloroform-metanolos kivonatban voltak. Ezek olyan antigének lehetnek, amelyek vagy olyan fehéqét tartalmaznak, amely a kezelés során nem denaturálódott, vagy olyan glikolipidet, amely a glikoproteinnel közös szénhidrát-fragmenst tartalmaz.

A humán monoklonális antitestek reakcióképessége 8 vastagbéltumor-sejtvonal felületi antigénjével szemben

Citocentrifugált, levegőn szárított humán vastagbéltumor-sejtvonal preparátumok 8 tagú sorozatában a tumor sejtfelületi antigénekkel szembeni reaktivitására 36 humán monoklonális antitestet vizsgáltunk. Az eredményeeket az 1H ábra, illetve a következő 3. táblázat mutatja.

HU 209 519 B

3. táblázat

Humán monoklonális antitestek 8 vastagbélrák-sejtvonal sejtfelületi antigénjével szemben mutatott reakcióképessége

Monoklonális antitest	Koncentrá- ció11	Izotípus	Vastagbélrák-sejtvonal1
HT-29	SW1463	SW948	SW480	SW403	LS-1741	LoVo	WiDr
6a3xc	11	IgM	2+	+	-	-	-	4+	+	+
7a2x	23	IgM	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+
7a4x	18	IgM	+	4+	-	2+	-	3+	+	-
11A7	3	IgM	-	-	-	-	-	-	-	-
11Β5	7	IgM	-	-	-	-	-	2+	-	-
12—38x	144	IgG	-	-	-	-	-	-	-	-
12-42x	74	IgG	-	-	-	-	-	-	3+	-
12-47x	25	IgG	-	-	-	-	-	-	+	-
12-53x	219	IgG	-	-	-	-	-	-	-	2+
15-12	15	IgM	-	-	-	-	-	-	-	+
15-24	18	IgG	-	ND	ND	-	-	-	-	-
15-33	11	IgM	-	-	-	-	-	+	-	-
15-39	3	IgG	-	-	-	-	-	-	. -	-
16-4	19	IgM	-	-		-	-	+	+	-
16-50	3	IgM	-	ND	ND	-	-	+	ND	ND
16-52	4	IgM	2+	3+	+	3+	3+	3+	4+	3+
16-58	14	IgM	3+	2+	-	4+	2+	2+	+	-
16-66	7	IgM	+	2+	-	4+	3+	+	+	-
16-72	5	IgM	-	-	-	-	-	-	-	-
16-80	8	IgG	-	-	-	-	-	-	-	-
16-81	6	IgM	-	-	-	-	-	-	-	-
16-86	9	IgM	-	3+	-	-	-	4+	4+	4+
16-88	9	IgM	3+	4+	3+	-	3+	4+	4+	4+
16-103	6	IgM	-	-	-	-	-	+		-
16-105	11	IgM	-	-	-	ND	-	-		-
18-15	16	IgG	-	-	-	+	-	-	-	-
18—21x	12	IgM	2+	2+	-	-	-	2+	-	-
18-22x	7	IgM	+	+	+	-	+	-	2+	+
19b2x	26	IgG	3+	4+	2+	-	+	4+	4+	4+
20A3	4	IgG	-	-	-	-	-	+	-	-
20A6	9	IgG	-	-	-	-	-	-	-	-
20B7	9	IgG	-	-	-	-	-	-	—	-
21B27X	19	IgM	-	-	-	-	-	-	-	-
23A4	8	IgM	-	-	ND	ND	ND	-	ND	ND
27B1	3	IgM	-	-	ND	ND	ND	-	ND	ND
28A32X	3	IgM	-	2+	ND	ND	ND	2+	ND	ND

a = Az immunperoxidáz festődés intenzitása a kontrolihoz képest, amely izotípusát és koncentrációját tekintve a tesztelt monoklonális antitesteknek megfelelő.

b = gg/ml c vagy x = hibridómára jellemző morfológiájú tenyészet, míg a többi transzformált (diploid) B-sejtvonalra jellemző képet mutat.

Sejtvonalak: A HT-29, SW1463, SW948, SW480, LoVo és WiDr humán vastagbél adenokarcinóma sejtvonalakat az American Type Culture Collectiontől (Rockville, Maryland) kaptuk. A sejteket az intézet által ajánlott táptalajon tenyésztettük, melyhez 10% borjúembrió-szérumot is adtunk. Az LS-174¹ vastagbél adenokarcinóma sejtvonalat dr. Jeffery Schlomtól kaptuk (National Cancer Institute, Bethesda, Matyland) és azt DNEM-oldatban tenyésztettük. Az összes sejtvonalat 37 °C hőmérsékleten, 5% széndioxidot tartalmazó atmoszférában inkubáltuk.

ND = nm detektálható.

HU 209 519 Β

A 36 antitestt közül 13 legalább két humán vastagbélrák-sejtvonal felületén ismert fel antigéneket. Mind a 13 antitest, amely felületi antigénnel reagált, izotípusát tekintve IgM típusú volt. A kérdéses antitesteket mind a heterohibridómák, mind a diploid B-sejtvonalak termelik.

Citoplazma eredetű struktúr antigéneket (mint például aktint) felismerő egér antitestekkel folytatott kísérletek azt bizonyították, hogy az egyébként megfelelően preparált, levegőn szárított citospin sejtpreparátumokkal a sejthártya előzetes áteresztővé tétele nélkül nem lehet a citoplazmához kötött struktúr antigéneket detektálni. Citospin sejtpreparátumok felületén elhelyezkedő antigéneknek antitestek által történő felismerését az esetek többségében az élő sejt indirekt immunfluoreszcens vizsgálatával igazoltuk.

A monoklonális antitestek reakcióképessége és az antitestet tartalmazó sejt felülúszó folyadékának immunglobulin koncentrációja között nem találtunk öszszefüggést. Az összes vizsgált sejtek feliikíszóit hígítás nélkül teszteltük és nem próbálkoztunk azzal, hogy konstans immunglobulin koncentráció-nívót alakítsunk ki. Az a 13 antitest, amely két vagy több sejtvonallal is reagált, nem egyszerűen csak nyomokban kimutatható, hanem annál erősebb aktivitással rendelkezett; a 12-42 és 12-53 jelű antitestek, melyek IgG izotípusba tartoznak, kivételek, ezek erősen reagáltak, de csak egy sejtvonallal. A hasonló antigének sejtvonalakhoz kötődése tekintetében eltérések voltak; így az LS—174' sejtvonalhoz 17 monoklonális antitest, az SW-1463 és HT-29 sejtvonalhoz 12, illetve 10 antitest, a többi sejtvonalhoz 5-9 antitest kötődött; a 7a2 és 16-52 jelű antitest mind a 8 sejtvonallal reagált. Egyébként a monoklonális kötődési mód sokféle felismert specifitásra utalt.

A humán monoklonális antitestek reakciókészsége disszociált vastagbélrák daganatsejtek sejtfelületi antigénjével szemben betegtől származó, enzimatikusan disszociáltatott vastagbél-tumorsejtek felhasználásával készült, levegőn szárított citospin preparátumokon igazoltuk, hogy az antitestek reagálnak a vastagbél-sejtvonal sejtfelületi antigénjeivel. Az eredményeket a 4. táblázat mutatja.

4. táblázat

A humán monoklonális antitestek reakcióképessége vastagbélrák-tumorsejtek sejtfelületi antigénjeivel szemben³

Monoklonális antitestek	Koncent- ráció1’	Izotípus	A beteg száma
16	17	18	19	20	21	22	23	24
6a3xc	11	IgM	+	-	-	-	2+	3+	+	-	-
7a2x	23	IgM	4+	4+	4+	4+	4+	4+	-	+	4+
7a4x	18	IgM	2+	-	2+	2+	-	4+	ND	-	-
11B5	7	IgM	-	-	-	-	-	+	-	-	ND
12-38*	144	IgG	-	-	-	-	-	-	-	-	ND
12-42x	74	IgG	-	-	-	-	-	-	-	-	ND
12-47*	25	IgG	-	-		-	-	-	ND	ND	ND
12-53*	219	IgG	2+	-	3+	ND	-	-	-	-	2+
15-12	15	IgM	-	-	-	-	+	+	-	-	-
15-24	18	IgG	-	-	-	-	-	-	ND	-	ND
15-33	11	IgM	-	-	-	-	+	2+	-	-	-
15-39	3	IgG	-	-	-	-	-	-	-	-	ND
16-4	19	IgM	-	-	-	-	-	3+	-	-	ND
16-50	3	IgM	-	-	-	-	-	+	ND	-	ND
16-52	4	IgM	2+	2+	2+	2+	+	2+	+	+	-
16-58	14	IgM	3+	3+	3+	2+	-	+	-	-	3+
16-66	7	IgM	4+	4+	3+	-	+	-	-	-	-
16-72	5	IgM	-	-	-	-	-	2+	-	-	-
16-80	8	IgG	-	-	-	-	+	-	+	-	-
16-81	6	IgM	-	+	-	-	+	-	-	-	ND
16-86	9	IgM	-	-	-	-	+	-	-	-	-
16-88	4	IgM	+	+	+	3+	4+	-	-	+	-
16-103	6	IgM	-	-	-	-	-	-	ND	-	ND

HU 209 519 Β

Monoklonális antitestek	Koncent- ráció1’	Izotípus	A beteg száma
16	17	18	19	20	21	22	23	24
16-105	11	IgM	-	-	2+	+	+	+	ND	ND	ND
18-15	16	IgG	-	+	-	-	-	+	-	-	ND
18-21*	12	IgM	+	+	+	+	-	+	-	-	-
18-22*	7	IgM	2+	+	2+	2+	+	2+	-	+	-
19b2x	26	IgM	2+	2+	2+	2+	3+	4+	+	2+	-
20A3	4	IgG	-	-	-	-	-	*l·	-	-	ND
20A6	9	IgG	-	-	-	-	-	-	-	-	ND
20B7	9	IgG	-	+	-	-	-	-	-	-	ND
21B27*	19	IgM	-	-	-	-	-	-	-	-	ND

a = A kötődés meglétét és erősségi fokozatát a 3. táblázat lábjegyzetében megadott módon indukáltuk b = pg/ml c (vagy x) = hibridómára jellemző morfológiájtí tenyészet; a többi transzformált (diploid) B-scjtvonalként növekszik ND - nem detektálható

A monoklonális antitestek közül 17 legalább két daganatsejt-preparátummal reagált. A tumorsejtvonalakon kapott eredményhez képest a tumorsejteken kapott eredmények némileg eltérőek; így a 16-86 monoklonális antitest, amely 8 sejtvonal közül néggyel reagált, 25 csak egy tumorsejt preparátummal adott pozitív eredményt, a 16-105 és 12-53 monoklonális antitestek pedig, amelyek a 8 sejtvonal közül eggyel sem, illetve csak eggyel reagáltak, 3 vagy több daganatsejt preparátummal is reakcióba léptek. A sejtvonalak reaktivitásá- 30 ra, valamint az antitest kötődés módjára vonatkozó kísérletek, amelyek a daganatsejt által kifejezett antigén jelenlétére, illetve az expresszio mértékere utalnak, látható, hogy a monoklonális antitestek sok különböző specifitású antigént ismertek fel.

Humán monoklonális antitestek reaktivitása normális vastagbél-nyálkahártya és vastagbéltumor paraffinos szövetmetszet-párral szemben Paraffinos metszetekkel reagáló 25 humán monoklonális antitest specifitását indirekt immun-hisztokémiai módszerrel vizsgáltuk 5 betegtől származó autológ normális vastagbél-nyálkahártya és vastagbéltumoros szövetmetszet párokon. Az eredményeket az 5. táblázat mutatja.

5. táblázat

Humán monoklonális antitestek reaktivitása vastagbél- és végbéltumorok (T) és normális vastagbél-nyálkahártya (N) paraffinos metszetpárokkal szemben^a

Monoklonális antitestek	A beteg száma
2	6	7	8	10
T	N	T	N	T	N	T	N	T	N
T	N	T	N	T	N	T	N	T	N
6a3	+	-	-	ND	2+	-	2+	-	2+	-
7a2	-	ND	3+	-	-	ND	4+	-	-	ND
7a4	-	ND	-	ND	-	ND	4+	-	-	ND
11B5	+	-	3+	-	3+	-	4+	2+	3+	+
12-38	-	ND	-	-	2+	-	2+	-	3+	-
12-42	-	ND	-	ND	2+	-	3+	-	2+	-
12-47	+	-	-	ND	+	-	2+	-	-	ND
12-53	-	ND	3+	-	-	ND	+	-	-	ND
15-24-2	-	ND	3+	-	4+	2+	3+	+	-	ND
16-4	-	ND	2+	-	+	-	3+	+	+	-
16-58	-	ND	4+	+	4+	-	2+	+	-	ND
16-66	-	ND	4+	-	+	+	3+	+	+	-
16-86	-	ND	-	ND	2+	-	+	-	+
16-88	+	-	2+	-	+	-	4+	+	+	-
18-55	+	-	2+	-	+	-	2+	+	+	-

HU 209 519 B

Monoklonális antitestek	A beteg száma
2	6	7	8	10
T	N	T	N	T	N	T	N	T	N
18-21	-	ND	3+	+	2+	+	3+	+	+	+
18-22	-	ND	-	ND	+	-	-	ND	+	-
19b2	-	ND	-	ND	2+	+	4+	2+	-	ND
20A3	+	-	4+	+	+	-	2+	-	+	-
20A6	3+	-	2+	-	2+	-	2+	-	2+	+
20B7	3+	+	2+	-	+	-	3+		+	+
21B27	2+	+	2+	-	-	ND	3+		-	ND
23A4	-	ND	2+	-	2+	-	2+	+	3+	-
27B1	2+	-	4+	+	3+	-	4+	2+	3+	+
28A32	-	ND	4+	-	+	-	-	ND	+	-

a = A kötődés meglétét és mértékét a 3. táblázat lábjegyzetében megadott módon indikáltuk ND = nem detektálható

A 25 vizsgált antitestből ll-nél az 5 betegtől származó normális vastagbél-nyálkahártyával szemben nem volt kimutatható reakció, viszont mind a 11 reagált a tumoros mintákból, A 25 antitestből 14, bár a tumoros mintával reagált, a normális vastagbél-nyálkahártyával szemben is reaktívnak mutatkozott. Ezekben az esetekben azonban a normális vastagbél szövettel szembeni reaktivitás kisebb mérvű volt, mint a tumoros szövettel szemben. Az egyes antitestek a tesztelt normális vastagbél-nyálkahártya minták közül 1-4-gyel reagáltak. Az inkonzekvensen reagáló 14 antitest közül 5, az 5 betegtől származó normális vastagbél-nyálkahártyák közül csak 1 betegtől származóval reagált. A 8. számú betegtől származó normális vastagbél-nyálkahártya a 23, a beteg tumorszövettel reagáló antitest közül 13-mal lépett reakcióba. Hogy az ettől a betegtől származó normális vastagbél-nyálkahártya minta mennyire volt közel, vagy távol a tumortól, azt nem tudjuk. Ha ennek a 8. számú betegnek az adatait figyelmen kívül hagynánk, akkor eredményül azt kapnánk, hogy a 24 tesztelt antitest közül csak 9 reagált 1-3-mal az 5 betegtől származó normális vastagbél-nyálkahártya mintapárok közül. Összességében az összes tesztelt vastagbéltumor mintapárok és normális vastagbélnyálkahártya mintapárok mintegy 30%-ával reagáltak Ínkonzekvensen az antitestek, de a reaktivitás mértéke lényegesen kisebb volt a normális minták, mint a tumoros mintapárok esetében. Mi több, lehet hogy az alacsony, de még detektálható reaktivitásszint annak a következménye, hogy a felismerő determinánsok a normálistól eltérő körülményeket észleltek, noha azok nem látszottak rákosnak.

Humán monoklonális antitestek reaktivitása humán vastagbéltumor és nyálkahártya sejtek citocentrifugával nyert mintapárjain biotinnal jelzett antitestek direkt kötődése alapján

Citocentrifugával nyert és fagyasztva tárolt metszetek indirekt festődése alapján nehéz az antitestek normális, illetve daganatos sejtekkel szembeni specifitását értékelni. A peroxidázzal jelzett anti-humán lg antitestek, amelyeket humán antitestek detektálására használtunk, szintén az összes emberi szövetben jelen levő endogén humán immunglobulint felismerik. A normális szövetek nagyobb mennyiségben tartalmaznak endogén immunglobulint, mint a megfelelő daganatszövetek, s emiatt a zavaró háttér normál szövetek esetében erősebb, mint a daganatszöveteknél. Az antitestek direkt jelzésével ez a probléma megoldódik és e módszer lehetővé teszi, hogy nagy feleslegben alkalmazott, a monoklonális antitestekkel össze nem férhető humán immunglobulinnal a nem specifikus immunglobulin kötődést gátolják, amely ugyancsak egy, az indirekt módszerek alkalmazása esetén fellépő probléma.

5, felületi antigénnel reagáló humán antitestet a táptalajtól megtisztítottunk és biotinnal jelöltük. Az 5 választott antitest korábbi vizsgálatoknál egyrészt jól reagált, másrészt viszonylag nagy mennyiségben termelt humán immunglobulint. Az eredményeket a 6. táblázat mutatja.

6. táblázat

Biotinnal jelzett monoklonális antitestek reaktivitása humán vastagbéltumor (T) és normális vastagbél-nyálkahártya (N) sejtek citocentrifugált preparátumával szemben³

A beteg száma	6a3	7a2	7a4	18-22	19b2
T	N	T	N	T	N	T	N	T	N
18	+	-	+	+	+	+	+	+	+	+
21	3+	-	+	+	2+	-	4-	+	+	-

HU 209 519 Β

A beteg száma	6a 3	7a2	7a4	18-22	19b2
T	N	T	N	T	N	T	N	T	N
24	2+	-	+	+	4+	-	2+	-	3+	-
25	+	-	+	-	+	+	2+	2+	+	+
26	-	-	-	-	+	+	-	-	+	-
27	2+	-	-	-	2+	-	2+	+	2+	2+
28	+	+	+	-	+	+	+	-	2+	+

a - A kötődés meglétét és mértékét a 3. táblázat lábjegyzetében megadott módon indikáltuk

A 6. táblázat 5, biotinnal jelzett antitesttel lefolytatott direkt kísérletek eredményeit mutatja 7 betegtől származó vastagbéltumor és a vele szomszédos normá- 15 lis nyálkahártya citocentrifugával preparált és levegőn szárított sejtjeivel szemben. Mind az 5 antitest reagált a tumorsejtekkel, igazolva az indirekt vizsgálatokkal valószínűsített reakciókészséget. A normális nyálkahártya setjeknél ez a reakció gyenge, vagy ki sem mutatható.

Biotinnal jelzett monoklonális antitestek direkt kötődése vastagbéltumor és normális vastagbél-nyálkahártya fagyasztott szövetmetszetekhez.

Az 5, biotinnal jelzett antitest tumor-specifikus jellegének további valószínűsítésére, azokat vastagbéltumor és a vele szomszédos normális vastagbél-nyálkahártya fagyasztott szövetmetszeteivel szemben vizsgál20 tűk. Az eredményeket a 7. táblázatban mutatjuk be.

7. táblázat

Biotinnal jelzett nonoklonális antitestek reaktivitása vastagbéltumor (T) és normális szövetek (N) fagyasztott metszeteivel szemben”

A szövet eredete	Monoklonális antitestek
6a3	7a2	7a4	18-22	19b2
T	N	T	N	T	N	T	N	T	N
vastagbél	+	-	-	-	2+	-	+	-	2+	+
vastagbél	3+	-	2+	-	3+	-	4-	-	2+	-
vastagbél	3+	-	+	-	3+	-	3+	-	3+	-
vastagbél	2+	-	+	-	-	-	-	-	-	-
emlő		-		-		-		-		-
emlő		-		-		-		-		-
emlő	-	-	-	-		-	-	-	-
gyomor		-		-		-		-		+
vese		-		-		-		-		-
máj		-		-		-		-		-
izom		-		-		-		-		-
bőr		-		-		-		-		-
bőr		-		-		-		-		-

a = A kötődés meglétét és mértékét a 3. táblázat lábjegyzetében megadott módon indikáltuk antitest esetében a specifitás abszolút: az 5 vastagbéltumor közül legalább kettővel erősen reagáltak, 50 nem mutattak viszont reaktitivást a 4 megfelelő közül egyik normális vastagbél-nyálkahártya metszettel szemben sem. A 19b2 antitest az 5 daganatmetszet közül néggyel erősen reagáltak, és gyenge reaktivitást mutattak a 4 normális vastagbél-nyálkahártya metszet 55 közül eggyel szemben. A 19b2 antitest valamelyest a normális vastagbél-nyálkahártya citocentrifugával preparált sejtjeivel (6. táblázat) és paraffinos metszeteivel (5. táblázat) is reagált.

Normális emlő, gyomor, vese, máj, izom és bőr- 60 eredetű fagyasztott szövetmetszetek biotinnal jelzett humán antitestek hatására nem festődtek, kivéve a 19b2 antitestet, amely gyengén kötődött a normális gyomorszövethez (7. táblázat). Az összekapcsolt szövet komponenseken mindenütt háttér festődés volt észlelhető. A háttér festődés nem specifikus és már mások is észlelték, akik biotinnal jelzett monoklonális antitestekkel dolgoztak.

A monoklonális antitestek reaktivitása karcioembrtonális antigénnel (CEA), eritrocita és leukocita antigénekkel szemben

A monoklonális antitestek specifitásának további

HU 209 519 B tisztázása érdekében azokat CEA, humán eritrocita antigén és humán limfocita antigén iránti reaktivitásra is megvizsgáltuk különböző módszerekkel. Az anti-CEA aktivitást két CEA preparátumon komplementkötési reakción alapuló ELISA módszerrel vizsgáltuk. A humán monoklonális antitestek humán vastagbéltumor paraffinos metszeteihez való kötődést jelző festődés módja eltér attól, amit egér anti-CEA antitest esetében észleltünk. A 36 humán antitest közül egy sem mutatott fluoreszkáló festődést, amely az anti-CEA antitestek esetében jellegzetes volt. A humán eritrocita antigénekkel szembeni reaktivitást indirekt immunfluoreszcens eljárással, valamint az összes vércsoport főbb és a legtöbb egyéb faktort képviselő eritrocita sorozaton mért hemagglutinációs módszerrel határoztuk meg. Reaktivitást nem tapasztaltunk. A humán limfociták esetében ELISA, citotoxicitási vizsgálat és indirekt immunperoxidáz festődési módszerrel nem tudtunk az antitestek és a humán limfocita antigének között reakciót kimutatni.

A humán monoklonális antitestek hatása a vastagbél, illetve végbélrákra

A tumorral reagáló monoklonális antitestek használhatóságának megállapításánál a specifitás a domináló szempont. Egy másik mérlegelendő szempont az, ha vizsgált monoklonális antitestek közül néhány nem reagál a daganatminták bizonyos százalékával. Az eddigi adatok alapján nem valószínű, hogy egyetlen olyan monoklonális antitestet lehessen találni, amely az összes szempont alapján ideálisan alkalmazható lenne terápiás és diagnosztikai célokra. Immunizált rákbetegek bevonásával egy olyan kutatási stratégiát alakítottunk ki, amellyel nagyszámú kiónt állítottunk elő, melyek reaktivitás és specifitás szerint már szelektálhatok. Széles körű in vitro szkrin alapján az általunk termelt antitestek közül csak kettőt választottunk ki, azokat amelyeknek a tumorral szembeni reaktivitása a legnagyobb mérvű és ugyanakkor a normális végbélnyálkahártyával szembeni reakciósebessége a legkisebb, s ennek alapján olyan antitest-koktélok kifejlesztését javasoljuk, amelyek együttesen hatékonyabban alkalmazhatók, mint bármely antitest külön-külön. Mint azt a 3. táblázat mutatja, a 6a3-l és 7a2 jelű két monoklonális antitest egy olyan párt alkot, amely mind a daganat szövetmetszeten, mind disszociált tumorsejteken reaktivitási intervallum tekintetében kiegészíti egymást, és amelyet a normális vastagbél-nyálkahártyával szemben mutatott reakciókészség viszonylagos hiánya miatt szelektáltunk, és így egy olyan antitestkoktélt alkot, amely 15 tumor-metszet minta közül 14gyel, és 9 disszociált tumorsejt preparátum közül kilenccel reagál. Más ilyen típusú koktélok is kialakíthatók; ehhez azonban feltétlenül nagyszámú monoklonális antitest közül kell szelektálni olyan kiterjedt in vitro szkrin alapján, melyeknél a tesztelést nagyszámú tumormintán, és igen különböző differenciáltságéi tumorokon végezzük, hogy végül is terápiában és diagnosztikában jól alkalmazható humán monoklonális antitestekhez jussunk.

Azonkívül, hogy a találmány szerinti eljárással a rák in vivő diagnosztizálására és immunterápiás gyógyítására használható, a tumor sejtfelületi antigénjével reagáló monoklonális antitesteket nyerhetünk, ezek a monoklonális antitestek mintegy szondaként is használhatók lesznek a humán rák immunitásért felelős antigének izolálására és jellemzésére. Ezek a antigének végső soron tumor-vakcinaként is hasznosak lehetnek. Ezenkívül a diploid sejteket termelő antitestek előállításával bizonyos fokú genetikai stabilitás érhető el a tumorsejt felületi antigénekkel reagáló humán monoklonális antitestek termelésében.

A 3. táblázat ilyen eljárással nyert monoklonális antitest sejtvonalakkal előállított monoklonális antitestek szövetekkel szembeni reaktivitását mutatja.

Az eddigiekben bizonyos tumorokra specifikus, új monoklonális antitestek termelését, hibridómák képződését és a vonatkozó előállítási eljárásokat ismertettük. Az új monoklonális antitestek, hibridómák és diploid sejtek előállítását részletesen, bizonyos kiviteli módokat példaszerűen is ismertettünk. A jelen találmány szerinti termékek és előállításmódjuk rendkívüli jelentőségűek a rák felismerésében és kezelésében. A találmány tárgyához nagyszámú monoklonális antitest tartozik, amelyek mindegyike egy-egy rákos tumortörzs determinánsaira specifikus, és ugyancsak a találmány tárgyát képezik az ilyen antitestek előállítására használható, az előbbiekben ismertetett eljárások is. Az idevonatkozó irodalmat ismerő szakember ezeknek az eljárásoknak számos változatát és módozatát ismerheti, s mindezeket a változatokat és módozatokat is a találmány tárgyához tartozónak tekintjük.

A példák csak szemléltetik, hogy a találmány rákos daganatokra, főként jól differenciálódott vastagbél-, illetve végbél adenokarcinómás esetekre vonatkozik. A találmányba azonban az összes olyan rákfajták kezelése beletartozik, amelyek ugyanilyen embrionális szövetekből nőnek ki, így például tüdő- és emlőrákra is. A szakember szükség esetén a találmány szerinti eljárásokat olyan értelemben is változtathatja, hogy azok más típusú rák esetében is alkalmazhatók legyenek.

Claims (18)

1. Eljárás humán monoklonális antitestek előállítására, melyek az azonos szövettípusú, nem autológ humán daganatok tumorspecifikus antigénjével specifikusan reagálnak, azzal jellemezve, hogy azonos szövettípusú, nem autológ humán daganatok tumorspecifikus antigénjével specifikusan reagáló humán monoklonális antitestek termelésére képes sejteket tenyésztünk, és kívánt esetben a kapott antitestet önmagában ismert módon kinyerjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rákos daganatra specifikus monoklonális antitestet termelünk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tumorantigénre specifikus, de karcinoembrionális antigénnel, valamint a megfelelő nor18

HU 209 519 Β malis szöveteken fellelhető antigénekkel nem reagáló monoklonális antitestet termelünk.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jól differenciálódott tüdő-, emlő-, vastagbél- vagy végbélrákos daganatban található antigén-determinánsokra specifikus monoklonális antitestet termelünk.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tumorsejt-felületi antigénre specifikus monoklonális antitestet termelünk.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sejtként egy hibridómát alkalmazunk.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hibridómaként humán B-limfociták és mielómasejtek fúziójával előállított hibridómákat alkalmazunk, ahol az alkalmazott B-limfocitákat tumort nem képező, életképes tumorsejteket tartalmazó vakcinával beoltott emberek perifériás véréből nyerjük.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy B-limfocita donorként a saját daganatsejttel beoltott rákbetegek vérét használjuk.

9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tumorsejt-felületi antigénekre specifikus antitestet termelő hibridómát alkalmazunk.

10. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy transzformált humán B-limfocitát alkalmazunk.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tumorspecifikus monoklonális antitestek in vitro termelésére transzformált humán B-limfocitát vagy annak mutánsát alkalmazzzuk.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 46 humán kromoszómát tartalmazó transzformáit B-limfocitát alkalmazunk.

13. A 10-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az azonos szövettípusú, nem autológ humán tumor daganatspecifikus antigénjeivel specifikusan reagáló humán monoklonális antitesteket termelő sejteket a transzformációt elősegítő körülmények között, B-limfociták besugárzásával, életképes, de tumort nem képező daganatsejtekké alakításával állítjuk elő, és a transzformált B-limfocitákat szelektáljuk.

14. Eljárás hibridóma előállítására, azzal jellemezve, hogy tumort nem képző daganatsejtet tartalmazó vakcinával beoltott emberek perifériás véréből nyert B-limfocitákat mielómasejtekkel fuzionálunk.

15. Eljárás transzformált B-limfocita előállítására, azzal jellemezve, hogy életképes, de tumort nem képező daganatsejtet tartalmazó vakcinával beoltott emberek perifériás véréből nyert B-limfocitákat valamely transzformálószerrel kezelünk.

16. Eljárás tumorellenes vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy adenokarcinóma tumorsejteket izolálunk emberekből, a sejteket disszociáljuk és nem-tumorogénné alakítjuk, majd legalább egy hordozóanyaggal keverjük.

17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozóanyagként BCG-t (Bacillus CalmetteGaerin) használunk.

18. A 16. vagy 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tumorsejteket besugárzással alakítjuk nem-tumorogénné.