HU208070B - Process for producing lipid suspension - Google Patents

Process for producing lipid suspension Download PDF

Info

Publication number
HU208070B
HU208070B HU903559A HU355990A HU208070B HU 208070 B HU208070 B HU 208070B HU 903559 A HU903559 A HU 903559A HU 355990 A HU355990 A HU 355990A HU 208070 B HU208070 B HU 208070B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
lipid
priority
march
cholesterol
dmso
Prior art date
Application number
HU903559A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT59818A (en
HU903559D0 (en
Inventor
Francis C Szoka
Original Assignee
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ California filed Critical Univ California
Publication of HU903559D0 publication Critical patent/HU903559D0/hu
Publication of HUT59818A publication Critical patent/HUT59818A/hu
Publication of HU208070B publication Critical patent/HU208070B/hu

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1617Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A61K47/544Phospholipids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127Liposomes
    • A61K9/1277Processes for preparing; Proliposomes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás egy hasznos összetevőt becsomagoló meghatározott részecskeméretű lipid-szuszpenzió előállítására.
A liposzómák kisméretű hólyagocskák, (vezikulumok) amelyeket gömb alakot formáló, kettős rétegű amfotikus lipidek alkotnak. A liposzómákat rendszerint az alábbi osztályokba soroljuk: kicsi, egyterű vezikulumok (SUV), nagy, egyterű vezikulumok (LUV) vagy többterű vezikulumok (MLV). A SUV és a LUV típusú liposzómákban definíciószerűen csak egy kettős réteg található, míg az MLV típusúak több, koncentrikusan elhelyezkedő kettős réteget tartalmaznak. A liposzómák különböző anyagok becsomagolására használhatóak, oly módon, hogy a hidrofil komponenseket a vizes fázisú belső térbe, vagy a kettős rétegek közé, illetve a hidrofób anyagokat a kettős rétegbe zárjuk!
A liposzómák a jellemzők széles skáláját mutatják, a mérettől, az összetételtől és a töltésüktől függően. Például a telítetlen lipideket alacsony százalékban tartalmazó liposzómák egy kissé átjárhatóbbak, míg a koleszterolt vagy egyéb szterolokat tartalmazó liposzómák keményebbek és kevésbé átjárhatóak. A liposzómák a töltésüket tekintve lehetnek negatív, pozitív és semleges töltésűek a hidrofil csoporttól függően. Például, a kolin alapú lipidek pozitív töltést juttatnak a liposzómákba, a foszfát és szulfát alapú lipidek negatív töltéssel járulnak hozzá a szerkezet kialakulásához, a glicerin alapú lipidek és a szterolok pedig általában oldatban semlegesek.
A liposzómákat alkalmazzák biológiailag aktív anyagok szállítására. Egy ilyen módszert ír le Allison a 4 053 585. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amelyben negatív töltésű liposzómákba csomagolt néhány antigén vagy elölt M. tuberculosis alkalmazását teszi közzé. Fullerton és munkatársai a 4 261 975. szabadalmi számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban hemagglutinin tüskékre kapcsolt, szeparált influenza membránok alkalmazását teszik közzé, amelyeket liposzómához kötöttek influenza elleni vakcina alkalmazása céljából. Luck és munkatársai a 4 619 913. számú USA-beli szabadalmi leírásban kollagént és/vagy fibrinogént és egy citotoxikus anyagot tartalmazó liposzómákat ismertetnek.
Liposzómaképzési eljárást ismertetnek Lopez-Berenstein és munkatársai a 4 812 312. számú USA-beli szabadalmi leírásban. Gombafertőzések kezelésére nisztatint tartalmazó multilamelláris liposzómákat állítanak elő a találmány szerintitől eltérő módszerrel, az ún. „dried-film” módszerrel.
A liposzómákat használják még olyan összetevők széles skálájának becsomagolására is, amelyeknek kicsi a vízoldhatósága vagy az alkalmazott dózisban elviselhetetlen mérget jelentenek. Példaként említjük az amfotericin B gombaölő antibiotikumot, amely vízben alig oldódik és alkoholok, kloroform és egyéb halogéntartalmú szénvegyületek az oldószerei. Az amfotericin B hatásos gombaölő szer, ugyanakkor a kezeléshez szükséges koncentráció feletti mennyiségben alkalmazva veszélyes méreg. F. C. Szoka és munkatársainak 1987-ben, azAníimicrob Agents Chemother-be.n 37:421-29 megjelent tanulmánya szerint a liposzómába történő becsomagolás úgy tűnik, hogy csökkenti az emlőssejtekre gyakorolt mérgező hatást, mialatt a gombaölő aktivitást relatíve változatlanul hagyja. A sejtekre gyakorolt mérgező képességre és a fungicid aktivitásra gyakorolt hatások függtek a különleges liposzóma összetételtől, a liposzóma struktúrától (SUV, MLV stb.) és a készítés módjától.
Afoszfolipid hólyagocskák (liposzómák) D. Lasic J. Theor. Bioi. (1987) 124:35-41 dolgozata szerint különböző technikákkal készíthetők, amelyek általában „száraz” lipidekből indulnak ki, amelyeket vizes fázisba juttatnak. Majd a hidratált lipidek spontán képezik a liposzómákat. Külön technikákat fejlesztettek ki a liposzómákban található lamellák számának szabályozására és a kívánt méretű részecskék készítésére. Ahol kis anyagmennyiségekre van szükség, a rendelkezésre álló technikák a legtöbb esetben megfelelőek, amint azt G. Gregoriadis a „Liposome Technology” Ι-ΠΙ-ban (Boca Raton, Florida, CRC Press Inc., 1984) is leírja. A hólyagocskák nagy mennyiségben való gyártásakor a lipidek hidratációja a képződés sebességének a meghatározó lépése.
A lipid hidratációjának meggyorsítására a lipideket szerves oldószerben lehet föloldani és ezt követően injektálni a vizes fázisba. Ily módon lehetővé válik a hólyagocskák folyamatos képződése, hiszen az oldószer dialízissel vagy párologtatással eltávolítható.
Etilalkoholt használva oldószerként injektálással meghatározott méretű egyterű liposzómákat lehet készíteni, amint azt S. Batzari és munkatársai [Biochem Biophys Acta (1973) 298:1015-1019] és J. Kremer és munkatársai [Biochemistry (1977) 70:3932-3935] leírják. Ez az eljárás egyterű hólyagocskákat eredményez mindaddig, amíg a lipidkoncentrációja az etanolban 40 mM alatt marad és az etanol végkoncentrációja a vizes szuszpenzióban kevesebb mint 10%, F. Boller és munkatársainak az 1987. július 17-én iktatott 87306202.0. európai lajstromszámú szabadalmi leírása szerint. Ez a két faktor limitálja az etanol injektálással (kb. 4 mM) készített, meghatározott méretű liposzómák koncentrációját. Ez a liposzómáknak meglehetősen híg oldata; a vízoldható anyagok becsomagolási hatékonysága alacsony, míg a lipidekben oldódó anyagok számára nagy térfogatra' vari szükség ahhoz, hogy elegendő mennyiségű anyagot kapjunk. Ezen korlátozó tényezők miatt nem alkalmazzák széles körben az etanolos injektálást a lipid hólyagocskák készítésére, amint azt D. Lichtenberg és munkatársai leírják a „Methods of Biochemical Analysis” 33:337-462 (1988) (D. Glick, ed., John Wiley and sons, N.Y.) számában.
A lipidrészecskék egy amfipatikus lipidnek és egy másik molekulának meghatározott arányú komplexei, amelyek a részecskék szupramolekuláris szerkezetét eredményezik. Az alapvető különbség a liposzómák és a lipidrészecskék között az, hogy egy liposzómának van egy lipidből álló kettős rétege a vizes mag körül, míg a lipidrészecskénél ez hiányzik. Emiatt a különbség miatt a lipidrészecskék a legtöbb esetben nem képesek vízoldható molekulákat becsomagolni. A lipidrészecskék mérete az 5 nM-től az 1000 nM-nél is nagyobb mérettartományban lehet. A végső lipidrészecs2
HU 208 070 Β kék mérete az összetételüktől és a készítés módjától függ. A lipidrészecskékre példák a lipidemulziók [S. Ljungberg és munkatársai, Acta Pharmaseutica Suecica (1970) 7:435440], a lipoproteinek [A. Gotto és munkatársai, Meth. Etizymol. (1986) 129:783-89] és azok ...ok [K. Lovgren és munkatársai, J. Immunoi. Meth. (1987) 98:13743).
Egy új módszer leírását adjuk meg, olyan összetevőket tartalmazó liposzomális szuszpenziók készítésére, amelyek rosszul oldódnak vízben, alkoholokban és halogénezett szénhidrogén oldószerekben. A módszer alkalmazása magas, hatékony becsomagolási rátát biztosít. Továbbá, a módszer megfelelő az ipari méretű gyártásra is és lehet, hogy használható folyamatos technológiában is. A módszer egyéb lényeges előnyei: a liposzómák nagy koncentrációban képződnek, adott átmérővel keletkeznek, egyszerűség, kedvező a részecskeképződés sebessége, könnyű áttérni vele nagy térfogatokra, lehetőség van olyan anyagok becsomagolására, amelyek rosszul oldódnak vízben/szerves oldószerben, de kitűnő az oldékonyságuk nem vizes oldószerekben.
A módszer magában foglalja a gyengén oldódó komponenst és a megfelelő lipideket tartalmazó oldatnak a készítését, olyan, akár oldódást segítő mennyiségű alacsony rendű alkoholt tartalmazó aprotikus oldószerben, mint a DMSO, és a keletkező oldat kívánt méretű készüléken keresztül történő injektálását a megfelelő ionerősségű és gyógyszert vagy más hasznos összetevőt tartalmazó, kevertetett vizes oldatba. A módszer alkalmas folyamatos termelésre. A kapott liposzóma szuszpenzió, amennyiben szükséges dializálható vagy egyéb módon koncentrálható.
A rajzok rövid leírása
1. ábra bemutatja a keverés mértékének hatását a liposzóma átmérőjére, amint azt az I. példában bemutatjuk.
2. ábra bemutatja a befecskendezés mértékének hatását a liposzóma átmérőjére.
3. ábra bemutatja a befecskendezési térfogat hatását a liposzóma átmérőjére.
4. ábra bemutatja a vizes oldat térfogatának hatását a liposzóma átmérőjére.
5. ábra bemutatja a növekvő, nem vizes oldószer térfogatának hatását (állandó lipidkoncentráció és vizes oldat térfogat mellett) a liposzóma átmérőjére.
6. ábra bemutatja a vizes oldat hőmérsékletének hatását a liposzóma átmérőjére.
7. ábra bemutatja a vizes fázis ionerősségének hatását a liposzóma átmérőjére.
8. ábra bemutatja a vizes oldat oldatösszetételének hatását a liposzóma átmérőjére.
A 9. ábra bemutatja a vizes oldatban levő karbamid koncentrációjának hatását a liposzóma átmérőjére.
A 10. ábra bemutatja a vizes oldat pH-jának hatását a liposzóma átmérőjére.
All. ábra bemutatja az etil-alkohol DMSO arányának hatását a liposzóma átmérőjére.
A 12. ábra bemutatja a befecskendezést követő etilalkohol koncentráció hatását a liposzóma átmérőjére.
A 13. ábra bemutatja a különböző alkanol/DMSO keverékek hatását a liposzóma átmérőjére.
A 14. ábra bemutatja az etil-alkoholt tartalmazó különböző nem vizes oldószerek hatását a liposzóma átmérőjére.
A 15. ábra bemutatja a lipidkoncentráció hatását a liposzóma átmérőjére etil-alkohol és három különböző DMSO/alkanol keverék esetében.
A találmány megvalósítási módjai
A. Meghatározások
A „gyengén oldódó komponens” kifejezést ebben az esetben azokra az anyagokra használjuk, amelyek fiziológiás hőmérsékleten és pH értéken nagyon gyengén vagy gyakorlatilag egyáltalán nem oldódnak (kevesebb mint 1 mg/ml koncentrációt érhetnek el) a standard oldószerekben. A „standard oldószerek” közé tartoznak a víz és a vizes oldatok, a rövidebb szénláncú alkoholok (például metanol, etanol, propanol, i-propanol, butanolok, tercier-butanol és egyéb hasonló szerek) és a halogénezett szénhidrogének (például diklórmetán, kloroform, 1,1,1-triklórmetán és egyéb hasonló szerek). A megfelelő gyengén oldódó komponensek közé tartoznak a ciszplatin, doxorubicin, epineífin, mebendazol, a polién antibiotikumok mint az amfotericin B, nisztatin, a primaricin és az ezekhez hasonló vegyületek.
A „megfelelő lipid” kifejezés ebben az esetben egy olyan amfipatikus komponensre vonatkozik, amely képes ama, hogy liposzómát hozzon létre és gyakorlatilag nem mérgező ha a liposzóma készítéshez szükséges koncentrációban alkalmazzuk. A megfelelő lipidek általában egy poláris vagy hidrofil és egy apoláris vagy hidrofób véggel rendelkeznek. K. R. Patel és munkatársai közleménye [Biochim. Biophys Acta (1985) 5/4:256-64] szerint a megfelelő lipidek közé tartoznak a tojás foszfatidil-kolinja (EPC), a tojás foszfatidil-glicerolja (EPG), dipalmitoil-foszfatidil-kolin (DPPC), koleszterol (Chol.), koleszterol-szulfát és sói (CS), koleszterol-hemiszukcinát és sói (Chems), koleszterolfoszfát és sói (CP), koleszterol-ftalát, koleszteril-foszforil-kolin, 3,6,9-trioxioktán-l-ol-koleszteril-3e-ol, dimirisztidil-foszfatidil-glicerol (DMPC), hidrogénezett szója foszfatidil-koiin (HSPC) és egyéb hidroxikoleszterol vagy aminokoleszterol származékok.
A „becsomagoló mennyiség” kifejezés arra a lipid mennyiségre vonatkozik, amely szükséges a gyengén oldódó komponensek becsomagolásához és ahhoz, hogy a megfelelő méretű liposzómák vagy lipidrészecskék képződjenek. A liposzómák vagy lipidrészecskék átmérőjének kívánt átlagos mérete 1000 nm alatt van, de lehetőleg több mint 20-200 nm. A becsomagolási mennyiség függ a becsomagolandó különleges komponenstől és a választott körülményektől, általában lipid:komponens arány 2:1-től 1:100-ig terjedhet, de előnyösebb 1:1-1:20 arányok között tartani.
A „meghatározott részecske méretű lipid-komponens szuszpenzió” általánosítva a találmány komplexeire vonatkozik, amelyek a megfelelő lipidből és egy
HU 208 070 Β becsomagolandó vagy komplex képzó'désbe vinni kívánt komponensbó'l keletkeztek. A meghatározott méretű lipid-komponens szuszpenziók tartalmaznak liposzómákat és lipidrészecskéket az 1000 nm alatti mérettartományban, melyből a 20-600 nm közötti eloszlás a legkedvezőbb.
A jelen esetben használt „lipidrészecske” kifejezés nem meghatározott szerkezetű részecskékre vonatkozik, amelyek egy megfelelő lipidből és egy becsomagolt vagy komplexált komponensből tevődnek össze. A polién antibiotikumok magas antibiotikuműipid arány esetén szívesebben képeznek lipidrészecskéket, mint liposzómákat a polién szerkezet és annak lipidekkel való kölcsönhatása miatt. A lipidrészecskék lehetnek lamellázott szerkezetűek, de nem szükségszerű, hogy bármilyen meghatározható szerkezetet mutassanak. Ezeknek a részecskéknek a szerkezete jelenleg még nem ismert.
A jelen esetben használt „nem vizes (aprotikus) oldószer” kifejezés azokra az oldószerekre vonatkozik, amelyek nem hidrogén donorok és nem tartoznak a szénhidrogén vagy a halogénezett szénhidrogén oldószerek közé. Jelenleg az etanolt és a metanolt alkalmazzák, de különösen az etanolt részesítik előnyben.
B. Általános módszer
A találmány összetételei a következőképpen készülnek: egy gyengén oldódó komponenst föloldunk egy nem vizes oldószerben a becsomagoláshoz szükséges mennyiségű, megfelelő lipiddel együtt. A nem vizes oldószer, amennyiben a lipidoldásához szükséges, kiegészítőként tartalmazhat rövidebb szénláncú alkoholt. A kapott oldatot azután állandó keverés mellett extrudáljuk egy vizes oldatba és ily módon liposzómák, illetve lipidrészecskék szuszpenziójához jutunk. Amennyiben kívánatos, a szuszpenzió dializálható vagy egyéb módon is bekoncentrálható.
A nem vizes oldószer a dimetil-szulfoxid (DMSO), dioxán, dimetil-formamid (DMF), aceto-nitril, 1,2-dimetoxi-etán (DME), Ν,Ν-dimetil-acetamid (DMA), szulfolán, gamma-butirolakton, 1-meti]-2-pirrolidinon (MP) és metil-pirrolinból álló csoportból kerül ki. Jelenleg leginkább a DMSO-t használják.
A nem vizes oldószerben lévő lipidkoncentrációja változik a választott lipid vagy lipidkeveréktől függően. A találmány gyakorlata szerint az alkalmazott lipidkoncentráció a 2-400 mM, azon belül a 40-120 mM koncentráció tartományban van. Előnyös ha a lipidoldat tartalmaz rövidebb szénláncú alkoholokat, elsősorban etil-alkoholt vagy metanolt, 1:2-től 8:1-ig terjedő oldószer alkohol arányban. Jelenleg a legelfogadottabb az 1:1-7:3 DMSO:alkohol arány.
A gyengén oldódó komponenst a használt nem vizes oldószerben vagy a nem vizes oldószer/alkohol keverékben tapasztalt oldhatósága alapján választják ki. A komponensnek az alkalmazott lipidhez viszonyított aránya a 2:1 és a kb. 1:100 komponens : lipid arány között változhat, leginkább az 1:1- 1:20 között alakul az alkalmazott komponenstől függően. A polién típusú komponensek, mint az amfotericin B esetében a jelenleg használt arány körülbelül 1:1. Vízben oldható vegyületeket vizes fázisban oldják vagy szuszpendálják fel a kívánt komponensdipid aránynak megfelelő koncentrációban.
A komponens/lipidoldatot ezután extrudálják vagy befecskendezik és egy megfelelő vizes oldatba. Az extrudáló feltét lehet fecskendő, perforált korong vagy cső vagy egyéb megfelelő megoldás, amely kb. 0,05 mm-től 5 mm-ig terjedő, de leginkább kb. 0,8 mm-es nyílást biztosít. Egy színtereit lemez szintén használható, amelynek 0,1-50 u normális retenciós mérete van. A találmány eljárása nem érzékeny az extrudációs arányra; a javasolt arány kb. 0,510 ml/perc/nyílás a kényelem kedvéért. A módszer nem különösebben érzékeny a keverési arányra sem. A vizes fázis keverésére leginkább a 150 rpm-et használják. A vizes oldat a lipidoldékony komponensek számára tartalmazhat kis mennyiségű pufferáló összetevőket, tartósítószereket és hasonló adalékokat, de az ionerősség ne haladja meg a kb. 1 M NaCl oldat, vagy még inkább a 0,1 M NaCl ionerősségét, de leginkább ajánlott a 10 mM NaCl ionerősségnek megfelelő érték alatt maradni. A vizes fázis hőmérséklete általában az alkalmazott lipidek átmeneti hőmérséklete és az aprotikus oldószer/alkohol keverék forráspontja között van. A kívánatos hőmérséklet tartomány a 25-80 °C, de még előnyösebb a 30-60 °C közötti hőfok. A lipidoldat hőmérséklet tartománya a nem vizes oldat/alkohol keverék fagyáspontjától a forráspontjáig terjedhet, de általában a környezeti hőmérséklet a kívánatos. A találmányban leírt folyamat szempontjából a vizes oldat térfogata nem különösebben kritikus és lehetőleg minimalizálva van annak érdekében, hogy elősegítse a képződött liposzómák vagy lipid részecskék koncentrációjának növelését. Általában a lipidoldat vizes oldathoz viszonyított aránya 1:25 és 1:1 között lehet, de leginkább 1:10-től 1:25-ig terjed.
Amennyiben szükséges, a kapott liposzómák vagy a lipidrészecskék szuszpenziója az általánosan használt technikák, mint a centrifugálás, dialízis, diaiszűrés és ezekhez hasonló módszerek segítségével bekoncentrálható.
A megfelelő módon kezelt szuszpenziókban a gyengén oldódó komponensek becsomagolódnak. Abban az esetben, ha a komponens biológiailag aktív alkotórész, a szuszpenziókat parentálisan alkalmazzák, például izomba, bőr alá, vagy intravénásán injekció formájában. Egyéb alkalmazási módok lehetnek a szemcseppek, a szájspray vagy szájban olvadó drazsé, esetleg kenőcs.
C. Példák
Az alábbiakban ismertetésre kerülő példák további útmutatást adnak a szakterületen általában jártas gyakorló szakembereknek és nem arra szolgálnak, hogy a találmány korlátozásaként értelmezzék azokat.
Módszerek és anyagok
Az alábbi példákban a tojás foszfatidil-kolin (EPC), tojás foszfatidil-glicerin (EPG), dipalmitoil-foszfatidilkolin (DPPC) a Sigma Inc.-től (St. Louis, Mo.,) szár4
HU 208 070 Β mazik kloroform/etil-alkohol oldat formájában. A koleszterin (Chol), koleszterol szulfát (nátrium só) (CS) és a koleszterin-hemiszukcinát (Tris só) (Chems) por formában szintén a Sigma-tól származik. Néhány kísérletben a használt EPC-t, a dimirisztoil-foszfatidilglicerint, dimirisztoil-foszfatidil-kolint és a hidrogénezett szója foszfatidil-kolint (HSPC) száraz porként a kölni Natterman cégtől kaptuk. A fenti foszfolipidek vékonyréteg kromatográfiás képén, melyet szilika gél 60-as lemezen (Merck) kloroform/metanol/víz (65/25/4) keverékével, nagy mennyiségű anyag fölvitelével végzett futtatással kaptunk csak az adott komponens volt kimutatható. A DL-a-tokoferol a Serva-tól származott. A cisz-piatinum a Bristol Myers (Syracuse, N.Y.) terméke volt. A doxorubicint laktóz tartalmú liofilizált por formájában a Farmi tál ia-tól vettük. Az 1metil-2-pirrolidinon (MP), az 1,2-dimetoxi-etán (DME), a gamma butirolakton, a laktóz, a karbamid, az amfotericin B (AmpB), a nisztatin és a primaricin a Sigma-tól származtak. Az egyéb vegyszerek reagens minőségűek voltak. A fentiek kivételével az oldószerek a Merck-től származtak és tiszta vagy HPLC minőségűek voltak. Az abszolút etanol (EtOH) a Merck-től származik. Valamennyi oldat készítéséhez kétszer desztillált, ionmentes vizet használtunk.
Lipid törzsoldatok készítése A lipideket ismert tömegű, kerek aljú edénybe bemértük vagy kloroform/ etanol oldatból kimérve az oldószert rotációs bepárlón eltávolítottuk. Erős vákuum alá helyeztük a lipideket szobahőmérsékleten 24 órára. Ezután újra lemértük a lombikokat majd állandó térfogatra föltöltöttük száraz alkohollal egy mérőlombikban, így megkaptuk a lipid törzsoldatot állandó koncentrációban. A tojás foszfatidil-kolin, 0,05 mól százalék tokoferolt tartalmazó, tiszta, 300—400 mM-os törzsoldatát rendszerint nitrogén atmoszférában készítettük, az alkoholos oldat 60 °C-ra történő hevítésével. A DPPC-t és HSPC-t melegítéssel oldottuk föl 300 mM koncentrációban. Ebben a koncentrációban, amikor a hőmérséklet 20 °C-ra lecsökkent a HSPC gélt képezett. Valamennyi lipidoldat készítésére vízmentes oldószert használtunk és az előzetes számításokat úgy végeztük, hogy a legkevésbé tegyük ki az oldatokat az atmoszféra hatásainak. Amikor egyéb alkoholokat, mint pl. metanolt (MeOH), propánok, izopropanolt és tercier-butanolt használtunk a tojás foszfatidil-kolint 400 mM koncentrációban, 60 ’C-ra melegítve oldottuk fel. Az alkoholos lipidoldat különböző más oldószerekkel, térfogatarányok szerint képzett keverékeit úgy készítettük, hogy az alkoholos lipidoldatot egy mérőlombikba pipettáztuk és a második oldószerrel jelig töltöttük. A koleszterolt etanolban melegítéssel oldottuk 100 mM koncentrációban; miután lehűlt szobahőmérsékletre kikristályosodott az oldatból. Bizonyos kísérletekben a koleszterolt l-metil-2-pirrolidinonban oldottuk 364 mM koncentrációban. A koleszterol-szulfátot és a Chems-et dimetil-szulfoxidban (DMSO) oldottuk 71 mM koncentrációban. A lipidek keverékét a törzsoldatokból készítettük térfogatarányok alapján. A lipid törzsoldatokat -20 °C-on, nitrogén atmoszférában tároltuk. A liposzóma készítéshez használt foszfolipid végső koncentrációját savas emésztés után végzett foszfor méréssel határoztuk meg, G. Bartlett által a J. Bioi. Chem.-ben (1989) 234:466-468 leírt módszer alapján.
Egy 15 ml térfogatú, víz-köpenyes üvegből készült reakció edényt használtunk a vizes fázis tárolására. Az edény hőmérsékletét, ha másként nem jelöltük, 30 ’Con tartottuk egy ellenőrzött hőfokú vízfürdőből származó fűtővíz keringetésével. Az edényt egy mágneses keverőre tettük és egy 1 cm hosszú mágneses keverőbotot tettünk az aljára. A keverőbot forgási sebességét egy ellenállás segítségével szabályoztuk és biztosítottuk a folyamatos keverést kb. 1000 rpm sebességgel. Az oldószer befecskendezésének tipikus körülményei a következők voltak: az edénybe helyeztük a 3 ml térfogatú befogadó, vizes fázist és a mágneses keverőt 750 rpm sebességre állítottuk. Hagytuk, hogy a vizes fázis hőmérséklete elérje a szükséges hőmérsékletet. Egy szorosan záró 0,5 ml-es Hamilton fecskendőt használtunk 0,5 ml-nél kisebb térfogatok befecskendezésére. A 0,5 ml és 3 ml közötti térfogatok injektálására 3 ml térfogatú műanyag fecskendőket használtunk. A fecskendőt úgy helyeztük el, hogy az edény közepére essen közvetlenül a mágneses keverő fölé és az injekciós tű (25-ös) vége 2-4 mm-rel volt a keverő fölött, a vizes fázisba érve. Egy tipikus kísérletben 0,3 ml lipidoldatot fecskendeztünk be 3-6 ml/perc (5s) sebességgel. Ez az összeállítás nagyon gyors és tökéletes keveredést biztosított a lipidoldat és a vizes oldat között, A keveredést megfigyelhettük a lipidoldathoz adott és a vele együtt befecskendezett festék segítségével. A lipidszuszpenziót 5 percig kevertettük, majd kivettük az edényből és egy dialízis zacskóba helyeztük. A mintát mintegy 100-szoros térfogatban dializáltuk és 24 óra alatt kétszer cseréltük a puffért. Amint az kiderült a rendszer meglehetősen működőképes, és hasonló átmérőjű részecskéket produkál a különböző befecskendezési körülmények (keverés sebessége, befecskendezés sebessége, hőmérséklet, befogadó térfogat, víz:oldószer arány) esetén is.
A részecskék átmérőjének meghatározása
A részecske átmérőt dinamikus fény szóródást hasznosító, hélium-neon, 100 mW-os gáz lézerrel és Malverin K7027-es korrelátorral határoztuk meg. Minden egyes meghatározásra legalább három mérést végeztünk. Az átmérőt és a polidiszperzitást is három meghatározás után adtuk meg.
1. példa (A liposzóma képződés paraméterei)
A következő kísérletek a folyamat paramétereinek a végső liposzóma termékekre gyakorolt hatásának meghatározásához kapcsolódtak.
(A) A befecskendezés körülményeinek hatása
Elsőként a befecskendező rendszert vizsgáltuk egy oldószer keverékben oldott festék segítségével. Megfigyeltük, hogy gyors keveredést eredményezett, ha a fecskendő hegyét a vizes fázisba, közvetlenül a keverő5
HU 208 070 Β bot fölé tettük. Amikor egy 0,2 ml térfogatú, DMSO:EtOH (7:3) oldószerben készült, 70 mM-os EPC oldatot fecskendeztünk 2 ml vízbe, amint az oldat elkeveredett, egy gyengén opálos szuszpenziót kaptunk. Kevertetés nélkül a részecskeátmérő 152 nm volt. Ahogy a keverési sebességet 250 rmp-re növeltük, a részecskeátmérő 71 nm-re csökkent (1. ábra). A kapott részecskeátmérő a keverési sebesség további, 750 rpmre történt emelése mellett is állandó maradt. Valamennyi következő kísérletben a keverési sebességet 750 rmp értéken tartottuk.
A képződő liposzómák átmérője viszonylag érzéketlen volt a befecskendezés sebességére a 0,4 ml/perc és 6 ml/perc közötti tartományban (2. ábra). Valamennyi következő kísérletben a befecskendezés sebessége 2-6 ml/perc volt.
Amikor a vizes fázis térfogata állandó volt, de a lipid és az oldószer mennyiségét növeltük, a képződő részecskék átmérője alig változott (3. ábra). Amikor a vizes fázis térfogatát növeltük 2 ml-ről 5 ml-re, de az oldószernek a vizes fázishoz viszonyított aránya és a végső lipidkoncentráció állandó maradt, a részecskeátmérő enyhe csökkenést mutatott 68 nm-ről 48 nm-re (4. ábra). Valamennyi következő kísérletben a vizes fázis térfogata legalább 3 ml, de a legtöbb esetben 4 ml volt.
Amikor a befecskendezett lipid és a vizes fázis mennyisége maradt állandó, de a befecskendezett oldószer térfogatát növeltük, a képződő részecskék átmérője nem változott. (5. ábra) A vizsgált legmagasabb koncentrációnál a befecskendezés után a végső keverék 50% oldószert tartalmazott.
Ezekben a kísérletekben a vizes fázis hőmérsékletét 30 °C-on tartottuk, bár a vizes fázis hőmérsékletének 30 és 80 °C közötti változtatása csekély hatással volt a képződő részecskék átmérőjére. (6. ábra) Valamennyi következő kísérletben a vizes fázis hőmérsékletét 30 °C-ra szabályoztuk be. A lipidoldatokat szobahőmérsékleten (20-24 °C) használtuk.
így a kezdeti kísérletek megmutatták, hogy a nagy számú változó tényező, amely feltételezésünk szerint befolyásolhatta a befecskendező rendszert, relatíve nincs hatással az oldószer befecskendezésének folyamata során a képződő vezikulumok átmérőjére.
(B) A vizes fázis hatása
Számos liposzóma készítésre szolgáló eljárás során a vizes fázis azon tulajdonságai, mint az ionerősség, a pH és a pufferek típusai, befolyásolhatják a képződő liposzómák tulajdonságait. Egyenes arányosság (r2=0,88) volt megfigyelhető a vezikulák átmérője és a moláris NaCl koncentráció logaritmusa között (7. ábra). Az ionerősségnek a vezikula átmérőre gyakorolt ezen a hatását mindkét esetben tapasztaltuk, amikor a 0,001-től 1,0 mM-ig terjedő sókoncentráció értékekkel titráltunk. Amikor kettő vagy több készítményt összehasonlítottunk, mindig azt tapasztaltuk, hogy magasabb ionerősségű oldatban képződött vezikulumok átmérője nagyobb, annak ellenére, hogy minden egyéb körülmény azonos volt.
Ionmentes oldatok (glicerol, laktóz vagy karbamid) vizes fázishoz történő hozzáadása nem volt hatással a vezikulumok átmérőjére (8. ábra), még akkor sem, amikor a karbamid koncentrációját 0-ról 8 M-ra emeltük (9. ábra). Ez azt sugallja, hogy sóhatás az ioneró'sség, és nem a vizes szuszpenzió ozmolaritásának változása miatt lép fel.
A vizes fázis pH változása pH=10 és pH=4 között, egy viszonylag állandó ionerősség mellett, kevés hatással van a vezikulák átmérőjére (10. ábra). Bár a pH=2nél képződött vezikulák örvendetesen kisebbek voltak, mint magasabb pH értékek esetén.
(C) Az oldószerkeverék hatása
Az előzetes kísérletek jelezték, hogy az oldószerek természete és az oldószerkeverékben lévő lipidkoncentrációja befolyásolta a lipid szuszpenzió megjelenését és a fényszóródással mért vezikula átmérőt. Ezen két paraméter hatását megvizsgáltuk 40 mM koncentráció mellett, ami Kremer és munkatársainak közleménye [Biochemistry (1977), /6:3932-3935] szerint az EtOH-s befecskendező módszer esetén az egykamrás vezikulák képzó'désének maximális koncentrációja, valamint két- és háromszor nagyobb lipidkoncentráció esetén. A DMSO:EtOH arányt 8:2-től abszolút EtOHig változtatva nem tapasztaltuk a vezikulák átmérőjére gyakorolt szignifikáns hatást (11. ábra).
A klasszikus EtOH befecskendezéses technika során a vizes fázisban, állandó befecskendezett lipidkoncentráció mellett az EtOH végső százaléka befolyásolta a képződő vezikulák átmérőjét. Ez a hatás látható a 12. ábrán, ahol a vezikulum átmérője úgy változik, ahogyan az EtOH százaléka növekszik a keletkező szuszpenzióban. Összehasonlításképpen megemlítjük, hogy 7,5% végső oldószer tartalom esetén, azonos lipid koncentráció mellett a DMSO:EtOH keverékből keletkező vezikulák átmérője 93 nm volt, míg a tiszta EtOH esetében ez az érték 483 nm. Amint azt föntebb megjegyeztük, DMSO:EtOH keverék alkalmazásakor a végső oldószer arányát 50%-ra növelve, az oldószer alig változtatta meg a vezikula átmérőjét (5. ábra).
Mivel a 2:1-es DMSO:EtOH arány elég jól oldja a lipideket, megvizsgáltuk, hogy az alkohol megváltoztatása, állandó lipidkoncentráció esetén milyen hatással van a vezikulák átmérőire (13. ábra). Ennél a lipid koncentrációnál a DMSO EtOH-val és MeOH-val készült keverékei adták a legkisebb átmérőt, 114 nm-t és 154 nm-t. Propanol és i-propanol, DMSO-val összekeverve, szignifikánsan nagyobb átmérőket (295 nm és 254 nm) eredményezett. Végül, a terc-butanol:DMSO keverékekkel kaptuk a legnagyobb átmérőjű (832 nm) vezikulákat. Az utóbbi három oldószerkeverék olyan vezikula szuszpenziókat eredményezett, amelyek dialízis után leülepedtek. A három szuszpenzió mikroszkópos vizsgálatával láthatóvá vált, hogy klasszikus MLV megjelenésű kicsi és nagyobb szerkezetű vezikulák keverékei [A. Bangham és munkatársai, J.Mol. Bioi. (1965) /3:238-252],
Etanollal együtt alkalmazott társoldószer szintén
HU 208 070 Β befolyásolta a keletkező vezikulák átmérőjét (14. ábra). A legkisebb átmérőjű (113 nm) vezikulákat a DMÍ>0 szolgáltatta. A dioxán, a dimetil-formamid, az aceto-nitril és az l-metil-2-pirrolidinon 160-200 nm-es vezikulákat produkáltak. A tetrahidrofurán/EtOH és a tiszta EtOH esetében 800 nm-nél nagyobb átmérőjű vezikulák keletkeztek (14. ábra). A két utolsó liposzóma szuszpenziót, a dialízis után nagy, MLV szerkezetű struktúrák alkották, amelyek, amint mikroszkópon látható, erősen aggregálódtak.
(D)A lipidkoncentráció befolyása
Az eredeti etanolos módszerben fontos paraméter volt a lipidkoncentrációja az etanolban. A lipidkoncentráció hatását megvizsgáltuk etil-alkoholban és három DMSO:alkohol (2:1) oldószerkeverékben: EtOH, MeOH, és propanol (15. ábra). Amint azt föntebb megjegyeztük, amikor az alkoholban a lipidkoncentrációja meghaladja a 40 mM-t a keletkező vezikulák átmérője jelentékeny mértékben megnövekszik. 40 mM-nál 83 nm, míg 121 mM-nál 650 nm volt a vezikulák átmérője. A DMSO/propanol keverék esetén szintén a vezikula átmérő és a készítmény polidiszperzitásának (0,24-ről 0,59-re) növekedéséhez vezetett, amikor a lipidkoncentrációt 121 mM-ra növeltük. A DMSO/EtOH és DMSO/MeOH keverékek körülbelül 50 nm átmérőjű vezikulákat képeztek az alkalmazott legalacsonyabb, és kb. 150 nm-eseket a legmagasabb lipidkoncentrációnál (15. ábra). A vezikula preparátumok polidiszperzitása efölött a koncentrációtartomány fölött 0,250 és 0,370 értékek között változott az EtOH és MeOH tartalmú oldószerkeverékek esetében.
A magas lipidkoncentrációknál fényszóródással mért megnövekedett vezikula átmérők tükröződtek a készítmények megjelenésében is. EtOH és a propanol/DMSO keverékekkel 121 mM lipid esetén nagyon zavaros szuszpenziót láthatunk és sokkal kevésbé opálos szuszpenzió keletkezik EtOH/DMSO és MeOH/DMSO keverékek befecskendezését követően.
2. példa (A doxorubicin becsomagolása)
Arák gyógyszeres kezelésében a doxorubicin egy nagyon fontos gyógyszer. Számos kutató kimutatta, hogy amikor ezt a gyógyszert liposzómába csomagolt formában alkalmazzák, mérgező hatása az állatokban lecsökkent. Valamennyi, korábban ismertetett, doxorubicin becsomagolására szolgáló liposzóma készítésére a száraz lipidek hidratálását alkalmazták, a gyógyszer pH=7,4-en tapasztalt alacsony vízoldhatósága ellenére. A doxorubicin nagyon jól oldódik DMSO-ban, így szinte kínálja magát a találmány DMSO befecskendezéses eljárására.
A doxorubicint feloldottuk DMSO-ban és hozzáadtuk az EPG:EPC:Chol (7:3:6) alkoholos oldathoz úgy, hogy a végső, doxorubicin koncentráció 6,2 mM, a végső teljes lipidkoncentráció pedig 96,4 mM volt egy DMSO : EtoH (7 : 3) oldószer keverékben. A lipid vezikulákat úgy készítettük, hogy a lipid-doxorubicin oldat 1 ml-ét befecskendeztük 2 ml 140 mM NaCl-ból és 10 mM Tris-HCL-ből (pH=4,0) álló, 30 °C-os vizes fázisba. A lipidszuszpenziót dializáltuk, 2 órán keresztül szobahőmérsékleten 100-szoros térfogatú 140 mM NaCl-10 mM Tris, pH=4,0 (Tris-HCl) oldattal szemben. A liposzómába becsomagolt doxorubicint a be nem csomagoktól oszlop kromatográfiával választottuk el egy 1x40 cm-es Sephadex G-50 oszlopon, NaCl-Tris-sel végzett elúcióval. A vezikula csúcsban visszanyert doxorubicin mennyiségét korrigáltuk az eljárás során lezajlott térfogat változásokkal és viszonyítottuk a befecskendezett kiindulási mennyiséghez, így megkaptuk a becsomagolás hatékonyságot. A liposzóma/doxorubicin készítmények Triton Χ-100-zal és melegítéssel történt feloldását követően spektrofotométerrel 480 nmes hullámhosszon megmértük a doxorubicin koncentrációját.
A kapott vezikula átmérő 227 nm volt és a doxorubicin 41,2%-a becsomagolódott a részecskékbe.
3. példa (Polién lipid komplexek készítése) (A) Amint azt R. New és munkatársai Antimicrob Chemoterap (1987) 8:371-381; G. Lopez-Berestein és munkatársai „Biophysics.to Therapeutics” (M. Ostro, Ed. 1987) 253-76; E Szoka és munkatársai Antómicrob Ag Chemoterap (1987) .3/:421-429, közleményekben leírták az amfotericin B liposzómák vagy lipidrészecskék készítése mindig technikai problémákat jelentett, mert N. Rajagopalan és munkatársai szerint [7 Parenteral Sci Tech (1988) 42:97-102] a polién antibiotikumok a legtöbb oldószerben gyengén oldódnak. A polién antibiotikumoknak a legtöbb oldószerben tapasztalt korlátozott oldhatósága miatt a korai készítmények előállítása nagy mennyiségű olyan oldószert igényelt, mint a metanol (Lopez-Berenstein, 1987). A készítéskor fölhasznált oldószer csökkentése érdekében az amfotericin B-t DMSO-ban adtuk a lipid száraz filmjeihez, hogy ily módon képezzenek amfotricin B liposzómákat. Ez azonban nem eredményezett kis átmérőjű készítményeket és további olyan jelentős készítési lépéseket igényelt, mint a szonikálás annak érdekében, hogy biztosítsuk az állatokban történő felhasználáshoz megfelelő formát.
A találmány módszerének kifejlesztése lehetővé tette ezen készítmények egyszerű előállítását. Nemcsak a polién antibiotikumok, hanem a Chems és a CholSO4 is oldódnak DMSO-ban. A koleszterol kiválóan oldódik 1metil-2-pirrolidinonban. Ezek alapján az oldószer befecskendezéses módszert használtuk a polién/szterol komplexek készítésére. Az 5 mM amfotericin B-t tartalmazó készítményeket könnyen előállítottuk számos módon (1-4. táblázatok). A polién antibiotikumok esetén, a készítést követő, a be nem épült gyógyszer eltávolítása érdekében végzett erőteljes dialízis után több 90%-ot visszanyertünk. Ezek az összetételek 1:1 vagy 1:2 poliéndipid arányt mutattak, így a képletben az aktív komponens tömeg százaléka igen magas. A koleszterolból, a Chems-ból és a CholSO4-ből 1000 nm alatti átmérőjű komplexek készíthetők (1. táblázat). Szintén készítettünk három megfelelő, DPPC-t és Chems-t vagy Chol-t tartalmazó komplexet (2. táblázat).
HU 208 070 Β
1. táblázat
Amfotericin B/lipid komplexek készítése oldószer befecskendezéssel
Lipid aránya Oldószer15 Vizes fázis Átmérő0 (nm)
Chol 1:1 DMSO.EtOH 7:3 10 mM Hepes 451
Chol 1:1 pMSO:MPl:l NaCl-Hepes >1500
Chems 1:1 DMSO NaCl-Hepes >1500
Chems 1:1 DMSO 10 mM Hepes 90
Chems l:ld DMSO 10 mM Hepes 160
CholS04 1:1 DMSO NaCl-Hepes >1500
CholS04 1:1 DMSO 10 mM Hepes 143
DPPC 1:1 DMSO:EtOH 7:3 NaCl-Hepes >1500
DPPC 1:1 DMSO:EtOH 7:3 10 mM Hepes >1500
DPPC 1:1 DMSO:EtOH 7:3 NaCl-Hepes >1500
a. amfotericin B:lipid arány
b. 0,25 ml térfogatú oldószert fecskendeztünk be a jelzett puffer 3,0 ml-ébe, 30 °C-on. A puffer pH-ja 7,4 volt.
c. A képződési pufferben végzett dializálás után mértük meg a részecskék átmérőjét. Az 1500 nm-nél nagyobbnak feltüntetett értékek esetében olyan nagy méretű részecskék voltak jelen, amelyeket nem lehetett megmérni a dinamikus fényszóródás módszerével. Minden esetben, amikor az átmérő nagyobb volt, mint 1500 nm, a készítményeknél erőteljes aggregálódást és ülepedést figyeltünk meg a dializáló zacskóban.
d. A jelzett puffer 3,0 ml-ébe fecskendezett oldószer térfogata 1,0 ml volt.
2. táblázat
Amfotericin B/többszörös lipid komplexek készítése oldószer befecskendezéssel
Komponens arány4 Oldószer15 Vizes fázis Átmérő0 (nm)
Chol.DPPC 1:1:1 DMSO:EtOH 7:3 10 mM Hepes 254
ChokDPPC 1:1:1 DMSO:EtOH 7:3 NaCl-Hepes >1500
Chems:DPPC 1:1:1 DMSO:EtOH 7:3 NaCl-Hepes >1500
Chems:DPPC l:l:ld DMSO:EtOH 7:3 10 mM Hepes 92
Chems:DPPC 1:1:1 DMSO:EtOH 7:3 NaCl-Hepes >1500
Chems:DPPC 1:1:1 DMSO:EtOH 7:3 NaCl-Hepes >1500
a. amfotericimlipid arány
b. A jelzett puffer 3,0 ml-ébe 0,25 ml oldószert fecskendeztünk be 60 °C-on. A puffer pH-ja 7,4 volt.
c. A képződési pufferben végzett dializálás után mértük meg a részecskék átmérőjét. Az 1500 nm-nél nagyobbnak feltüntetett értékek esetében olyan nagy méretű részecskék voltak jelen, amelyeket nem lehetett megmérni a dinamikus fényszóródás módszerével. Minden esetben, amikor az átmérő nagyobb volt, mint 1500 nm, a készítményeknél erőteljes aggregálódást és ülepedést figyeltünk meg a dializáló zacskóban.
d. A vizes fázis hőmérséklete 30 °C volt.
Az amfotericin B (30 mM) és nisztatin (50 mM) polién antibiotikumok oldatait DMSO-ban készítettük. A Sigma-tól kapott primaricin vizes szuszpenziót liofilizáltuk, majd újra felszuszpendáltuk különböző oldószerekben. A primaricin nagyon jól oldódott DMSO-ban, de miután két órát állt szobahőmérsékleten, csapadék keletkezett, amelyet nem tudtunk újra szuszpendálni melegítéssel sem. Stabil, sárga primaricin oldatot készíthetünk DMS0:MP (1:1) oldószerkeverékben. A polién antibiotikumokat különböző lipidekkel kombináltuk DMSO, DMS0:MP vagy DMSO:EtOH (7:3) oldószer keverékben, majd a vizes fázisba fecskendeztük. A képződött preparátumokat dializáló zacskóba tettük és mintegy 100 térfogatnyi, ha másképp nem jeleztük kétszer cserélt, desztillált vízzel dializáltuk. A komponensek arányát, a pontos oldószer keveréket és egyéb körülményeket, az eredményekkel együtt adjuk meg. A készítmények mintáit metanolban föloldottuk és spektrofotométeren meghatároztuk a poliének koncentrációját; az amfotericin B-t 406 nm-en, a nisztatint 306 nm-en és a primaricint 318 nm-en.
A polién antibiotikumokat tartalmazó készítmények érzékenyek voltak az ionerősségre, pH-ra és a készítmény oldószer-vizes fázis arányára (1., 3., 4. táblázatok). Például alacsony ionerősségnél (10 mM puffer) kevesebb mint 700 nm átmérőjű részecskéket kaptunk. Amikor a vizes fázis 0,1 M NaCl-ot tartalmazott, mialatt minden egyéb körülményt állandóan tartottunk, a részecskék mérete nagyobb lett mint 1500 nm és jelentős aggregálódást figyeltünk meg. Ez a polién hatása, mivel számos lipid esetében, amikor egyedül fecskendeztük be őket a NaCl-Hepes pufferbe, kevesebb mint 200 nm átmérőjű részecskét kaptunk.
A befogadó fázis pH-ja szintén fontos szerepet játszott a részecske méretének meghatározásában. A Chems:polién komplex esetében a legkisebb részecskeátmérőt pH>7 értéknél kaptuk, míg a CholSO4:polién komplexeknél pH=4,0 és pH>5 esetekben voltak kicsik az átmérők (3. és 4. táblázat).
3. táblázat
Amfotericin B/lipid komplexek készítése oldószer befecskendezéssel
Komponens arány4 pHb Vizes fázis Átmérő0 (nm)
A:Chems 1:1,1 4,0 10 mM acetát >1500
A.’Chems 1:1,1 7,0 10 mM Hepes 111
HU 208 070 Β
Komponens arány3 pHb Vizes fázis Átmérő13 (nm)
A:Chems 1:1,1 8,0 10 mM Hepes 121
A:CholS04 1:1,1 2,0 10 mM glicin >1500
A:CholS04 1:1,1 4,0 10 mM acetát 86,4
A:CholSO4 1:1,1 5,0 10 mM citrát >1500
A:CholS04 1:1,1 7,0 10 mM Hepes 456
A:CholSO4 1:1,1 8,0 10 mM Hepes 539
A:CholSO4 1:1,1 10,0 10 mM glicin 615
A:CholSO4 1:1,1 7,0 10 mM Hcpes:8 M karbamid 64,8
a. amfotericin Bilipid arány
b. A puffer 0,3 ml-e volt az oldószer mennyiség, °C-on.
c. A képződési pufferben végzett dializálás után mértük meg a részecskék átmérőjét. Az 1500 nm-nél nagyobbnak feltüntetett értékek esetében olyan nagy méretű részecskék voltak jelen, amelyeket nem lehetett megmérni a dinamikus fényszóródás módszerével. Minden esetben, amikor az átmérő nagyobb volt, mint 1500 nm a készítményeknél erőteljes aggregálódást és ülepedést figyeltünk meg a dializáló zacskóban.
Az oldószer vizes fázishoz viszonyított arányának változtatása, amely szintén növelte a komponensek koncentrációját, a részecskék átmérőjének növekedését eredményezte, amint azt az Ny:Chol4 esetében látható volt (4. táblázat).
4. táblázat
Polién/lipid komplexek készítése oldószer befecskendezéssel
Komponens arány3 pHb Vizes fázis Átmérő13 (nm)
Ny:CholSO4 1:1,1 4,0 10 mM acetát 552
Ny:CholSO4 1:1,1 8,0 10 mM Hepes 364
Ny:CholSO4 1:1,ld 8,0 10 mM Hepes >1500
Ny:CholS04 1:1,1 4,0 10 mM acetát >1500
Ny:CholS04 1:1,1 8,0 10 mM Hepes >1500
Ny:Chems 1:1,1 4,0 10 mM acetát >1500
Komponens arány3 pHb Vizes fázis Átmérő13 (nm)
Ny:Chems 1:1,1 7,0 10 mM Hepes 45
Ny:Chems. 1:1,1 ' 8,0 10 mM Hepes 47
Primaricin:Chol 1:1 7,4 10 mM Hepes 1052
Primaricin:Chems 1:1 7,4 10 mM Hepes >1500
a. poliénüipid arány. Ny=nisztatin
b. A puffer 0,3 ml-e volt az oldószer mennyiség, °C-on.
c. A képződési pufferben végzett dializálás után mértük meg a részecskék átmérőjét. Az 1500 nm-nél nagyobbnak feltüntetett értékek esetében olyan nagy méretű részecskék voltak jelen, amelyeket nem lehetett megmérni a dinamikus fényszóródás módszerével. Minden esetben, amikor az átmérő nagyobb volt, mint 1500 nm a készítményeknél erőteljes aggregálódást és ülepedést figyeltünk meg a dializáló zacskóban.
d. A 2,0 ml pufferbe befecskendezett oldószer menynyiség 1,0 ml volt.
A gyógyszeres kezelések tanulmányozására készülő polién:lipid komplexek előállítására szolgáló befecskendezéses eljárás előnye T. Patterson és munkatársai [7 Infect Dis (1989) nyomdában] szerint először is az, hogy ismertek a befecskendezés körülményei, a módszer méretei könnyűszerrel növelhetők. Amikor az amfotericin B:CholSO4 készítésének a méreteit megnöveltük 3 ml-ről 50 ml-re, a nagyobb méretű preparálás esetében is ugyanakkora részecskeméreteket kaptunk. Másodszor, hogy 200 nm kisebb részecskeméreteket lehet' kapni ezzel az eljárással. Ez lehetővé teszi a kapott készítmények szűréssel történő sterilezését.
(B) Egyéb koleszterol származékok is használhatóak amfotericin B-lipid részecskék készítésére. Például koleszterol-foszfátot, koleszterol-ftalátot, koleszterolfoszforilkolint, 3,6,9-trioxaoktán-l-ol-koleszteril-3eolt, és egyéb hidroxi- vagy amino-koleszterol származékokat oldhatunk DMSO-ban, EtOH-ban, metil-pirrolinben, MP-ben vagy amfotericin B-vel kombinálva DMSO-ban és fecskendezhetjük pufferbe kisebb mint 700 nm átmérőjű részecskék előállítása céljából.
Dimirisztil-foszfatidil kolimdimirisztil-foszfatidil glicerol (DMPC:DMPG, 7:3), koleszterol-foszfokolin, koleszterolo-leát, koleszterol-foszfát, koleszteril-ftalát, koleszterol-szulfát lipidek felhasználásával elkészítettük oldataikat DMSO-ban, DMSO/EtOH-ban és DMSO/metilpirrolin és hozzájuk adtunk az amfotericin B DMSO-ban készült oldatából annyit, hogy valamennyi komponens koncentrációja 12,5 mM volt (lipid és antibiotikum 1:1 arányban volt). ADMSO/metilpirrolin keverékek két fázist képeztek és közvetlenül a befecskendezés előtt emulgeáltuk őket.
Amfotericin B-lipidrészecskék készítése végett
HU 208 070 Β mindegyik keverékből azonos (0,3 ml) mennyiséget fecskendeztünk 2,7 ml 10 mM Tris/lactát pufferbe (pH= 7,0, 0,1 mM EDTA) 30 ’C-on. A befecskendezés után 5 percig kevertettük a keveréket, majd áttettük dialízáló zacskóba és 48 óráig dializáltuk 100 térfogatnyi 1 mM Tris/lactát (pH=7,0) pufferrel szemben, amelyet kétszer cseréltünk. Ilyen körülmények között az amfotericin B teljes mennyisége a részecskékben maradt vissza. A lipidrészecskék átmérőjét szórt, lézer fénnyel határoztuk meg és a kapott értékeket az alábbi 5. táblázatban mutatjuk be.
5. táblázat
Az amfotericin lipidrészecskék
LipidösszetéteP Oldószer Részecskeátmérő (nm)
DMPCOMPG (7:3) DMSO/EtOH 149
koleszterol-foszfo- kolin DMSO/EtOH 659
koleszterol-oleát DMSO/metilpirro- lin 431
koleszterol-foszfát DMSO 182
koleszterol-ftalát DMSO 126
koleszterol-szulfát DMSO 76
a. Mindegyik összetétel tartalmazta az amfotericin B-t
1:1 antibiotikurmlipid arányban.
4. példa (A cisz-platinum becsomagolása)
A cisz-platinum (cisplatin) egy másik komponens, amelyet széles körben használnak a rák gyógyszeres kezelésében. Kitűnően oldódik DMSO-ban és a ciszplatiumot tartalmazó liposzómák DMSO befecskendezéssel történő előállításának módszere könnyen megvalósítható. Különböző lipidösszetételű, 100 és 200 nm közötti átmérőjű liposzómákat készítettünk (6. táblázat). Az itt használt körülmények között a cisz-platinum végső koncentrációja a liposzóma szuszpenzióban körülbelül 100 ffg/ml volt.
A cisz-platinumot feloldottuk DMSO-ban 45 mg/ml koncentrációban és hozzáadtuk 7,5 mg/ml (25 mM) végkoncentrációban különböző lipidoldatokhoz, amelyekben a lipidek koncentrációja 90 és 135 mM között volt DMSO.EtOH (7:3) keverékben. Az ellenőrzött lipid összetételek az EPC:Chems (2:1) 135 mM; EPC:EPG (7:3) 90 mM és EPC:EPG:Chol (7:3:6) 96,4 mM oldatok voltak. Szobahőmérsékleten a lipid-gyógyszer keverékek kissé zavarosak voltak; rövid, 60 °C-os vízfürdőn történt melegítés után az oldat kitisztult. A lipid-gyógyszer oldat milliliterét fecskendeztük be 150 mM NaCl-10 mM Hepes, pH=7,4 (NaCl-Hepes) puffer 2 ml-ébe, 30 ’C-on. A liposzómákat mintegy 100 térfogatnyi NaCl-Hepes oldattal dializáltuk szobahőmérsékleten, 2 órán keresztül, majd 1x40 cm méretű, Sephadex G-50 oszlopon kromatografáltuk NaCl-Hepes oldattal eluálva. A cisz-platinum koncentrációját atomabszorpciós spektrofotométerrel mért platinumszint alapján határoztuk meg.
6. táblázat
Cisz-platinum liposzómák készítése oldószer befecskendezéssel
Komponens Becsomagolási hatékonyság (%);l Átmérő (nm)b
EPC:EPG7:3 7,4 169
EPC:EPG:Chol 7:3:6 6,9 109
EPC:Chems 2:1 14,5 216
a. A becsomagolási hatékonyság jelenti az oszlopon történt elválasztás után a liposzóma készítményben maradt cisz-platinumnak a kiindulási cisz-platinumhoz viszonyított százalékos arányát. Az oszlopon történt elválasztás után a vizes fázisban a teljes lipid koncentráció körülbelül 20 mM volt.
b. A részecskeátméró't dialízis után mértük 0,1 mM NaCl-10 mM Hepes, pH=7,4 oldatban.
5. példa (Az amfotericin B alkalmazása)
Az amfotericin B-vel és a koleszterol-szulfáttal készült liposzómákat a 3. példában leírt módon készítettük. A szabad és a lipidrészecskékbe épült amfotericin B összehasonlítására az előtörő aszpergilózis modelljét, egy immunoszupreszív neutropén nyulat használtunk.
Huszonnyolc nyulat immonuszupresszáltunk ciklofoszfamid és triamcinolon alkalmazásával. A nyulakat ezután 106 A. fumigatus-sal reagáltatták. 24 óra után a nyulakat három kezelési csoportra osztották: nyolc nyúl kapott 4,5 mg/kg/nap szabad amfotericin B-t; négy nyúl kapott 7,5 mg/kg/nap szabad amfotericin B-t; öt nyúl kapott 6-9 mg/kg/nap amfotericin B-t lipidrészecskében; és nyolc nyúl volt a kontrol.
A 7,5 mg/kg/nap szabad amfotericin B-t kapott nyulak esetén mind a négy elpusztult 24 órán belül, 3/8 arányt figyelhettünk meg a 4,5 mg/kg/nap szabad amfotericin Bvel kezelt csoportban. A lipides amfotericin B-t kapott csoportokban nem volt pusztulás. A4,5 mg/kg/nap szabad amfotericin B-t és a 6-9 mg/kg lipidrészecskéket alkalmazó kezeléseket tovább folytattuk 30 napig.
A kezelési időszak végén az állatokat megöltük és a májat, a vesét, a tüdőt, az agyat tenyésztéssel megvizsgáltuk életképes Aspergillis jelenlétére. Az eredményeket a 7. táblázatban mutatjuk be, viszonyítva a steril szervek számát (Aspergillis-től mentes) az összeshez.
7. táblázat
Aspergillosis kezelés
Szerv tenyészete (Sterilek száma/összes)
Csoport Máj Vese Tüdő Agy
Kontrol 0/8 0/8 0/8 1/3
Szabad AmpBa 5/5 5/5 3/5 1/5
Lipides- AmpBb 4/5 4/5 4/5 3/5
a. 4,5 mg/kg/nap
b. 6,5 mg/kg/nap
HU 208 070 Β
Az eredmények jelzik, hogy lipidrészecske készítmények ugyanolyan hatékonyak voltak, mint a szabad amfotericin B, de kisebb volt a toxicitásuk.
6. példa (Vízoldható komponensek becsomagolása) (A) A találmány eljárását használva a nátrium-foszfonoformátot tökéletesen lehet meghatározott méretű liposzómákba csomagolni. Befogadó fázisként a trinátrium-foszfonoformát (Sigma Chemical Co.) 80 mM-os oldatát használtuk. Az EPC/EPG/Chol (7:3:6) lipid keverék DMSO:EtOH (7:3) oldószerben készült, 96 mMos oldatának 1 ml-ét fecskendeztük 2 ml foszfohoformát oldatba. A keletkezett liposzómákat 100 térfogatnyi 140 mM NaCl-10 mM Hepes pufferrel (pH=7,4) szemben, amelyet 24 órás periódusban kétszer cseréltünk, dializáltuk. A végtermékben a gyógyszerdipid arányt a szakterületen ismert módszereket használva határoztuk meg. Egy ilyen módszert írnak le pl. E Szoka és munkatársai az Antimicrob Agents Chemoter-\xu\ (1988) 32:858-64 megjelent közleményükben. A keletkezett liposzómák átmérője <=200 nm volt.
(B) Amint azt a fenti 1. példa (B) bekezdésében bemutattuk igen különböző oldatokat használhatunk fogadó fázisként anélkül, hogy azok a liposzómák képződését károsan befolyásolnák. A fogadó fázisban jelen levő bármilyen oldat becsomagolódik a liposzóma képződés során. így becsomagolhatok a gyenge savak, gyenge bázisok, aminosavak, kelátképző ágensek és az ezekhez hasonló anyagok. Nátrium-karbonát, nátriumbikarbonát, nátrium-acetát, nátrium-formát, nátriumszukcinát, mono-, di- és trinátrium-citrát, nátrium-benzoát, nátrium-szalicilát, EDTA, dezferroxamin és más hasonló anyagok 140 mM-os oldatait készítettük el és használtuk befogadó fázisként. DMSO:EtOH (7:3) keverékében készült lipidoldat (EPC, 120 mM) 1 ml-ét fecskendeztük be a befogadó fázis 2 ml-ébe. Becsomagolt pufferek készítése céljából dializáljuk a keletkező liposzóma szuszpenziót 100 térfogatnyi, 280 mM-os laktóz oldattal szemben, melyet kétszer cseréltünk.
(C) Az aminosavakat a következőképpen csomagoljuk be: Az arginint, glicint, glutamátot, lizint, hisztidint, prolint vagy egyéb aminosavat előkészítettük a kívánt koncentrációjú és pH-jú vizes oldat formájában. DMSO:EtOH (7:3) keverékében készült lipidoldat (EPC, 120 mM) 1 ml-ét fecskendeztük be a befogadó fázis 2 ml-ébe. Becsomagolt aminosavak készítése céljából dializáltuk a keletkező liposzóma szuszpenziót 100 térfogatnyi, 280 mM-os laktóz oldattal szemben, melyet kétszer cseréltünk.
(D) Egyidőben számos különböző komponens is becsomagolható. Ezek lehetnek vízoldhatók, lipidekben oldódóak vagy víz- és lipid-oldható komponensek keverékei. Például, glicint, arginint, ornitint vagy egyéb aminosavat tartalmazó vizes aminosav oldatot készítünk körülbelül 100 mM-os koncentrációban és a pH=7,4 értéket állítjuk be. 2 ml vizes fázisba befecskendezzük az EPC-t (120 mM) és lipid A (1 mM) endotoxint [J. Dijkstra és munkatársai, J Immunoi (1987)
733:2663-71] tartalmazó lipid keverék 1 ml-ét és a keletkező liposzóma szuszpenziót 100 térfogat 0,14 M NaCl-dal szemben dializáljuk. A liposzómák a vizes fázisban tartalmazzák az aminosavat, a lipid A a lipid fázisban van és az átmérő <200 nm.
(E) A találmány alkalmazásával a különböző összetevők széles spektrumát csomagolhatjuk be. A megfelelő komponensek közé tartoznak - korlátozás nélkül a fluoreszkáló molekulák, radiokontraszt anyagok, radioaktív izotópok és komponensek, paramágneses anyagok, elektronspin jelölt és flavint tartalmazó komponensek, antibiotikumok, mint az aminoglükozidok, vírus elleni anyagok, mint az azidotimidin vagy deoxicitidin vagy foszforilált származékaik, szénhidrátok, peptidek, mint a vazopresszin, oxitocin, luteinizáló hormont képző hormonok, muramii peptid származékok és analógok, kalcitonin, inzulin, proteáz inhibitorok mint a kaptopril és a leupeptin, renin inhibitorok, oligonukleotidok és származékaik [lásd pl. G. Zon, Pharmaceut Rés (1988) 5:539M9], ribonuklein savak, dezoxiribonuklein savak, módosított nuklein savak, proteinek, mint a szuperoxid-dizmutáz, emberi növekedési hormon, interferonok, interleukinok mint az IL1, IL-2. A találmány eljárása előnyösen alkalmazható jól meghatározott méretű liposzómák vagy lipidrészecskék nagy koncentrációban történő képzésére különböző körülmények között.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (18)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás egy hasznos összetevőt becsomagoló, meghatározott részecskeméretű lipidszuszpenzió készítésére, azzal jellemezve, hogy
    a) a hasznos összetevőt és a lipidet aprotikus, nemhalogénezett szénhidrogént tartalmazó oldószerelegyben oldjuk, és a hasznos összetevőt és lipidet tartalmazó oldatot vizes oldatba extrudáljuk, vagy
    b) vízben oldható hasznos összetevőt becsomagoló, meghatározott részecskeméretű lipidszuszpenzió előállítására a lipidet aprotikus, nem-halogénezett szénhidrogént tartalmazó oldószerelegyben oldjuk, és a lipidoldatot a vízben oldható hasznos anyag vizes oldatába extrudáljuk, melynek során' az aprotikus, nem-halogénezett szénhidrogén oldószerben a lipid koncentráció 1500 mM, és a lipid és hasznos komponens tömegaránya 2:1-1:100.
    (Elsőbbsége: 1989. 03. 31.)
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal jellemezve, hogy vízben, alkoholokban és halogénezett szénhidrogén oldószerekben rosszul oldódó hasznos összetevőt alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1989.03.31.)
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy liposzómák szuszpenzióját alakítjuk ki. (Elsőbbsége: 1989. 03. 31.)
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aprotikus oldószerként dimetil-szulfoxidot, dioxánt, dimetil-formamidot, acetonitrilt, dimetil-acetami11
    HU 208 070 Β dót, szulfolánt, gamma-butirolaktont, l-metil-2-piiToIidinont vagy metil-pirrolint alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1989. 03. 31.)
  5. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hasznos összetevőként ciszplatint, doxorubicint, epinefrint, mebendazolt vagy niridazolt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1989. 03. 31.)
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rövidszénláncú, telített alkanolt tartalmazó oldószerelegyet alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1989. 03. 31.)
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rövidszénláncú alkanolként etanolt tartalmazó oldószerelegyet alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1989. 03. 31.)
  8. 8. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lipidrészecskéket tartalmazó szuszpenziót alakítunk ki.
    (Elsőbbsége: 1989. 03. 31.)
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hasznos összetevőként amfotricin B-t, nisztatint vagy primaricint alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1989. 03. 31.)
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lipidet és a rosszul oldódó komponenst 1:1 tömegarányban alkalmazzuk.
    (Elsőbbsége: 1989. 03. 31.)
  11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lipidként tojás foszfatidil-kolint, tojás foszfatidil-glicerint, dilpamitoil-foszfatidil-kolint, koleszterint, koleszterin-szulfátot és annak sóit, koleszterin-hemiszukcinátot és annak sóit, koleszterin-ftalátot és annak sóit, koleszterin-foszfátot és annak sóit, koleszteril-foszforil-kolint, 3,6,9-trioxaoktán-l-ol-koleszteril-3e-olt, dimirisztoil-foszfatidil-glicerint, dimirisztoil-foszfatidil-kolint vagy hidrogénezett szója foszfatidil-kolint alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1989. 03. 31.)
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lipidszuszpenziót bekoncentráljuk. (Elsőbbsége: 1989.03.31.)
  13. 13. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy hasznos összetevőként gyenge savakat, gyenge bázisokat, keláló ágenseket, aminosavakat, fluoreszkáló molekulákat, radiokontraszt anyagokat, radioaktív izotópokat és komponenseket, paramágneses anyagokat, elektronspin jelölt komponenseket, oldható antibiotikumokat, vírus elleni anyagokat, nukleotidokat és azok foszforilált származékait, szénhidrátokat, peptideket, oxitocint, luteinizáló hormont képző hormont, muramii peptid-származékokat és analógokat, kalcitonint, inzulint, proteáz inhibitorokat, renin inhibitorokat, oligonukleotidokat és származékaikat, ribonukleinsavakat, dezoxiribonukleinsavakat, módosított nukleinsavakat, hidrogénperoxid-dizmutázt, emberi növekedési hormont, interferonokat, kolónia stimuláló faktorokat, ideg növekedési faktorokat, átalakuló növekedési faktorokat, alfa és béta epidermális növekedési faktort, IL-l-et vagy IL—2-t alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1989. 04. 05.)
  14. 14. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy liposzómák szuszpenzióját alakítjuk ki. (Elsőbbsége: 1989. 04. 05.)
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aprotikus oldószerként dimetil-szulfoxidot, dioxánt, dimetil-formamidot, acetonitrilt, dimetilacetamidot, szulfolánt, gamma-butirolaktont, 1-metil2-pirrolidinont vagy metil-pirrolint alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1989. 04. 05.)
  16. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rövidszénláncú, telített alkanolt tartalmazó oldószerelegyet alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1989. 04. 05.)
  17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy telített alkanolként etanolt vagy metanolt tartalmazó oldószerelegyet alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1989. 04. 05.)
  18. 18. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy lipidként tojás foszfatidil-kolint, tojás fosztatidil-glicerint, dipalmitoil-foszfatidil-kolint, koleszterint, koleszterin-szulfátot és annak sóit, koleszterin-hemiszukcinátot és annak sóit, koleszterin-ftalátot és annak sóit, koleszterol-foszfátot és annak sóit, koleszteril-foszforil-kolint, 3,6,9-trioxaoktán-l-ol-koleszteril-3e-olt, dimirisztoil-foszfatidil-glicerint, dimirisztoil-foszfatidil-kolint vagy hidrogénezett szója foszfatidil-kolint alkalmazunk.
    (Elsőbbsége: 1989. .04. 05.)
HU903559A 1989-03-31 1990-03-28 Process for producing lipid suspension HU208070B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33260989A 1989-03-31 1989-03-31
US33405589A 1989-04-05 1989-04-05

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU903559D0 HU903559D0 (en) 1991-12-30
HUT59818A HUT59818A (en) 1992-07-28
HU208070B true HU208070B (en) 1993-08-30

Family

ID=26988293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU903559A HU208070B (en) 1989-03-31 1990-03-28 Process for producing lipid suspension

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0467954B1 (hu)
JP (1) JP2798302B2 (hu)
AT (1) ATE137403T1 (hu)
AU (1) AU638245B2 (hu)
CA (1) CA2050679C (hu)
DE (1) DE69026820T2 (hu)
DK (1) DK0467954T3 (hu)
ES (1) ES2087151T3 (hu)
HK (1) HK1000912A1 (hu)
HU (1) HU208070B (hu)
NO (1) NO303205B1 (hu)
WO (1) WO1990011780A1 (hu)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5178875A (en) * 1991-01-14 1993-01-12 The Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal-polyene preliposomal powder and method for its preparation
JPH0363298A (ja) * 1989-07-31 1991-03-19 Green Cross Corp:The コロニー形成刺激因子・脂質複合体
FR2653015B1 (fr) * 1989-10-12 1993-10-29 Oreal Composition cosmetique ou pharmaceutique pour application topique contenant au moins un derive retinouide et au moins un derive de pyrimidine, son utilisation comme medicament et procede de traitement correspondant.
DE4238779A1 (de) * 1992-11-12 1994-05-19 Max Delbrueck Centrum Lyotrophe Mesophasen und ihre Anwendung in der Pharmazie, der Kosmetik und der Dermatologie
PT707472E (pt) 1993-07-08 2001-07-31 Liposome Co Inc Processo para controlar a dimensao de lipossomas
EP1642500A3 (en) * 1993-09-29 2010-03-03 DSM IP Assets B.V. Antifungal compositions comprising an antifungal compound of the polyene type
CA2223179A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Bob Dale Brown Phosphonic acid-based cationic lipids
JP2002532535A (ja) * 1998-12-22 2002-10-02 アメリカ合衆国 水不溶性薬剤送達システム
US6511676B1 (en) * 1999-11-05 2003-01-28 Teni Boulikas Therapy for human cancers using cisplatin and other drugs or genes encapsulated into liposomes
EP1334718A4 (en) 2000-10-26 2007-07-18 Senju Pharma Co DRUG COMPOSITION CONTAINING DIPEPTIDYL ALDEHYDE COMPOUND
WO2002043699A2 (en) * 2000-12-01 2002-06-06 Biomira, Inc. Preparation of large liposomes by infusion into peg
IS6389A (is) * 2001-08-31 2003-03-03 Heraeus Kulzer Gmbh & Co. Kg Reynsla af sýklalyfjahúðun skrokka, sem í eru örholrými, og einnig af þannig húðuðum skrokkum og notkun þeirra
CA2681302C (en) * 2007-03-19 2013-07-23 Dhiraj Khattar Proliposomal and liposomal compositions of poorly water-soluble compounds
AU2008321174A1 (en) * 2007-11-14 2009-05-22 The Regents Of The University Of California Sterol-modified amphiphilic lipids
JP2012504135A (ja) 2008-09-27 2012-02-16 ジャイナ ファーマシューティカルズ,インコーポレーテッド 経口適用および局所適用のための脂質系薬学的調製物、ならびにそれらの組成物、方法、および使用
WO2012006956A1 (zh) * 2010-07-14 2012-01-19 中国医学科学院药物研究所 一种胰岛素的脂质复合物及其制备方法和制剂
US10004759B2 (en) 2014-08-04 2018-06-26 Zoneone Pharma, Inc. Remote loading of sparingly water-soluble drugs into lipid vesicles
CN113616798A (zh) * 2021-09-06 2021-11-09 天津农学院 一种甲苯咪唑脂质复合物、制备方法和应用
CN115177590A (zh) * 2022-04-20 2022-10-14 南昌大学抚州医学院 一种甲苯达唑类脂质体的制备方法及应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4588578A (en) * 1983-08-08 1986-05-13 The Liposome Company, Inc. Lipid vesicles prepared in a monophase
JPS60240634A (ja) 1984-05-08 1985-11-29 関 則雄 飲み干し容易なコツプ
US4619913A (en) * 1984-05-29 1986-10-28 Matrix Pharmaceuticals, Inc. Treatments employing drug-containing matrices for introduction into cellular lesion areas
AU598002B2 (en) * 1986-07-15 1990-06-14 Cilag Ltd. Method of preparing single bilayered liposomes
US4804539A (en) 1986-07-28 1989-02-14 Liposome Technology, Inc. Ophthalmic liposomes
US4839175A (en) * 1986-07-28 1989-06-13 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced retention on mucosal tissue
US4812312A (en) * 1987-03-03 1989-03-14 Board Of Regents Of The University Of Texas System Liposome-incorporated nystatin
NZ223660A (en) * 1987-03-05 1990-11-27 Liposome Co Inc Low toxicity drug-lipid complexes; methods of making them; and method of determining their toxicity

Also Published As

Publication number Publication date
DE69026820D1 (de) 1996-06-05
AU5434590A (en) 1990-11-05
EP0467954A4 (en) 1992-06-03
HUT59818A (en) 1992-07-28
WO1990011780A1 (en) 1990-10-18
DK0467954T3 (da) 1996-05-28
EP0467954A1 (en) 1992-01-29
JPH04506207A (ja) 1992-10-29
JP2798302B2 (ja) 1998-09-17
DE69026820T2 (de) 1996-11-28
HU903559D0 (en) 1991-12-30
ATE137403T1 (de) 1996-05-15
NO913816L (no) 1991-11-26
ES2087151T3 (es) 1996-07-16
EP0467954B1 (en) 1996-05-01
NO303205B1 (no) 1998-06-15
AU638245B2 (en) 1993-06-24
HK1000912A1 (en) 1998-05-08
NO913816D0 (no) 1991-09-27
CA2050679A1 (en) 1990-10-01
CA2050679C (en) 1998-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5077057A (en) Preparation of liposome and lipid complex compositions
US5567434A (en) Preparation of liposome and lipid complex compositions
US5277914A (en) Preparation of liposome and lipid complex compositions
HU208070B (en) Process for producing lipid suspension
FI119621B (fi) Multivesikulääristen liposomien valmistus aktiivisten aineiden vapauttamiseksi kontrolloidusti
EP0260811B1 (en) Phospholipid particles encapsulating polyene antibiotics for the treatment of systemic fungal infections
EP0380584B1 (en) Polyene macrolide pre-liposomal powders
CA1314481C (en) Liposomal preparation and antibiotic
WO1990014074A1 (en) Improved liposomal formulations of nucleotides and nucleotide analogues
CN1044093C (zh) 低毒性药物类脂制剂
JPH07108166A (ja) リポソーム
JPH03501732A (ja) 多重ラメラリポソームの自発的小胞化方法
US5043107A (en) Preparation small unilamellar vesicles including polyene antifungal antibiotics
JPH10316555A (ja) 高分子化合物を含有するリポソーム外用剤
JPS6362490B2 (hu)
US20020016302A1 (en) Liposomal antitumor drug and its preparation
Gunda et al. A Review on Formulation and Evaluation of Liposomal Drugs
JPH10236946A (ja) 二重リポソーム製剤の改善された製造法
Tonger et al. A REVIEW ON “DEVELOPMENT AND EVALUATION OF LIPOSOMES
CA1329548C (en) Liposomal preparation and antibiotic
AU641532B2 (en) Liposome preparation and antibiotic
Sad et al. LIPOSOMES AS DRUG CARRIER FOR NOVEL DRUG DELIVERY SYSTEM

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees