JPH06508028A - 腫瘍に関連するモノクローナル抗体８１ａｖ７８ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍に関連するモノクローナル抗体８１ＡＶ７８本特許出願は、１９８４年１月 ３１日に出願され、現在は放棄されている米国特許出願第０６１５７５．５３３ 号の一部継続出願である１９８９年５月９日に米国特許第４．８２８．９１１号 として発行された１９８５年１月３１日出願の米国特許出願第０６／６９７．０ ７８号の一部継続出願である１９８９年１月２５日出願の米国特許出願第０７／ ３０２．１５５号の一部継続出願である１９９０年１２月２８日出願の米国特許 出願第０７／６３６．１７９号の一部継続出願である。これら全ての親特許出願 は全てが参照によって本明細書の一部を構成するものとする。

発明の説明 本発明は、白虎性腫瘍抗原で活性免疫感作したガン患者のＢ細胞から誘導された 形質変換Ｂ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体に関する。これらのモ ノクローナル抗体はヒトガンの診断方法及び治療で使用することができる。本発 明は更に、これらのモノクローナル抗体を使用する診断方法及び治療アプローチ に関する。

発明の背景 現在行われているガン治療、特に放射線治療及び化学治療は、ガン細胞が正常細 胞よりもこれらの治療に対する感受性が比較的高いという根拠に基づいている。

しかしながら、正常細胞に対する毒性が強いために、これらの治療は大幅に制限 されている。対照的に、抗体分子は、その抗原に対して申し分のない特異性を示 す。従って、研究者等は“ｌｏｎｇ−ｓｏｕｇＭ　”ｍａｇｉｃ　ｂｕｌｌｅｔ ’ｆｏｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｔｈｅｒａｐｙ”（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　１９８２．２ １６：２８３）に記載のように、ガン細胞に特異な抗体を単離しようと努めた。

抗体は、通常骨髄で産生されるＢ細胞リンパ球によって合成されて、血液流中に 運ばれるタンパク質分子である。

体内に入る任意の抗原、即ち単純有機化学物質から複合タンパク質までの任意の 異分子に対して、特定の化学構造を認識して、これに結合する抗体が産生される 。特定の抗体が結合できる抗原の独特な化学構造を抗原決定基又はエピトープと 称する。Ｂ細胞、リンパ球又は白血球と称する体内のＢ細胞リンパ球が、数億個 の遺伝子プログラムの異なる細胞として存在する。各細胞は異なる決定基に特異 な抗体を産生ずる。抗体の産生を刺激する抗原は、その表面上に幾つかの決定基 を有し得る。Ｂ細胞は、抗原に遭遇すると、この抗原上の決定基に特異な抗体を 表面上に担持し、複製する。このクローナル拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）によっ て）この抗体を血液流中に分泌する多数の娘細胞が形成される。

抗体は抗原の認識及び抗原との結合に際して特異性を示すので、単一の決定基に 特異な、従って特定の決定基を有する抗原又は組織にのみ結合する抗体を多量に 産生ずることが所望された。

Ｂ細胞は“不死性”細胞とのハイブリッド形成によって又はウィルスＤＮＡ若し くは腫瘍ＤＮＡでの形質転換によって変化させなければ、連続培養では増殖しな い。ハイブリドーマ及び形質転換細胞は、培養すると、特定の抗原上の単一の決 定基に特異な抗体を産生ずる。このような抗体を“モノクローナル抗体”と呼ぶ 。

モノクローナル抗体は、リンパ趨向性ウィルス（例えばエプスタイン−バールウ ィルス（ＥＢＶ））で自然に又は意図的に形質転換された８９２３球細胞系によ って産生される。

他の形質転換剤（例えばウィルスＤＮＡ及び細胞ＤＮＡ）を使用して形質転換す ることもできる。これらの細胞はハイブリドーマ細胞とは異なり、正常ヒトの二 倍数（４６）の染色体を有する。

モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンで汚染されていない純粋な形態で合 成される。モノクローナル抗体を産生ずる細胞では、特定の抗原上の１個の決定 基に特異な抗体をほぼ無限に産生ずることができる。

特定のガン細胞に特異な抗体が入手可能であれば、これらの抗体を種々の治療方 法及び診断方法で使用できると考えられていた。ある抗体は、この抗体が特異性 を示す決定基で細胞と単に結合することによって、特定の腫瘍細胞を不活性化又 は死滅させることができる。他の抗体をエフェクターであるリンパ球又はマクロ ファージの表面に結合して、これらを腫瘍抗原に特異なキラー細胞に転換しても よい。

モノクローナル抗体は更に化学治療薬、毒素及び放射性同位元素と接合すること によって、これらの特異性を増し、効能を高めると共に、毒性を抑えることがで きる。更には、放射性核種又は金属トレーサーと接合した抗体を、転移のｉｎ　 ｖｉｖｏ診断及び位置決定のための画像化に使用することができる。ガンの診断 試験及び／又は予後試験のように、血液中での腫瘍抗原存在の検出のために抗体 を使用することもできる。更には、モノクローナル抗体を使用して、標準化され たワクチンで潜在的に使用される腫瘍抗原を単離することができる。

従来技術の説明 これまで、ヒトガンに特異なモノクローナル抗体を誘導するＢ細胞の入手方法は ２通りあった。１）ヒト腫瘍に対して免疫感作したマウスの肺臓からＢ細胞を抽 出した（米国特許第４．１７２．１２４号）；２）ガン患者の末梢血又は腫瘍を 流出する（　ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節からヒトＢ細胞を抽出した。いずれの 方法でも満足の行く結果は得られなかった。

ヒト腫瘍に対して免疫感作したマウスはあまりにも広範な反応性を有する。即ち 、産生したマウスモノクローナル抗体の大半は、腫瘍組織上に存在するヒト抗原 だけでな（正常組織のヒト抗原とも反応する。産生じた広範な抗体の中から、腫 瘍細胞とだけ反応する抗体を選択することは非常に困難である。例えばヒト小細 胞肺ガンで免疫感作したマウスから誘導された２０．０００個のハイブリドーマ を、腫瘍細胞との反応性についてスクリーニングした（Ｓｃｉｅｎｃｅ。

１９８２、２１６　：２８３）。この調査グループで観察された比率は非常に低 い（０，４％未満）が、これとは対照的に、本発明の抗体を得るために使用した 方法では、免疫感作した結腸患者から誘導されたハイブリドーマの１６％までが 、腫瘍細胞と特異的に反応するモノクローナル抗体を産生ずる。更には、マウス Ｂ細胞から誘導されたモノクローナル抗体はガン治療に適用すると潜在力が制限 される。これらのモノクローナル抗体は、繰り返し投与すると、ヒト免疫系を刺 激して、“抗マウス”抗体を産生ずる。この抗体は臨床実験では、マウスモノク ローナル抗体の活性を無効にすることが分かった。我々のヒトモノクローナル抗 体を使用すれば、このような困難を回避することができる。

ヒトモノクローナル抗体とマウスモノクローナル抗体との他の明らかな違いは、 その標識パターンである。あらかじめマウス抗体で行った調査では、腫瘍部分内 でしばしば細胞の不均一な標識があることが分かった。ある著者によれば、この 反応性パターンは腫瘍細胞の抗原異質性によるものであった（Ｈａｎｄ等、Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、４３ニア２８−７３５゜１９８３）。対照的に、 我々の戦略によって開発されたヒトモノクローナル抗体は、この抗体が反応する 腫瘍との反応性が均一であった。マウスモノクローナル抗体の不均一な染色のも っともらしい説明は、これが、推定上の腫瘍関連抗原よりもむしろ腫瘍細胞上に 多い位相又は細胞同期に特異な分化抗原のマウス免疫認識の反映であるというこ とである。マウスをヒト腫瘍細胞で免疫感作すると実質的な抗原の競合が起きて 、より豊富で優性な組織型及び分化抗原が宿主による免疫応答性のための比較的 少量の腫瘍関連抗原と都合良（競合すると期待することは不合理ではない。従っ て、ヒトを白虎性免疫感作すると、通常マウスでは免疫原性の低い抗原群に対す る抗体が誘発され得る。このことは、ヒトとマウスとが異なる腫瘍抗原に応答し 得ることを示唆している。我々が産生じた最初の３６個のヒトモノクローナル抗 体のいずれも、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）　（ヒト腫瘍細胞に対して産生された マウスモノクローナル抗体で頻繁に認識される抗原）と反応しないように思えた という我々の発見はこの仮定に一致している。

ヒトモノクローナル抗体の開発のためにこれまでに行われた大半の研究では、腫 瘍を患った患者の末梢血又はリンパ節から抽出したＢ細胞が使用された。抗原性 腫瘍が存在すると、腫瘍を患った患者が自分の腫瘍に対して免疫応答を示しくｍ ｏｕｎｔ）　、特異免疫性のＢ細胞を産生ずると考えられていた。従って、ガン 患者の腫瘍を流出するリンパ節から又は末梢血内にある循環リンパ球からＢ細胞 を採取した。しかしながら、本発明以前は、腫瘍に特異的なモノクローナル抗体 はなかなかうまく産生されなかった。

ヒト腫瘍抗原に特異なモノクローナル抗体を産生ずる上で重要な問題は、特異免 疫性のＢ細胞のソースを見つけることができないことであった（Ｓｃｉｅｎｃｅ 、　１９８２．２１６：２８５）。

ヒトの場合、ガン細胞の初期の病巣は、疾病の明確な臨床的形跡が現れる前に長 期間かけて、即ちヒトの寿命の１％〜１０％の期間で成長する傾向にある。患者 はこの時点までは、自分の腫瘍に対して免疫的に低応答性であるか又は場合によ っては免疫的に寛容である。従って、本発明以前は、腫瘍細胞と反応性のヒトモ ノクローナル抗体を複製できるように入手することはできなかった。更には、ガ ン患者がら得た少数のヒトモノクローナル抗体の中で、腫瘍細胞の表面上に見い 出される決定基と反応するものは僅かであり、これらの抗体はむしろ細胞内決定 基と反応した（Ｒ，Ｊ、Ｃｏｔｅ等、黙、　１９８３．８０：２０２６）。本発 明によって、表面抗原と反応性のモノクローナル抗体を開発することができる。

これは腫瘍の画像化及び治療のために必要な活性である。

発明の要約 ８１＾Ｖ７８はＥＬＩＳ＾アッセイでＩｇＭクラスとしてアイソタイプの決定さ れたヒトモノクローナル抗体である。このアッセイでは、ヒトＩｇ旧こ対するポ リクローナルヤギ抗血清との反応性を調べたが、ヒトＩｇＧＸＩｇ＾又はマウス 免疫グロブリンＩｇＧ若しくはＩｇ旧二対する抗血清との反応性は調べなかった 。精製８１＾Ｖ７８をＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析すると、ヒトＩｇＭに適した８０Ｋ ｄのＨ鎖と２５ＫｄのＬ鎖との構造であることが分かった。

発明の詳細な説明 本発明は特に、ヒト二倍体細胞系、即ちＥＢＶに暴露して形質転換した不死性ヒ トＢ細胞系（名称は８１＾ｖ７８）に関する。この細胞系は、本明細書と同時に 出願されて、参照によって本明細書の一部を構成するものとする同時係属出願“ ＣＴＡＡ　８１ＡＶ７８．　ＴＨＥ　ＡＮＴＩＧＥＮ　ＲＥＣＯＧＮＩＺＥＤ　 ＢＹ　ＨＵＭＡＮ　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＹ　８１ＡＶ７８″ （Ｎｉｃｈｏｌａｓ　Ｐｏｍａｔｏ　ａｎｄ　Ｊａｎｅｔ　Ｈ。

Ｒａｎｓｏｍ）に記載の結腸腫瘍抗原ＣＴＡＡ　８１ＡＶ７８と特異的に反応す るヒト腫瘍抗原を産生する。ＣＴＡＡ　８１ＡＶ７８は、結腸ガン腫瘍組織及び 腫瘍細胞系で検出されるリン酸化、非グリコジル化脂質抗原である。

我々は、種々の酵素調製物を使用して固体のヒト悪性物質をうまく消化した。組 織１ｇ当たりの腫瘍細胞の量、回収した細胞の型、細胞生存率、細胞寸法及び不 稔性について腫瘍の解離を評価した。活性特異性免疫治療に有効なワクチンの基 準を表１に示す。

転移性結腸ガンの患者から腫瘍組織を外科手術で除去し、腫瘍のない組織から分 離し、小片に切断した。次いで、酵素溶液中でインキュベートすることによって 、腫瘍断片を消化して、個々の腫瘍細胞を遊離した。

消化後、遊離した細胞をプールし、カウントして、細胞生存率を評価した。トリ バンブルー排除試験によって、許容し得る程度の細胞生存率であることが判明し た。次いで、腫瘍細胞を凍結し、液体窒素中で貯蔵した。

凍結保存した細胞を急速解凍し１．細胞を希釈し、ＨＢＳＳで洗浄し、再度懸濁 させ、カウントし、生存率を評価して、注射用ワクチンを製造した。

生存可能腫瘍細胞を照射して、非腫瘍形成性にした。

１０’個の生存可能細胞が管内に残留するようにＩＴ　Ｂ　Ｓ　Ｓ細胞懸濁液の 容量を調整した。細胞を遠心分離にかけ、上清を除去し、１０７個の生存可能Ｂ ＣＧを０．１ｍｌの容量で加えた。最終容量を０．２ｍｌにするのに十分な量の ノ１ンクス液（ＨＢＳＳ）を加えた。第３のワクチンを同様に製造したが、ＢＣ Ｇは加えなかった。

腫瘍細胞ワクチンを陵内接種して、患者を免疫感作した。

最初の２回のワクチン接種では１０７個の生存可能腫瘍細胞とＢＣＧとの混合物 を使用し、第３回のワクチン接種では１０７個の腫瘍細胞のみを使用した。１週 間毎のワクチン接種が患者の末梢血リンパ球から抗体を産生ずるのに最適な方法 であると判明した。

各ワクチン接種から１週間後に免疫感作した患者から静脈血液を採取した。形質 転換のために、採取した血液から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を分離した。

腫瘍特異性抗体を産生ずる形質転換ヒトＢ細胞（二倍体細胞）を調製した。ウィ ルスが吸着されるまでの時間Ｂ細胞をＥＢＶでインキュベートし、その後細胞を ＥＢＶを含む培地で分離し、再度懸濁させ、スクリーニングした。形質転換Ｂ細 胞を、ヒト免疫グロブリンの合成について予めスクリーニングし、次いで腫瘍関 連抗原への特異性について組織上で試験した。従って、腫瘍組織との陽性反応並 びに正常組織及びＣＥ＾との陰性反応を試験したウェルの上清は形質転換Ｂ細胞 を含んでいた。

活性特異性免疫治療の無作為抽出実験のために、結腸ガン又は直腸ガンを外科手 術で切除する患者を選択した。病理段階に応じた層別化で無作為抽出を行い、臨 床基準に合った全ての患者から腫瘍を入手した。調査対象者は、ガンの既往歴が なく、以前に化学治療も放射線治療も受けたことがな（、また外来患者の治療プ ロトコルに適合する適切な医療状況にある結腸直腸ガン患者であった。実験に適 した患者は、腫瘍が腸壁を貫通して広がっている患者（＾５ｔｌｅｒ−Ｃｏｌｌ ｅｒ　Ｂ２）、陽性リンパ節の患者（段階ＣＩ、　Ｃ２）　、又は移転性疾病の 患者（段階Ｄ）であった。これらの分類では、治療を行うグループと行わないグ ループとに分けて、患者を無作為に選択した。無作為抽出カードをコンピュータ で作成し、術後に各カテゴリーから逐次引き出した。

Ｂ、腫瘍入手 腸試験片を外科手術によって切除するとすぐに病院の病理学部に持って行き、滅 菌状態で開いた。腫瘍組織を切除し、ハンクス液（ＨＢＳＳ）と５０μｇ／ｍｌ のゲンタマイシンとを含む滅菌管に入れ、氷の上に載せて、処理、凍結のために すぐに研究室に運んだ。

Ｃ９結腸粘膜からの固体腫瘍の解離 完全に層流フード（ｌａｍｉｎａｒ　ｆｌｏｗ　ｈｏｏｄ）下での滅菌技術を用 いて、Ｐｅｔｅｒ等の組織解離方法（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ、　３９： １３５３−１３６０．１９７９）を実施した。ｔｌＢｓｓ及びゲンタマイシンを 含む遠心分離管で腫瘍組織を３度洗浄し、氷上のペトリ皿に移した。小力で切開 して、生体外組織を除去し、腫瘍を細か（直径約２〜３■の切片にした。３７℃ に予熱した０、１４％（２００単位／ｍｌ）のコラゲナーゼ型１　（Ｓｉｇｉ＋ ａ　Ｃ−０１３０）及び０．１％（５００Ｋｕｎｉｔｚ単位／＋１）のデオキシ リボヌクレアーゼ型１　（Ｓｉｇｍａ　Ｄ−０８７６）（ＤＮＡアーゼ１．Ｓｉ ｇｍａ　Ｄ−０８７６）を２０〜４０■ｌ含む７５ｍ１のフラスコに組織断片を 入れた。混転させるが、起泡させない速度で作動する浸漬性磁気撹拌器を備えた ３７℃の水浴中にフラスコを置いた。３０分間インキュベートした後に、５０ｍ １の遠心分離管内にある無菌培地で濡らした三層のナイロンメツシュ（１６６ｔ ：Ｍａｒｔｉｎ　５ｕｐｐｌｙ　Ｃｏ、。

Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）で遊離細胞をデカントした。冷却遠 心機を用いて細胞を１２０Ｏｒｐｍ（２５０ｘ　ｇ）で１０分間遠心分離にかけ た。上清を流し去り、細胞を５〜１ＱＩｌｌのＤＮＡアーゼ（ＨＢｓｓ中に０． １％）に再度懸濁させて、３７℃で５〜１０分間保持した。管にＨＢＳＳを充填 し、遠心分離によって洗浄し、ＨＢＳＳに再度懸濁させて１５１１にし、氷上で 保持した。十分な細胞が得られるまで、通常腫瘍細胞では３度手順を繰り返した 。

次いで、種々の消化物から得た細胞をプールし、カウントし、トリバンブルー排 除試験で細胞生存率を評価した。細胞を最終洗浄のために遠心分離にかけてから 、凍結保存した。

Ｄ、凍結保存 最適な凍結保存は重要な問題であった。ワクチンの製造では、解離した腫瘍細胞 をＨＢＳＳ１ｍ１当たり５〜８　Ｘ　１０’個に調整し、１５９ｆｉジメチルス ルホキシド（ＤＭＳＯ）と４％ヒト血清アルブミン（ＵＳＡ）とを含む冷やした ２ｘ冷凍培地に同量加えた。２〜４　Ｘ　１０７個／ｍｌの細胞を含む最終懸濁 液を、１．２ｍｌのＮｕｎｃフリーザーバイアルに入れた。ＤＣＨ細胞試験での 手順は、ＥＩＳ＾を使用しないことを除いて同じであった。いずれの場合も、凍 結のために、Ｎｕｎｃバイアルを氷に載せて、凍結速度調整用にモデル７００調 整器とモデル５００温度記録器とを備えたＣｒｙｏ−Ｍｅｄモデル９９０生物冷 凍庫に移した。監視バイアルを含む個々のバイアルの温度が凍結処理開始時に均 一になるように注意した。バイアルを一り℃／分の調整速度で一８０℃の最終温 度まで冷却した。バイアルを液体窒素内に移して、貯蔵した。

Ｅ、臨床プロトコル 適切な病理段階の腫瘍患者を無作為に抽出して、一方には白虎性腫瘍細胞−ＢＣ Ｇワクチンを接種し、他方にはそれ以上治療を行わなかった。段階りの患者には 全て５−フルオロウラシル化学治療を行い、腹膜反転部下に病巣を持つ全ての患 者（直腸ガン）には免疫治療が終了して２週間後に５０４０ラドの骨盤Ｘ線照射 を行った。麻酔及び外科手術によって引き起こされる免疫低下を回復させるのに 必要な時間を与えるために、腫瘍切除から４〜５週間後にワクチン接種を開始し た。切除から３〜４週間後に、対照患者及び被治療患者の皮膚を、標準リコール （ｒｅｃａｌｌ）抗原及びグレード分けした用量（ｇｒａｄｅｄ　ｄｏｓｅｓ） の１原性腫瘍細胞で試験した。使用したリコール抗原は、おたふくかぜ皮膚試験 用抗原（ＵＳＰ、　Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎ ｄｉａｎａ）；Ａｐｌｉｓｏｌ、ＰＰＤ　（精製ツベルクリンタンパク）　（Ｐ ａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ。

Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉｃｈｉｇａｎ）　；白せん菌（１：３０に希釈、Ｃｅｎ ｔｅｒＬａｂｏｒａｔｏｉｒｉｅｓ、　Ｐｏｒｔ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ）　；及びカンシタ・アルビカンス（１：　１００に希釈、Ｃｅ ｎｔｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｐｏｒｔ　ｌｆａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）であり、各々０．１ ｍｌを前腕の皮肉に接種して、２４時間後及び４８時間後の紅斑及び硬化を調べ た。

治療プロトコルのために選択した患者には一週間毎に３度、最初の２度は１０７ 個の照射白虎性腫瘍細胞と１０７個のＢＣＧとからなるワクチンを、最後は１０ ７個の腫瘍細胞のみを含むワクチンを陵内注射した。イリノイ州シカゴのイリノ イ大学から入手した新鮮な凍結Ｔｉｃｅ　ＢＣＧを一７０℃で貯蔵した。左前方 大腿の凧径部のしわの約１０ｃ■下方に第１のワクチンを接種した。右大腿の相 当する場所に第２のワクチンを接種し、右三角筋区域に第３のワクチンを接種し た。

Ｆ、ワクチンの製造 第１回及び第２回のワクチン接種口に、バイアルを３７℃の水浴中で急速解凍し た。腫瘍細胞をＨＢＳＳにゆっくりと希釈して１５ｍ１にし、１２００ｒｐｍで の遠心分離によって１度洗浄し、ｆｌＢｓｓに再度懸濁させて１５ｍ１にした。

トリバンブルー排除試験で細胞をカウントして、生存率を測定した。生存率は７ ０〜９０％であり、平均８０％であった。１２００ｒｐｍでの遠心分離によって 細胞を１度洗浄し、ＨＢＳＳに再度懸濁させて１５ｍ１にした。腫瘍細胞懸濁液 を氷上に置き、４０２０ラド／分、合計２０．０００ラドで照射した。１０７個 の生存可能腫瘍細胞が管内に残る（管及び注射器内での細胞損失及びリンパ球様 細胞の約２０％の同定不良の可能性を考慮に入れて、１．３×１０７個の生存可 能細胞が含まれる）ように細胞懸濁液の容量を調整した。細胞を遠心分離にかけ て、上清を除去し、１０７個のＢＣＧを０．１ｍｌの容量で加えた。最終容量を ０．２ｍｌにするのに十分な量のＨＢＳＳを加えた。第３のワクチンを同様に製 造したが、ＢＣＧは加えなかった。

全ての患者は最初、少なくとも１種の標準リコール抗原に反応した。２９人のう ち２人がカンシタに反応し、２９人のうち２６人がおたふ（かぜに反応し、２９ 人のうち１６人がＰＰＤに反応し、２９人のうち３人が白せん菌に反応した。免 疫感作した全ての患者のうち２人を除く全員がＰＰＤ陽性に変わったことを除け ば、フォローアツプ段階で反応性に大きな変化はなかった。

Ｈ１腫瘍細胞に対する遅延型皮膚過敏症（ＤＣＨ）２４人の患者のうち４人（１ ７％）が免疫感作する前に１０６個の腫瘍細胞に対するＤＣＨが陽性であった。

これは、免疫感作しなかった対照グループでは試験した１１人の患者のうち１人 （９％）が陽性であったのと大差なかった。重要なのは（ｐ＜０．１）、免疫感 作したグループのうち最初に陽性反応を示した４人全員と１２人の陰性反応者と が、免疫治療を行うと、より高いＤＣＨ反応性を示したことである（６７％が陽 性になった）。これらの患者のうち７人を１年後に試験したところ、３人が陽性 反応を維持していた。客観的に免疫感作した１６人の患者のうち３人だけが、６ 週間で１０５個の腫瘍細胞に対してＤＣ１１陽性反応を示したが、１０４個の細 胞に対しては反応を示さなかった。

１回目の免疫感作から１週間後の２回目の免疫感作時及び２回目の免疫感作から １週間後の３回目のワクチン接種時に患者から採血した。最終濃度が１７単位／ ｍｌの保存剤を含まないヘパリン（０’Ｎｅ１ｌｌ、Ｊｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｆｅ ｌｄｍａｎ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

Ｍｊｓｓｏｕｒｉ）の存在下で静脈血を無菌状態で採取した。血液を室温に保持 し、採血から数時間以内に素早く実験室に運んだ。

カルシウム及びマグネシウムを含まないＨＢＳＳで１：２に希釈した血液を３ｍ ］のリンパ球分離培地（ＬＳＩ、　ＬｉｔｔｏｎＢｉｏｎｅｔｉｃｓ）上に置き （４ｍｌ）、１５ａ＋１の遠心分離管内にて、４００Ｘｇで３０分間遠心分離に かけた。界面の細胞を除去し、）ＩＢｓｓで３度希釈し、ペレット化した（　１ １０００ｒｐで１０分間）。

末梢血リンパ球を、血清を含まず、Ｈｅｐｅｓ緩衝剤で処理しタタルヘッコＭＥ Ｍ（ＤＭＥＭ）ｌＯｍｌに再度懸濁させ、カウントし、生存率を測定した。

免疫感作したＢ細胞を回収するために代替方法も使用した。ＡＥＴで処理したヒ ツジ赤血球でロゼツト形成してＴリンパ球を除去した。（オルシーバー液中の） ヒツジ赤血球を平衡塩類溶液（ＢＳＳ）で３度洗浄し、３７℃で２０分間インキ ュベートした。充填した細胞は０．１４Ｍ　ＡＥＴ（Ｓｆｇｍａ）で４度処理し た。次いで、被処理細胞をＨＢＳＳで３度洗浄し、１０％懸濁液に再度懸濁させ た。被処理赤血球をＬＳＩ上に置き、２５ｏＯｒｐｍで遠心分離にかけ、ペレッ トを収集した。ＨＢＳＳで３度洗浄した後に、ヒツジ赤血球を非希釈ウシ胎児血 清を含む１０％懸濁液に再度懸濁させて、２週間以内に使用した。（８０００万 個までの細胞を含む）ＰＢＬを、ＡＥＴで処理したヒツジ赤血球ｌｌｌ１■と混 合し、１１０００ｒｐ、４℃で１０分間処理してペレット化した。ペレットを氷 上で４５分間インキュベートし、広口ピペットで穏やかに再度懸濁させ、３ｍｌ のＬＳＭ上に置いた。

ロゼツト形成した細胞を室温にて４００　Ｘ　ｇで４０分間遠心分離にかけた。

Ｔ細胞のないＰＢＬを界面で収集し、ＨＢＳＳで３度洗浄し、ペレット化した。

カウントして、生存率を測定した後に、Ｂ細胞に富むＰＢＬをハイブリドーマ生 成のために使用した。

Ｂ、ＥＢＶ形質転換方法 免疫感作した患者から得た末梢血Ｂ細胞を形質転換物質に暴露して、モノクロー ナル抗体を産生ずる連続増殖細胞系を得た。我々はＥＢＶを形質転換物質として 使用した。但し、Ｂ細胞を形質転換することによって連続培養で増殖させること ができ、かつ腫瘍関連抗原に特異なモノクローナル抗体を産生ずることのできる 効果的な任意のリンパ球ウィルス又は他の形質転換物質を使用してもよい。

我々の方法では、ヘパリン化した血液をＬＳＩ勾配で分離し、単核細胞画分を界 面で収集した。この単核細胞画分をこの時点で使用してもよいし、将来の形質転 換のために凍結保存してもよい。

場合によっては、形質転換する前に、マクロファージの単核細胞画分及び形質転 換を阻害し得る他の細胞を除去した。使用した２種の技術は、プラスチック付着 及びＬ−ロイシンのメチルエステルでの処理であった。プラスチック付着技術で は、２０％ウシ胎児血清（２ｘｌＯ’／＋１）を含む細胞培地（ＲＰＭＩ　１６ ４０培地、Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ、Ｙ、）で細胞を懸濁 させ、プラスチック細胞培養皿で一晩インキユベートした。非付着性細胞をピペ ットを用いてプラスチックから除去して、リンパ球を残した。代替方法では、細 胞をメチルエステルＬ−ロイシン（血清のない細胞培地中に５■Ｍ）中、室温で ４０分間インキュベートし、次いで洗浄した。

新鮮な若しくは凍結保存した、又は非分画の若しくは幾つかの非Ｂ細胞を除去し たリンパ球をカウントし、２〜５ｘ１０６個の細胞をベレット化した。ベレット 化した細胞を、４〜６日間培養したＢ９５−８細胞から採取した非希釈Ｂ９５− ８上清液の形態の、新しく採取したエプスタインパールウィルス５ａｌに再度懸 濁させ、２．００Ｏｒｐｍ、　４℃で１５分間遠心分離にかけて清澄し、０．８ ミクロンのフィルターで濾過して、全ての細胞を除去した。Ｄｒ、　Ｇ、　Ｔｏ ｓｔａｄｏ、　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、　ＦＤＡからＢ９ ５−８細胞系を入手した。ウィルスを吸着させるために細胞とＥＢＶとを３７℃ で９０分間インキュベートした。ウィルス吸着中に細胞を定期的に撹拌した。

ウィルス吸着後に細胞を室温でベレット化し、２０％ウシ胎児血清を含む細胞培 地に再度懸濁させて、カウントした。

次いで、細胞を約５　Ｘ　１０’個の細胞／Ｉ１１に希釈し、約１００μｍを９ ６個のウェルプレートの各ウェルにプレート化した。次いで、更に１００μｍの 細胞培地を各ウェルに加えた。代替方法では、照射支持細胞（例えばＪ７７４） を含むウェルに細胞をプレート化してもよい。マウスマクロファージ系Ｊ７７４ （ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍｄ、）を照射しく２０．０００ラド）、 次いで凍結保存した。細胞を解凍し、ＥＢＶ形質転換物質を播種する１日前に９ ６個のウェルプレートにプレート化した（ウェル１個当たり５Ｘ１０３個の細胞 ）。

６〜８週間までの間、細胞培地を１週間に２度変えた。モノクローナル抗体を産 生ずる細胞の選択及び培養のために、ヒト免疫グロブリンを合成する細胞系の選 択及び選択した細胞系の培養のために顕著な細胞増殖を示亡ウェルからの上清液 をスクリーニングした。

Ｃ４二倍体細胞のスクリーニング ＥＢＶで形質転換した細胞を定量し、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ＾、　ＩｇＧ、 　ＩｇＭ）の合成のためにキャプチャーエンザイムリンクドイムノアッセイ（Ｅ ＬＩＳＡ）によってアイソタイプを決定した。標準的なり１ｏ−ＥｎｚａＢｅａ ｄ法を使用した。この方法は、１０〜３００ｎｇ／ｍｌの範囲で感受性を示した 。ハイブリドーマ上清液を０．３〜９μｇ／ｍｌの効果的な範囲で１：３０に希 釈した。

抗体のアイソタイプ（Ｉｇ＾、ＩｇＧ又はＩｇＭ）を決定した後に、１μｇ／ｍ １以上の濃度でヒト免疫グロブリンを合成する細胞のみを組織上で間接イムノペ ルオキシダーゼによって試験した。

ポリカーボネートで被覆した金属ビーズ（Ｂｉｏ−ｅｎｚａＢｅａｄ”、Ｌｉｔ ｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ）を、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ＋ＩｇＡ＋Ｉｇ Ｍ）に対するヤギ抗体にて４℃で一晩インキユベートし、次いで２．５％ＢＳＡ で（室温で３０分間）ブロックして、非特異的結合を阻止した。次いでビーズを 空気乾燥し、４℃で貯蔵した。免疫グロブリン検出のためのＥＬＩＳＡを以下の ように実施した。９６−ウェル培養プレートからの上清液を希釈し、抗体−キャ プチャービーズを用いて３７℃で１時間インキュベートし、洗浄し、次いでヒト 免疫グロブリン（ＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ）に対するペルオキシダーゼで標識し たアフィニティー精製ヤギ抗体を用いて３７℃で１時間インキュベートした。次 いで、洗浄したビーズを２．２′−アジノージ［３−エチル−ベンズチアゾリン −６−スルホン酸］でインキユベートシた（室温で１０分間）。４０５ｎｍで光 学密度を測定した。

免疫グロブリン濃度をヒトγグロブリンの標準曲線（３０〜１１０００ｎ／ｍｌ ）の直線部分から数学的に補間した。次いで、ペルオキシダーゼで標識した、ヒ トγ、α、μ鎖に対するヤギ抗体を用いるこのＥＬ　Ｉ　ＳＡで、含有量が１ｊ ｇ／ｌｌより多い上清液のアイソタイプを決定した。その後の定量アッセイはモ ノクローナル抗体アイソタイプに適した免疫グロブリン標準液を使用した。マウ ス免疫グロブリンを、ヤギ抗マウス ＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）で被覆したＢｉｏ−ＥｎｚａＢｅａｄｓ及びペルオキ シダーゼと接合したヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）で検定した。他の実 験では、上清液を抗ヒトＩｇビーズ及びペルオキシダーゼと接合したヤギ抗マウ スＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）でインキュベートした。

一３０℃で貯蔵した正常組織及び腫瘍組織の凍結切片をその後ＰＬＰ（０，５％ ｐ−ホルムアルデヒド、０．０７５Ｍ　Ｌ−リシン、０．０１１１１過ヨウ素酸 ナトリウム）中にて４℃で２０分間固定した。

次いで切片を洗浄した。１０％ホルマリンで固定した組織のパラフィン切片を使 用直前に脱パラフイン化した。次いで、０．０７５Ｍ　Ｌ−リシンを含む１％ウ シ血清アルブミンのＰＢＳ中にて、凍結切片及びパラフィン切片を家屋で２０分 間インキュベートした。切片を上清液を用いて４℃で一晩インキユベートした。

ＰＢＳで３度洗浄した後に、切片を適切な抗ヒトペルオキシダーゼ標識試薬にて ３７℃で６０分間インキュベートし、洗浄し、０，１％過酸化水素を含むジアミ ノベンジジン（０，５ｍｇ／ｍ１．　ｐＨ７，６）のＰＢＳを用いて室温で１５ 分間インキュベートした。切片をＰＢＳで洗浄し、ヘマトキシリンで染色し、脱 水し、ベルマウント（ｐｅｒａ＋ｏｕｎｔ）でマウントした。

これらの方法によって、広範な組織反応性抗体（即ち表面抗原又は細胞質抗原に 対する抗体）を検出することができた。

反応性抗体を広範に単離するために、上清液を腫瘍切片のパネルに対してスクリ ーニングした。次いで、希釈度を制限して、モノクローナル抗体を産生ずる細胞 系をクロー１０％ウシ胎児血清、３Ｍｍのし一グルタミン及び５μｇ／ｍｌのゲ ンタマイシンを加えたＲＰＭＩ　１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、　ＧｒａｎｄＩｓ ｌａｎｄ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）でヒトモノクローナル抗体を産生ずる細胞を増 殖させた。細胞は、大気中に７．５％Ｃ０２を含む加湿雰囲気下で３７℃（３５ 〜３８℃）であった。細胞のない培地をベレット化することによって（例えば５ ００ｒｐａ＋で１５分間遠心分離にかけることによって）、高度に代謝されたス ペント培地から抗体を採取した。

実施例ＩＩＩ　：正常組織及び腫瘍組織に対するモノクローナ大半の抗体は、正 常結腸粘膜との結合が実質的に小さかった。更に、パラフィン切片に反応する抗 体を正常組織との反応性について試験した。３１ＡＶ７８は、以下のヒト正常組 織：卵巣、子宮、頚、精巣、副腎腺、甲状腺、胸腺、リンパ節、肺臓、骨髄、心 筋、脳、を髄、皮膚、筋肉及び造血性細胞との反応性が陰性であった。８１＾Ｖ ７８は、以下の組ｆｍ：結腸（縁線及び表面腺）、小腸（縁線及び表面腺）、胃 （胃小窩及び表面腺）、食道（偏平上皮細胞及び偏平上皮腺の基底層）、膵臓（ 幾つかの管上皮）、腎臓（集合細管の２０〜５０％）、乳房（腺及び管上皮）、 肺（幾つかの肺胞管）並びに肝臓（管（３１５の試験片が陽性であった））と僅 かな反応を示した。８１＾Ｖ７８のヒト腫瘍細胞系との反応性を表２に示す。表 ３及び表４は８１＾Ｖ７８の腫瘍組織試験片との反応性を示す。

結腸腫瘍から誘導されるタンパク質抗原に対するモノクローナル抗体を産生ずる には、タンパク質抽出物の製造と、マウス免疫感作のための免疫吸着剤レクチン の使用とを含む技術が必要である。従って、ヒトを白眉性免疫感作すると、通常 マウスでは免疫原性の低い抗原群に対する抗体が誘発される。従って、ヒトとマ ウスとが異なる腫瘍関連抗原に反応し得ることが可能である。この方法で製造し て、我々が試験した２８個の異なるモノクローナル抗体のいずれも、精製ＣＥＡ 　（結腸腫瘍細胞に対して産生されたマウスモノクローナル抗体で頻繁に見られ る抗原）と反応しなかった（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ等、Ｓｏｍａｔ、　Ｃｅ１ｌ　 Ｇｅｎｅｔ、、　５：９５７−９７２．１９７９）という発見はこの仮定に一致 している。

本発明は、ガンのｉｎ　ｖｉｖｏ診断及び免疫治療のために腫瘍細胞の表面抗原 と反応するモノクローナル抗体を提供する他に、ヒトガン免疫性に関連する抗原 を単離して、特徴付けるためのプローブとして有効なモノクローナル抗体を提供 する。８１ＡＶ７８によって同定された抗原は、Ｔ細胞増殖アッセイでの陽性反 応によって示されるように、腫瘍ワクチンとして有効であろう。更には、抗体を 産生ずる二倍体細胞を生成すると、腫瘍細胞の表面抗原に反応するヒトモノクロ ーナル抗体の産生に対して遺伝安定性の要素が付加される。

ＩｇＭヒトモノクローナル抗体８１ＡＶ７８を産生する細胞系は、１９９１年５ 月１６日Ａａ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ ｎ（１２３０１゜Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍ ａｒｙｌａｎｄ　２０８５２．　ＵＳＡ）に寄託された。

同定　寄託番号 ヒトＢ細胞から誘導される細胞系、ＣＲＬ　１０７５０８１＾Ｖ７ｇ 表１ （ａ　）　ＢＣＧ（Ｐｈｉｐｐｓ、　Ｔｉｃｅ、　Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ）　；凍 結乾燥、凍結（用量依存性（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）　＞　１０’（ ７０μｇ〜７００μｇ） 腫瘍細胞 （ａ）　酵素性解離 （１）コラゲナーゼ型１　（ＨＢＳ３１ｍｌ当たり１．５〜２．０Ｕ） （２）ＤＮＡアーゼ（■Ｂ５３１ｍ１当たり４５００．　Ｕ、　）（３）撹拌し ながら３７℃ （ｂ）　凍結保存 （１）凍結調整速度（−１℃／分）（７，５％ＤＭＳ０．５％ｔｌｓＡ。

ＨＢＳＳ） （２）生存率８０％ （Ｃ）　Ｘ線照射 （１）１２．０００〜２０．０ＯＯＲで非腫瘍形成性にする成分及び投与■ （ａ）　アジュバント対腫瘍細胞の比率−１０：１−１：１　（最適）（ｂ）　 １０”個の腫瘍細胞（最適） （Ｃ）　１週間の間隔で２〜３回皮内皮肉チン接種。３回目のワクチンは腫瘍細 胞のみを含んでいる。

１　任意のＢＣＧ感染のイソニアシト化学予防法ＢＣＧ−Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃ ａｌｍｅｔｔｅ　ＧｕｅｒｉｎＨＢＳＳ−ハンクス液 ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド ＦＩＳＡ−ヒト血清アルブミン Ｒ−ラド ＰＢＳ−リン酸緩衝溶液 ＥＤＴＡ−エチレンジアミンテトラ酢酸表２ ヒトモノクローナル抗体８１＾Ｖ７８の反応性生存腫瘍細胞での間接免疫蛍光分 析“６ａ　８１ＡＶ７８の濃度はｌｈｇ／ｍｌである。ｌｈｇでの対照ヒトＩｇ Ｍとの反応性は全ての細胞で陰性である。

ｂ　蛍光強度：４十強い、３＋普通、２＋いくらか弱い、】十弱い−マイナス。

Ｃ規定した蛍光強度を示す細胞の割合。残りの細胞は非蛍光性である。

ｄ　アセトンで固定した透過（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）細胞を染色すると 、線状細胞体質染色パターンを示す。アセトンで固定した細胞を用いると、全て の細胞系は強い蛍光染色を示す。

表３ ヒトモノクローナル抗体８１＾Ｖ７８の反応性ヒト結腸ガン異種移植片での間接 免疫組織化学調査ａ　染色強度：４十強い、３＋普通、２＋いくらか弱い、ｌ十 弱い一マイナス。

ｂ　染色した細胞の割合。抗体によって認識された細胞の割合は特に明記しない 限り８０％以上である。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏ ｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄから入手した細胞系。

表４ 見ヒソｌユニ１Ｂ啓ｌ旦生す建１ 新鮮な凍結結腸腫瘍での直接免疫組織化学調査ａ）　分化の度合い ｂ）　染色強度：４十強い、３＋普通、２＋がなり弱い、■＋弱い、−マイナス 。表に示す細胞の比率は染色レベルを示した。ビオチニル化ヒトＩｇＧで調査す ると、ｌｈｇ／ｍｌ以下の全ての濃度で染色がマイナスであった。

Ｃ）　細胞質染色であり、上皮細胞上のみ染色される。核染色はない。内皮細胞 、平滑筋細胞、腺維芽細胞、基質細胞及び炎症細胞は染色しない。

ｄ）　試験を実施していない。

補正音の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成５年１１月１５日 特許庁長官　麻　生　渡　殿　ｈ ｌ、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０４０２３２、発明の名称　腫瘍に 関連するモノクローナル抗体８１ＡＶ７ｇ３、特許出願人 住　所　オランダ国、ｆｉＨＯ・エル−ニス・アーネム、べ−・オー・ボックス ・Ｉ８６、フエルベルウエヒ・７６名　称　アクゾーエヌφヴエー （ほか３名） ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正音の提 出年月日　１９９３年５月１１日６、添附書類の目録 別紙 ３４条補正 請求の範囲 １、＾ＴＣＣ寄託番号がＣＲＬ　１０７５０である形質転換ヒトＢ細胞８１＾Ｖ ７８゜ ２、請求項１に記載の細胞によって産生されるモノクローナル抗体。

３、検出可能な標識に接合した請求項２に記載のモノクローナル抗体を患者に投 与し、標識した抗体を腫瘍細胞と反応させ、標識した抗体を検出することからな る患者の腫瘍の画像化方法。

４、請求項２に記載の抗体の部分と結合する抗原を含んでいる抗原結合単位。

５、抗体の開裂、ペプチド合成及び抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列 の発現の中から選択しｔこ方法で抗原結合部分を得ることによって誘導される請 求項４１こ記載の抗原結合単位。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　 Ｙ　８３１０−２Ｊ３３１５７４　Ｚ　８３１０−２Ｊ ３３１５７７　８　８３１０−２Ｊ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７１）出願人　フーバー、バーバート・シイ・ジュニアアメリカ合衆国、マサ チューセッツ・ ０２０４３、ヒンガム、サマー・ストリート・（７２）発明者　ハンナ、マイケ ル・ジー・ジュニアアメリカ合衆国、メリイランド・２１７０１、フレデリック 、フェアビュー・アベニュー・１１３ Ｉ （７２）発明者　ハスペル、マーティン・ブイアメリカ合衆国、メリイランド・ ２０８７４、セニカ、ベリイビル・ロード・１４０２９（７２）発明者　フーバ ー、バーバート・シイ・ジュニアアメリカ合衆国、マサチューセッツ・ ０２０４３、ヒンガム、サマー・ストリート・

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．ＡＴＣＣ寄託番号がＣＲＬ１０７５０である形質転換ヒトＢ細胞８８ＡＶ７ ８。
2. ２．請求項１に記載の細胞によって産生されるモノクローナル抗体。
3. ３．検出可能な標識に接合した請求項２に記載のモノクローナル抗体を患者に投 与し、標識した抗体を腫瘍細胞と反応させ、標識した抗体を検出することからな る患者の腫瘍の画像化方法。
4. ４．請求項２に記載の抗体の部分と結合する抗原を含んでいる抗原結合単位。
5. ５．抗体の開裂、ペプチド合成及び抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列 の発現の中から選択した方法で抗原結合部分を得ることによって誘導される請求 項４に記載の抗原結合単位。