HU208439B - Process for producing pharmaceutical peptides - Google Patents

Process for producing pharmaceutical peptides Download PDF

Info

Publication number
HU208439B
HU208439B HU896391A HU639189A HU208439B HU 208439 B HU208439 B HU 208439B HU 896391 A HU896391 A HU 896391A HU 639189 A HU639189 A HU 639189A HU 208439 B HU208439 B HU 208439B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
phe
leu
gly
ala
val
Prior art date
Application number
HU896391A
Other languages
English (en)
Other versions
HU896391D0 (en
HUT59420A (en
Inventor
David H Coy
Jacques-Pierre Moreau
John E Taylor
Sun Hyuk Kim
Original Assignee
Univ Tulane
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/282,328 external-priority patent/US5162497A/en
Application filed by Univ Tulane filed Critical Univ Tulane
Publication of HU896391D0 publication Critical patent/HU896391D0/hu
Publication of HUT59420A publication Critical patent/HUT59420A/hu
Publication of HU208439B publication Critical patent/HU208439B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57572—Gastrin releasing peptide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C07K7/086—Bombesin; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány olyan terápiás hatású peptidekkel foglalkozik, melyeket jó- és rosszindulatú szövetburjánzások és gasztrointesztinális betegségek kezelésére alkalmazunk.
A kétéltűek pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-TrpAla-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 összetételű bombezin peptidje [Anastasi és munkatársai, Experientia 27: 166-167 (1971)] szoros rokonságban van az emlősök gasztrint felszabadító peptidjeivel (gastrin-releasing peptid, GRP), mint amilyen például az NH2-Ala-, Pro-Val-Ser-Val-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Ala-LysMet-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-HisLeu-Met-(NH2) összetételű sertés GRP [McDonald és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 90: 227-233 (1979)] és a humán GRP, melynek összetétele, NH2-Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-ThrVal-Leu-Thr-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-TrpAla-Val-Gly-His-Leu-Met-(NH2). A bombezinről kimutatták, hogy számos humán ráksejt-vonalnál növekedési faktor, így például a kis-sejtes tüdőráknál (small-cell hung carcinoma, SCLC), és a humán mell-, prosztataráknál [Haveman és munkatársai szerkesztésében: Recent results in cancer research - Peptide hormones in Lung cancer; Springer-Verlag, New York, 1988]. Sok ilyen ráknál ismert, hogy a GRP-vei vagy a bombezinnel rokon peptidhormonok kiválasztása történik. Következésképpen, a bombezin antagonistákról feltehető volt, hogy felhasználhatók ezeknek a rákoknak a kezelésére.
Cuttitta és munkatársai kimutatták, hogy a bombezinnek egy speciális monoklonális antiteste in vivő gátolta a meztelen egérbe oltott humán kis-sejtes tüdőrák sejtvonalát [Cuttitta és munkatársai, Cancer Survey, 4: 707-727 (1985)].
Az egérfélék 3T3 fibroblasztjainál, melyek érzékenyek a bombezin mitózist befolyásoló hatására, Zachary és Rozengurt megfigyelte, hogy a P-anyag (spantide) bombezin-antagonistaként hat [Zachary és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82: 7616-7620 (1985)]. Heinz-Erian és munkatársai a bombezin 12. helyén lévő His-t D-Phe-vel cserélte ki, és e peptidnél bombezin antagonista hatást tapasztalt tengerimalac hasnyálmirigyből származó diszpergált acinusoknál. [Heinz-Erian és munkatársai, Am. J. of Physíol., 252: G 439-G 442 (1987)]. Rivier intramolekuláris diszulfid-híd beépítésével korlátozta a bombezin bioaktív C-terminális dekapeptid részének konformációs szabadságát, de ezzel a módosítással nem kapott olyan analógokat, amelyek antagonista aktivitást mutattak volna [Rivier és munkatársai, „Competitive antagonist of peptide hormones”, Abstracts of the International Symposium on bombezin-like peptides in health and disease; Róma (1987. október)].
Rövidítések, kifejezések: pGlu = piroglutaminsav (IV. képlet)
Nle = norleucin; NH2-CH[-(CH2)3-CH3]-COOH
Pál = 3-piridil-alanin β-leu = β-homoleucin γ-leu = gamma-homoleucin
D-Cpa = D-p-klór-fenil-alanin cSta = ciklosztarin
HyPro = hidroxi-prolin
Nal = naftil-alanin
Sar= szarkozin
Sta= sztatin; (3S,4S)-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptán-sav, (II. képlet)
AHPPA = (3S,4S)-4-amino-3-hidroxi-5-fenil-pentánsav
ACHPA = (3S,4S)-4-amino-5-ciklohexil-3-hidroxipentánsav
R = D-konfiguráció (jobb)
S = L-konfiguráció (bal) racemát = R és S azonos arányú keveréke
1-metil-His, 3-metil-His = az 1-es vagy 3-as helyű nitrogénatomon metilcsoportot viselő hisztidin (III. képlet).
A találmány tárgya eljárás olyan lineáris (azaz nem ciklusos) peptid előállítására, mely aktív hellyel, a célsejt receptorához kötődésért felelős kötőhellyel rendelkező, a természetes peptidek aktív helyén egy, az in vivő biológiai aktivitást nem befolyásoló felszakított peptidkötésű természetes, bioaktív kétéltű-bombezinnek vagy az emlősök gasztrint felszabadító peptidjeinek (GRP) analógja, melyre az alábbi módosítások egyike jellemző:
a) az aktív hely egyik aminosavjának kiesése és egy másik megváltoztatása az aktív helyen kívül;
b) egy vagy két aminosav szintetikus aminosavval való helyettesítése az aktív helyen.
Az analóg a természetes pepiidnek kompetitív inhibitora, minthogy megkötődik a receptoron, de - a módosításoknak köszönhetően - nem rendelkezik a természetes peptidek in vivő biológiai aktivitásával.
A természetes peptidek aktív helyének meghatározásával határolhatjuk be azokat a helyeket, ahol a módosításokat el kell végezni, hogy antagonistákat nyerjünk. így például azoknál a peptideknél, ahol az aktivitás az aminosavlánc C-terminálisának két aminosavjához kapcsolódik, antagonista hatást érhetünk el vagy azt fokozhatjuk olyan lineáris peptidnél, ahol a két aminosav közé egy nem-peptidkötést viszünk be, vagy a két természetes aminosavat szintetikus β- vagy gamma-aminosavval helyettesítjük vagy a C-terminális aminosavakat kiejtjük („dez”). Ezért, ha a természetes peptid aktív helye a C-terminális előnyösen legalább egy aminosavát tartalmazza, a találmány szerinti lineáris peptid is tartalmazza a peptid karboxilcsoportos felében azt az aminosavat. Hasonlóképpen, ahol a természetes peptid amino-terminális részén van az aktív hely, a találmány szerinti megfelelő analóg az aminoterminális részen módosított.
Előnyös megvalósítási módnál az aktív hely magában foglalja a természetes, bioaktív peptid karboxil-terminális részének legalább egy aminosavját, ez az aminosav a lineáris peptid karboxil-terminális részében található.
Egy másik előnyös megvalósítási módnál, ahol az aktív hely a természetes, bioaktív peptid amino-terminális részének legalább egyik aminosava, ez az aminosav a lineáris peptid amino-terminális felében található.
HU 208 439 Β
A módosításokat végezhetjük a receptor kötőhelyen, vagy más, nem-kötő helyen. Előnyös, ha az analógok homologitása a természetes peptidekkel legalább 25%-os, még előnyösebb, ha legalább 50%-os.
A találmány tárgya tehát eljárás
A1 -Gln-Trp-A4-A5-A6-A7-A8-A9-NHR (I) általános képletű peptidek és sóik előállítására, ahol a képletben
A1 D-Phe, halogén-D-Phe, D-Nal vagy pGlu
A4 és A5 egymástól függetlenül Gyl, Ala, Val, Leu, Ile vagy Nle,
A6 Gly, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val vagy D-Nle,
A7 His, 1-metil-His vagy 3-metil-His,
A8 Phe, Gly, Ala, Leu, β-Leu, gamma-Leu, Ile, Val, Sta vagy cSta,
A9 Gly, Ala, Leu, Val, Ile, Nle, Phe vagy halogén-Phe, vagy közvetlen kötés, azzal a feltétellel, hogyha A4 kémiai kötéstől eltérő, az A8 és A9 között peptidkötés CO-csoportja CH2 csoporttá redukált formában van jelen, és
R jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport.
A találmány szerint úgy járunk el, hogy a fenti (I) általános képletnek megfelelő pepiidet, mely legalább egy, a peptidkémiában ismert védőcsoportot tartalmaz, és/vagy valamely gyantához kapcsolódik, védőcsoporthasításnak vetünk alá és/vagy lehasítunk a gyantáról, és kívánt esetben egy keletkezett pepiidet sójává alakítunk.
Előnyösek azok az (I) általános képletű peptidek, ahol
A1 pGlu, D-Phe, β-D-Nal vagy D-Cpa,
A4 jelentése Ala,
A5 jelentése Val,
A6 jelentése Gly vagy D-Ala,
A7 jelentése His,
A8 jelentése Leu, β-Leu, Phe vagy Sta,
A9 kémiai kötés, és
R jelentése hidrogénatom.
E fenti vegyületcsoport közül különösen előnyös a pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-sztatin-amid, és a D-pCl-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His^-Leu-NH2.
Ugyancsak előnyösek az olyan (I) általános képletű peptidek, ahol
A1 pGlu, D-Phe, β-D-Nal vagy D-Cpa,
A4 jelentése Ala,
A5 jelentése Val,
A6 jelentése Gly vagy D-Ala,
A7 jelentése His,
A8 jelentése Leu, Phe vagy cSta,
A9 Leu vagy Phe,
R jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, és az A8 és A9 közötti CO-csoport redukált. E vegyületcsoporton belül előnyösek azok az (I) általános képletű peptidek, ahol
A1 jelentése β-D-Nal és A8 és A9 jelentése egymástól függetlenül Leu vagy Phe.
Különösen előnyös e vegyületek közül a β-D-NalGln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuv(CH2-NH)Leu-NH2, és a 3-D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu\|Z(CH2NH)Phe-NH2.
[A képletben a redukált peptidkötést ψ jellel ábrázoljuk, például (CH2NH)].
Ugyancsak előnyösek az olyan (I) általános képletű peptidek, ahol
A1 pGlu, D-Phe, β-D-Nal vagy D-Cpa,
A4 jelentése Ala,
A5 jelentése Val,
A6 jelentése Gly vagy D-Ala,
A7 jelentése His,
A8 jelentése Leu vagy Phe,
A9 jelentése közvetlen kötés, és
R jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport.
Csoporton belül előnyösek az olyan (I) általános képletű peptidek, ahol A8 jelentése Leu.
E csoporton belül előnyös vegyület a D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-etil-amid, és a D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-NH2.
E terápiás peptidek közül a legelőnyösebb: D-pClPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Lem|r(CH2NH)Phe-NH2.
Előnyös, ha az itt leírt terápiás hatású peptidek aminosav-sorrendje legalább 25%-ban homológ a természetes peptidek aminosav-sorrendjével; még előnyösebb, ha a homológia legalább 50%-os.
[A képletben a redukált peptidkötést ψ jellel ábrázoljuk, ψ (CH2NH)].
A találmány szerinti antagonisták alkalmasak olyan rosszindulatú vagy jóindulatú sejtburjánzások, a rák minden olyan formájának kezelésére, ahol a bombezinnel vagy GRP-vel rokon anyagok antokrin vagy parokrin mitotikus faktorként hatnak. A keletkező betegségek például: a gasztrointesztinális rendszer rákjai, hasnyálmirigyrák, vastagbélrák, tüdőrák - különösen a kissejtes altípus -, mellrák, arteroszklerózis, a gyomorbél-rendszer gasztrint és pankreatint elválasztó, valamint mozgató szöveteinek a megbetegedése, például amelyik az amiláz elválasztás felfüggesztését okozza, vagy ami az étvágyérzet szabályozásával kapcsolatos.
Az α-aminosav meghatározó csoportja az az atom vagy atomok csoportja, ami ahhoz az aszimmetriás α-szénatomhoz kapcsolódik, melyhez az a-aminocsoport nitrogénatomja, az α-karbonilcsoport szénatomja vagy a hidrogénatom is kapcsolódik. így például a meghatározó csoport az alaninnál a CH3, a valinnál a (CH3)2CH, a lizinnél H3N+(CH2)4, a fenil-alaninnál a (C6H6)CH2 csoport. A β- vagy gamma-aminosavaknál a meghatározó csoport az az atom vagy atomok csoportja, ami a β-, illetve gamma-szénatomhoz kapcsolódik. Ahol a meghatározó csoport egy aminosavnál nincs jellemezve, az lehet α, β vagy gamma-helyzetű.
A találmány szerinti peptidek mindegyikének van egy nem-peptid kötése a feltüntetett helyek legalább egyikén, kivéve a sztaninnal helyettesített analógokat, mint például a sta8-desLeu8-Met9 litorin. A nem-peptid kötésen azt értjük, hogy a két aminosav közötti kötésben részt vevő szénatomnál a karboxilcsoport metiléncsoporttá redukált. A peptidkötés redukciójának módszerét Coy és munkatársai írják le a 879348 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés3
HU 208 439 Β ben. A peptid még aktív, ha a litorin antagonistánál hiányzik a 0, 1, 2 és 9 helyű bármelyik aminosav.
A találmány szerinti peptidek gyógyászati szempontból elfogadható só állapotában is lehetnek. Ilyen sót képezhetnek például az alábbi szerves, illetve szervetlen savakkal: ecetsav, tejsav, maleinsav, citromsav, almasav, aszkorbinsav, borostyánkősav, benzoesav, szalicilsav, metánszulfonsav, toluolszulfonsav, pamoionsav, csersav, karboxi-metil-cellulóz, halogénsavak például sósav, kénsav, foszforsav.
A pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ(CH2NH)Leu-NH2 litorin antagonistát az alábbiak szerint állítjuk elő (e módszer megfelelő módosításával szintetizáljuk más bombezin, litorin, neuromedin vagy GRP antagonistákat is):
Első lépésként a pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-GlyHis(benzil-oxi-karbonil)-Leu-v(CH2NH)Leu-benzhidril-amin-gyanta köztiterméket készítjük el.
0,97 g (0,5 mmól) klorid-ionos formában lévő benzhidril-amin-polisztirol gyantát (Vega Biochemicals, Inc.) teszünk a Beckman 990B peptid szintetizátor reakcióedényébe, és a szintetizátort a következő reakcióciklusokra programozzuk be: (a) metilén-klorid, (b) 33%-os trifluor-ecetsav (TFA) metilén-kloridban (mindegyik kétszer; 1, illetve 25 percre), (c) metilén-klorid, (d) etanol, (e) metilén-klorid és (f) 10% trietil-amin kloroformban.
A semlegesített gyantát 1,5 mmól a-terc-butoxi-karbonil (Boc)-leucinnal és 1,5 mmól diizopropil-karbodiimiddel kevertetjük metilén-kloridban 1 órán át és a kapott aminosavas gyantát a fenti (a)-(f) ciklusú mosásnak vetjük alá. 1,25 mmól Boc-leucin aldehidet [előállítva Fahrentz és Castro módszerével, Synthesis 576. old. (1983)] feloldunk 5 ml száraz dimetil-formamidban (DMF), és hozzáadjuk a gyanta trifluor-ecetsavas só szuszpenziójához, majd 100 mg (2 mmól) nátrium-ciánbór-hidridet adunk hozzá [Sasaki és Coy, Peptides 8: 119-121 (1987); Coy és munkatársai, ugyanott]. Egyórás kevertetés után a gyantakeverék ninhidrin-negatív (1 perces), jelezve, hogy megtörtént a származékképzés valamennyi szabad aminocsoporton.
1.5 mmól diizopropil-karbodiimid jelenlétében egymást követően az alábbi aminosavakat (1,5 mmól) kapcsoljuk fel, az aminosav-gyanta rendszert a fenti (a)-(f) mosó/deblokkoló lépéseknek alávetve: Boc-His (benzil-oxi-karbonil), Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Trp, Boc-Gln (6M feleslegben alkalmazott p-nitro-fenil-észterként felkötve) és pGlu. A kész gyantát metanollal mossuk és levegőn szárítjuk.
1.6 g (0,5 mmól) fenti gyantát 5 ml anizollal és 35 ml vízmentes hidrogén-fluoriddal kevertetjük 0 °C hőmérsékleten 45 percen át. Száraz nitrogénáramban gyorsan eltávolítjuk a hidrogén-fluoridot és a szabad pepiidet lecsapjuk és éterrel mossuk. A nyers pepiidet 2 M ecetsav minimális térfogatában oldjuk és 2x5x100 mm méretű Sephadex G-25 gyantaoszlopon engedjük át. (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.).
A frakciókat, melyek az UV elnyelés és a vékonyréteg-kromatográfia szerint a főkomponenst tartalmazza, összegyűjtjük, kis térfogatra bepároljuk és
2,5x50 cm méretű oktadecil-szilán-szilikagéllel töltött (Whatman LRP-1, 15-20 pm) oszlopra visszük.
A pepiidet lineáris gradienselúcióval oldjuk le; az eluens: 0-30% acetonitrilt és 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó víz. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával és HPLC-vel analizáljuk és összegyűjtjük a maximális tisztaságra törekedve. Ismételt fagyasztva szárítás után 60 mg terméket kapunk fehér, pelyhes por alakjában.
A termék a HPLC és a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatok szerint homogén. A savas hidrolizátum aminosav-analízise megerősíti a peptid várt összetételét. A Leuy(CH2NH)Leu kötési „fást atom bombardment” tömegspektrometriával bizonyítjuk.
A pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe y(CH2NH)Leu-NH2 és a pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuy(CH2NH)Leu-NH2, valamint más peptideket hasonló eredménnyel, analóg módon állítjuk elő a fenti módszer megfelelő módosításával.
A D-Phe1, Leu8v(CH2NH)D-Phe9-litorin, D-PheGln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuv(CH2NH)D-Phe-NH2 szilárd fázisú szintézise az alábbiak szerint történik:
Először Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(tozil)-Leuy(CH2NH)-D-Phe-benzhidril-amin-gyantát szintetizálunk.
1,25 g (0,5 mmól) kloridionos állapotban lévő benzhidril-amin-polisztirol gyantát (Advanced ChemTech. Inc.) helyezünk az Advanced ChemTech. ACT 200 peptid szintetizátorba és a fenti (a)-(f) reakciólépéseket programozzuk be.
A semlegesített gyantát 1,5 mmól Boc-D-fenil-alaninnal és 1,5 mmól diizopropil-karbodiimiddel kevertetjük metilén-kloridban egy órán át, majd a nyert aminosavas gyantát a mosó program fenti (a)-(g) lépésének vetjük alá. Ezután trifluor-ecetsavas kezeléssel eltávolítjuk a Boc-csoportot 1,25 mmól, Fehrents és Castro módszerével (lásd fentebb) előállított Boc-Leucin-aldehidet feloldunk 5 ml száraz dimetil-formamidban és hozzáadjuk a gyanta trifluor-ecetsavas sójának szuszpenziójához, majd 100 mg (2 mmól) nátrium-cián-bór-hidridet (1. fentebb) adunk a szuszpenzióhoz. Egyórás keverés után a gyantakeverék ninhidrin negatív (1 perces reakció), jelezve, hogy valamennyi szabad aminocsoporton megtörtént a származékképzés.
Ugyanezzel a módszerrel az aminosavakat (mindegyik 1,5 mmól) az alábbi sorrendben kötjük fel: BocHis(benzil-oxi-karbonil), Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Trp, Boc-Gln (1 ekvivalens mennyiségű hidroxibenzotriazol jelenlétében kötve fel), Boc-D-Phe (1 ekvivalens mennyiségű hidroxi-benzo-triazol jelenlétében kötve fel). Szárítás után a peptides gyanta súlya 1,93 g.
Az 1,93 g (0,5 mmól) gyantát 5 ml anizollal és 35 ml vízmentes hidrogén-fluoriddal kevertetjük 0 °C hőmérsékleten 45 percen keresztül. A hidrogén-fluorid felesleget gyorsan elpároljuk száraz nitrogéngáz áramban és a szabad pepiidet lecsapjuk és éterrel mossuk. A nyers pepiidet 2 M ecetsav minimális térfogatában oldjuk és egy 2,5x100 mm méretű Sephadex G-25 gyan4
HU 208 439 B taoszlopon engedjük át. Az UV elnyelés és a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatok szerint a főterméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, kis térfogatra bepároljuk és egy 2,5x50 cm méretű Vydac oktadecil-szilános szilikagéllel (15-20 pm) töltött oszlopra visszük, amit lineáris gradienssel eluálunk. A lineáris gradienshez az eluens: 15-45% acetonitril 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó vízben. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával és HPLC analízissel vizsgáljuk és úgy gyűjtjük össze, hogy a maximális tisztaságot érjük el. Vízből ismételt fagyasztva szárítás után 120 mg terméket kapunk fehér, pelyhes por alakjában.
Más peptideket, például a D-p-Cl-Phe-Glu-TrpAla-Val-Gly-His-Leuv(CH2NH)-D-Phe-NH2 képletű pepiidet is előállíthatunk lényegében ugyanazzal a módszerrel.
A Leu8v(CH2NH)D-Phe9-litorin szintézise:
Először Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(tozil)-Leuy(CH2NH)-D-Phe-benzhidril-amin-gyantát szintetizálunk.
1,25 g (0,5 mmól) kloridionos állapotban lévő benzhidril-amin-polisztirol gyantát (Advanced ChemTech. Inc.) helyezünk az Advanced ChemTech. ACT 200 peptid szintetizátorba és a fenti (a)-(f) reakciólépéseket programozzuk be.
A semlegesített gyantát 1,5 mmól Boc-D-fenil-alaninnal és 1,5 mmól diizopropil-karbodiimiddel kevertetjük metilén-kloridban egy órán át, majd a nyert aminosavas gyantát a mosó program fenti (a)-(g) lépésének vetjük alá. Ezután trifluor-ecetsavas kezeléssel eltávolítjuk a Boc-csoportot 1,25 mmól, Fehrentz és Castro módszerével (lásd fentebb) előállított Boc-Leucin-aldehidet feloldunk 5 ml száraz dimetil-formamidban és hozzáadjuk a gyanta trifluor-ecetsavas sójának szuszpenziójához, majd 100 mg (2 mmól) nátrium-cián-bór-hidridet (1. fentebb) adunk a szuszpenzióhoz. Egy órás keverés után a gyantakeverék ninhidrin negatív (1 perces reakció) jelezve, hogy valamenynyi szabad aminocsoporton megtörtént a származékképzés.
Ugyanazzal a módszerrel az aminosavakat (mindegyik 1,5 mmól) az alábbi sorrendben kötjük fel: BocHis(benzil-oxi-karbonil), Boc-Gly, Boc-Val, Boc-AIa, Boc-Trp, Boc-Gln (1 ekvivalens mennyiségű hidroxibenzotriazol jelenlétében kötve fel), Boc-D-Phe (1 ekvivalens mennyiségű hidroxi-benzo-triazol jelenlétében kötve fel). Szárítás után a peptides gyanta súlya 1,93 g.
Az 1,93 g (0,5 mmól) gyantát 5 ml anizollal és 35 ml vízmentes hidrogén-fluoriddal kevertetjük 0 °C hőmérsékleten 45 percen keresztül. A hidrogén-fluorid felesleget gyorsan elpároljuk száraz nitrogéngáz áramban és a szabad pepiidet lecsapjuk és éterrel mossuk. A nyers pepiidet 2 M ecetsav minimális térfogatában oldjuk és egy 2,5x100 mm méretű Sephadex G-25 gyantaoszlopon engedjük át. Az UV elnyelés és a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatok szerint a főterméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, kis térfogatúra bepároljuk és egy 2,5x50 cm méretű Vydac oktadecil-szilános szilikagéllel (15-20 pm) töltött oszlopra visszük, amit lineáris gradienssel eluálunk. A lineáris gradienshez az eluens: 15-45% acetonitril 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó vízben. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával és HPLC analízissel vizsgáljuk és úgy gyűjtjük össze, hogy a maximális tisztaságot érjük el. Vízből ismételt fagyasztva szárítás után 120 mg terméket kapunk fehér, pelyhes por alakjában.
A termék a HPLC és vékonyréteg-kromatográfiás analízisek szerint homogén. A savas hidrolizátum aminosavösszetétele megfelel az oktapeptid aminosavöszszetételének. A Leuy(CH2NH) peptidkötés jelenlétét a „fást atom bombartment” tömegspektrometriával bizonyítjuk.
A D-Phe'-Des-Met9-litorin szintézise:
A D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-NH2 peptid szilárdfázisú szintézisét az alábbiak szerint végezzük:
(1) lépés:
0,62 g (0,25 mmól) kloridionos állapotban lévő benzhidril-amin-polisztirol gyantát (Advanced Chem. Toh, Inc.) töltünk az ACT 200 peptidszintetizátor reakcióedényébe és a következő reakcióciklust programozzuk be: (a) metilén-klorid, (b) 33% trifluor-ecetsav metilén-kloridban (mindegyik kétszer, 1 és 25 perces idővel), (c) metilén-klorid, (d) etanol, (e) metilén-klorid, (f) 10%-os trietil-amin kloroformban.
A semlegesített gyantát 1,5 mmól Boc-leucinnal és 1,5 mmól diizopropil-karbodiimiddel kevertetjük metilén-kloridban egy órán át. Az aminosavas gyantát a fenti (a)-(g) lépésekből álló mosóprogramnak vetjük alá. Ezt követően mindegyik aminosavból 1,5 mmólt alkalmazva az alábbi sorrendben kötjük fel az aminosavakat ugyanezzel a módszerrel. Boc-His(benzil-oxikarbonil), Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Trp, BocGln (6 M p-nitro-fenil-észterként feleslegben alkalmazva) és pGlu (hidroxi-benzotriazol jelenlétében felkötve). Szárítás után a peptides gyanta súlya 0,92 g.
(2) lépés:
A 0,92 g gyantát 5 ml anizollal, 200 mg ditio-treitollal és 35 ml vízmentes hidrogén-fluoriddal kevertetjük 0 °C hőmérsékleten 45 percen át. A hidrogén-fluorid felesleget gyorsan elpároljuk száraz nitrogén-áramban, a szabad pepiidet lecsapjuk és éterrel mossuk. A nyers pepiidet 2 M ecetsav minimális térfogatában oldjuk és egy 2,5x100 mm méretű) Sephadex G-25 oszlopon eluáljuk. Az UV elnyelés és a vékonyréteg-kromatográfiás analízis szerint a főterméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, kis térfogatra pároljuk és egy 2,5x50 cm méretű Vydac oktadecil-szilán (10-15 pm) oszlopra visszük. Az oszlopra vitt anyagot lineáris grádienssel eluáljuk, amihez eluensként 0-30% acetonitrilt és 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó vizet használunk. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával vizsgáljuk és a maximális tisztaságra törekedve összegyűjtjük. Az oldat vízből való ismételt fagyasztva szárítással fehér, pelyhes port kapunk. Ez a termék a HPLC és a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatok szerint homogén.
A peptid savas hidrolizátumának aminosav-analízisével nyert eredmény a vártnak megfelelő.
A D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-NH2 peptid szintézisét a fenti eljárással végezhetjük el.
HU 208 439 B
Az N-acetil-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuNH2 szintézisét ugyancsak a fent leírt módon hajtjuk végre az első lépésben 0,62 g (0,25 mmól) benzhidrilamino gyantát használva és a második lépésben a 0,92 g gyantát anizollal kevertetve, azzal a különbséggel, hogy az eljárás végén a Boc csoportot eltávolítjuk és a gyantát metilén-kloridban ecetsav-anhidriddel acetilezzük.
A Sta8-Des-Met9-litorin szintézise:
A peptid bármely két aminosavja, ahol a peptid csak peptidkötéseket tartalmaz, helyettesíthető sztatinnal, AHPPA-val vagy ACHPA-val. így például a Sta8Des-Met9-litorin analóg módon szintetizálható először sztatint kötve a gyantához, majd folytatva a BocHis(benzil-oxi-karbonil) hozzáadásával. A sztatint vagy Boc-sztatint az alábbi eljárások szerint állíthatjuk elő: Rich és munkatársai, J. Org. Chem., 43: 3624 (1978); Rich és munkatársai, J. Med. Chem., 23: 27 (1980). Az AHPPA és az ACHPA szintéziséhez módszert ad meg: Hűi és munkatársai, J. Med. Chem., 30: 1287 (1987), Schuda és munkatársai, J. Org. Chem., 53: 873 (1988) és Rich és munkatársai, J. Org. Chem., 53: 869 (1988).
A p-Glu-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-NH2 összetételű BIM-26120 peptid szilárdfázisú szintézise az alábbi eljárás szerint történik. Elsőként a-terc-butoxikarbonil-sztatint [előállítva Rich és munkatársai szerint; J. Org. Chem., 43: 3624, (1978)] kötünk a metilbenzhidril-amin-polisztirol gyantához. Acetilezés után a p-Glu-GIn-Trp-Ala-Val-GIy-Hís-(benziI-oxi-karbonil)-Sta-metil-benzhidril-amÍn-gyanta köztiterméket állítjuk elő. A szintézis a következőképpen történik:
(1) Az α-terc-butoxi-karbonil-sztatin hozzákötése a metil-benzhidril-amin-gyantához: 1,0 g (0,73 mmól) kloridion formában lévő metil-benzhidril-amin-polisztirol gyantát (Vega Biochemicals, Inc.) teszünk a Vega 250C Coupler peptidszintetizátor reakcióedényébe. A szintetizátort az alábbi lépésekre programozzuk be:
(a) metilén-klorid, (b) 10%-os trietil-amin kloroformban, (c) metilén-klorid, (d) dimetil-formamid.
A semlegesített gyantát 18 órán át kevertetjük az előzőleg 1,46 mmól a-terc-butoxi-karbonil-sztatinból, 2 mmól diizopropil-karbodiimidből és 1,46 mmól hidroxi-benzotriazol-hidrátból dimetil-formamidban 0 °C hőmérsékleten, egyórás reakcióidővel előállított aktív észterrel. A keletkezett aminosavas gyantát a szintetizátorban mossuk dimetil-formamiddal, majd metilénkloriddal. A Kaiser-féle ninhidrin teszt (5 perc) szerint ekkor a sztatin gyantához való kapcsolódása 84%-os.
Az acetilezést úgy végezzük, hogy az aminosavas gyantát 15 percen át 5 mmól N-acetil-imidazollal kevertetjük metilén-kloridban. A Kaiser-féle ninhidrin teszt szerint (5 perc) a szabad aminocsoportokon a származékképzés 94-99%-os. A Boc-sztatin-gyantát ezután metilén-kloriddal mossuk.
(2) A többi aminosav felkötése:
A peptidszintetizátort a következő reakciólépésekre programozzuk: (a) metilén-klorid, (b) 33%-os trifluorecetsav (TFA) metilén-kloridban (mindkettő kétszer 5 és 25 perccel), (c) metilén-klorid, (d) izopropil-alkohol, (e) 10% trietil-amin kloroformban és (f) metilénklorid.
Diizopropil-karbodiimiddel (4 mmól) vagy diizopropil-karbodiimiddel és hidroxi-benzotriazol-hidráttal (1,47 vagy 0,73 mmól) az aminosavakat (2,19 mmól) az alábbi sorrendben kapcsoljuk fel, a peptides gyantát a szintetizátorban dimetil-formamiddal, majd metilénkloriddal mosva és a mosó és deblokkoló (a)-(f) beprogramozott lépéseknek alávetve: Boc-His(benziloxi-karbonil) (2 ekvivalens mennyiségű hidroxibenzotriazol jelenlétében felkötve), Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Ala és Boc-Trp (hidroxi-benzotriazol aktív észterekként felkötve, amit 1 ekvivalens mennyiségű hidroxi-benzotriazol-hidráttal állítunk elő 0 °C hőmérsékleten egyórás reakcióidővel), Boc-Gln és pGlu (ugyancsak az előzetesen elkészített hidroxi-benzotriazol aktív észterekként felkötve, amit 1 ekvivalens hidroxibenzotriazol-hidráttal állítunk elő 0 °C hőmérsékleten, egyórás reakcióidővel). A teljes peptidet hordozó gyantát metanollal mossuk és levegőn szárítjuk.
A fenti 1,60 g (0,73 mmól) peptides gyantát 2,5 ml anizollal, 50 mg ditiotreitollal és 30 ml vízmentes hidrogén-fluoriddal kevertetjük 0 °C hőmérsékleten egy órán át. A hidrogén-fluorid felesleget gyorsan elpárologtatjuk száraz nitrogéngáz áramban, a szabad peptidet lecsapjuk és éterrel mossuk. A nyers peptidet 100 ml 1 M ecetsavban oldjuk és az oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk. A nyers peptidet minimális mennyiségű metanol/víz, 1 : 1 elegyben oldjuk és tízszeres térfogatú etíl-acetátban eldörzsöljük.
A triturált peptidet egy 9,4 mmx50 cm méretű oktadecil-szilán-szilikagél oszlopra (Whatman Partisii 10 ODS-2 M9) visszük. A peptidet lineáris grádienselúcióval eluáljuk az oszlopról. A lineáris grádienst 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó vízben állítjuk elő a 0,1% trifluor-ecetsav/acetonitril 20: 80 arányú elegyének 20%-ról 80%-ra való emelésével. A frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával és HPLC analízissel vizsgáljuk és a maximális tisztaságra törekedve gyűjtjük össze. Az oldatnak vízből való fagyasztva szárításával 77 mg terméket nyerünk fehér, pelyhes por alakjában.
A fenti módszerrel állítottuk elő például az alábbi vegyületeket, melyek molekulatömegét gyorsatom bombázásos tömegspektroszkópiával (FAB-MC) határoztuk meg:
vegyület FAB- MS
p-Glu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe- V(CH2NH)-Lcu-NH2 1054
p-Glu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- y(CH2NH)-Leu-NH2 1015
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- V(CH2NH)-Leu-NH2 1055
D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- V(CH2NH)-Leu-NH2 1105
D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- V(CH2NH)-Phe-NH2 1140
HU 208 439 Β
vegyület FAB- MS
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- V(CH2NH)-Phe-NH2 1090
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- V(CH2NH)-Cpa-NH2 1124
D-Phe-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- V(CH2NH)-D-Phe-NH2 1140
p-GIu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-NH2 965
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-NH2 956
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-GIy-His-Leu-NH(C2H5) 981
p-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Sta-NH2 1015
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-P-Leu-NH2 1005
A peptidek agonista vagy antagonista hatását az alábbi vizsgálati módszerek szerint vizsgáljuk.
1. vizsgálat - 3T3 peptid által stimulált (3H) timidin felvétel.
Sejtkultúra: A Swiss 3T3 sejtek törzskultúráját Dulbecco-féle módosított Eagles táptalajon (DMEM) növesztjük ki, mely táptalajt még kiegészítjük 10% borjúembrió-szérummal. A tenyésztés 37 °C hőmérsékleten történik 10% széndioxid, 90% levegő összetételű nedves gáztérben. A kísérlethez a sejteket 24 lyukas tittertálcákra oltjuk le, és a táptalaj utolsó cseréje után négy nappal használjuk fel. A sejteket a sejtciklus G1/G0 gázisában használjuk fel, a tápközegüket szérummentes DMEM-re lecserélve 24 órával a timidinfelvétel-teszt előtt.
A DNS szintézis vizsgálata: A sejteket kétszer 1 ml szérummentes DMEM közeggel mossuk, majd 1 ml szérummentes DMEM közegben inkubáljuk, mely 0,5 μΜ (metil-3H) timidint (20 Ci/mmól New England Nuclear) 3 nM bombezint és 1, 10, 100 vagy 1000 nM vizsgálandó vegyületet tartalmaz. A sejteket 2x1 ml jéghideg 0,9%-os nátrium-klorid oldattal mossuk, a savoldékony radioaktivitást eltávolítjuk 4 °C hőmérsékleten végzett, 5%-os triklór-ecetsavban történő inkubálással. A kultúrát egyszer 1 ml 95%-os etanollal mossuk, és 30 percen át inkubáljuk 1 ml 0,1 n nátriumhidroxid-oldatban. A beoldódott anyagot csövekbe visszük át, melyek 10 ml ScintA (Packard) közeget tartalmaznak. A radioaktivitást likvid-szcintillációs spektrométerrel határozzuk meg.
2. vizsgálat - Kis-sejtes karcinóma (SCLC)-bombezin által stimulált (3H) timidinfelvétel-teszt.
Sejtkultúra - NCI-H69 humán sejt karcinóma sejtvonalat (American Type Culture Associationtől beszerezve) 10% borjúembriószérummal kiegészített RPMI 1640 közegben tartjuk fenn 10% széndioxidot, 90% levegőt tartalmazó gáztérben, 37 °C hőmérsékleten. 24 órával a vizsgálatok előtt, a sejteket szérummentes közeggel mossuk és 24 lyukas titterlemezekre oltjuk be.
DNS szintézis - 1 nM bombezint, 0,5 μΜ (metil3H)-timidint (20 Ci/mmól, New England Nuclear) és 1, 10, 100 vagy 1000 nM vizsgálandó anyagot adunk a tenyészetekhez, hogy a végső térfogat 0,5 ml legyen. 28 órás, 37 °C hőmérsékleten történő inkubálás után a sejteket GF/B üvegszálas szűrőkön gyűjtjük össze, és a DNS-t jéghideg triklór-ecetsavval kicsapjuk. A savoldhatatlan DNS frakcióba beépült. (3H) timidint likvid-szcintillációs spektrometriával mérjük meg.
3. vizsgálat - Peptid által indukált hasnyálmirigygyulladás.
A kísérletekhez 250 g súlyú hím Sprague-Dawley patkányokat használunk. 15 perccel a bombezin injektálása előtt szubkután adjuk be a vizsgálandó vegyületet vagy a 0,9%-os nátrium-klorid oldatot. A bombezint 10 pg/kg dózisban szubkután injektáljuk és vérmintákat veszünk 1,5, 3 és 6 óra múlva. A plazma amiláztartalmát Pantrak amiláz-teszttel határozzuk meg.
4. vizsgálat - A (’25J) gasztrint felszabadító peptid (GRP) bombezinreceptorokhoz kötődésének in vitro gátlása.
Különböző szövetekből (patkányagy, patkány-hasnyálmirigy, patkány-agyalapimirigy, SCLC, 3T3 sejtek) membránt preparálunk oly módon, hogy a szövetet 0,1% borjúszérumalbumint és 0,1 mg/ml bacitracit tartalmazó 50 mM TrisHCl-ben homogenizáljuk, kétszer centrifugáljuk (39000 g, 15 perc, 4 ’C), a centrifugálások között friss pufferben szuszpendálva az üledéket. 0,8 ml kivétet 0,5 nM (125J)GRP-vel (2000 Ci/mmól; Amersham Corp.) és különböző koncentrációban lévő vizsgálandó anyaggal inkubáljuk 0,5 ml végső térfogatban. 30 perces 4 °C hőmérsékleten történő inkubálás után a reakciót gyorsan leállítjuk azáltal, hogy a szuszpenziót gyorsan átszűrjük egy Whatman GF/C szűrőn, amit előzőleg 0,3%-os vizes polietilén-iminben áztattunk, hogy csökkentsük a nem-specifikus megkötődést. A szűrőket és a csöveket háromszor 4 ml jéghideg pufferrel mossuk és a szűrőn maradt radioaktivitást gamma-spektrometriával megmérjük. A specifikus kötődést úgy határozzuk meg, hogy az összes (125J) GRPből kivonjuk azt, ami 1000 nM bombezin jelenlétében megkötődött.
5. vizsgálat - A gasztrin felszabadulás gátlása
Elaltatott patkányok gyomrán gyomorszáj kanülön keresztül sóoldatot öblítünk át, amit 15 perces periódusokban összegyűjtünk. A vizsgálandó peptidet 0150 perces periódusokban infuzáljuk az állatokba nyaki vénán keresztül.
6. vizsgálat - In vivő antitumor aktivitás db összefüggő 75 cm2 felületű szövettenyészetről NCI-H69 kis-sejtes tüdőkarcinóma sejteket transzplantálunk minden egyes állat tüdejének jobb lebenyébe. Az NCI-H69 sejteket sejtaggregátum szuszpenzióként in vitro tenyésztjük. A sejtaggregátumokat nem kíséreltük meg fizikai vagy kémiai úton dezaggregálni. A tumor méretét a két átmérő átlagában adjuk meg milliméterben, vagyis:
hosszúság és szélesség
Számos olyan bombezin vagy GRP analógot megvizsgáltunk egy vagy több fent ismertetett 1-6 teszttel, amely nem-peptidkötést, sztatint, AHPPA-t vagy ACHPA-t tartalmaz. Az 1. és 2. teszt eredményeit az I.
HU 208 439 Β táblázatban foglaljuk össze. Az I. táblázatban feltüntetjük a nem-peptid analógok képleteit, az (l25J) GRP in vitro kötődésének gátlását a 3T3 fibroblast bombezin receptoraihoz és a 3T3 sejtkultúrák bombezin-stimulálta (3H) timidin felvétel gátlását. A 3T3 GRP receptor és a timidin felvétel adatait nM-ben kifejezett IC50 értékekben adjuk meg. A táblázat tartalmazza egy nempeptidkötést tartalmazó természetes pepiidnek, a Neuromedin C-nek az adatait is, mely peptid C-terminálisának hét aminosavja hasonló a bombezin és a GRP megfelelő szakaszának aminosavjaihoz. (Az I. táblázatban a „litorin” egy 9 tagú peptidanalógot vagy származékát, a „Neuromedin C” egy 10 tagú analógot vagy származékát jelöli).
Az I. táblázatban a nem-peptid kötést a ψ((ΖΗ2ΝΗ) jelölés mutatja, azaz a ψ((ΖΗ2ΝΗ) jelölés mindig előtte áll annak az aminosavnak, melynek aminocsoportja részt vesz a nem-peptid kötésben.
1. táblázat
Kódszám Szerkezet 3T3 GRP timidin recep- tor ic50 (nM) Ti midi felvétel ic5„ (nM) felvétel FAB- MS
BIM26 092 Gly-Asn-His-TrpAla-Val-Gly-HisLeu-v(CH2NH)LeuNH2 Neuromedin C 242 466
BIM26 095 pGlu-Gln-Trp-AlaVal-D-Ala-His-LeuV(CH2NH)Leu-NH2 , Litorin 2623 1209
BIM26100 pGIu-Gln-Trp-Ala- Val-Gly-His-Phe- V(CH2NH)Leu-NH2 Litorin 23 26 1054
BIM26101 p-Glu-GIn-Trp-Ala- Val-Gly-His-Leu- V(CH2NH)Leu-NH2 Litorin 118 296 1015
BIM26105 D-Ala-Asn-His-TrpAla-Val-D-Ala-HisLeu\jr(CH2CH)LeuNH2 Neuromedin C 107 107
BIM26 106 desGly-D-Ala-His- Trp-Ala-Val-D-Ala- His-Leu- V(CH2NH)Met-NH2 Neuromedin C 401 354
BIM26 107 D-Phe-His-Trp-AlaVal-Gly-His-Leuy(CH2NH)Leu-NH2 Neuromedin C 199 154
BIM26 108 N-Ac-D-Ala-His- Trp-Ala-Val-Gly- His-Leu- V(CH2NH)Leu-NH2 Neuromedin C 841 >1000
Kódszám Szerkezet 3T3 GRP timidin recep- tor ic50 (nM) Timidi felvé- tel ic50 (nM) felvétel FAB- MS
BIM26 113 D-Phe-Gln-Trp-Ala- Val-Gly-His-Leu- V(CH2NH)Leu-NH2 Litorin 5,8 9 1055
BIM26114 D-Nai-Gln-Trp-Ala- Val-Gly-His-Leu- y(CH2NH)Leu-NH2 Litorin 23,5 28 1105
BIM26120 pGlu-Gln-Trp-AlaVal-Gly-His-StaNH2 Litorin 150 165
BIM26122 D-Phe-Gln-Trp-AlaVal-Gly-His-LeuNH2 Litorin 5,9 28,6
BIM26136 D-Nal-Gln-Trp-Ala- Val-Gly-His-Leu- V(CH2NH)Phe-NH2 Litorin 1,4 3,3 1140
BIM26 182 D-Cpa-Gln-Trp-AlaVal-Gly-His-P-LeuNH2 Litorin 0,88 4,77
Az I. táblázatból látható, hogy előnyös, ha a nempeptidkötés a litorin-analógok A8 és A9 tagjai között található. A két legaktívabb analóg (amit az alacsony GRP receptor IC50 érték jelez) a BIM-26100 peptid [Phe8v(CH2NH)Leu9] és a BIM-26101 [LeuV (CH2NH)Leu9].
Ezen túlmenően, mint az I. táblázat eredményei bizonyítják, a BIM-26113 (D-Phe'.Leu^CH^HjLeu9 peptid aktívnak bizonyult a 3T3 GRP receptor kötődés és a timidin felvétel tesztekben.
A legfigyelemreméltóbb, hogy a BIM-26136 peptid (D-Nal ^Leu^CHjNHjPhe9] a leghatékonyabb analóg, amelyik az amino és karboxil végén is aromás csoportot tartalmaz és ezáltal hidrofób kapcsolatokra képes. Végül, ha a litorin A8 és A9 aminosavját sztatinnal vagy β-leucinnal helyettesítjük, a nyert BIM-26120 és a BIM26 182 analógok ugyancsak hatásos antagonisták.
Az I. táblázatban negatív eredményt mutató Neuromedin C analógokra is találunk példát, ilyen például a BIM-26 108. A használható antagonisták kiválasztásához a nem-peptidkötéssel való cserét a fent ismertetett rutin vizsgálatokkal együtt kell elvégezni.
A bombezin és a bombezin analógok gátolják az interleucin-2 (IL-2) hatását [Fink és munkatársai, Kiin. Wochenschr., 66. Suppl. 13: 273 (1988)]. Minthogy az IL-2 a T-limfociták szaporodását idézi elő, lehetséges, hogy a litorin antagonisták megakadályozzák a bombezin vagy analógjainak IL-2-re gyakorolt hatását. Az IL-2 által stimulált limfociták képesek in vitro a kissejtes tüdőkarcinóma sejtek hatékony lizálására. Miközben a bombezin antagonistáknak közvetlen sejtsza8
HU 208 439 Β porodásgátló hatásuk van a neoplasztikus szövetekre, kedvezően hathatnak a limfociták szaporodására, melyeknek litikus hatása van a kis-sejtes tüdőrák sejtekre.
Ezek a megfigyelések serkentettek minket ama, hogy a 6. teszt alapján meghatározzuk a BIM-26100 5 hatását az SCLC tumorsejtvonal in vivő növekedésére. Húsz csecsemőmirigy nélküli, 5-6 hetes nőstény meztelen egérbe a nulladik napon beültettünk NCI-H69 humán kis-sejtes tüdőkarcinómát (SCLC), egyedenként azonosítjuk őket, majd véletlenszerűen szétoszt- 10 juk az alábbi kontroll és vizsgálati csoportokba:
csoport száma kezelés állatok száma
1. sóoldatos vivőanyaggal kezelt kontrollállatok 2 ml; s. k. inf.; kétszer naponta, 28 napon át 10
2. BIM-26100 50 pg/inj.; s. k.; kétszer naponta, 28 napon át 5
3. BIM-26100 50 pg/inj.; s. k. inf.; kétszer naponta, 28 napon át 5
(s. k. - szubkután; inj. - injektált; inf. - infúzió).
Az NCI-H69 xenograft növekedését és a tumornövekedés BIM-26100 [pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisPhetp(CH2NH)Leu-NH2] bombezin antagonistával tör- 25 ténő gátlását az 1. ábrán, a relatív tumorméreteket a II. táblázatban mutatjuk be.
A BIM-26100 tumorellenes hatása nyilvánvaló, tekintettel az NCI-H69 tumorsejtek nagy mennyiségű inokulumára (állatonként 5 db 75 cm2 összefüggő felületű 30 sejtkultúra), és a sejtek agglomerált állapotára. A tenyészedényekben az NCI-H69 agglomerátumok makroszkopikusan láthatók és együtt egy metasztázisos tumortelephez hasonlítanak. Sok ilyen tumortelepet ültetünk be állatonként. ABIM-26100 dózist önkényesen választottuk ki 35 a vegyület hozzáférhetősége alapján és nem volt az optimális. Magasabb BIM-26100 dózisokat is alkalmazhatunk, amire a testsúlygyarapodás utal (III. táblázat). A testsúlynál levonjuk a daganat súlyát. Ez azt mutatja, hogy a BIM-26100-nak semmi toxikus hatása nincs sem az alkalmazás helyén, sem az egész szervezetre vonatkozólag, és gyógyászati célra felhasználható, mint egy tumorellenes hatású növekedésgátló faktor.
A 3. ábra mutatja a D-p-Cl-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-GlyHis-Leu-v(CH2NH)Phe-NH2 bombezin-antagonista hatását a bombezin stimulálta amilóz kiválasztásra patkányoknál. Az eredmények azt mutatják, hogy ez az analóg hatásos antagonista. 5 nM analóg képes megakadályozni az 5 nM bombezin által kiváltott amilázelválasztást.
A találmány szerinti peptideket az emlősöknek, főként azonban az embernek adhatjuk be a szokásos módok valamelyikével (szájon át, parenterálisan, bőrön keresztül, nyálkahártyán át) vagy elnyújtott felszabadulást biztosító készítményekben, melyeket biodegradatív biokompatíbilis polimerekből készítünk vagy a célhelyre szállító készítményekkel (például a tüdőhöz) micellákat, géleket, liposzómákat alkalmazva.
A találmány szerinti bombezin-antagonisták alkalmasak valamennyi olyan rák kezelésére, ahol a bombezinnel rokon anyagok autokrin vagy perakrin mitotikus ágensként hatnak, különösen a kis-sejtes tüdőkarcinóma esetében. Ugyancsak alkalmazhatók a peptidek a gyomorsavszekréció gátlására, a gasztrointesztinális rendszer mozgási betegségeire, az exokrin hasnyálmirigy adenokarcinómájának kezelésére vagy a tünetek enyhítésére, kachexiás betegek étvágyának helyreállítására.
Embernek a peptidek napi 0,5 pg-5 mg/testsúlykilogramm dózisban adagolhatók. Némely ráknál, például a kis-sejt tüdőkarcinómánál a kuratív kezelés előnyös dózisa napi 250 mg személyenként.
Π. táblázat
A BIM-26 100 bombezin-antagonista in vivő tumorgátló aktivitása NCI-H69 humán sejtes tüdőrák esetében
kísérleti csoport száma kezelés tumorméret'118. nap (mm) kezelt/kontroll% tumorméret 28. nap (mm) kezelt/kontroll%
1. Vivőanyaggal kezelt kontroll 0,2 ml, sz. k., inf., kétszer naponta, 28 napon át 10,9 ±1,82 15,9 ±2,27
2. BIM-26100, 50 pg/inj., sz. k„ kétszer naponta, 28 napon át 10,1 ±1,47 93 17,3 ±1,96 108
3. BIM-26100,50 pg/inj., sz. k., inf., kétszer naponta 7,6 ± 1,56** 70 13,7 ±0,67* 86
d A kontrollcsoportban 10 állatnál, a vizsgálati csoportnál 5 állatnál kapott átlagérték ± SD. A Student-féle SD a kontrolitól * p<0,05; ** p<0,01.
///. táblázat
A tumornövekedés és a BIM-26 100 kezelés hatása a testsúlyra: nincs toxicitás
kísérleti csoport száma kezelés testsúly (g)a 0. nap testsúly (g) 18. nap testsúly (g) 28. nap
1. Vivőanyaggal kezelt kontroll, 0,2 ml, sz. k., inf., naponta kétszer, 28 napos kezelés 17,3 19,6 19,7
2. BIM-26100, 50 pg/inj., sz. k., naponta kétszer, 28 napos kezelés 16,9 19,2 19,1
3. BIM-26100, 50 pg/inj., sz. k„ inf., naponta kétszer, 28 napos kezelés 17,7 20,4 21,1
a A testsúlyadatok a kontrollcsoportban 10 állat, a vizsgálati csoportban 5 állat átlagértéke. A tumor súlyát levonjuk a testsúlyból. A tumor súlyát a két leghosszabb átmérő megmérésével határozzuk meg, az ellipszoid alakú test térfogatából a súlyt mg-ban kifejezve: (hosszúságxszélesség 2/2) mg.

Claims (17)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás A’-Gln-Trp-A4-A5-A6-A7-A8-A9-NHR (I) általános képletű peptidek és sóik előállítására, ahol a képletben
    A1 D-Phe, halogén-D-Phe, D-Nal vagy pGlu,
    A4 és A5 egymástól függetlenül Gly, Alá, Val, Leu, He vagy Nle,
    A6 Gly, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val vagy D-Nle,
    A7 His, 1-metil-His vagy 3-metil-His,
    A8 Phe, Gly, Alá, Leu, β-Leu, gamma-Leu, Ile, Val, Sta vagy cSta,
    A9 Gly, Alá, Leu, Val, Ile, Nle, Phe vagy halogén-Phe, vagy közvetlen kötés, azzal a feltétellel, hogyha A4 kémiai kötéstől eltérő, az A8 és A9 között peptidkötés CO-csoportja CH2 csoporttá redukált formában van jelen, és
    R jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, azzal jellemezve, hogy a fenti (I) általános képletnek megfelelő peptidet, mely legalább egy, a peptidkémiában ismert védőcsoportot tartalmaz, és/vagy valamely gyantához kapcsolódik, védőcsoport-hasításnak vetünk alá és/vagy lehasítunk a gyantáról, és kívánt esetben egy keletkezett peptidet sójává alakítunk, (Elsőbbsége: 1989. 10. 13.)
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek és sóik előállítására, ahol a képletben
    A1 D-Phe, halogén-D-Phe, β-D-Nal vagy pGlu,
    A4 és A5 egymástól függetlenül Gly, Alá, Val, Leu, Ile vagy Nle,
    A6 Gly vagy D-Ala,
    A7 His,
    A8 Phe, Gly, Alá, Leu, Ile vagy Val,
    A9 Gly, Alá, Leu, Val, Ile, Nle, Phe vagy halogén-Phe, és az A8 és A9 között peptidkötés CO-csoportja CH2 csoporttá redukált formában van jelen, és
    R jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1988. 10. 14.)
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek és sóik előállítására, ahol a képletben
    A1 D-Phe, halogén-D-Phe vagy pGlu,
    A4 és A5 egymástól függetlenül Gly, Alá, Val, Leu, Ile vagy Nle,
    A6 Gly vagy D-Ala,
    A7 His,
    A8 Phe, Gly, Alá, Leu, Ile vagy Val,
    A9 Gly, Alá, Leu, Val, Ile, Nle, Phe vagy halogén-Phe, és az A8 és A9 között peptidkötés CO-csoportja CH2 csoporttá redukált formában van jelen, és
    R jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1988. 12. 09.)
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek és sóik előállítására, ahol a képletben
    A1 D-Phe, halogén-D-Phe, β-D-Nal vagy p-Glu A4 és A5 egymástól függetlenül Gly, Alá, Val, Leu, Ile vagy Nle,
    A6 Gly, D-Ala, D-Leu, D-Ile vagy D-Val,
    A7 His, 1-metil-His vagy 3-metil-His,
    A8 Phe, Gly, Alá, Leu, Ile, Val, Sta vagy cSta,
    A9 Gly, Alá, Leu, Val, Ile, Phe vagy halogén-Phe, vagy közvetlen kötés, azzal a feltétellel, hogyha A4 kémiai kötéstől eltérő, az A8 és A9 között peptidkötés CO-csoportja CH2 csoporttá redukált formában van jelen, és
    R jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1989.03.02.)
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek és sóik előállítására, ahol a képletben
    A1 D-Phe, halogén-D-Phe, β-D-Nal vagy pGlu,
    A4 és A5 egymástól függetlenül Gly, Alá, Val, Leu, Ile vagy Nle,
    A6 Gly, D-Ala, D-Leu, D-Ile vagy D-Val,
    A7 His, 1-metil-His vagy 3-metil-His,
    A8 Phe, Gly, Leu, Ile, Val, Sta vagy cSta,
    A9 Gly, Alá, Leu, Val, Ile, Phe vagy halogén-Phe, vagy közvetlen kötés, azzal a feltétellel, hogyha A4 kémiai kötéstől eltérő, az A8 és A9 között peptidkötés CO-csoportja CH2 csoporttá redukált formában van jelen, és
    R jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1989. 07. 07.)
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek és sóik előállítására, ahol a képletben
    A1 D-Phe, halogén-D-Phe vagy pGlu,
    A4 és A5 egymástól függetlenül Gly, Alá, Val, Leu, Ile vagy Nle,
    A6 Gly, D-Ala, D-Leu, D-Ile vagy D-Val,
    A7 His, 1-metil-His vagy 3-metil-His,
    A8 Phe, Gly, Alá, Leu, Ile, Val, Sta vagy cSta,
    A9 Gly, Alá, Leu, Val, Ile, Phe vagy halogén-Phe, vagy közvetlen kötés, azzal a feltétellel, hogyha A4 kémiai kötéstől eltérő, az A8 és A9 között peptidkötés CO-csoportja CH2 csoporttá redukált formában van jelen, és
    R jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1989. 08. 21.)
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek előállítására, ahol
    A1 pGlu, D-Phe, β-D-Nal, vagy D-Cpa,
    HU 208 439 Β
    A4 jelentése Alá,
    A5 jelentése Val,
    A6 jelentése Gly vagy D-Ala,
    A7 jelentése His,
    A8 jelentése Leu, β-Leu, Phe vagy Sta,
    A9 kémiai kötés, és
    R jelentése hidrogénatom, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1989. 10. 13.)
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás a pGlu-Gln-Tip-Ala-Val-Gly-His-sztatin-amid előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1989. 03. 02.)
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás a D-p-Cl-Phe-Gln-Trp-Ala-VaI-Gly-His^-Leu-NH2 előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1989. 10. 13.)
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek előállítására, ahol
    A1 pGlu, D-Phe, β-D-Nal, Gin vagy D-Cpa,
    A4 jelentése Alá,
    A5 jelentése Val,
    A6 jelentése Gly vagy D-Ala,
    A7 jelentése His,
    A8 jelentése Leu, Phe vagy cSta,
    A9 Leu vagy Phe,
    R jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, és az A8 és A9 közötti CO-csoport redukált, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1989. 03. 02.)
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek előállítására, ahol
    A1 jelentése β-D-Nal és A8 és A9 jelentése egymástól függetlenül Leu vagy Phe, előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1989.03.02.)
  12. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás a β-Ο-Ν3ΐ-Ο1η-Τφ-ΑΗ-ν3ΐ-Ο^-Ηί5-Εβυ-ψ(ΟΗ2-ΝΗ)
    Leu-NH2 előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1988. 10. 13.)
  13. 13. A 10. igénypont szerinti eljárás a β-Ο-Ν3ΐΌ1η-ΤΓρ-Αυ-νΣΐ1-Ού-Ηί5-Εβυ-ψ(<2Η2-ΝΗ)
    Phe-NH2 előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1988. 10. 13.)
  14. 14. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek előállítására, ahol
    A1 pGlu, D-Phe, β-D-Nal vagy D-Cpa,
    A4 jelentése Alá,
    A5 jelentése Val,
    A6 jelentése Gly vagy D-Ala,
    A7 jelentése His,
    A8 jelentése Leu vagy Phe,
    A9 jelentése közvetlen kötés, és
    R jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1989.03.02.)
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek előállítására, ahol
    A8 jelentése Leu, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1989. 03. 02.)
  16. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás a D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-etil-amid előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1989. 03. 02.)
  17. 17. A 14. igénypont szerinti eljárás a D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-NH2 előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti szerkezetnek megfelelő védett és/vagy gyantához kötött kiindulási peptideket használunk. (Elsőbbsége: 1989.03.02.)
HU896391A 1988-10-14 1989-10-13 Process for producing pharmaceutical peptides HU208439B (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25799888A 1988-10-14 1988-10-14
US07/282,328 US5162497A (en) 1987-09-24 1988-12-09 Bradykinin analogs with non-peptide bond
US31794189A 1989-03-02 1989-03-02
US37655589A 1989-07-07 1989-07-07
US39716989A 1989-08-21 1989-08-21

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU896391D0 HU896391D0 (en) 1991-07-29
HUT59420A HUT59420A (en) 1992-05-28
HU208439B true HU208439B (en) 1993-10-28

Family

ID=27540392

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU896391A HU208439B (en) 1988-10-14 1989-10-13 Process for producing pharmaceutical peptides

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0438519B1 (hu)
JP (1) JP2919889B2 (hu)
KR (1) KR900701827A (hu)
AT (1) ATE165836T1 (hu)
AU (1) AU638423B2 (hu)
DE (1) DE68928667T2 (hu)
DK (1) DK66391A (hu)
FI (1) FI104252B (hu)
HK (1) HK1010785A1 (hu)
HU (1) HU208439B (hu)
MC (1) MC2144A1 (hu)
TW (1) TW201754B (hu)
WO (1) WO1990003980A1 (hu)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2877775A (en) * 1957-12-23 1959-03-17 Preston M Hall Rotary type filing and abrading appliance
US5877277A (en) * 1987-09-24 1999-03-02 Biomeasure, Inc. Octapeptide bombesin analogs
AU618029B2 (en) * 1987-11-02 1991-12-12 Imperial Chemical Industries Plc Polypeptide compounds
US6218364B1 (en) 1988-06-20 2001-04-17 Scott L. Harbeson Fluorinated neurokinin A antagonists
US5830863A (en) * 1988-06-20 1998-11-03 Merrell Pharmaceuticals Inc. Neurokinin A antagonists
WO1991004040A1 (en) * 1989-09-15 1991-04-04 Biomeasure, Inc. Treatment of colon cancer
JPH04502629A (ja) * 1989-11-06 1992-05-14 フアルミタリア・カルロ・エルバ・エツセ・エルレ・エルレ 還元不可逆性ボンベシンアンタゴニスト
US5834433A (en) * 1990-07-26 1998-11-10 Merrell Pharmaceuticals Inc. Compounds and pharmaceutical uses of peptides of bombesin and GRP
ZA915740B (en) * 1990-07-26 1992-05-27 Merrell Dow Pharma Peptides
US5244883A (en) * 1990-11-29 1993-09-14 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Nonapeptide bombesin antagonists
US5369094A (en) * 1990-11-29 1994-11-29 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Polypeptide bombesin antagonists
JP3350701B2 (ja) * 1991-05-23 2002-11-25 メレルダウファーマスーティカルズ インコーポレイテッド ボンベシン類似体類
JPH07505865A (ja) * 1992-02-07 1995-06-29 メレルダウファーマスーティカルズ　インコーポレイテッド ボンベシンのフェニルアラニン類似体類
DE4320201A1 (de) * 1993-06-18 1995-01-12 Asta Medica Ag Verwendung von Cetrorelix und weiteren Nona- und Dekapeptiden zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Aids und zur Wachstumsstimulation
FR2739553B1 (fr) * 1995-10-06 1998-01-02 Oreal Utilisation d'antagonistes de la bradykinine pour stimuler ou induire la pousse des cheveux et/ou stopper leur chute
US6156725A (en) * 1996-08-16 2000-12-05 National Institute Of Immunology Drug for the treatment of cancer
US6492330B1 (en) 1996-08-16 2002-12-10 National Institute Of Immunology Antiangiogenic drugs
US7850947B2 (en) 2003-01-13 2010-12-14 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US8420050B2 (en) 2003-01-13 2013-04-16 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US7611692B2 (en) 2003-01-13 2009-11-03 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US7922998B2 (en) 2003-01-13 2011-04-12 Bracco Imaging S.P.A. Gastrin releasing peptide compounds
US7226577B2 (en) 2003-01-13 2007-06-05 Bracco Imaging, S. P. A. Gastrin releasing peptide compounds
KR20070108953A (ko) 2003-04-22 2007-11-13 소시에떼 더 콘세이유 더 레세르세 에 다플리까띠옹 시엔띠피끄, 에스.아.에스. 펩타이드 벡터
EP2289564A3 (en) * 2006-09-08 2012-11-14 Piramal Imaging SA Derivatives of aniline as precursors for F18-labeling
KR101642363B1 (ko) 2008-06-12 2016-07-25 입센 바이오이노베이션 리미티드 신경내분비계 질환의 억제
ES2732205T3 (es) 2008-06-12 2019-11-21 Ipsen Bioinnovation Ltd Proteínas de fusión para uso en el tratamiento del cáncer
GB0820970D0 (en) 2008-11-17 2008-12-24 Syntaxin Ltd Suppression of cancer
EP2198878A1 (en) 2008-12-18 2010-06-23 University Of Miami Polypeptide bombesin antagonists
CN116333041A (zh) * 2023-04-10 2023-06-27 湖南中晟全肽生化有限公司 一种激活grp受体的多肽化合物及其用途

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4207311A (en) 1977-07-18 1980-06-10 The Salk Institute For Biological Studies Peptides having analgesic and thermoregulative properties
US4331611A (en) 1979-12-21 1982-05-25 International Flavors & Fragrances Inc. Nitrile and uses of same in perfumes, colognes and perfumed articles
US4331661A (en) * 1980-10-03 1982-05-25 The Salk Institute For Biological Studies Bombesin analogs
US4613586A (en) 1984-04-19 1986-09-23 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Gastrin releasing peptide-like peptides
US4803261A (en) * 1986-06-27 1989-02-07 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Method for synthesizing a peptide containing a non-peptide

Also Published As

Publication number Publication date
AU638423B2 (en) 1993-07-01
DK66391A (da) 1991-06-14
HU896391D0 (en) 1991-07-29
DE68928667T2 (de) 1998-10-01
WO1990003980A1 (en) 1990-04-19
DE68928667D1 (de) 1998-06-10
FI104252B1 (fi) 1999-12-15
EP0438519A4 (en) 1991-10-30
AU4494989A (en) 1990-05-01
FI911780A0 (fi) 1991-04-12
HUT59420A (en) 1992-05-28
DK66391D0 (da) 1991-04-12
JP2919889B2 (ja) 1999-07-19
MC2144A1 (fr) 1992-02-19
TW201754B (hu) 1993-03-11
KR900701827A (ko) 1990-12-04
HK1010785A1 (en) 1999-06-25
JPH04504406A (ja) 1992-08-06
EP0438519B1 (en) 1998-05-06
EP0438519A1 (en) 1991-07-31
ATE165836T1 (de) 1998-05-15
FI104252B (fi) 1999-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU208439B (en) Process for producing pharmaceutical peptides
EP0309297B1 (en) Therapeutic peptides
AU648037B2 (en) Therapeutic peptides
US5877277A (en) Octapeptide bombesin analogs
US5723578A (en) Peptide analogs of bombesin
KR100225679B1 (ko) 노나펩티드 봄베신 길항제
KR100306506B1 (ko) 폴리펩티드봄베신길항제
US5162497A (en) Bradykinin analogs with non-peptide bond
JPH04503075A (ja) 結腸癌の処置
US6479460B1 (en) Synthetic peptides and pseudopeptides having osteogenic activity and pharmaceutical compositions containing the same
HUT62604A (en) Process for producing peptides for treating tissue proliferation and pharmaceutical compositions comprising same
EP0588873B1 (en) Treatment of liver cancer
EP0737691B1 (en) Bombesin analogs
RU2088592C1 (ru) Терапевтические пептиды или их фармацевтически приемлемые соли
AU622123C (en) Therapeutic peptides
CA1340988C (en) Therapeutic peptides
JP3743794B2 (ja) ボンベシン類似体
PT95057B (pt) Processo para a preparacao de peptidos terapeuticos

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee