HU207342B - Process for producing human or mouceleukemie inhibitor factor /lif/ and pharmaceutical compositions of lif activity and process for purifying lif after or without glycozilation - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás glikozilezett vagy nem-glikozilezett LIF tisztítására kromatográfiás módszerek alkalmazásával. A találmány további tárgya a LIF lényegében tiszta formában, rekombináns DNS-techno- lógiával történő előállítása prokarióta, élesztő vagy emlős gazdasejtben. A találmány oltalmi körébe tartozik a LIF hatású gyógyszerkészítmények előállítása is. HU 207 342 B A leírás terjedelme: 58 oldal (ezen belül 35 lap ábra)

Description

A találmány tárgya leukémia inhibitor faktor (LIF) előállítása lényegében tiszta formában, rekombináns LIF klónozása és kifejezése útján.

Az érett vérsejtek az éretlen prekurzor sejtek klonális szaporodásával és ezzel együttjáró differenciálódásával képződnek (Metcalf, D.: The Hemopoietic Colony Stimulating Factors, Elsevier kiadó, Amszterdam [1984]). A normális hemopoetikus sejtek esetében a szaporodás és a differenciálódás folyamata szorosan összekapcsolódik, úgyhogy a rövid élettartamú érett sejtek folyamatosan pótlódnak. Kimutatták, hogy a granulociták és makrofágok prekurzor sejtjeinek szaporodását és differenciálódását in vitro legalább 4, biokémiailag megkülönböztethető növekedési faktor, a telepserkentő faktorok (colony-stimulating factors, CSFek) serkentik: ezek a G-CSF, M-CSF, GM-CSF és a Multi-CSF (IL—3) (lásd Metcalf, D.: Proc. R. Soc. B., 230, 389-423, [1987]).

A normális sejtekkel ellentétben a leukémiás mieloid sejteket az jellemzi, hogy a szaporodás és a differenciálódás nem kapcsolódik egymáshoz, így az éretlen progenitor sejtek felszaporodnak, megtartják szaporodási kapacitásukat és nem differenciálódnak. Sok vita volt a mieloid leukémiás sejtek differenciálódását in vitro indukálni képes biológiai faktorok természetét illetően és abban a vonatkozásban, hogy bizonyos faktorok ki tudják-e váltani a szaporodás nélküli differenciálódást. Fölvetődött, hogy a szaporodást és a differenciálódást szükségszerűen különböző faktorok váltják ki (Sachs, L.: J. Cell. Physiol. Suppl., 1., 151-164, [1982]). Másrészt két csoport írt le és tisztított olyan aktivitású anyagot (MGI-2 vagy D-faktor), amelynek az Ml egér mieloid leukémiás sejtvonal differenciálódását kiváltó hatása van, de nem serkenti a normális progenitor sejtek szaporodását (Lipton, J. H., Sachs, L.: Biochem. Biophys, Acta, 673, 552-569 [1981]; Tomida, M.: Yamamoto-Yamaguchi, Y. és Hozumi, M.: J. Bioi. Chem., 259, 10978-10982, [1984]). Kutatócsoportunk másrészt korábban kimutatta, hogy az egyik CSF — a G-CSF - a WEHI-3B D⁺ egér mieloid leukémiás sejtvonal differenciálódását kiváltó erős serkentő faktor, valamint a normális sejtek szaporodását és differenciálódását serkentő faktor is (Nicola, N. A., Metcalf, D., Matsumoto, M. és Johnson, G. R.: J. Bioi. Chem. 258, 9017-9023, [1983]). Tomida és munkatársai továbbá azt is kimutatták (Tomida, M., YamamotoYamaguchi, Y. Hozumi, M.: Okabe, T. és Takaka, E: FEBS Leet., 207, 271-275 [1986]), hogy a rekombináns G-CSF az Ml sejtek makrofág differenciálódását is serkenteni képes. Ezeknek a faktoroknak az egymással való kapcsolatán viták folynak. A helyzetet még bonyolultabbá tette az a felismerés, hogy az ct(TNFa) daganat nekrózis faktor serkenteni képes az MU-1 emberi mieloblasztikus sejtvonal differenciálódását (Takeda, K., Iwamoto, S., Sugimoto, H., Takuma, T., Kawatani, N., Noda, M., Masaki, A., Morise, H., Arim ura, Η., Konno, K.: Natúré, 323,338-340, [1986]).

Megkíséreltük feloldani ezeknek a kutatócsoportoknak az adatai között fennálló ellentmondásokat, és ennek során biokémiailag frakcionáltuk a számos korábbi kísérletben alkalmazott Krebs Π aszcitesz daganatsejtek által kondicionált közeget, és kimutattuk, hogy nemcsak autentikus, a normális progenitor sejtekre és a WEHI-3B D⁺ sejtekre egyaránt ható G-CSF-et és GM-CSF-et tartalmaz, hanem 2 biokémiailag különböző, de funkcionálisan hasonló olyan faktort is, amelyek ki tudják váltani az Ml sejtek differenciálódását. Ez utóbbi faktorokat leukémia inhibitor faktor A-nak és B-nek (LDF-A és LIF-B) neveztük, mivel in vitro vissza tudják szorítani az Ml leukémiás sejtek szaporodását, és kimutattuk, hogy nem váltják ld a WEHI-3B D⁺ sejtek differenciálódását és nem serkentik a normális granulocita/makrofág progenitor sejtek szaporodását.

Találmányunk értelmében a LIF-et a következő két tulajdonsággal rendelkező molekulaként definiálhatjuk: a) vissza tudja szorítani a mieloid leukémia sejtek, úgymint az Ml sejtek szaporodását, a leukémiás sejtek ezzel együttjáró differenciálódásával, és b) verseng az Ml sejteken vagy egér vagy emberi makrofágokon levő speciális sejtreceptorokhoz kötődésért az olyan molekulákkal, amelyek az egér LIF vagy emberi LIF leírásunkban definiált szekvenciájával rendelkeznek. A LIF alkalmazható terápiás, szaporodást nem befolyásoló szerként a mieloid leukémia bizonyos formáinak visszaszorítására, valamint reagensként makrofág funkciók és más, fertőzésekre adott válaszok módosítására, és az ezekre vonatkozó klinikai vizsgálatokban és kutatásokban.

Leírásunkban a „LIF hatással rendelkező polipeptid” kifejezés alatt olyan polipeptidet vagy glikopolipeptidet értünk, amely rendelkezik a LIF fent meghatározott tulajdonságaival; beleértve azokat - de nem csak azokat - a polipeptideket, amelyeknek egy, az egér vagy emberi LIF leírásunkban ismertetett aminosavszekvenciájával részben vagy egészében homológ aminosavszekvenciája van. Ebbe a kifejezésbe beleértjük azokat a polipeptideket is, amelyek az egér vagy az emberi LIF aminosavszekvenciájának csak egy részével mutatnak teljes vagy részleges homológiát, feltéve, hogy a polipeptid rendelkezik a LIF fent meghatározott tulajdonságaival. Ebbe a kifejezésbe beleértjük továbbá azokat a polipeptideket vagy glikopolipeptideket is, amelyek a kifejezéskor inaktívak, de amelyeket a gazdasejt aktív molekulákká dolgoz fel, valamint azokat a polipeptideket vagy glikopolipeptideket, amelyek a kifejezéskor inaktívak, de in vitro vagy in vivő szelektíven aktív molekulákká hasíthatók.

Az egér LIF a következő biológiai tulajdonságokkal rendelkező molekula:

a) a makrofág differenciálódás kiváltása az Ml egér mieloid leukémiás sejtvonal sejtjeiben, a klónozható leukémiás sejtek szaporodási képességének elvesztésével és elpusztulásukkal; ezt a hatást a G-CSF potencírozza;

b) szelektív kötődés az Ml sejtek és a hasüregből, a lépből és a csontvelőből származó normális egér monociták és makrofágok nagy affinitású receptorain; a receptorok száma növekszik a makrofágok érésével vagy funkcionális aktiválással; az ilyen szöveteknek a granulocita, eritroid vagy limfoid sejtjeihez azonban nincs kötődés;

HU 207 342 Β

c) a ¹²⁵I-LIF specifikus kötődésével a nagy affinitású receptorokhoz nem verseng a G-CSF, GM-CSF, Multi-CSF (interleukin-3), az M-CSF, az interleukin 1, 2, 4 és 6, az endotoxin és számos más növekedési faktor, verseng viszont a nem jelzett LIF;

d) normális vagy timuszuktól megfoszfott egerek szérumában emelkedik a mennyisége a bakteriális endotoxin hatására, de az endotoxin-rezisztens C3H/HeJ egerekében nem;

e) különböző szövetek termelik, beleértve a tüdőés nyálmirigyszövetet, a hashártyasejteket és csontvelőt;

f) a CSF hiányában tenyésztett normális granulocita-makrofág progenitor sejtek in vitro túlélési idejét csökkenti;

g) nem képes visszaszorítani a szaporodást vagy kiváltani a differenciálódást a következő sejteknél: WEHI-3B D⁺ egér mieloid leukémiás sejtek, GMCSF-et vagy multi-CSF-et kifejező retrovírusokkal megfertőzve leukemogénné alakított egér mieloid sejtek, WEHI265 és WR19 egér leukémiás sejtvonalak;

h) nem képes serkenteni a granulociták, makrofágok, eozinofilek, megakariociták, eriffoid és emlőssejtvonalak normális progenitor sejtjeinek szaporodását, és nem képes visszaszorítani a klonális szaporodást vagy megváltoztatni a CSF-ekkel in vitro végzett serkentéssel kiváltott kvantitatív válaszkészséget normális granulociták, makrofágok, megakariociták, eozinofilek vagy természetes citotoxikus sejtek progenitorai esetében, és a 32CD1.13 és FDCP-1 folytonos sejtvonalak sejtjeinek szaporodását;

i) nem képes versengeni a granulocita telepserkentő faktor (G-CSF) jódozott származékaival a specifikus sejtreceptorokhoz való kötődésért annak ellenére, hogy a G-CSF indukálni tudja a differenciálódást az Ml-ben és a WEHI-3B D⁺ egér mieloid leukémiás sejtekben és potencírozni tudja a LIF hatását az Ml sejtekre;

j) hatását a daganat nekrózis faktor (TNF) ellen specifikusan termelődő antiszérumok nem képesek gátolni;

k) az egér LIF transzkriptumai alkotórészei az LB3 és E9.D4 T sejtek citoplazmájának, a lektin konkanavalin A ezekben a sejtekben nem indukálja őket, és jelen vannak számos más sejttípusban;

Az egér LIF-ről a következő tulajdonságokat is megállapítottuk:

l) egyetlen glikoprotein alegység, melynek molekulatömege 58 000±5000 (meghatározása elektroforézissel 8-25% gradiensű poliakril-amid géleken, melyek nátrium-dodecil-szulfátot tartalmaznak, redukálószerrel - 2-merkapto-etanol vagy ditiotreitol - vagy anélkül), és N-glükanáz endoglükozidázzal való kezelés után molekulatömege 23 000±5000;

m) izoelektromos pontja 8,6 és 9,3 között van;

n) primer aminosavszekvenciáját 10., 11. és 15. ábráink szemléltetik;

o) a 10., 11, és 15. ábráinkon szemléltetett nukleotidszekvencia kódolja;

p) specifikus aktivitása l-2xl0⁸ egység/mg (50 egység a LIF-nek az a mennyisége, amely 1 ml térfogatban 50%-kal csökkenti az egér Ml mieloid leukémiás sejtek általi klónképzést);

q) ^egy egyedi, a 11. egér kromoszómán levő gén kódolja (amint azt egér/kínai hörcsög petefészek szomatikus sejthibridjeinek felépítését elemezve megállapítottuk), amelyet restrikciós endonukleáz hasítóhelyek vesznek körül a 19. ábrán ábrázolt módon;

r) homológ egy emberi génszekvenciával, amit a kromoszomális DNS-ben restrikciós endonukleáz hasítóhelyek vesznek körül a 27. ábrán szemléltetett módon.

Az emberi LIF egy olyan molekula, amely rendelkezik a természetes és/vagy élesztőből származó rekombináns termék következő tulajdonságaival:

a) kiváltja a makrofág differenciálódást az Ml egér mieloid leukémia sejtvonal sejtjeiben, a szaporodási képesség elvesztésével és a klonogén leukémia sejtek elpusztulásával;

b) nem képes serkenteni a granulocita, makrofág, eozinofil és eritroid vonalak normális emberi progenitor sejtjeinek szaporodását;

c) G-CSF-fel kombinálva részlegesen vissza tudja szorítani az U937 emberi leukémiás sejtvonal sejtjeinek szaporodását és GM-CSF-fel kombinációban vissza tudja szorítani az U937 és HL60 emberi leukémiás sejtvonalak szaporodását;

d) specifikusan kötődik az Ml sejtek egér LIF receptoraihoz és az egér makrofágokhoz és teljes versengésbe lép a ¹²⁵-I-LIF-fel a kötődésért az ilyen sejtekhez;

e) kötődik a Hep-2G emberi hepatóma sejtvonal specifikus sejtreceptoraihoz.

Az emberi LIF következő tulajdonságait is megállapítottuk:

f) az egér LIF-fel a kész fehérjében levő aminosavmaradékok körülbelül 80%-ában azonos;

g) elsődleges aminosavszekvenciája a 25., 26. és 29. ábra szerinti;

h) egy egyedi, kromoszomális DNS-ben restrikciós endonukleáz hasítóhelyekkel a 27. ábrán szemléltetett módon körülvett gén kódolja;

i) génszekvenciája egy részeként a 25. ábra szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazza.

Találmányunk további tárgya a lényegében tiszta LIF előállítása Krebs H aszcitesz daganatsejtek tisztításával, és lényegében tiszta emberi LIF előállítása 5637 emberi hólyag karcinóma sejtvonalból (ATCC deponálási szám HTB 9) kiinduló tisztítással. A lényegében tiszta LIF-et gazdasejtekkel, úgymint élesztősejtekkel, emlőssejtekkel vagy E.coli sejtekkel is előállíthatjuk, amelyek tartalmazzák a LIF aminosavszekvenciáját kódoló rekombináns DNS-molekulákat vagy azok egy részét.

Leírásunkban a „lényegében tiszta” kifejezés olyan polipeptidet vagy glikopolipeptidet jelöl, amelynek legalább 90%-a egyetlen sávként jelenik meg egy megfelelő nátrium-dodecil-szulfát-poliakril-amid gélen elektroforézisnek alávetve, és ez a sáv összhangban áll a LIF hatással.

A LIF-fel kapcsolatos vizsgálataink során, különö3

HU 207 342 B sen arra törekedve, hogy biztosítsunk egy alternatív forrást, amelyből ez az egér vagy emberi eredetű glikoprotein klinikai vagy más alkalmazásra kinyerhető, az egér LIF-et Krebs II aszcitesz daganatsejtekből tisztítottuk egy hatásos tisztítási eljárással és részleges aminosavszekvencia elemzésnek vetettük alá, ami az első lépés ennek a faktornak a kémiai vagy biokémiai előállításához vezető úton.

Azoknak az egér és emberi eredetű sejteknek és szöveteknek az azonosítására, amelyek termelik a LIFet, radioaktív ¹²⁵I izotóppal jelzett LIF-et alkalmaztunk egy receptorversengési vizsgálatban. Ennek a vizsgálatnak az eredményeképpen screeneltük az ezen források egyikéből számlázó mRNS DNS másolatainak rekombináns DNS-tárát és azonosítottuk az egér LIF-et kódoló kiónokat az előzőleg meghatározott egér LIF aminosavszekvencia részleteit kódoló, radioaktívan jelzett oligonukleotidokkal végzett hibridizálással, és a fent említett egér LIF cDNS-klónokat nukleotidszekvencia-elemzésnek vetettük alá. A klónozott egér LIFet kódoló szekvenciát továbbá hibridizációs próbaként használtuk egy olyan emberi gén azonosítására, amely az egér LIF egy homológját kódolja, és meghatároztuk azokat a hibridizálási körülményeket, amelyek között az említett fajtaközötti hibridizációt hatékonyan végrehajthatjuk. Ennek eredményeképpen az egér LIF emberi homológját kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS-klónokat azonosítottunk.

A LIF-et kódoló szekvenciák létrehozásának eredményeképpen olyan rekombináns DNS-molekulákat hoztunk létre, amelyek klónozott egér vagy emberi LIF-kódoló DNS-szekvenciákat alkalmaznak a klonálisan tiszta, teljes vagy részleges LIF szintézisének irányítására, például tenyésztett emlőssejtekben, élesztőkben vagy baktériumokban. A találmány így kiterjed az ilyen módon előállított, lényegében tiszta LIF-re is.

A találmány egyik megvalósítási módja a klónozott emberi és egér LIF-gének kifejezése élesztősejtekben, fibroblasztokban és E. coli-ban, továbbá a klónozott gén olyan módosítása, hogy ilyen formában kifejezhető legyen, valamint a rekombináns emberi és egér LIF biológiai és biokémiai tulajdonságainak meghatározására.

Ebben a megvalósítási módban a találmány kiterjed olyan rekombináns DNS-molekulák előállítására is, amelyek emberi vagy egér LIF-et (vagy annak lényegileg hasonló homológjait) részlegesen vagy egészében kódoló nukleotidszekvenciákat tartalmaznak olyan formában, amelyben ezek a nukleotidszekvenciák irányítani tudják a teljes vagy részleges, emberi vagy egér LIF termelését élesztősejtekben, fibroblasztokban vagy E. coli-ban.

Figyelembe véve a LIF hatékonyságát a mieloid leukémia bizonyos formáiban és bizonyos fertőzésekben szenvedő betegek kezelésében, találmányunk kiterjed olyan, teljes vagy részleges LIF-et - elsősorban emberi LIF-et - tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, amelyeket például klónozott LIF-kódoló DNS szekvenciák alkalmazásával vagy kémiai szintézissel állítunk elő, és a LIF olyan analógjait tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, amely analógokat például kémiai szintézissel állítunk elő, vagy amelyek a fent említett klónozó LIF-kódoló DNS-szekvenciák mutageneziséből származnak.

Az ábrákon a következő jelöléseket alkalmazzuk:

M - moláris; v/v - térf./térf.; cpm - szám/perc; RlEcoRl restrikciós enzim; H3-HindIH restrikciós enzim; Kbp - kilobázispár; nm - nanométer; pg/ml - mikrogramm/milliliter, Bam-BamHI restrikciós enzim.

1. példa

Az 1-5. ábrák mutatják az alábbiakban leírt tisztítási módszer különböző lépéseit, megjelölve, ahol a LIFet összegyűjtjük minden frakcionálási lépésben és jelezve tisztaságának bizonyítékát.

1. ábra ~ a LIF DEAE-Sepharose Cl-óB-n végzett tisztításának második lépésére vonatkozik. Az I—I jel azokat a frakciókat jelöli, amelyeket összegyűjtünk a 3. lépéshez.

2. ábra - a LIF tisztításának harmadik lépését mutatja Lentil lektin Sepharose 4B-n. AI—I jel azokat a frakciókat jelöli, amelyeket összegyűjtünk a 4. lépéshez.

3. ábra - a LIF tisztításának negyedik lépését mutatja CM-Sepharose CI-6B-n. AI—I jel azokat a frakciókat jelöli, amelyeket összegyűjtünk az 5. lépéshez.

4. ábra - a LIF tisztításának ötödik lépésére vonatkozik, egy zsírsavelemző HPLC oszlopon. A 39,6— 41,3% acetonitril frakciókat összegyűjtjük.

5. ábra - a tisztított LIF molekulatömegét és tisztaságát mutatja. A felső mező szemlélteti a protein standardek (93000, 67000, 43000, 30000, 20000 és 14000 molekulatömegű) és a tisztított LIF (két készítmény) vándorlását 8-25% poliakril-amid SDS gélen. A protein és biológiai aktivitás egyaránt összefügg egy 58 000 molekulatömegű proteinnel.

1. lépés lxlO⁶ Krebs II daganatsejtet intraperitoneálisan befecskendezünk C57B16/6fj/WEHI egereknek és (W. and E. Hall Inst. of Med. Rés., Animál House, Kew Victoria, Ausztrália) és 7 nap múlva az egereket megöljük és a hasüregi folyadékot eltávolítjuk. A sejteket centrifugáljuk, újraszuszpendáljuk 5xl0⁶ sejt/ml töménységben Dulbecco szerinti módosított Eagle-közegben (Flow Laboratories, NSW, Ausztrália), amely 200 mg/ml E. coli lipopoliszacharidot tartalmaz, és 24 órát inkubáljuk 37 °C-on egy nedvesített inkubátorban, amelynek levegője 10% szén-dioxidot tartalmaz. A sejteket újra centrifugáljuk, a kondicionált közeget eltávolítjuk, nátrium-azidot adunk hozzá 0,02 vegyes% mennyiségben és 4 °C-on állni hagyjuk. 36 1 kondicionált közeget 100 ml-re sűrítünk be HIP10-8 üreges szál cartridge (Amicon Co., Lexington, MA, AEA’) alkalmazásával, Amicon DC2A besűrítőben, 10 mM pH-8,0 trisz-HCl pufferbe (amely 1 mM fenil-metilszulfonil-fluoridot [PMSF-et], 0,02 vegyes% nátriumazidot és 0,02 térfogat% Tween 20-at tartalmaz) viszszük át és újra besűrítjük., YM-10 membránon, Amicon kevert cellában (Amnicon Co., Lexington, MA, AEA) 20 ml-re.

HU 207 342 Β

2. lépés

A sűrítményt felvisszük egy 2,5x30 cm-es DEAESepharose CL-6B (Pharmacia) oszlopra, amelyet azonos pufferrel ekvilibráltunk, és eíuáljuk 200 ml ekvilibráló pufferrel, majd ugyanennek a puffemek 400 miében egy lineáris, 0,3 M nátrium-kloridig terjedő gradienssel. Az áranlási sebesség 25 ml/h és 5,8 ml-nyi frakciót gyűjtünk és elemzünk (lásd 1. ábra).

3. lépés

Összegyűjtjük azokat a proteinfrakciókat, amelyek nem kötődtek a gélhez a gradiens alkalmazása előtti lépésben és amelyek hatást mutatnak egér Ml sejtekre (azaz LIF-et tartalmaznak, amely képes az Ml sejtek differenciálódásának indukálására), besűrítjük, egy YM-10 membránon, átvisszük 100 mM pH=6,0 nátrium-acetát pufferbe (amely 1 mM magnézium-kloridot, 1 mM PMSF-et, 0,2% nátrium-azidot és 0,02% Tween20-at tartalmaz) és felvisszük egy 1x4 cm-es Lentil lectin-sepharose 4B oszlopra (Pharmacia), amelyet ugyanezzel a pufferrel ekvilibráltunk. Az oszlopot 25 ml ekvilibráló pufferrel eíuáljuk, majd ugyanennek a puffemek 100 ml-ében egy lineáris, 0,5 M-ig terjedő alfa-metil-D-mannopiranozid gradienssel 10 ml/h áramlási sebességgel. 3 ml-nyi frakciót gyűjtünk össze és megvizsgáljuk (lásd 2. ábra).

4. lépés

Azokat a proteinfrakciókat, amelyek kötődnek a gélhez, a cukorral eluálódnak és hatásuk van az Ml sejtekre, összegyűjtjük, besűrítjük., 100 mM pH=5,0 nátrium-acetát pufferbe (amely 1 mM PMSF-et, 0,02% nátrium-azidot és 0,02 Tween 20-at tartalmaz) visszük át és felvisszük egy 1,0x4,0 cm-es CM-Sepharose C1-6B (Pharmacia) oszlopra, amelyet ugyanazzal a puffenel ekvilibráltunk. Az oszlopot eíuáljuk 25 ml ekvilibráló pufferrel, majd 100 ml ugyanilyen puffenel, amely 1,0 M nátrium-kloridig teq'edő lineáris gradienst tartalmaz, ezután 25 ml 1,0 M nátrium-kloriddal, amelynek pH-ját nátrium-hidroxiddal 10-re állítottuk. Az áramlási sebesség 2,0 ml/h és 3,0 ml-nyi frakciót gyűjtünk össze (lásd 3. ábra).

5. lépés

Azokat a proteinfrakciókat, amelyek kötődnek a gélhez, a nátrium-klorid gradienssel eluálódnak és hatnak az Ml sejtekre, összegyűjtjük, YM-10 membránon besűrítjük 2 ml-re és 20 mM (pH=5,0) ammóniumacetát pufferbe (amely 0,02%, Tween 20-at tartalmaz) visszük át, majd 0,45 μ Millipore szűrőn szűrjük. Az összegyűjtött anyagot felvisszük egy Waters zsírsavelemző oszloppal és gradiens programozójú kettős szivattyúval ellátott Beckman nagyteljesítményű folyadékkromatográf rendszer injektorába. Az oszlopot 0,1 térfogat% trifluor-ecetsavat (TFA) tartalmazó vízzel ekvilibráljuk, a mintát befecskendezzük, majd az oszlopot eíuáljuk egy 5 perces, 34,8 térfogat%-ig terjedő, vizes oldatban levő acetonitril gradienssel és 0,1% TFA-val, majd egy 50 perces, 49,8 térfogat%-ig terjedő, vizes oldatban levő acetonitril gradienssel és 0,1% TFA-val. Az áramlási sebesség 1 ml/perc és 1 mles frakciókat szedünk 50 μΐ-nyi 100 mM ammóniumhidrogén-karbonátot és 0,4% Tween 20-at tartalmazó polipropilén csövekbe (lásd 4. ábra).

Az 5. lépésből származó, az Ml sejtekre ható frakciók két átfedésben levő ultraibolya abszorbciós csúcsot adnak. Mindegyik csúcs összefügg az Ml sejtekkel szembeni aktivitással és mindegyik megfelel egyetlen 58000 molekulatömegű (nátrium-dodecil-szulfát poliakril-amid gélen, ezüst festéssel) protein sávnak. Az 58000 molekulatömegű proteinsáv minden esetben tartalmazza az Ml sejtekkel szembeni biológiai aktivitást, amint az megállapítható a gélen egy párhuzamos sávot, amely LIF-et is tartalmaz 1 mm-es csíkokra vágva, a proteint extrahálva a gélcsíkokból és megvizsgálva, hogy az extrahált protein vissza tudja-e szorítani a szaporodást és ki tudja-e váltani a differenciálódást Ml sejtekben félszilárd agar tenyészetekben (lásd 5. ábra).

2. példa

Ebben a példában ismertetjük az N-terminális aminosavszekvencia és tripszinnel vagy Staphylococcus V8 proteázzal (Miles Co., Napperville, IL, AEA’), végzett proteolitikus hasítással kapott különböző peptidek aminosavszekvenciája meghatározásának lépéseit.

pg, az 1. példa szerinti eljárással tisztított LIF-et 2 mm-es belső átmérőjű mikrooszlopra viszünk fel, amelyet Brownlee RP300 gyöngyökkel (C8) (Brownlee Laboratories, Santa Clara, CA, AEA’) töltöttünk meg, és HPLC rendszerben eíuáljuk 0-60% acetonitril lineáris gradienst tartalmazó 0,1%-os trifluor-ecetsavval. A protein egyetlen csúcsként eluálódik, 100 pl térfogatban. Az eluátumot felvisszük egy üvegszálas korongra, hagyjuk megszáradni, majd bevisszük egy Applied Biosystem (470A modell) gázfázisú proteinszekvenáló szekvenáló kamrájába. A proteint Edman vegyszerekkel szekvenáljuk és az egyes aminosavak fenil-tio-hidantoin-származékait HPLC-vel azonosítjuk egy Applied Biosystems 120A PTH elemzővel.

A LIF egy 20 pg-os külön alikvot részét szintén megtisztítjuk a fent leírt eljárással, 2 ml-re hígítjuk 6 M guanidin-hidrokloriddal, 0,2 M pH=8,5 trisz-HCl pufferrel, 2 mM ditiotreitollal és 37 °C-on inkubáljuk 2 órát. Ezután jód-ecetsavat adunk hozzá harmincszoros moláris feleslegben és az oldatot 37 °C-on inkubáljuk még 15 percig. Az oldatot felvisszük ugyanarra a HPLC mikrooszlopra, és a fent leírt módon eíuáljuk. A LIF redukált és karboxi-metilezett származéka (RCMLIF) 3 perccel később eluálódik az oszlopról, mint a kezeletlen LIF, és 200 pl RCM-LIF-et 1 ml-re hígítunk 0,1 M pH=8,0 trisz-HCl pufferrel, amely 0,02% Tween 20-at, 1 mM kalcium-kloridot és 2 pg TPCKval (tozil-fenil-alanil-klór-metán) kezelt tripszint tartalmaz. Az elegyet 18 órát inkubáljuk 37 °C-on, majd újra felvisszük a mikrooszlopra és a fent leírt módon eluáljuk. Az egyes peptidek UV-abszorbeáló csúcsokként jelennek meg, és egyenként gyűjtjük össze őket. Egyes peptideket közvetlenül szekvenálunk a fent leírt módon, míg másokat ugyanezen az oszlopon újra tisztítunk a szekvenálás előtt 0-60% acetonitril gradienst alkalmazva 0,9%-os pH=6,0 nátrium-kloridban.

HU

Az RCM-LEF egy második alikvot részét (200 μ1= 10 pg) 1 ml-re hígítjuk 0,05 M pH-7,8 nátrium-foszfát pufferrel, amely 0,002 M EDTA-t és 0,02% Tween 20-at tartalmaz, és 2 pg fenti Staphylococcus aureus V8 proteázzal emésztjük 18 órát 37 °C-on. A reakcióelegyet felvisszük ugyanarra a mikrooszlopra és a fent leírt módon eluáljuk.

A LIF-et meghatározó 26 aminosav az aminoterminálistól kezdve sorrendben a következő:

N-Pro-Leu-Pro-IIe-Thr-Pro-Val-X-Ala-Thr-X-AlaIle-Arg-His-Pro-Cys-His-Gly-Asn-LeuMet-Asn-Gln-Ile-Lys

Néhány triptikus peptid aminosavsorrendje a következő:

1. His-Pro-Cys-His-Gly-Asn-Leu-Met-Asn-Gln-IleLys

2. Met-Val-Ala-Tyr...

3. Gly-Leu-Leu-Ser-Asn-Val-Leu-Cys...

4. Leu-Gly-Cys-Gln-Leu-Leu-Gly-Thr-Tyr-Lys

5. Val-Leu-Asn-Pro-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Gln-ValLys

6. Asn-Gln-Leu-Ala-Gln-Leu-X-Gly-Ser-Ala-AsnAla-Leu-Phe-Leu-Val-Glu-Leu-Tyr....

7. Leu-Val-Ile-Ser-Tyr...

8. Val-Gly-His-Val-Asp-Val-Pro-Val-Pro-Asp-HisSer-Asp-Lys-Glu-Ala-Phe-Gln.

9. Leu-X-Ala-Thr-Ile-Asp-Val-Met-Arg.

10. Gin-Val-Ile-Ser-Val-VAl-X-Gln-Ala-Phe.

A LIF V8 proteázzal végzett emésztésével képződött peptid aminosavsorrendje a következő:

Ala-Phe-Gln-Arg-Lys-Lys-Leu-Gly-Cys-Gln-LeuLeu-Gly-ThrTyr-Lys-Gln-Val-He-Ser-Val-Val-Val-Gln-Ala-Phe.

3. példa

Ebben a példában a radioaktívan jelzett LIF előállítására alkalmazott lépéseket és a LIF-források receptor versengéses vizsgálattal való azonosításának lépéseit mutatjuk be.

A 6. ábra vonatkozik erre a példára: a radioaktív jóddal jelzett tiszta LIF (körülbelül 2xl0⁵ cpm/ng) kötődése az Ml mieloid leukémia sejtekhez 0 °C-on. 5xl0⁵ Ml sejtet 4xl0⁵ cpm ¹²⁵I-LIF-fel inkubálunk versengő faktorokkal vagy anélkül 2 órát, ezután a megkötődött radioaktív anyagot elválasztjuk a meg nem. kötődött radioaktív anyagtól borjú magzati szérumon keresztül centrifugálva.

A) A nem jelzett tiszta LIF és tiszta Multi-CSF, GM-CSF vagy M-CSF mint versengő faktorok titrálása a megadott hígításokban (mindegyik hígítás 10 pl-ét 80 pl végső térfogatra egészítjük ki). A legnagyobb koncentráció minden esetben 10^{3 4} egység/ml; 3,5xl0⁴ egység/ml; 3xl0⁴ egység/ml; 5X10⁴ egység/ml, illetve 4xl0⁴ egység/ml.

B) A tiszta LIF vagy lipopoliszacharid (LPS) vagy töményített (4-8-szoros), endotoxin injekcióval kezelt egerekből származó különböző sejtekkel vagy szérummal kondicionált közeg versengési képessége a ^I25I-LIF-nek az Ml sejtekhez való kötődéséért a fenti módon.

A Krebs H aszcitesz sejtekkel kondicionált közeg342 B 2 bői az 1. példában leírt módon tisztított LIF-et ¹²⁵I izotóppal radioaktívan jelzetté alakítjuk a tirozincsoportokon a korábban leírt módon (Nicola, N. A., Metcalf, D.: J. Cell. Physiol., 128, 180-188, [1986]), így körülbelül 2x10 cpm/ng specifikus radioaktivitású ^]25I-LIF-et állítunk elő. A ¹²⁵I-LIF specifikusan kötődik az Ml mieloid leukémiás sejtekhez, valamint a felnőtt egér csontvelőhöz, léphez, timuszboz és hasüregi exudált sejtekhez. A sejt autoradiográfiás elemzés azt mutatja, hogy a ¹²⁵I-LIF specifikusan csak a makrofágokhoz és prekurzorsejtjeikhez kötődik, és a receptorok száma nő a sejt érésével, továbbá nem kapcsolódik kimutathatóan semelyik másik hemopoetikus sejttípushoz, Ez azt sugallja, hogy a LIF klinikailag felhasználható lehet a makrofág funkció módosításában különbözó betegségállapotokban. A ¹²⁵I-LIF specifikus kötődését az Ml mieloid leukémiás sejtekhez vagy a peritoneális makrofág populációhoz a nem jelzett LIF gátolja, számos más hemopoetikus növekedési faktor - beleértve a G-CSF-et, GM-CSF-et, M-CSFet (CSF-1), Multi-CSF-et (interleukin 3), az interleukin 1, 2, 4, 6-ot, az endotoxint vagy más növekedési faktorokat (lásd például a 6. ábrát) - azonban nem.

A sejttel kondicionált közegnek vagy sejtextraktumnak az a képessége, hogy gátolja a ¹²⁵I-LIF kötődését az ilyen sejtpopulációkhoz (LIF radioreceptor vizsgálat) (6.B ábra) így egy specifikus vizsgálatot biztosít annak kimutatására, hogy különböző sejtek és szövetek termelnek vagy tárolnak-e LIF-et. így például a lektinnel aktivált LB3 T sejtekkel kondicionált közeg erősen gátolja a ¹²⁵I-LIF specifikus kötődését az Ml sejtekhez, így jelezve, hogy az LB3 sejtek termelnek LIF-et.

4. példa

Ebben a példában az egér LIF-et kódoló niRNS klónozott komplementer DNS másolatának előállítására használt lépéseket ismertetjük.

A 7-10. ábrák mutatják az alábbiakban ismertetett módszer különböző lépéseit.

A 7. ábra a LIF cDNS-klónok klónozásának első lépésére vonatkozik: a hemopoetikus növekedésszabályozók mRNS-einek felhalmozódása az LB3 sejtek citoplazmájában a lectin concanavalin A-val végzett stimulálást követően.

A) A eitoplazma poliadenilezett RNS-ét (5 pg) a WEHI-3B D~ sejtekből (1. sáv), a T sejt klón LB3 sejteket I0⁶ sejt/ml koncentrációban tenyésztve 5 pg/ml concanavalin A jelenlétében 5 órát (2. sáv), és a nem stimulált LB3 sejtek RNS-ét (3. sáv) formaldehid agaróz géleken elektroforézisnek vetjük alá, nitrocellulózra visszük át és egy ³²P-GM-CSF próbával (a mező) vagy egy ³²P-multi-CSF próbával (b mező) hibridizáljuk (az eljárás részleteit lásd: Kelso, A., Metcalf, D. és Gough, N. M.: J. Immunoi., 136,1718-1725, [1986]).

A 8. ábra a LIF cDNS-klónok klónozásának 3. lépését mutatja: szintetikus oligonukleotidokat használunk a LIF kiónok azonosítására. Az egér LIF aminosavszekvenciájának egy, az N-terminálishoz közeli részét (15-26. gyökök, lásd 2. példa) a felső vonalon mutatjuk be, az mRNS szekvenciák lehetséges

HU 207 342 Β kombinációt, amelyek ezt a peptidet kódolhatják, középen, és az az ezzel az mRNS szekvenciával komplementer oligonukleotid próbát alul. A17. Cys és 18. His aminosavak kivételével valamennyi aminosavra az oligonukleotid csak az emlős kódoló szakaszokban leggyakrabban használt kodonokkal komplementer (Grantham és munkatársai: Nucleic Acid. Rés., 9, 4377, [1981]). A 17. Cys vonatkozásában a szekvencia mindkét kodonnal komplementer. A18. His vonatkozásában az oligonukleotid a kevésbé gyakori CAU kodonnal komplementer. Valószínűtlennek tartjuk, hogy a CAC kodon kerülne felhasználásra, mivel ez a szomszédos Gly kodonnal együtt a ritka CpG dinukleotidet hozná létre (Swartz és munkatársai: J. Bioi. Chem., 238,1961-1967, [1962]).

A 9. ábra a LIF cDNS-klónok klónozásának 4. lépését mutatja; a LIF cDNS kiónok azonosítása a 8. ábrán szemléltetett oligonukleotiddal való hibridizálással.

A10. ábra a LIF cDNS-klónok klónozásának 5. lépését mutatja: a pLIF7.2b cDNS-klón és a LIF aminosavszekvencia nukleotidszekvenciája. A cDNS mRNS-szinonim fonalának szekvenciáját 5’-3’-vel soroljuk fel, a LIF előre megjósolt amiiíosavszekvenciáját felül megadva; a vonalak végén levő számok a végső gyök (aminosav vagy nukleotid) helyzetét mutatják azon a vonalon. Az aminosavszekvenciát egymás után számozzuk az ebben a kiónban kódolt első gyöktől. Az aminosavszekvenciának proteinelemzéssel meghatározott szakaszai fölött vonalat húztunk; a kettő között nincs ellentmondás. Pro 9 a közvetlen aminosavszekvencia elemzéssel (2. példa) meghatározott N-terminális maradék. 7 potenciális N-kapcsolt glikozilezési helyet (Neuberger, A. és munkatársai a Glycoproteins-ben; Gottschalk, A. Elsevier kiadó, Amsterdam, 450-490. oldal, [1972]) csillagokkal jelölünk meg és 4 potenciális 0-kapcsolt glikozilezési helyet (Tkahashi, N. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,2021-2025. [1984]) vonalkázással.

1. lépés

A LIF mRNS-t tartalmazó RNS előállítása

A klónozott egér LB3 T sejtvonal (Kelso, A., Metcalf, D.: Exptl. Hematol., 13, 7-15, [1985]) sejtjeit 5 pg/ml lectin concanavalin A-val serkentjük 6 órát, hogy megnöveljük a citoplazmában az olyan mRNS-ek felhalmozódását, amelyek különböző, a hemopoetikus sejtek növekedését és differenciálódását szabályozó faktorokat kódobiak (Kelso, A., Metcalf, D., Gough, N. M.: J. Immunoi., 136, 1718-1725, [1986]). (A 7. ábra például a GM-CSF és a Multi-CSF hemopoetikus növekedési faktorokat kódoló mRNS-ek megnövekedett termelését mutatja az így stimulált sejtekben).

5X10⁸ concanavalin A-val stimulált LB3 sejtből korábban leírt technikát alkalmazva (Gough, N. M.: J. Mól. Bioi., 165, 683-699, [1983]) citoplazma RNS-t állítunk elő. Riboszomális RNS-ből poliadenilezettmRNS molekulákat választunk el két, oligo-dT cellulózon végzett kromatográfiás ciklussal standard eljárások alkalmazásával (Maniatis, T. és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, [1982]).

Ezt követő Northem-féle szűrős elemzéssel azt találjuk, hogy a GM-CSF és a Multi-CFS mRNS-eitől eltérő módon a LIF mRNS alkotórészként jelen van az LB3 sejtekben és mennyiségét nem növeli a concanavalin A serkentés (Gearing D. P. és munkatársai: EMBO I, 6, 3995-4002, [1987]; „Materials and Methods”, p. 4001). A felhasznált minta egy kb. 750bp méretű EcoRi-Hindlü fragmentum, amely a pLIF7.2b cDNS-ét PSP65-be klónozva tartalmazza.

2. lépés

LB3 cDNS molekulatár előállítása és klónozása A fent leírt módon előállított LB3 mRNS kétfonalas DNS másolatait ismert eljárásokkal (Maniatis, T. és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, [1982]; Gough, N. M. és munkatársai: Natúré, 309, 763-767, [1984]) állítjuk elő. Röviden úgy járunk el, hogy 10 gg citoplazma poliadenilezett LB3 mRNS-t alkalmazunk templátként az egyfonalas komplementer DNS (cDNS) előállításánál, egy madár mieloblasztozis vírus reverz transzkriptázzal katalizált reakcióban. A kapott DNS az oligo-dT-ből kiinduló vagy azt magában foglaló DNS-t tartalmaz. Ennek a reakciónak a lezajlása után az mRNS-t megbontjuk 65 °C-on 1 órát inkubálva 0,3 M nátriumhidroxidban, amely 1 mM EDTA-t tartalmaz. A bázis semlegesítése és a cDNS etanolos kicsapással végzett kinyerése után az egyfonalas cDNS-t duplexszé alakítjuk egy, az E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentumával katalizált reakcióban. Ezután a cDNS „hajtűkanyar” szerkezetét széthasítjuk az SÍ egyfonalas specifikus nukleázzal kezelve, majd dezoxi-citidin gyökök „farkát” (körülbelül 20-30 gyök hosszúak) hozzákapcsoljuk a kétfonalas cDNS mindegyik végéhez a terminális dezoxi-nukleotidil-transzferáz enzimet használva az irodalomban ismertetett módon (Michelson, A. M., Orkin, S.: J. Bioi. Chem., 257, 14773-14782, [1982]). AdC-farkazott cDNS-t elektroforézissel frakcionáljuk 1,5%-os agaróz gélen és az 500 bázispámál hosszabb molekulákat kinyerjük és hőkezeléssel bevisszük egy plazmid DNS molekulába (pJL3, Gough, N. M. és munkatársai: EMBO1,4, 645-653, [1984]), amelyet a Sacl restrikciós endonukleázzal hasítottunk és amelyhez dezoxi-guanozin gyökök „farkát” csatoltuk (Michelson A. M., Urkin, J.: J. Bioi. Chem., 257, 14773-14782, [1982]). A farkazott cDNS és plazmid molekulákat a leírt módon (Gough, N. M. és munkatársai: Biochemistry, 19, 2702-2710, [1980]) hőkezeljük és a hőkezelt cDNS/plazmid keverékkel E. coli MC1061-et (Casadaban, M., Cohen, S.: J. Mól. Bioi., 138, 179-207, [1980]) transzformálunk, és körülbelül 50000 függetlenül transzformált baktériumtelepet választunk ki 10 gg/ml ampicillint tartalmazó agarlemezeken végzett tenyésztéssel. A transzformált baktériumtelepeket az agarlemezekről 50 gg/ml ampicillint tartalmazó folyékony tápközeggel mosva távolítjuk el, és 10 független csoportban tároljuk 10%-os glicerinben -70 °C-on.

HU 207 342 Β

3. lépés

Oligonukleotid próbák létrehozása

Meghatározzuk a LIF aminoterminális végénél 26 aninosav szekvenciáját és a LIF tripszinnel és V8 proteázzal végzett emésztésénél kapott 11 különböző peptid aminosavgyökeinek szekvenciáját (lásd 2. példa). Ezek az aminosavszekvenciák biztosítják az alapot azoknak az oligonukleotidoknak a megtervezésére, amelyek a LIF-et kódoló mRNS bizonyos meghatározott szakaszaival komplementerek, amelyeket hibridizáló próbákként alkalmazunk a LIF mRNS-nek megfelelő cDNS kiónok azonosítására.

Minden természetben előforduló aminosavat a neki megfelelő mRNS-ben 3 ribonukleozid-trifoszfát specifikus kombinációja (egy kodon) kódol (például Watson, J.: Molecular Biology of the Gene, 3. kiadás, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., [1976]). Bizonyos aminosavakat csak egy kodon határoz meg, míg másokat 6 különböző kodon is meghatározhat (például Watson, J.: Molecular Biology of the Gene, fenti hivatkozás). Mivel ezért valójában a nukleotidszekvenciák nagyszámú különböző kombinációja kódolhat bármely konkrét aminosavszekvenciát, nagyszámú különböző degenerált oligonukleotidot kellene szerkeszteni, hogy megtaláljunk minden lehetséges szekvenciát, amely ezt a pepiidet kódolhatja. A nagymértékben degenerált oligonukleotidok hibridizációs próbákként való alkalmazásával kapcsolatosan azonban vannak bizonyos technikai nehézségek. Mivel azonban egy bizonyos aminosavnak nem mindegyik kodonja kerül azonos gyakorisággal felhasználásra (Grantham, R. és munkatársai: Nucleic Acid. Rés., 9, 43-73, [1981]), és mivel az emlősgenomban a CpG dinukleotid a bázisösszetétel alapján várható gyakorisághoz képest csak 20-25%-ban fordul elő (Swartz, M. N. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 238, 1961-1967, [1962]), gyakran előre meg lehet jósolni az egy adott pepiidet kódoló valószínű nukleotidszekvenciát, és így csökkenteni lehet egy adott oligonukleotid próba bonyolultságát. Az előbbi megfontolások alapján a különböző LIF-peptideknek megfelelő számos oligonukleotidot terveztek meg és állítottak elő standard eljárásokkal, amelyeket korábban leírt már T. Maniatis et. al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Láb., Cold Spring Harbor, New York, 1982.

4. lépés

Egy LB3 cDNS tár screenelése LIF-et kódoló kiónokra

A baktériumtelepek screenelésére a 8. ábra szerinti oligonukleotid próbákkal végzett hibridizálással a fent említett LB3 cDNS tár mindegyik csoportjából 1000015 000 baktériumtelepet tenyésztünk 50 μg/ml ampicillint tartalmazó agarlemezeken, átvisszük őket nitrocellulóz szűrőkorongokra és plazmid DNS-t építünk be a szűrőket 200 pg/ml klóramfenikolt tartalmazó agarlemezeken inkubálva (Hanahan, D., Meselson, M.: Gene, 10, 63-67, [1980]). A telepeket újra tenyésztjük az eredeti lemezen, és egy második nitrocellulóz szűrőt készítünk a fenti módon. A mesterlemezt másodszor újratenyésztjük, majd 4 °C-on tároljuk. A plazmid DNS-t kiszabadítjuk a baktériumtelepekből és nitrocellulóz szűrőkhöz rögzítjük az irodalomban ismertetett módon (Maniatis, T. és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, [1982]). Hibridizálás előtt a szűrőket néhány órát 37 °C-on inkubáljuk 0,9 M nátrium-klorid, 0,09 M nátrium-citrát, 0,2% Ficoll., 0,2% polivínil-pirrolidon, 0,2% borjúszérumalbumin, 50 gg/ml hővel denaturált lazac sperma DNS, 50 gg/ml E. coli tRNS, 0,1 Μ ATP és 2 mM nátriumpirofoszfát elegyében. A hibridizálást ugyanebben az oldatban hajtjuk végre, 0,1% NP40-nel kiegészítve, 37 °C-on 18 órát. A 8. ábrán szemléltetett szintetikus oligonukleotid 500 ng-ját radioaktívan jelzetté alakítjuk polinukleotid-kinázzal katalizált reakcióban, 500 gCi (γ-³²Ρ)ΑΤΡ (specifikus aktivitása 20003000 Ci/mmól) jelenlétében. Azután a be nem épült (y-³²P)ATP-t elválasztjuk a radioaktívan jelzett oligonukleotidtól ioncserés kromatográfiával, NACS-PREPAC oszlopon (Bethesda Research Laboratories) a gyártó utasításai szerint. A radioaktívan jelzett oligonukleotidot a hibridizálási reakcióban körülbelül 20 ng/ml koncentrációban alkalmazzuk. A hibridizálás után a szűrőket alaposan mossuk 0,9 M nátrium-kloriddai, 0,09 M nátrium-citráttal, 0,1 %-os nátrium-dodecilszulfáttal különböző hőmérsékleteken (amint azt az alábbiakban leírjuk), és mindegyik mosás után autoradiográfiát végzünk.

Az egymást követő mosások értelme az, hogy alacsony hőmérsékleten minden olyan klón, amely akár csak kevéssé is homológ az oligonukleotiddal (körülbelül 15 nukleotidnyi mértékben) kimutatható a szűrőmásolatokon megjelenő autoradiográfiás foltok formájában. Ahogy a hőmérséklet emelkedik, az oligonukleotid elszakad a legkisebb mértékben homológ klónoktól és így a megfelelő autoradiográfiás foltok eltűnnek. A legnagyobb mértékben homológ kiónok (és így azok a kiónok, amelyek a legvalószínűbben tartalmaznak LIF cDNS-szekvenciákat) megtartják a hibridizálódást a legmagasabb hőmérsékleten is. Ezzel a módszerrel közvetlenül a legjobb kiónokra lehet összpontosítani. A 9. ábra mutatja egy klónsorozat adatait a mosási hőmérséklet 46 °C-ról 66 °C-ra emelésével egy szűrőpár másolaton, amely 15 000 LB3 cDNS kiónt tartalmaz. Néhány klón csak az alacsonyabb hőmérsékleten hibridizáládik az oligonukleotidhoz, míg néhány 66 °C-on is hibridizálódik (például az 1. és 2. kiónok), így az utóbbi kiónokat kiválasztjuk további elemzésre és a megfelelő baktériumtelepeket eltávolítjuk a mesterlemezről, tisztítjuk és szokásos eljárásokkal (Maniatis, T. és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, [1982]) mindegyik bakteriális klónból plazmid DNS-t készítünk.

Ezeknek a kiónoknak előzetes szerkezeti elemzése (a beékelt cDNS méretének becslésével, a különböző restrikciós endonukleázok hasítási helyének feltérképezésével és hibridizálási kísérletekkel különféle, különböző LIF-peptideknek megfelelő oligonukleotidekhez) azt mutatja, hogy valójában mindegyik klón azonos; azaz ugyanannak az eredeti klónozási eseménynek

HU 207 342 Β különböző izolátumai. így további részletes elemzést csak egy kiónon, a pLIF7.2b-n végzünk.

5. lépés

A pLIF7.2b nukleotidszekvenciájának meghatározása

ApLIF7.2b klón cDNS részének nukleotidszekvencia elemzését a didezoxi láncterminációs módszerrel (Sanger, E és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, [1977]) végezzük, templátként lúggal vagy hővel denaturált kétfonalas plazmid DNS-t alkalmazva, printerként számos, mind a cDNS-sel szomszédos vektor (pJL3) szakaszaival, mind pedig a beékelt cDNS-en belüli szekvenciákkal komplementer oligonukleotidot használva, és polimerázként felhasználva a szekvenálási reakciókban mind az E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentumát, mind pedig a madár mieloblasztózis vírus reverz transzkriptázát. A pLIF7.2 klón cDNS részének így meghatározott szekvenciáját a 10. ábrán mutatjuk be. Ez az elemzés megerősíti, hogy ez a klón tényleg tartalmazza az mRNS-nek egy DNS másolatát, amely kódolni képes a LIF molekulát, mivel az egyetlen transzlációs leolvasási kereten belül, amely átfogja a teljes, stop kodonokkal meg nem szakított cDNS-t, valamennyi aminosavszekvencia megtalálható, amelyet korábban meghatároztunk a LIF molekula különböző peptidjeire. Ez a klón azonban nem tartalmazza a LIF kódoló szakasz teljes másolatát, mivel a) az 5’-végnél nem terjed ki egy olyan szakaszra, amely egy metionin kodonnal kezdődő feltételezett hidrofób vezérszekvenciát kódol, és b) 3’-végén nem tartalmaz egy kereten belüli transzlációs stop kodont. Az 5’-végnél azonban túlnyúlik a kész proteint kódoló szakasz kezdetén, amelyet a korábban meghatározott aminoterminális aminoszekvenciával való összehasonlítással határozunk meg (Pro 9 gyök a 10. ábrán). ^{5 * * * * * 11 12}

5. példa

A következőkben ismertetjük az egér LIF kódoló szakasza teljes hosszúságú másolatának elkészítésére, ennek a kódoló szakasznak egy élesztő kifejező vektorba való beépítésére és az egér LIF termelésére alkalmazott lépéseket.

Az alább leírt módszer különböző lépéseit a következő ábrák szemléltetik:

11. ábra - az egér LIF élesztősejtekben való kifejezésének első lépése: a LIF C-terminális aminosavszekvenciája. A pLEF7.2b leolvasási keretének aminosavszekvenciáját a C-teiminusnál egy Staphylococcus V8 proteázzal emésztett és egy Krebs aszcitesz daganatsejtből tisztított LIF-ből származó triptikus peptid szekvenciája fölött mutatjuk be. Megjegyzendő, hogy ez utóbbi peptidek 9 aminosavval meghaladják a pLIF7.2b LIF szekvenciát és ugyanannál a gyöknél végződnek. Az alsó sorban mutatjuk be a nukleotid- és aminosavszekvenciát a klón pLIFNKl megfelelő szakaszában, megerősítve a közvetlen aminosavszekvenálással kapott C-terminust. A számozási rendszer megegyezik a 10. ábráéval.

12. ábra - az egér LIF élesztősejtekben való kifejezésének második lépése: a pLBF7.2b cDNS rekonstruálása az YEpsecl élesztő kifejező vektorba való beékeléshez. A felső sorban mutatjuk a pLIF7.2b cDNS részleges nukleotidszekvenciáját és kódolt aminosavszekvenciáját; a számozás a 10. és 11. ábrákéval azonos. A második és harmadik sorok mutatják a pLIFmutl, illetve a pLIFmut2 szekvenciáját. A csillagok jelzik a stop kodonokat. Meg vannak jelölve az YEsecl-be való klónozásra (Baldari, C. és munkatársai: EMBO J., 6,229234, [1987]) és a pGEX-2T-be való klónozásra (Smith, D. B., Johnson, K. G.: Gene, sajtó alatt [1988]) használt restrikciós helyek (Bam Hl, Hind III és EcoRI). Az alsó sor mutatja a K. lactis killer toxin jelzőszekvenciájának részleges szekvenciáját az YEpsecl-ben. A Bam Hl restrikciós helynél kódolt Gly-Ser szekvenciát a jelzőpeptidáz hatékonyan felismeri (Baldari, C. és munkatársai: EMBO J., 6,229-234 [1987]).

13. ábra - az egér LIF élesztősejtekben való kifejezésének 4. lépését mutatja: az élesztőből származó rekombináns LIF biológiai aktivitása Ml leukémiás sejtek tenyészeteiben. Az élesztőből származó rekombináns LIF (-·-) és a tisztított természetes LIF-A (-O-) Ml tenyészetekben végzett titrálása hasonló koncentrációfüggő differenciálódás kiváltást (A mező) és telepképződés visszaszorítást (B mező) mutat Ml telepekben. Mindegyik pont két tenyészet átlagértékét mutatja.

14. ábra - az egér LIF élesztősejtekben való kifejezésének 5. lépését mutatja: a következő anyagok különböző hígításainak versengési képessége a kötődésért ¹²⁵I-LIF-A-val az egér hashártya sejtek sejtreceptoraihoz: hiteles természetes egér LIF-A (-O-), kondicionált közeg LIFmutl/YEpsecl rekombinánst tartalmazó, galaktózzal indukált élesztősejtekből (-·-) és kondicionált közeg ugyanezekből az élesztősejtekből, amelyek azonban nincsenek galaktózzal indukálva (-+-).

1. lépés

Az aminosavszekvencia meghatározása az egér

LIF C-tenminusánál

A 4. példa szerinti pLIF7.2b cDNS klón az egér LIF mRNS egy nem teljes másolatát tartalmazza. A cDNS az 5’-végnél 8 gyököt kódol, amelyek az N-terminális aminosavszekvencia elemzéssel meghatározott első gyökhöz (Pro 9 a 10. ábrán) képest N-terminálisak. A 3’végen azonban a pLIF7.2b nem teljes, mivel nem tartalmaz egy kereten belüli transzlációs stop kodont. Két LIF peptid közvetlen aminsavszekvenálással meghatározott aminosavszekvenciájának (2. példa) ellenőrzése azt sugallja, hogy a pLIF7.2b-ből csak a kódoló szakasz 27 nukleotidja hiányzik a 3’-végnél. Amint azt a 11. ábrán bemutatjuk, a V8-cal emésztett peptid a cDNS-szekvencia Alá 162. gyökénél kezdődik és a cDNS kiónból következtetett aminsavszekvenciát 9 gyökkel haladja meg. A V8 pepiiden belül levő egy triptikus peptid ugyanennél a gyöknél ér véget, azt sugallva, hogy a protein C-terminális gyöke a Phe 187. Ennek a következtetésnek a megerősítésére egy LIF cDNS kiónt, amely átfedésben van a pLIF7.2b-vel és 3’-irányban túlnyúlik, elkülönítünk és nukleotidszekvencia elemzésnek vetünk alá.

HU 207 342 B

Annak érdekében, hogy létrehozhassunk és screenelhessünk egy megfelelő cDNS-tárat, amelyből ilyen klón elkülöníthető, különböző mRNS minták sorozatát screeneljük Northem-féle szűrős hibridizálással, hogy azonosítsuk azokat az RNS mintákat, amelyekben a legmagasabb a LIF mRNS molekulák koncentrációja. Lényegében az irodalomban leírt módon előállított citoplazma poliadenilezett RNS-t (Gough, N. M.: J. Mól. Bioi., 165, 683-699, [1983]) frakcionálunk 20 m; morfolinopropánszulfonsavat (MOPS), 5 mM nátrium-acetátot, 1 mM EDTA-t (pH=7,0) és 6 térfogat% formaldehidet tartalmazó 1%-os agarózgéleken, az RNS-t tartalmazó szűrőket 0,2% Ficollt, 0,2% polivinil-pirrolidont, 0,2% borjúszérumalbumint, 2 mM nátrium-pirofoszfátot, 1 mM ATP-t, 50 pg/ml denaturált lazac sperma-DNS-t és 50 pg/ml E. coli tRNS-t tartalmazó 2xSSC-ben áztatjuk 67 °C-on néhány órát. A hibridizálást ugyanebben a pufferben végezzük 0,1% SDS-sel kiegészítve, 67 °C-on. A LIF transzkriptumok kimutatására használt próba egy körülbelül 750 bázispámyi EcoRI-HindlH fragmentumból áll, amely beékelve tartalmazza a pSP65-be szubklónozott pLIF7.2b cDNS-ét. Ez a fragmentum nem csak a cDNS-szekvenciát, hanem G-C „farkakat” és körülbelül 150 bázispámyi pJL3 vektorszekvenciát is tartalmaz. Ennek az SP6 szubklónnak a BRESA cégtől (Adelaide) származó reagensekkel végzett átírásával körülbelül 2xl0⁹cpm/pg ribopróbát kapunk. A próbát körülbelül 2xl0⁷ cpm/ml mennyiségben alkalmazzuk a hibridizációban. A szűrőket alaposan mossuk 2xSSC-vel, 2 mM EDTA-val és 0,1% SDS-sel 67 °C-on, végül 0,2xSSCvel 67 °C-on az autoradiográfiás vizsgálat előtt.

Ez a vizsgálat kimutatja, hogy a LIF transzkriptumok kis mennyiségben vannak jelen számos különböző hemopoetikus sejtvonalban és jelentős eltérés van a LIF mRNS szintjében a Krebs RNS különböző sarasainál. Kiválasztunk két Krebs daganat aszcitesz sejt RNS sarzsot két cDNS-tár előállítására. A cDNS-tárakat az Amersham cég által gyártott reagensek (termékszámok RPN.1256 és RPN.1257) alkalmazásával, a gyártó utasításai alapján hozzuk létre; a klónozó vektor λϋΤΙΟ. Körülbelül 4xl0⁵ rekombináns kiónt kapunk és screenelünk egy olyan oligonukleotiddal (Joint Protein Seguencig Laboratory; Ludwig Inst. fór Cancer Rés. és The Walter and Eliza Hall Inst. of Med. Rés.) hibridizálva, amely megfelel egy 36 gyökös szekvenciának a pLIF7.2b szekvencia 3’-végén; ezek az 500-535. nukleotidok a 10. ábrán.

A Krebs cDNS-tárat képviselő fág tarfoltokat körülbelül 50000 tarfolt/10 cm-es Petri-csésze sűrűségben tenyésztjük, másolatban nitrocellulózra visszük át és szokásos módszerek alkalmazásával kezeljük (Maniatis, T. és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, [1982]). A hibridizálás előtt a szűrőket néhány órát inkubáljuk 37 °C-on 6xSSC (SSC = 0,15 M nátrium-klorid és 0,015 M nátriumcitrát), 0,2% Ficoll, 0,2% polivinil-pirrolidon, 0,2% borjúszérumalbumin, 2 mM nátrium-pirofoszfát, 1 mM ATP, 50 mg/ml denaturált lazac sperma DNS és 50 μg/ml E. coli tRNS jelenlétében. A hibridizálást ugyanebben az oldatban végezzük, 0,1% NP 40-nel kiegészítve, 37 °C-on 16-18 órát. A hibridizációban körülbelül 20 ng/ml koncentrációban alkalmazzuk a fent említett oligonukleotid próbát, emelyet (γ-³²P) ATP és polinukleotid-kináz alkalmazásával radioaktívan jelzetté alakítottunk (specifikus aktivitás körülbelül 10⁹ cpm/gg), és NACS oszlopon (Bethesda Research Laboratories) végzett ioncserélő kromatográfiával elválasztottunk a be nem épült radioaktív anyagtól. A hibridizálás után a szűrőket alaposan mossuk 6xSSC és 0,1% nátrium-dodecil-szulfát alkalmazásával 60 °C-on. Kiemelünk egy λΕΙΕΝΚΙ kiónt képviselő tarfoltot, amely a szűrőmásolatokon pozitív, és kisebb sűrűségnél újra screeneljük őket a fent leírt módon.

A XLIFNK 1-ben levő körülbelül 950 bázispámyi beékelt cDNS-t, amely hibridizál a fent említett oligonukleotidhoz, egy plazmidvektorba szubklónozzuk (pEMBL8+, Dente, L. és munkatársai: Nucl. Acid. Rés., 11, 1645-1655, [1983]) a pLIFNKl klón előállítására. A pLIFNKl-ben levő beékelt cDNS nukleotidszekvencia elemzését a dídezoxi láncterminációs módszerrel (Sanger, F. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 [1977]), tempátként lúggal denaturált kétfonalas plazmid-DNS-t (Chen, E. Y. és Seeburg, P. H.: DNA, 4, 165-170, [1985]), primerekként különböző, a cDNS-t határoló vektor szakaszaival és a beékelt cDNS-en belüli szekvenciákkal egyaránt komplementer oligonukleotidokat (W. and E. Hall Inst. Med. Rés., Joint Protein Sequencing Laboratory, Ken Victoria, Ausztrália) alkalmazva, és a szekvenálási reakcióban polimerázokként mind az E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmentumát mind pedig az AMV reverz transzkriptázt felhasználva. Az „oligonukleotidok” kódolt cDNS szekvenciák részei, amelyek a pLIFNKl-ben helyezkednek el. A pLIFNKl-be beékelt cDNS egy részének nukleotidszekvenciáját a 11. ábra mutatja. A pLIFNKl által meghatározott aminosavszekvencia C-terminusánál azonos azzal a 9 aminosavval, amelyet a közvetlen aminosavszekvenálás alapján a LIF C-terminusát képező aminosavakként jósoltunk, és megerősíti, hogy a LIF C-terminális gyöke a Phe 187, mivel a pLIFNKl cDNS-szekvenciájában ennek a gyöknek a kodonját közvetlenül egy leolvasási kereten belüli stop kodon követi.

2. lépés

Egy LIF kodon szakasz létrehozása egy élesztő kifejező vektorban

A LIF cDNS-klónok által kódolt protein kezdeti termelését egy eukarióta rendszerben (élesztő) érjük el úgy, hogy a kifejezéssel nyert termék glikozilezett kiválasztott és megfelelően felcsavarodott legyen. Az alkalmazott YEpsecl kifejező vektor (Baldari, C. és munkatársai: EMBO J., 6, 229-234, [1987]) biztosít egy olyan N-terminális vezérszekvenciát, amely a Kluyveromyces lactis killer toxin génjéből származik, és amelyről korábban kimutatták, hogy irányítja az interleukin I hatékony kiválasztását (Baldari, C. és munkatársai: EMBÖ J., 6, 2291

HU 207 342 Β

234 [1987]) átírva egy galaktózzal indukálható hibrid GAL-CYC promoterről.

Annak érdekében, hogy kifejezzük az ebben a vektorban levő pLIF7.2b által kódolt proteint, néhány módosítást kell végrehajtani a cDNS-en (lásd 12. ábra). 5’-végén nem csak azt a néhány nukleotidot kell eltávolítani, amelyek meghatározzák a részleges emlős vezérszekvenciát, hanem be is kell vinni egy megfelelő restrikciós endonukleáz hasítóhelyet (BamHI), hogy lehetővé tegyük a leolvasási kereten belüli beékelést a K. lactis vezérszekvenciával és megtartani egy megfelelő jelzőpeptidáz hasítóhelyet (Gly-Ser). A 3’-végen a LIF-et kódoló szakasznak két változatát hozzuk létre. Az egyik változatot (LIFmutl) úgy alakítjuk ki, hogy a pLIF7.2b utolsó kodonját (Gin 178) közvetlenül egy stop kodon követi. A másik változatot (LIFmut2) úgy alakítjuk ki, hogy beiktatunk egy, azt a 9 aminosavgyököt kódoló szekvenciát, amelyekről tudjuk, hogy hiányoznak a LIF7.2b-ből (lásd fent), és egy ezt követő leolvasási kereten belüli transzlációs stop kodont. Mindkét változat egy megfelelő restrikciós endonukleáz hasítóhellyel (HindHI) egészül ki. Mindezeket a módosításokat oligonukleotiddal közvetített mutagenezissel érjük el: a körülbelül 750 bázispámyi EcoRI-HindHI fragmentumot, amelyet restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel állítunk elő, és amelyben benne van a pLIF7.2b 535 bázispámyi beékelt cDNS-e, G-C „farkakkal” megkötve és a pJL3 vektor egy része, plazmid pEMBL8+-ba (Dente, L. és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 11, 1645-1655, [1983]) klónozzuk és egyfonalas DNS-t készítünk az irodalomból ismert módon (Cesarini, G., Murray, J. A. H., a Genetic Engineering: Principles and Methods című könyvben, szerkesztők Setlow, J. K. és Hollaender, A., Plenum Press kiadó, New York, 8. kötet [1987]). Az in vitro mutagenezist az irodalomban leírt módon (Nisbet, I. T., Beilharz, M. W.: Gene Anal. Techn., 2, 23-29, [1985]) hajtjuk végre 35, 51, illetve 61 bázisból álló oligonukleotidokat (W. and E. Hall Inst. Med. Rés., JPSL termékei) alkalmazva a cDNS 5’- és 3’-végének fent leírt módosítására. A módosított LIF cDNS-szekvenciákat tartalmazó BamHI-HindlII fragmentumokat az YEpsecl plazmidba ligáljuk és meghatározzuk a kapott rekombinánsban a beékelt részek szekvenciáját.

3. lépés

Az YEpsecl/LIF rekombinánsok bevitele élesztősejtekbe

S. cerevisiae GY41 törzset (leu 2 ura3 adel his4 met2 trp5 gall cir+; x4003-5b, Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley) transzformálunk a polietilénglikolos módszerrel (Klebe, R. J. és munkatársai: Gene, 25, 333-341, [1983]). A transzformánsokat kiválasztjuk és mesterséges minimálközegen (2% szénforrás, 0,67% élesztő nitrogénbázis [Difco] kiegészítve a kívánt aminosavak 50 pg/ml-nyi mennyiségével) tartjuk uracil nélkül. Az YEpsecl plazmidba beékelt szekvenciák kifejeződését úgy érjük el, hogy a transzformánsokat vagy nem-szelektív teljes közegen (1% élesztőkivonat, 2% pepton) vagy mesterséges minimálközegen tartjuk; mindkét közeg 2% galaktózt tartalmaz.

4. lépés

Az élesztőből származó LIF biológiai tulajdonságainak meghatározása

Az élesztő által kondicionált közeg differenciálódást kiváltó hatását és a leukémiát visszaszorító hatását 1 ml-es, 300 Ml (Saitama Cancer Research Centre, Japán) sejtet tartalmazó tenyészetekben vizsgáljuk Dulbecco-féle módosított Eagle-közegen, borjú magzati szérum 20%-os végső koncentrációja és 0,3% agar alkalmazásával. A vizsgálandó anyagot sorozatosan hígítva, 0,1 ml térfogatú részekben adagoljuk a tenyésztő edényekbe, az agarközeges sejtszuszpenzió hozzáadása előtt. A tenyészeteket 7 napig inkubáljuk maximális nedvességtartalmú légkörben 10% szén-dioxid tartalomnál. A tenyészeteket mikroszkóppal értékeljük 35szörös nagyításnál, differenciálódottnak tekintve minden telepet, amelynek koronája van diszpergált sejtekből vagy teljesen diszpergált sejtekből áll. A telepek morfológiai vizsgálatát a teljes tenyészetet 1 ml 2,5%os glutáraldehiddel rögzítve, majd a megszárított tenyészeteket mikroszkóp tárgylemezeken megfestve végezzük, acetil-kolin-észteráz/Luxol Fást Blue/Haematoxylín alkalmazásával.

A telepserkentő hatás vizsgálatát 75000C57BL csontvelősejt alkalmazásával hajtjuk végre az irodalomban leírt módon (Metcalf, D.: The Hemopoietic Colony Stimulating Factors, Elsevier kiadó, Amsterdam, [1984]). A differenciálódást kiváltó hatás vizsgálatát WEHI-3B D⁺ sejteken az irodalomban ismertetett módon végezzük (Nicola, N. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 258, 9017-9023, [1983]). Az Ml telepek tenyészeteiben a tipikus makrofág differenciálódást kiváltja a teljes hosszúságú kódoló szakaszt (LIFmut2) tartalmazó élesztő tenyészetéből származó közeg, de nem váltják ki azok a közegek, amelyek nem-transzformált élesztő tenyészeteiből, csak az YEpsecl vektort tartalmazó élesztő tenyészeteiből vagy a nem teljes kódoló szakaszt (LIFmutl) tartalmazó élesztő tenyészeteiből származnak (13.A ábra). Amint a tisztított természetes LIF-fel, az élesztőből származó anyag koncentrációjának növekedésével is progresszíven csökken a kifejlődő Ml telepek száma és mérete (13.B ábra). A tisztított természetes LIF-fel végzett összehasonlítás azt mutatja, hogy az élesztővel kondicionált közeg 16000 egység/ml-ig (körülbelül 130 ng/ml) terjedő mennyiségű LIF-et tartalmaz. Az élesztőből származó LIF, a tisztított természetes LIF-hez hasonlóan nem serkenti a normális granulocita-makrofág progenitor sejtek telepképzését, és nem váltja ki a differenciálódást és nem szorítja vissza a szaporodást sem WEHI3B D⁺ leukémiás telepek esetében.

A méret szerinti frakcionálás Sephacryl S-200 oszlopon azt mutatja, hogy az élesztőből származó LIF 67 000-150000 Dalton látszólagos molekulatömegű proteinekkel együtt eluálódik, a Krebs sejtekből

HU 207 342 Β származó LIF 58000 Dalton molekulatömegével szemben.

Az a tény, hogy a nem teljes kódoló szakaszt (LIFmutl) tartalmazó élesztő által kondicionált közeg nem mutat LIF hatást, azt sugallja, hogy az ebből a felépítésből hiányzó 9 hidrofób C-terminális gyök szükséges lehet a LIF funkcióhoz. Míg ezek a gyökök kölcsönhatásba léphetnek a receptorral, egy a proteinen belüli hidrofób mag részét is képezhetik, és így hiányuk meggátolhatja a megfelelő felcsavarodást. Egy másik lehetőség az, hogy valamilyen módon a LIF hatékony kiválasztásához szükségesek.

5. lépés

Élesztőből származó egér LIF és Krebs II aszcitesz sejttel kondicionált közegből származó tisztított természetes LIF-A receptorkötődési fajlagossága Tisztított egér LIF-A-t (1. példa) a korábban leírt módon (3, példa) jódozunk. Hasüregi sejteket nyerünk kimosással olyan egerekből, amelyek hasüregében magas makrofágszintet váltottunk ki tioglikoláttal. Ezeket a sejteket mossuk és újra szuszpendáljuk 2,5x106/50 pl Hepes-pufferolt RPMI közegben, amely 10% borjú magzati szérumot tartalmaz. 50 μΐ-es alikvot részekben a sejteket 200000 cpm ¹²⁵I-LIF-A-val (10 pl, ugyanebben a közegben) inkubáljuk és 10 pl kontrollközeget vagy nem jelzett tiszta egér LIF-A vagy élesztőből származó egér LIF kétszeres hígításainak sorozatát alkalmazzuk. Megfelelő koncentrációknál a LIF-mut2 szerkezetet (12. ábra) tartalmazó, galaktózzal indukált élesztő felülúszója verseng a ¹²⁵ILIF-A-val a hasüregi receptorhoz kötődésért, míg a nem indukált élesztő felülúszója nem (14. ábra). A versengés mértéke megegyezik a hiteles természetes LIF-A-éval, jelezve, hogy az élesztőből származó LIF-A tartalmazza valamennyi, a LIF-A sejtreceptorokhoz kötődéshez szükséges információt.

6. példa

Ez a példa a rekombináns egér LIF emlőssejtekben való kifejezéséhez alkalmazott lépéseket ismerteti.

A 15. ábra az alább leírt eljárás első lépésére vonatkozik; a pLIFNK3 cDNS részének nukleotidszekvenciája. Az mRNS-szinonim fonal nukleotidszekvenciáját 5-3’ orientációban mutatjuk be, a LIF következtetett aminosavszekvenciáját felül megadva. A korábban meghatározott N-terminális aminosavgyököt +l-gyel jelöljük. A cDNS 5’-végénél megjelöljük az EcoRI helyet és megadjuk az Xbal helyet, amelyek közrefogják a stop kodont (a második lépésben a LIF kódoló szakaszának a pMP-Zen-be való beékelésére használjuk)·

I. lépés

Az egér LIF N-terminális vezérszekvenciája aminosavszekvenciájának meghatározása ApLIF7.2b és pLIFNKl cDNS-klónok (lásd fent) a

LIF mRNS nem teljes másolatát tartalmazzák. Bár együtt a LIF protein kész részét kódoló teljes kódoló szakaszt tartalmazzák, nem tartalmazzák a teljes hidrofób vezérszekvenciáí, ami szükséges a LIF kiválasztásához emlőssejtből. A hidrofób vezérszekvenciát kódoló szakaszt tartalmazó cDNS-klón elkülönítésére további 10⁶ cDNS-klónt hozunk létre a fenti módon (5. példa), templátként ugyanazt a Krebs mRNS sarzsot alkalmazva, és screeneljük (mint fent), próbákként két olyan oligonukleotidot alkalmazva, amelyek a pLIF7.2b szekvencia 5’-végén 35 gyökből álló szekvenciának, illetve 3’-végén 36 gyökből álló szekvenciának (67-102., illetve 500-535. nukleotidok a 10. ábrán) felelnek meg. (Joint Protein Sequencing Laboratory; Ludwig Inst. fór Cancer Rés. és The Walter and Eliza Hall Inst. of Med. Rés.)

Kiemeljük a ÁLIFNK2 és a ZLIFNK3 kiónokat képviselő két tarfoltot, amelyek pozitívak a szűrőmásolatokon, és újra sereeneljük őket kis sűrűségnél, mint fent. Mivel a ZLIFNK3 mindkét alkalmazott oligonukleotidhoz hibridizál, ezt választjuk ki további elemzésre.

A XLIFNK3-ba beékelt körülbelül 1400 bázispárnyi cDNS-t a pEMBL 8⁺ plazmidvektorba szubklónozzuk (Dente, L. és munkatársai: Nucleic Acid Rés., 11, 1645-1655, [1983]; 1. Maniatis idézett könyvét is) a pLIFNK3-klón létrehozására. A pLIFNK-ba beékelt cDNS nukleotidszekvencia elemzését ugyanúgy hajtjuk végre, mint a pLIF7.2b és pLIFNKl esetében (mint fent).

ApLIFNK3-ba beékelt cDNS nukleotidszekvenciáját a 15. ábra mutatja, és feltünteti, hogy a pLIFNK3 egy teljes LIF kódoló szakaszt tartalmaz: van egy iniciátor kodon (AUG) a pLIFNK3 szekvencia 23-25. helyzetében, megelőzve egy olyan szekvenciát, amely egy 24 aminosavgyökből álló tipikus hidrofób vezérszekvenciát kódol. A kódoló szakasz ugyanaddig a transzlációs stop kodonig terjed, amit fent a pLIFNKlnél meghatároztunk.

2. lépés

Egy LIF kódoló szakasz bevitele egy emlős kifejező vektorba

A kiindulásként választott emlős kifejező vektor a pMP-Zen retrovírus kifejező vektor. (Bemard et ah, J. Neurosci. Rés. 24, 9-20, [1989], A vektor a Moloney egér leukémia vírus- alapú pZIPNeo SV(X) vektorból (Cepko, C. L. és munkatársai: Cell, 37, 1053-1062, [1984]) származik a neo^R gén deléciójával a közeli SV40 és plazmid szekvenciákkal együtt, meghagyva egy Xhol kifejezési helyet. A vektor 3’-szakaszát is módosítjuk az enhancer beépítésére a mieloproliferatív szarkóma vírus (MPSV) hosszú terminális ismétlődéséből (long terminál repeat, LTR), (Bowtel, D. D. L. és munkatársai: M01. Bioi. Med. 4, 229-250, [1987]). Elsősorban azért választjuk ezt a vektort, mert a LIF/PMP-Zen rekombinánst be lehet csomagolni segítőmentes fertőző retrovírus részecskékbe ψ2 sejteken átengedve (Mann, R. és munkatársai: Cell, 33, 153— 159, [1983]). Ezeket a vírusrészecskéket azután felhasználhatjuk a LIF/pMP-Zen rekombináns hatékony bevitelére (fertőzéssel) számos különböző típusú egér sejtbe (Mann, R. és munkatársai: Cell, 33, 153-159,

HU 207 342 Β [1983]). Másodszor erről a vektorról, amely az MPSV LTR-eket alkalmazza az idegen kódoló szakasz kifejezésére, kimutatták, hogy irányítja bizonyos más hemopoetikus növekedési és differenciálódási faktorok beleértve a GM-CSF-et - hatékony kifejezését is.

A pMP-Zen-be való beékelésre kiválasztott pLIFNK3 szegmens az 1. pozíciótól (egy EcoRI hely) a 630. pozícióig (egy a stop kodont átfogó Xbal hely) terjed (15. ábra). Azért választjuk ezt a szegmenst, mivel ez egy kicsit többet tartalmaz, mint a pre-LIF kódoló szakasza és kizárja valamennyi 3’ - le nem fordított szakaszt, amelyek az mRNS-nek instabilitást kölcsönző szekvenciákat tartalmazhatnak (például Shaw, G. és Kamen, R.: Cell, 46, 659-667, [1986]; Verma, I. M. és Sassone-Corsi, P.: Cell, 57,513-514, [1987]). Annak érdekében, hogy ezt a szegmenst beékelhessük a pMP-Zen-be, először a pIC20H EcoRI és Xbal helyei közé ékeljük be (Marsh, J. L. és munkatársai: Gene, 32, 481-485, [1984]) ismert módszerekkel (Maniatis és munkatársai, fenti hivatkozás, [1982]). Ezután a beékelt cDNS-t kinyerjük a pIC20H plazmid polilinkeréből Sall-gyel és Xholgyel végzett emésztéssel, így egy olyan LIF cDNSfragmentumot hozva létre, amelynek ragadós végei megfelelőek arra, hogy beékeljük a pMP-Zen Xhol klónozó helyére. A LIF cDNS-fragmentum beékelését a pMP-Zen-be irodalomból ismert eljárásokkal végezzük (Maniatis és munkatársai, fenti hivatkozás, [1982]).

3. lépés

ApMP-Zen/LIF rekombináns bevitele egér fibroblasztokba pMP-Zen/LIF DNS-t ψ2 fibroblasztokba viszünk be elektroporációval (Potter és munkatársai: PNAS, 81, 7161-7165, [1984]). 30 pg pMP-Zen/LIF DNS-t és 3 pg pSV2Neo DNS-t (Southern, P. I, Berg, P.: J. Mól. App.Genet., 7, 327-341, [1982]) összekeverünk 1x106 ψ2 fibroblaszttal 1 ml DME/10% FCS-ben (Dulbecco szerinti módosított Eagle-közeg, amely 10% borjú magzati szérumot tartalmaz) és 500 V-on, 25pF kapacitásnál áramlökésnek vetjük alá (BioRad Gene-Pulser készülékkel, modellszám 1652078). A transzfektánsokat először G418 antibiotikummal szembeni rezisztencia - amit a pSV2Neo DNS-e kölcsönöz - alapján válogatjuk ki. A G418-cal szemben rezisztens ψ2 sejteket 400 pg/ml G418-ban választjuk ki irodalomból ismert eljárásokkal (Mann, R. és munkatársai: Cell, 33,153-159, [1983]). 19 megvizsgált G418-rezisztens kiónból 2 a pMP-Zen/LIF szerkezetet is tartalmazza, amint azt megjósoltuk az ψ2vel kondicionált közegben kimutatható LIF hatás alapján.

4. lépés xp2-ből származó LIF biológiai tulajdonságainak meghatározása

A pMP-Zen/LIF-et tartalmazó ψ2 sejtekkel kondicionált közeg differenciálódást kiváltó hatását és leukémiát visszaszorító hatását a fent leírt módon vizsgáljuk.

A differenciálódást kiváltó hatást ΙΟ⁶ ψ2 sejttenyészetéből vett közeg 3 ml DME/10% FCS-sel készített oldatával vizsgáljuk. A két pozitív tenyészet eredményeit a következő táblázat mutatja:

Klónszám Ml differenciálódást kiváltó hatás (egység/10⁶ sej(/ml C. M.) y2-kontroll nem mutatható ki y2-lla >16000 y2-lld >16000 így ebben a kifejezési rendszerben jelentős biológiailag hatásos, rekombináns egér LIF szint érhető el.

5. lépés pMP-Zen/LIF retrovírus átvitele ψ2 sejtekből hemopoetikus sejtekbe

Leírják, hogy fertőző pMP-Zen/LIF retrovírus átvihető a szülő ψ2 sejtvonalakból a FDC-P1 vonal hemopoetikus sejtjeibe (Dexter, T. M. és munkatársai: J. Exp. Med., 752,1036-1047, [1980]) együttes tenyésztéssel. ΙΟ⁶ ψ2 sejtet összekeverünk 10⁶ FDC-P1 sejttel 10 ml DME/10% FCS-ben, amely WEHI-3BD^_-vel kondicionált közeg az FDC-P1 sejtek növekedéséhez legkedvezőbb koncentrációját tartalmazza. 2 nap inkubálás után a nem tapadó FDC-P1 sejteket eltávolítjuk, minden hozzájuk tapadó ψ2 sejtet lemosunk róluk és 16 órát tenyésztjük őket ugyanabban a közegben. A kondicionált közeget összegyűjtjük és megvizsgáljuk differenciálódást kiváltó és leukémiát visszaszorító hatását a fent leírt módon. Az eredményeket a következő táblázat mutatja:

Klónszám, amelyből Ml differenciálódását kiváltó az FD-tenyészet szár- hatás (egység/10⁶ FDC-P1 mazik sejt) i}r2-kontroll nem mutatható ki y2-lla körülbelül 3000 ψ2-11ό körülbelül 1500 így az ψ2- 11a és ψ2-11ά y2-klónok át tudják vinni a biológiailag aktív pMP-Zen/LIF retrovírust hemopoetikus sejtekbe. Ezek a kiónok ezért alkalmazhatók lennének a normális egér hemopoetikus progenitor sejtek megfertőzésére, amelyeket besugárzott egerek hemopoetikus rendszerének helyreállítására lehet alkalmazni, a magas szintű természetes LIF kifejezés hatásának vizsgálatára normális egér vérképzésre, a Zen/GM-CSF vírusfertőzésre használttal analóg módon.

7. példa

A következőkben a rekombináns egér LIF E. coli sejtekben való kifejezésére alkalmazott lépéseket ismertetjük.

A 16. ábra az alább leírt módszer első lépését mutatja: a glutation S-transzferáz/trombin hasítóhely/LEF

HU 207 342 Β kapcsolódás nukleotidszekvenciája a pGEX-2T/LIF plazmában, és a kódolt fúziós protein kapcsolódásánál levő szekvencia. Szemléltetjük a glutation S-transzferáz és a trombin hasítóhely C-terminálisát és a háromrészes fúziós protein egér LIF részeinek N-terminálisát, az ezt az aminosavszekvenciát kódoló nukleotidszekvenciával együtt. A feltételezett trombin hasítóhelyet nyíllal jelöljük.

1. lépés

LIF kódoló szakasz bevitele egy E. coli kifejező vektorba

A LIF E. coli-ban való kifejezésére használt kifejező vektor a pGEX-2T (Smith, D. B., Johnson, K. S.: Gene, [1988]), 67. p. 31-40), amely irányítja olyan idegen polipeptidek szintézisét, amelyek fuzionáltak az Sj26 - egy a Schistosoma japonicum parazita bélféreg által kódolt 26 kD-os glutation S-transzferáz (E. C. 2.5.1.18) - C-terminálisával. A fúziós proteinek az esetek túlnyomó részében oldhatónak bizonyulnak vizes oldatokban és nyers baktérium-lizátumokból immobilizált glutationon végzett affinkromatográfiával tisztíthatók nem-denaturáló körülmények között. A pGEX-2T vektort úgy alakítjuk át, hogy a glutation S-transzferáz hordozót le lehessen hasítani a fúziós proteinről a hasítóhelyre specifikus proteáz trombinnal végzett emésztéssel (D. B. Smith, K. S. Johnson: Gene, 67. p. 31-40, [1988]).

Az egér LIF pLIFmut2 plazmidból (lásd 5. példa és 12. ábra) származó teljes kódoló szakaszát bevisszük a pGEX-2T többszörös klónozó helyére BamHI - EcoRl fragmentumként (Smith, D. B., Johnson, K. S. fent hivatkozott közlemény), így a LIF kódoló szakaszt a glutation S-transzferázhoz és a trombin hasítóhelyhez képest 3’-helyzetben, és velük azonos transzlációs leolvasási keretbe helyezzük el. így a LIF protein ezekhez az elemekhez képest C-terminálisan helyezkedik el egy háromrészes glutation S-transzferáz/trombin hasítóhely/LIF fúziós proteinben (lásd 16, ábra). Megjegyzendő, hogy a trombin hasítóhely úgy helyezkedik el, hogy két aminosavgyök (Gly-Ser) kapcsolódik majd a LIF protein N-terminusához a trombinos hasítás után. A fent említett pGEX-2T/LIF plazmid létrehozását és bevitelét E. coli NM522-be (Gough, J. A., Murray, N. M.: J. Mól. Bioi., 166, 1-19, [1983]) ismert módszerekkel végezzük.

2. lépés

Glutation S-transzferáz/LIF fúziós protein kifejezése és tisztítása

A glutation S-transzferáz/LIF fúziós protein kifejeződésének kiváltására pGEX-2T/LIF-et tartalmazó E. coli NM522 sejtek tenyészetének 10 ml-es részeit Luria tápközegen (1. pl. Maniatis idézett művét), a logaritmikus szakaszig tenyésztjük, és izopropil-P-D-tiogalaktopiranozidot adunk hozzá 0,1 mM koncentrációig. További 4 óra tenyésztés után, ami alatt a glutation S-transzferáz/LIF gén kifejeződik, a sejteket centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 1 ml egér tóniás foszfáttal pufferolt sóoldatban (MTPBS:

150 mM nátrium-klorid, 16 mM dinátrium-hidrogénfoszfát, 4 mM nátrium-dihidrogén-foszfát, pH=7,3). A sejteket jégen elroncsoljuk enyhe ultrahangos kezeléssel és 1% Triton X-100 hozzáadása után a sejttörmeléket kicentrifugáljuk (10000 g, 5 perc, 4 °C). A tisztított felülúszót szobahőmérsékleten egy 50 ml-es polipropilén centrifugacsőben forgótányéron összekeverjük 200 μΐ 50%-os glutation-agaróz gyöngyökkel (kén kötés, Sigma). A gyöngyöket felhasználás előtt előduzzasztjuk MTPBS-ben, ugyanebben a pufferben kétszer mossuk és MTPBS-ben tároljuk 4 °C-on 50 térfogat%-os oldat formájában. Az abszorpció után (5 perc) a gyöngyöket centrifugálással (500 g, 1 perc) összegyűjtjük és háromszor mossuk MTPBS/Triton X-100ban. A glutation S-transzferáz/LIF fúziós proteint ezután szabad glutationnal versengtetve eluáljuk: a gyöngyöket 10 μΐ trisz-HCl-dal, amely 5 mM redukált glutationt tartalmaz (pH = 7,5) inkubáljuk 2 percig szobahőfokon, majd centrifugálással eltávolítjuk őket. Az elúciós lépést kétszer hajtjuk végre és a két 100 μΐ-es alikvot eluátumot egyesítjük.

A glutation S-transzferáz/LIF fúziós protein 100 μΐét trombinnal kezeljük az irodalomban leírt módon (Smith, D. B., Johnson, K. S., fent hivatkozott közlemény).

A nem hasított és a trombinnal hasított glutation S-transzferáz/LIF fúziós proteinek 1 μΐ-es alikvot részeit Pharmacia Phast Gel-en (8-25% poliakril-amid gradiens gél) elektroforézisnek vetjük alá. Coomassie Blue-val végzett festés után a nem hasított készítményben egyetlen fő protein fajtát mutatunk ki, amelynek relatív molekulatömege körülbelül 46 kD; a trombinnal hasított készítményben pedig két fő sávot mutatunk ki, amelyek körülbelül 26 kD, illetve körülbelül 20 kD méretűek; ezek az adatok megfelelnek a várt értékeknek a fúziós protein (46 kD), a glutation S-transzferáz (26 kD) és a LIF proteinek (20 kD) esetében is. A Coomassie-festett sávok tömegét megbecsülve a gélben, az eredeti 10 ml-es E. coli tenyészetből kapott glutation S-transzferáz protein mennyiségét körülbelül 1,5 μg-nak becsüljük.

A glutation S-transzferáz/LIF fúziós protein és a trombinnal hasított LIF készítmény differenciálódást kiváltó és leukémiát visszaszorító hatását egér Ml sejtek alkalmazásával vizsgáljuk a fent leírt módon. Mindkét LIF készítményt biológiailag hatásosnak találjuk, 7xl0⁶ egység/mg-ot meghaladó specifikus aktivitással.

8. példa

A következőkben annak meghatározására alkalmazott lépéseket ismertetjük, hogy az egér genom tartalmaz-e bármilyen más gént, ami közeli rokonságban áll a pLIF7.2b kiónban (4. példa) jelen levő szekvenciát kódoló génnel; továbbá a LIF gén körüli restrikciós endonukleáz hasítóhelyek elhelyezkedését feltüntető térkép megszerkesztését írjuk le. A 17. ábra az alábbiakban leírt eljárás első lépését ismerteti: egér DNS hibridizálása pLIF7.2b-ből származó próbával nagy és kis intenzitású körülmények között. A megadott rest1

HU 207 342 Β rikciós enzimekkel emésztett BALB/c máj DNS-t próbával kezeljük LIF génszekvenciák kimutatására a 8. példa 1. lépésében leírt módon. A bal mezőben a hibridizálást 65 °C-on végezzük 2xSSC-ben, és a végső mosást 65 °C-on 0,2xSSC-ben. A jobb mezőben mind a hibridizálást, mind a mosást 6xSSC-ben végezzük 65 °C-on. A bal mezőben a lineáris pLIF7.2b plazmid DNS-t (5,6 kilobázis) haploid egér genomra számítva (400 pg, illetve 40 pg) 10 és 1 másolatnak megfelelő mennyiségben alkalmazzuk, a 3xl0⁹ bázispámyi haploid egér genom feltételezett molekulatömege alapján (Laird, C. D.: Chromosoma, 32, 378-406, [1971]). A hibridizálódó genomfragmentumok méretét megadjuk

18. ábra: az eljárás második lépésére vonatkozik különböző restrikciós endonukleázokkal hasított egér DNS hibridizálása, egyenként és párjellegű kombinációkban, egér LIF próbával. Az emésztett DNS-eket 0,8%-os agaróz géleken elektroforézisnek vetjük alá és a pLIF7.2b cDNS fragmentummal hibridizáljuk a 8. példa 1. lépésében leírt módon, nagy intenzitású körülmények között.

19. ábra: az eljárás második lépésére vonatkozik az egér LIF gén restrikciós endonukleáz hasítási térképe. Bekeretezéssel jelöljük a kromoszomális DNS-nek azt a szakaszát, ami a pLIF7.2b cDNS kiónnak megfelelő szekvenciákat tartalmaz. A központi vonal fölött (EcoR5) és alatt (Xbal, BamHl, PstI és Stul) megjelölt restriciós helyeket nem orientáljuk a központi vonalhoz képest.

A helyek viszonylagos elhelyezkedése a vonal alatti komplexen belül a megadott.

20. ábra: az eljárás harmadik lépésére vonatkozik az egér LIF gén kromoszomális elhelyezkedése. Az első sorban a BALB/c egér embrió DNS-t vetjük alá eletkroforézisnek, a második sorban a kínai hörcsög petesejtjeinek DNS-ét, és a 3-8. sorokban az I-18A HAT, I-18A-2a-8AG; EBS 58; EBS 11,; EBS 4; és I-13A-la-8AG hibrid kiónok DNS-ét (Cory, S. és munkatársai: EMBD 1,2, 213-216, [1983]). Ezeknek a hibrideknek az egér kromoszóma tartalmát Cory, S. munkatársai megadják (EMBO J., 2,213-216, [1983]). Valamennyi DNS-t BamHI-gyel emésztjük. Megjelöljük az egér LIF gént hordozó 3 kilobázispámyi BamHl fragmentum helyzetét.

1. lépés

A LIF-fel rokon gének számának meghatározása az egér genomban

Figyelembe véve az 1. példának azokat az adatait, hogy a Krebs II sejtekkel kondicionált közeg két biokémiailag különválasztható de funkcionálisan hasonló faktort tartalmaz, amelyek ki tudják váltani az Ml sejtek differenciálódását (LIF-A és LIF-B), meg akarjuk határozni, hány olyan gén van az egér genomban, amely rokon az általunk tisztított és klónozott fajtájúakkal. Ezért különböző restrikciós endonukleázokkal emésztett egér genomiális DNS Southern szűrős alakját hibridizáljuk pLIF7.2b-ből származó próbához, nagy és kis intenzitású körülmények között.

BALB/c egerek májából származó nagy molekulatömegű genomiális DNS 20 pg-os alikvot részeit különböző restrikciós endonukleázokkal teljesen emésztjük, 0,8% agaróz géleken végzett elektroforézissel frakcionáljukés nitrocellulózra visszük át. Hibridizálás előtt a szűrőket néhány órát 65 °C-on inkubáljuk vagy 6xSSC /kis intenzitás) vagy 2xSSC (nagy intenzitás), 0,2% Ficoll, 0,2% polivinil-pirrolidon, 0,2% borjúszérumalbumin, 2 mM nátrium-pirofoszfát, 1 mM ATP, 50 pg/ml denaturált lazac sperma DNS és 50 pg/ml E. coli tRNS jelenlétében. A hibridizálást ugyanebben az oldatban végezzük, amely 0,1% SDS-t tartalmaz, 65 °C-on 16-18 órát. A szűrőket ezután vagy 6xSSCvel és 0,1% SDS-sel mossuk 65 °C-on (kis intenzitás) vagy 2xSSC-vel és 0,1% SDS-sel, 65 °C-on, majd 0,2xSSC-vel 65 °C-on (nagy intenzitás) a 17. ábra szövegében ismertetett módon. Az alkalmazott hibridizáló próba - amint azt fent leírtuk - a körülbelül 750 bázispámyi EcoRI-Hindlü fragmentum, amely átfogja a pLIF7.2b nick-transzlációval radioaktívan jelezetté alakított (körülbelül 4xl0⁸ cpm/p/g specifikus aktivitású) beékelt cDNS-ét, és amelyet körülbelül 2xl0⁷ cpm/ml koncentrációban alkalmazunk a hibridizáláshoz. A radioaktív jelölés G. R. Sutherland et al. módszerével történt (Leukaemia, 3 (1), p. 9-13, [1989]; 1. különösen a cikk Materials and Methods c. részét, p. 9.)

Egér máj DNS-ben (17. ábra), valamint Krebs II sejtekből származó DNS-ben, LB3 T sejtek és WEHI265 monocita sejtek (W. and E. Hall Inst. Med. Rés., 1. az előbbiekben) DNS-ében a LIF próba egyedi, körülbelül 11, 3, illetve 13 kilobázispámyi EcoRl, BamHl és Hindin fragmentumokat mutat ki. Ugyanaz a hibridizálódási minta nyilvánvaló mind nagy (0,2xSSC, 65 °C), mind kis (6xSSC, 65 °C) intenzitásnál (17. ábra). Kis intenzitású hibridizációs és mosási körülmények esetén nincs további sáv. Hasonlóan, egyedi hibridizációs fragmentumokat mutatunk ki a Pstl-gyel, Stul-gyel, Sacl-gyel, EcoR5-tel és BglII-vel emésztett genomiális DNS-ben is (17. ábra). A 16. ábrán szemléltetett kísérletben ezenfelül a pLIF7.2b plazmid DNS haploid egér genomra számítva 10, illetve 1 másolattal egyenértékű mennyiségben kerül alkalmazásra (1. és 2. sáv); a genomiális LIF szekvenciák hibridizációs intenzitása nem különbözik jelentősen az egyedi gén standard intenzitásától (2. sáv). A WEHI265 sejteket először A. W. Hamis et. al. írta le (Cancer Rés. 39, p. 538-541, [1979]).

Az ismertetett adatok egybevetése azt jelzi, hogy a LIF gén egyedi az egér genomban, és nincs közeli rokona. így a két LIF fajta valószínűleg nem különböző gének terméke, hanem valószínűbben ugyanannak a génterméknek átírás utáni vagy transzláció utáni variánsai.

2. lépés

Az egér LIF gén restrikciós endonukleáz hasítási térképének elkészítése

Annak érdekében, hogy meghatározzuk a restrikciós endonukleáz hasítóhelyek elhelyezkedését az egér LIF génben és körülötte, és így biztosítsuk ennek a génnek egy molekuláris „ujjlenyomatát”, egérmájból

HU 207 342 Β vagy Krebs ascites daganatsejtekből származó DNS-t különböző restrikciós endonukleázokkal emésztünk és Southern szűrős elemzésnek vetjük alá az 1. lépésben leírt módon (nagy intenzitású hibridizációs és mosási körülmények között). Ezeknek a kísérleteknek a példáit mutatja a 18. ábra. Az emésztett termékek méretének elemzése lehetővé teszi egy olyan térkép megszerkesztését, amely valamennyi hasítási hely elhelyezkedését feltünteti a LIF-gén körül (19. ábra).

3. lépés

Az egér LIF gén kromoszomális elhelyezkedése

Annak meghatározására, hogy melyik kromoszómán helyezkedik el az egér LIF gén, megvizsgáljuk hat olyan egér - kínai hörcsög petefészek szomatikus sejt hibrid sejtvonal DNS-ét, amelyek különböző egér kromoszómákat tartalmaznak (Cory, S. és munkatársai: EMBO J., 2, 213-216, [1983]; Francke, U. és munkatársai: Cytogenet. Cell. Génét., 19, 57-84, [1977]). Southern szűrős elemzést végzünk az 1. lépésben leírt módon (nagy intenzitású hibridizációs és mosási körülményeket alkalmazva), és ez azt mutatja, hogy az egér LIF gént tartalmazó 3 kilobázispámyi BamHI fragmentum valamennyi hibridből hiányzik (20. ábra). Mivel a 11. kromoszóma, ami az egér kínai hörcsög hibridek jellemzője (Francke, U. és munkatársai: Cytogenet. Cell. Génét., 19, 57-84, [1977]), az egyetlen egér kromoszóma, ami egyik ilyen vonalban sem maradt meg (Cory, S. és munkatársai: EMBO J., 2, 213-216, [1983]), valószínű, hogy a LIF gén ezen a kromoszómán van. Ugyanezen az alapon az egér GM-CSF gén (Barlaw, D. P. és munkatársai: EMBO J., 6, 617-623, [1987]) és a Multi-CSF gén (Ihle, J. N., Kozák, C. A.: National Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facvility, Annual Report, [1984]) szintén all. kromoszómához rendelhető, és ezt az elhelyezést a genetikus kötődési vizsgálatok megerősítették (Barlow, D. P. és munkatársai: EMBO J., 6, 617-623, [1987]).

9. példa

Ez a példa ismerteti azoknak a körülményeknek a meghatározására alkalmazott lépéseket, amelyek között a klónozott egér LIF cDNS-t hibridizálással egy olyan emberi gén, vagy mRNS vagy rekombináns DNS-klónok azonosítására lehet használni, amelyek emberi LIF-kódoló szekvenciákat tartalmaznak.

A 21. ábra az alább leírt eljárás második lépését mutatja: pLIF7.2 kiónból származó, ³²P izotóppal jelzett cDNS-fragmentum hibridizálása különböző körülmények között egér és emberi eredetű genomiális DNS-hez. Mindkét esetben az 1. sáv 15 pg egér (LB3) DNS-t és a 2. és 3. sáv 15 pg emberi DNS-t (Raji, illetve Ramos sejtvonalból) tartalmaz. Az egyes szűrőknél alkalmazott hibridizációs és mosási körülményeket a 2. lépésben írjuk le. Nyíllal jelöljük az egér LIF gént tartalmazó körülbelül 10 kilobázispámyi EcoRI-fragmentumot és az emberi homológot tartalmazó körülbelül 9 kilobázispámyi EcoRI-fragméntumot. A molekulatömeg standardeket bal oldalon adjuk meg. Két különböző autoradiográfiás vizsgálatot (16 órás és 61 órás besugárzás) tüntetünk fel.

1. lépés pLIF7.2-ből származó cDNS-fragmentum elkészítése és radioaktívan jelzetté alakítása pLIF7.2b plazmid DNS-t szaporítunk E. coli

MC1061-ben való tenyésztéssel (Casabadan, M. Cohen,

S.: J. Mól. Bioi., 138,179-207 [1980]), az E. coli sejtekből ismert eljárásokkal (Maniatis, J. és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, [1982]) extraháljuk és CsCI gradiens centrifugálással tisztítjuk. Az így tisztított pLIF7.2b plazmid DNS-t EcoRI és Hindin restrikciós endonukleázokkal ismert módon hasítjuk, (1. Maniatis idézett művét), hogy a pJL3 vektorból kiszabadítsunk egy körülbelül 770 bázispámyi cDNStartalmú fragmentumot, amelyet a vektorszekvenciáktól 1,5% agarózgélen végzett elektroforézissel választunk el.

200 ng így tisztított pLIF7.2 cDNS-fragmentumot nick-transzlációval radioaktívan jelzetté alakítunk (specifikus aktivitás körülbelül 3xl0⁸ cpm/pg (Rigby, P. W. J., Dieckmann, M., Rhodes, C., Berg, P.: J. Mól. Biok, 113, 237-251, [1977]) 100 pCi /ct³²P/-dATP-t tartalmazó reakcióelegyben. A radioaktívan jelzett cDNS-fragmentumot megtisztítjuk a be nem épült radioaktív jelzőanyagtól 1 M nátrium-perklorát és 33% izopropanol jelenlétében végzett kicsapással.

2. lépés

Egér és emberi genomiális DNS-t tartalmazó Southern szűrők hibridizálása egy pLIF7.2b cDNS próbával

LB3 egér T sejtvonalból (1. sáv) és két emberi B sejtvonalból (Raji és Ramos: 2. és 3. sáv) származó nagymolekulatömegű genomiális DNS 15 pg-ját, amelyeket EcoRI restrikciós endonukleázzal hasítottunk, 0,8% agaróz gélen keresztül elektroforézisnek vetünk alá és ismert eljárások alkalmazásával nitrocellulózra viszünk át (Southern, E. M.:]. Mól. Bioi., 98,503-517, [1975]). 5 azonos Southern szűrőt készítünk, amelyek mindhárom fenti DNS-t tartalmazzák. Hibridizálás előtt a szűrőket néhány órát 55 °C-on inkubáljuk a következő oldatokban:

a) , b), c) és d) szűrők - 0,9 M nátrium-klorid 0,09 M nátrium-citrát, 0,2% Ficoll, 0,2% polivinil-pirrolidon, 0,2% borjú szérumalbumin, 50 pg/ml hővel denaturált lazac sperma DNS, 50 pg/ml E. coli tRNS, 0,1 mM ATP és 2 mM nátrium-pirofoszfát; e) szűrő - 0,3 M nátrium-klorid, 0,3 M nátrium-citrát, ugyanazokkal a további alkotórészekkel. Az 1. lépésben készített ³²P-jelzett pLIF7.2b cDNS-sel végzett hibridizálást ugyanabban az oldatban hajtjuk végre, mint az előhibridizálást, kiegészítve 0,1% nátrium-dodecil-szulfáttal és 55 °C-on hibridizálva [a),

b) és c) szűrők] vagy 65 °C-on hibridizálva [d), e) szűrők] 16 órát. Hibridizálás előtt a ³²P-jelzett cDNS-t forralással denaturáljuk és körülbelül 10⁷ cpm/ml mennyiségben alkalmazzuk a hibridizációs reakcióhoz.

Hibridizálás után a szűrőket a következő oldatokkal mossuk: a) szűrő - 0,9 M nátrium-klorid, 0,09 M nátrium-citrát, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát, 55 °C; b) szűrő - Ugyanez az oldat, 60 °C; c) és d) szűrő - azonos oldat,

HU 207 342 Β °C; e) szűrő - 0,3 M nátrium-klorid, 0,03 M nátriumcitrát, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát, 65 °C. Teljes kimosás után a szűrőket -70 °C-on autoradiografáljuk Kodak XAR-5 film és két intenzitásnövelő ernyő alkalmazásával. A 21. ábra mutatja a kísérlet eredményeit, amelyen a leírt két hibridizáló/mosó rendszer [d) és e) szűrők] lehetővé tette mind az egér LIF gén (amely egy körülbelül 10 kilobázispámyi EcoRI-fragmentumon van jelen), mind pedig az emberi LIF gén (amely egy körülbelül 9 kilobázispámyi EcoRI-fragmentumon van jelen) kimutatását a maradvány háttéri nem-specifikus hibridizáción túlmenően. Mindegyik további vizsgált körülmény elfogadhatatlanul magas háttér-hibridizációnak enged teret [a), b), c) szűrők].

10. példa

Ez a példa az egér LIF-fel homológ klónozott emberi gén előállítására alkalmazott lépéseket ismerteti.

22. ábra - az emberi LIF gén klónozásának első lépésére vonatkozik: A LIF gén kimutatása Southern szűrős hibridizálással, egér LIF cDNS próbát alkalmazva. RAMOS emberi sejtvonalból származó genomiális DNS-t a megadott restrikciós endonukleázokkal emésztünk és a 19. példa 1. lépésében leírt körülmények között hibridizáljuk, pLIF7.2b-ből származó egér cDNS-fragmentumraal.

23. ábra - az emberi LIF gén klónozásának első lépésére vonatkozik: A LIF gén kimutatása Southern szűrős hidridizálással, egér LIF cDNS próba alkalmazásával, különböző hibridizációs körülmények között. RAMOS emberi sejtvonalból származó genomiális DNS-t (H) vagy egérmáj DNS-t (M), amelyeket BamHI restrikciós endonukleázzal emésztettünk, egy egér LIF cDNS próbával (pLIF7.2b) hibridizálunk különböző hibridizációs és mosási körülmények között. A hibridizáláshoz alkalmazott hőmérsékleteket és SSC koncentrációkat a felső vonalon tüntetjük fel és a mosási körülményeket a második vonalon (lásd 10. példa 1. lépés).

24. ábra - az emberi LIF klónozásának második lépésére vonatkozik: három LIF gén klón jelölt restrikciós endonukleázos hasítása. AXHGLIFl, XHGLIF2 és XHGLIF3 kiónok λ fágjából 1 gg DNS-t Sall-gyel, BamHI-gyel vagy Pstl-gyel emésztünk, 0,8% agaróz gélen elektroforézisnek vetjük alá (bal mező), nitrocellulózra visszük át és hibridizáljuk (a fent leírt módon) pLIF7.2 cDNS-sel. Megadjuk a hibridizációs fragmentumok közelítő méretét.

25. ábra - az emberi LIF gén klónozásának harmadik lépésére vonatkozik: Az emberi LIF gént (H) átfogó XHGLIFl egy 1,3 kilobázispámyi szegmense mRNS-szinonim fonalának nukleotidszekvenciáját mutatja 5’-3’ orientációban. ApLIF7.2b, pLIFNKl és pLIFNK3 cDNS kiónjaiból származó egér LIF mRNS (M) megfelelő szekvenciáját az emberi gén alatt tüntetjük fel kisbetűkkel. Az egér és az emberi szekvencia közötti azonosságokat csillagokkal jelöljük. A kész emberi LIF feltételezett N-terminális gyökét az egér LIFfel analóg módon +1-gyei jelöljük.

26. ábra - az emberi LIF gén klónozásának harmadik lépésére vonatkozik: Az emberi LIF aminosavszekvenciája és összehasonlítás az egér LIF-fel. A kész egér LIF (M) aminosavszekvenciája, amint az közvetlen aminosavszekvenálással és a pLIF7.2b, pLIFNKl és pLIFNK3 cDNS kiónok elemzésével meghatározható, a felső vonalon, míg a KHGLIFl szekvenciájából következtetett megfelelő emberi LIF szekvencia (H) alul van feltüntetve. Az azonosságokat szaggatott vonallal jelöljük. A különbségekre az aminosavak jelölése mutat rá.

27. ábra - az emberi LIF gén klónozásának negyedik lépésére vonatkozik: az emberi LIF gén restrikciós endonukleáz hasítási térképe. A pLIF7.2b-vel homológ emberi gén exonjait bekeretezéssel jelöljük (25. ábra). A gén átíródásának irányát a vonal alatti nyíl mutatja.

1. lépés

Emberi LIF gén kimutatása egy egér próbával

Fent ismertettünk egy módszert a pLIF7.2b egér cDNS egy radioaktívan jelzett fragmentumának hibridizációs próbaként való alkalmazására az emberi LIF gén kimutatására. A 22. ábra szemlélteti, hogy ez a módszer lehetővé teszi az emberi LIF gén kimutatását különböző restrikciós endonukleázokkal emésztett emberi genomiális DNS-ben. Az ilyen elemzések, és más, fel nem tüntetett géleken végzett vizsgálatok felfedik a különböző endonukleázokkal való kezeléssel létrehozott DNS-fragmentumok méretét, amelyeken az emberi LIF gén elhelyezkedik. Ezek az adatok fontosak e példa további lépései szempontjából, nem csak azért, hogy meghatározzuk azokat a körülményeket, amelyek között az egér próbát hibridizációs próbaként alkalmazhatjuk az emberi LIF kimutatásánál, de azért is, hogy diagnosztikai restrikciós térképezési adatokat biztosítsunk az emberi genomiális LIF kiónok azonosításának elősegítésére.

Az egér és az emberi LIF szekvenciák között nagyfokú homológia válik nyilvánvalóvá, amikor a BamHIgyel emésztett egér és emberi genomiális DNS-t egér LIF cDNS próbával hibridizáljuk különböző hibridizációs és mosási körülmények között (23. ábra). Ahogy a hibridizálás és mosás intenzitása nő, úgy csökken a „háttérzaj”, és felfed egyetlen, az egér próbához hibridizálódó körülbelül 3 kilobázispámyi fragmentumot. Jelentős, hogy az emberi gén még 65 °C-on 0,2%xSSC-ben is lényeges mértékben hibridizálódik.

2. lépés

Egy emberi genomtár screenelése és egy, a LIF gént tartalmazó klón elkülönítése

Egy emberi genomiális DNS-tárat, amelyet részlegesen emésztettünk (N. M. Gough et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 85, p. 2623-2627, [1988]) Sau3A-val és az EMBL3A lambda fág klónozó vektorba ligáltunk, LIF gént tartalmazó kiónokra screenelünk próbaként egér cDNS-sel hibridizálva. A LIF cDNS fragmentumát radioaktívan jelzetté alakítjuk és a hibridizálási feltételek a korábban megadottak (4. példa). Röviden, a genomtárat képviselő fág tarfoltokat körülbelül 50000 tarfolt/10 cm-es Petri-csésze sűrűségben tenyésztjük és nitrocellulózra visszük át az irodalomban ismertetett módon (Maniatis, T. és munkatársai: Molecular Clo17

HU ning, Cold Spring Harbor, [1982]). Hibridizálás előtt a szűröket néhány órát inkubáljuk 65 °C-on 6xSSC-ben (SSC=0,15 M nátrium-klorid, 0,015 M nátrium-citrát), 0,2 Ficoll, 0,2% polivinil-pirrolidon, 0,2% borjúszérumalbumin, 2 mM nátrium-pirofoszfát, 1 mM ATP, 50 pg/ml denaturált lazac sperma DNS és 50 pg/ml E. coli tRNS jelenlétében. A hibridizálást ugyanebben az oldatban végezzük 0,1% SDS-sel kiegészítve, 65 °Con 16-18 órát. A LIF cDNS-fragmentumot, amelyet radioaktívan jelzetté teszünk nick-transzlációval (specifikus aktivitás körülbelül 2xl0⁸ cpm/pg) /a³²P/dATP alkalmazásával, körülbelül 2X10⁶ cpm/ml koncentrációban alkalmazzuk a hibridizációban. A hibridizálás után a szűrőket alaposan kimossuk 6xSSC-vel, 0,1% nátrium-dodecil-szulfáttal 65 °C-on, majd autoradiografáljuk. Kiemeljük azokat a tarfoltokat, amelyek a szűrőmásolatokon pozitívak, és kisebb sűrűségen a fenti módon újra screeneljük őket.

Ezzel a módszerrel három kiónt azonosítunk és tisztítunk: XHGLIFl, 2 és 3. Annak érdekében, hogy meghatározzuk az ezek a kiónok közötti kapcsolatot és megállapítsuk, hogy melyik tartalmazza az emberi LIF gént - ha egyáltalán van ilyen - mindegyik klónból DNS-t készítünk és ismert módon (1. Moniatis idézett könyvét) a következő restrikciós endonukleázokkal emésztjük: Sáli, amely felszabadítja a klónozott genomiális DNS teljes szekvenciáját, és BamHI és PstI, amelyek a LIF génben és körülötte hasítanak, és körülbelül 3 kilobázispámyi, 1,8 kilobázispámyi, illetve 0,6 kilobázispámyi jellegzetes fragmentumokat (mint azt fent meghatároztuk) hoznak létre. A rekombináns fág DNS-ek emésztése és agaróz géleken végzett elektroforézissel végzett szétválasztás (24. ábra, bal mező), után a DNS-t átvisszük nitrocellulózra és az egér LIF cDNS próbával hibridizáljuk (a fent ismertetett körülmények között), hogy megtaláljuk a LIF gént tartalmazó fragmentumokat (24, ábra, jobb mező). Ez az elemzés azt mutatja, hogy

a) mindhárom klón azonosnak látszik;

b) mindegyik tartalmazza a genomiális DNS-nek egy körülbelül 9 kilobázispámyi fragmentumát, amely egy, az egér LIF próbával homológ szakaszt tartalmaz;

c) az egér cDNS-sel homológ szakasz egy 3 kilobázispámyi BamHI-fragmentumon és két 1,8 és 0,6 kilobázispámyi Pstl-fragmentumokon helyezkedik el, amelyek jellegzetesek az emberi LIF génre (lásd fent). így arra következtetünk, hogy mindhárom klón tartalmaz egy kromoszomális DNS-szegmenst, amely magába foglalja az emberi LIF gént.

3. lépés

Az emberi LIF gén nukleotidszekvenciájának meghatározása

A HGLIF1 körülbelül 3 kilobázispámyi BamHIfragmentumát, amelyről fent kimutattuk, hogy hibridizál az egér LIF cDNS próbához, újra klónozzuk a pEMBL8⁺ plazmidvektorba, így létrehozzuk a pHGLIFBaml kiónt, és nukleotidszekvencia elemzésnek vetjük alá. A nukleotid szekvenálást didezoxi

342 B 2 láncterminációs módszerrel (Sanger, F. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, [1977]) végezzük, templátként lúggal denaturált kétfonalas plazmid DNS-t alkalmazva, primerekként különböző, a génen belüli szekvenciákkal komplementer oligonukleotidokat használva, és polimerázként felhasználva a szekvenálási reakcióban mind az E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentumát, mind pedig a madár mieloblasztózis vírus reverz transzkriptázát.

Meghatározzuk a LIF gént átfogó BamHI fragmentum (2840 bázispár) teljes nukleotidszekvenciáját, amelyből a 25. ábrán 1297 bázispárt mutatunk be.

Ennek a szekvenciának az összehasonlítása az egér LIF mRNS szekvenciával felfedi, hogy a kész emberi LIF proteint kódoló szekvenciák két exonon vannak jelen, amelyeket egy 693 bázispámyi intron választ el (25. ábra). A kész proteint kódoló szakasz vonatkozásában nagyfokú homológia van a két faj között mind a nukleotid-, mind az aminosavszekvencia szintjén. A kész proteint kódoló szakasz (58-186. helyzetek) vonatkozásában az 1. exonon belül 88%os nukleinsavszekvencia homológia (114 a 129 öszszehasonlított gyökből) és 91%-os aminosavszekvencia homológia (39/43) van. A 2. exon kevésbé homológ 77%-osan a nukleotidszinten (318/411), és 74%-osan az aminosavszinten (101/136) a kódoló szakaszon belül. A kész proteint mint egészet tekintve az itt meghatározott egér és emberi LIF szekvenciák 179 helyzet közül 140-ben (78%) azonosak, beékelés és deléció nélkül (26. ábra). Mi több, számos különbség igen ismert helyettesítés (Lys:Arg, Glu:Asp és Leu: Val: Alá).

A kész LIF N-terminális prolingyöke kodonjának 5’-je a 25. ábra 58. helyzete, az emberi gén homológ az egér LIF mRNS szekvenciával egy a hidrofób vezérszekvencia nagy részét kódoló szakaszon keresztül. A teljes vezérszekvencia azonban nem kódolódik ezen az exonon, mivel az mRNS és génszekvencia eltér egy tipikus RNS illesztési helynél (TCCCCAG) (Mount, S. M.: Nucleic Acids Rés., 10, 459-472, [1982]). Az 5’ le nem fordított szakaszt és a vezérszekvencia első gyökeit meghatározó exon nincs jelen 1097 bázispáron belül ettől az illesztési helytől az 5’-vég felé. Az egér LIF génben a hidrofób vezérszekvencia első 6 aminosavgyökét meghatározó exon körülbelül 1,5 kilobázispámyira helyezkedik el 5’-irányúan az analóg illesztési helytől.

4. lépés

Az emberi LIF gén restrikciós endonukleáz hasítási térképének elkészítése

Annak érdekében, hogy meghatározzuk a restrikciós endonukleáz hasítóhelyek elhelyezkedését az emberi LIF génben és körülötte, és így elkészítsük ennek a génnek egy molekuláris „ujjlenyomatát”, RAMOS sejtvonalból származó emberi genomiális DNS-t különböző endonukleázokkal emésztünk, azokat egyenként és párjellegű kombinációkban alkalmazva, és Southern szűrős elemzésnek vetjük alá a 8. példában leírt

HU 207 342 Β módon, azzal az eltéréssel, hogy próbaként a 3. lépésben leírt, pHGLIFBaml-ból származó 3 kilobázispárnyi BamHI-ffagmentumot alkalmazzuk, amelyet nicktranszlációval radioaktívan jelzetté alakítunk. Az így kapott - nem szemléltetett - adatok elemzése, éppúgy, mint a 22. ábrán bemutatottak és a XHGLIFl és pHGLIFBaml elemzésével kapottak a 27. ábrán bemutatott restrikciós endonukleáz hasítási térképet eredményezik.

77. példa

A következő példa a klónozott emberi génen annak érdekében végzett módosításokat ismerteti, hogy lehetővé tegyük a kifejezést élesztősejtekben; leírjuk továbbá az így kapott rekombináns emberi LIF biológiai és biokémiai tulajdonságainak meghatározását.

28. ábra - az első lépésre vonatkozik; az emberi génnek az YEpsecl-be való beviteléhez végzett módosítására alkalmazott oligonukleotidok (1. a 6. példa 1. lépése szerinti hivatkozást). Az (a) oligonukleotid megfelel a kódoló szakasz 5’-végének (31-69. gyökök a

25. ábrán). A (b) oligonukleotid megfelel a kódoló szakasz közepének (163-186. és 880-903. gyökök a 25. ábrán). Ennek az oligonukleotidnak az 1 exonnal komplementer részét szaggatott vonallal és a 2 exonnal komplementer részét pontozott vonallal húzzuk alá. A (c) oligonukleotid megfelel a kódoló szakasz 3'-végének (az 1279. helyzettel a 25. ábrán). Az (a) és (b) oligonukleotidok viszik be a megjelölt cestrikciós endonukleáz hasítóhelyeket.

29. ábra - az első lépésre vonatkozik: a klónozott emberi LIF gén mutagenezisével képződött szintetikus emberi LIF cDNS nukleotidszekvenciája és az általa kódolt aminosavszekvencia. Megjelöljük az (a) és (c) nukleotidok (28. ábra) által bevitt BamHI és Hindin hasítóhelyeket. A kész LIF feltételezett N-terminális aminosavat (az egérrel való analógia alapján) + 1-gyel jelöljük.

30. ábra - a harmadik lépésre vonatkozik: differenciálódás kiváltása Ml leukémiás sejtek telepeiben tisztított természetes egér LIF (Ο—-O) és az YEpsecl/HLIF rekombinánsttartalmazó galaktózzal indukált élesztősejtek kondicionált közegéből (·-—·) származó hígításokkal. Az YEpsecl/HLIF rekombinánst tartalmazó nem indukált élesztőtenyészetekből származó közeg (Ο—-O) hatástalan. 7 napos tenyészetekből átlagértékeket adunk meg.

37. ábra - a negyedik lépésre vonatkozik: élesztőből származó HLIF versengése természetes egér ¹²⁵ILIF-fel az egér Ml sejtek specifikus receptoraihoz való kötődésért. Hiteles természetes egér LIF-A (1. példa) (O_O), rekombináns egér LIF (·_·) és az

YEpsecl/HLIF szerkezetet tartalmazó élesztősejtekből származó kondicionált közeg nem indukált (_) és galaktózzal indukált (□_□) hígításait vizsgáljuk, hogy mennyire versengenek a sejtreceptorokhoz kötődésért a természetes ¹²⁵I-LIF-A-val egér Ml sejteken 37 °C-on, amint azt korábban leírtuk.

7. lépés

Az emberi LIF gén módosítása élesztőkben való kifejezésre

a) Egy emberi LIF gént tartalmazó rekombináns DNS klón elkülönítését és nukleotidszekvenciáját fent ismertettük (10. példa). A 25. ábrán mutatjuk be a kész emberi LIF proteint kódoló 2 exont átfogó 1297 bázispámyi DNS nukleotidszekvenciáját.

Fent leírtuk az egér rekombináns LIF előállítását élesztősejtekben az YEpsecl élesztő kifejező vektor alkalmazásával (5. példa). Ez a vektor biztosít egy N-terminális vezérszekvenciát, amely a Kluyveromyces lactis killer toxin génjéből származik, egy galaktózzal indukálható hibrid GAL-CYC promoterről átírva.

Annak érdekében, hogy kifejezzük az emberi LIF gén által kódolt proteint ebben a vektorban, néhány módosítást kell végrehajtani a génen. A kész proteint kódoló szakasz 5’-végén egy BamHI restrikciós endonukleáz hasítóhelyet építünk be ismert módon, hogy lehetővé tegyük a beékelést a keretbe a K. lactis vezérszekvenciával és megtartsunk egy megfelelő jelzőpeptidáz hasítóhelyet (Gly-Ser). Itt ugyanazt a módosítást hajtjuk végre, amit korábban az egér cDNS (pLIF7.2b) esetében. Középen ismert módon eltávolítjuk a 693 bázispámyi beékelődő szekvenciát, a két exont ugyanabba a transzlációs leolvasási keretbe összekapcsolva. A 3’-végen egy második transzlációs stop kodont építünk be közvetlenül 3'-helyzetben a természetes stop kodonhoz, utána pedig egy Hindin hasítóhelyet az YEpsecl-be való beékeléshez. Valamennyi módosítást oligonukleotiddal kiváltott mutagenezissel érjük el: a LIF gént átfogó körülbelül 3 kilobázispámyi BamHIfragmentumot a pEMBL8⁺ plazmidba szubklónozzuk (Dente, L. és munkatársai: Nucleic acid Rés., 77, 1645-1655, [1983]) és egyfonalas DNS-t állítunk elő FI szuperfertőzéssel. Az in vitro mutagenezist az irodalomban leírt módon hajtjuk végre (Nisbet, I. T., Beilharz, M. W.: Gene Anal. Techn., 2,23-29, [1985]), 39, 48, illetve 39 bázisból álló oligonukleotidokat (Joint Protein Sequencing Laboratory, Parkville, Victoria) alkalmazva a gén 5’-vége, a középső része és 3’-vége módosítására a fent ismertetett módon (lásd 28. ábra). A módosított emberi LIF kódoló szakasz nukleotidszekvenciáját a 29. ábrán adjuk meg.

2. lépés

Az YEpsecl/HLIF rekombináns bevitele az élesztősejtekbe

S. cerevisiae GY1⁺ törzset (lue2 ura3 ade2 trpl cir+; G. Cesareni-tól, EMBL Heidelberg) transzformálunk a polietilénglikolos módszerrel (Klebe, R. J. és munkatársai: Gene, 25, 333-341, [1983]). Kiválogatjuk a transzformánsokat és mesterséges minimálközegen (2% szénforrás, 0,67%, élesztő nitrogén bázis [Difco] kiegészítve a kívánt aminosavak 50 pg/ml-ével) tartjuk uracil távollétében. Rekombináns HLIF-et állítunk elő az alábbi két módszer bármelyikével: (1) Ura⁺ transzformánsokat a stacionárius szakaszig tenyésztünk nemszelektív, 2% galaktózt tartalmazó közegen, és megmérjük a közeg LIF hatását, vagy (2) Ura⁺ transzfor19

HU 207 342 Β mánsokat a stacionárius szakaszig tenyésztünk 2% glükózt tartalmazó szelektív minimálközegen. A sejteket ezután mossuk és újra szuszpendáljuk azonos térfogatú, 2% etanolt tartalmazó szelektív minimálközegen, és 8 órát tenyésztjük, hogy túljussunk a glükózrepresszión, Ezután indukáljuk a HLIF beékelt rész átírását a sejteket 2% galaktózt tartalmazó szintetikus minimálközegbe hígítva (1:10). Az indukálás után különböző időpontokban alikvot részeket veszünk ki a tenyészet felülúszójából, Millipore szűrőkön (0,2pm) szűrjük és közvetlenül megvizsgáljuk LIF hatásukat.

3. lépés

Élesztőből származó HLIF biológiai tulajdonságainak meghatározása

Figyelembe véve a nagyfokú szekvenciahasonlóságot az egér és emberi LIF között, megbecsüljük az élesztőből szánnazó emberi LIF hatását egér Ml sejtekre. Az élesztővel kondicionált közeg differenciálódást kiváltó és leukémiát visszaszorító hatásának mérését 1 ml-nyi 300 egér Ml sejtet (Dr. M. Hozumitól, Saitama Cancer Research Centre, Japán) tartalmazó tenyészetekben végezzük Dulbecco-féle módosított Eagle-közegen 20% végső borjú magzati szérum koncentrációval és 0,3% agarral. A mérendő anyagot sorozatosan hígított, 0,1 ml térfogatú mennyiségekben adjuk a tenyésztő edénybe, az agarközeges sejtszuszpenzió adagolása előtt. A tenyészeteket 7 napig inkubáljuk teljes nedvességtartalmú légkörben, amely levegőjében 10% szén-dioxidot tartalmaz. A tenyészeteket mikroszkóppal értékeljük 35-szörös nagyítással, differenciálódottnak tekintjük a diszpergált sejtekből álló koronát tartalmazó vagy teljes egészében diszpergált sejtekből álló telepeket. A telepek morfológiai vizsgálatát a teljes tenyészetet 1 ml 2,5%-os glutáraldehiddel rögzítve, majd a megszárított tenyészeteket mikroszkóp-tárgylemezen acetil-kolin-észteráz/Luxol Fást Blue/Haematoxylinnel megfestve értékeljük.

A galaktózzal indukált élesztőtenyészetekből - amelyek tartalmazzák az emberi kódoló szakaszt az YEpseclben - származó közeg kiváltja a jellegzetes makrofág differenciálódást az Ml telepek tenyészeteiben, míg ugyanezeknek az élesztősejteknek nem-indukált tenyészeteiből, a nem transzformált élesztők tenyészeteiből vagy a csak az YEpsecl vektort tartalmazó élesztő tenyészetéből származó közeg erre nem képes. Úgy mint az egér LIF-nél, az élesztőből szánnazó emberi anyag koncentrációjának növekedésével progresszíven csökken a kifejlődő Ml telepek száma és mérete. A tisztított természetes egér LIF-fel való összehasonlítás azt mutatja, hogy az élesztővel kondicionált közeg 50000 egység/mlig terjedő mennyiségű emberi LIF-et tartalmaz.

4. lépés

Élesztőből származó emberi LIF receptorkötődési specifitása

Tisztított egér LIF-A-t (1. példa) a fent leírt módon jódozunk. Ml sejteket mosunk és újra szuszpendálunk 2,5xl0^{4 * 6}/50 pl Hepes-pufferolt RPMI közegben, amely 10% magzati borjűszérumot tartalmaz. 50 μϊ-es alikvot részekben a sejteket 200000 cpm ¹²⁵I-LIF-A-val inkubáljuk (10 μΐ ugyanabban a közegben), és 10 μΐ kontroliközeget vagy sorozatos kétszeres hígítású nem-jelzett tiszta egér LIF-A-t vagy az YEpsecl/HLIF szerkezetet tartalmazó élesztő transzformánsok galaktózzal indukált vagy nem-indukált tenyészetéből származó kondicionált közeget alkalmazunk.

Az YEpsecl/HLIF rekombinánst tartalmazó galaktózzal indukált élesztősejtekkel kondicionált közeg ugyanolyan mértékig képes versengeni az egér Ml sejtekben levő specifikus sejtreceptorokhoz kötődésért a természetes egér ¹²⁵I-LIF-A-val mint a természetes és rekombináns egér LIF-A, 37 °C-on (31. ábra) és 0 °Con (nem tüntetjük fel); a nem indukált élesztősejtekből és a csak az YEpsecl vektort tartalmazó élesztősejtekből származó közeg azonban nem így hat. Ebből úgy látszik, hogy a receptorkötödési terület erősen megőrződik az egér és emberi LIF-ekben, összhangban a primer aminosavszekvencia hasonlóság magas fokával.

5. lépés

Élesztőből származó emberi LIF tisztítása, szekvenálása és jódozása

YEpsecl/HLIF rekombinánst tartalmazó, galaktózzal indukált élesztősejtekkel kondicionált közegben levő emberi LIF-et tisztítunk az 1. példa 2. és 4. lépései szerint, azzal az eltéréssel, hogy a DEAE-Sepharose CL-6B oszlophoz kötődő és a só gradienssel eluálódó LIF aktivitást a 2. lépésben gyűjtjük össze. Az élesztőből származó tisztított emberi LIF-et jóddal radioaktívan jelzetté tesszük 1 pg emberi LIF-et inkubálva 50 pl 0,2 M nátrium-foszfát pufferben, (pH=7,2), I mCi Nal¹²⁵I-dal (2,7 pl) és 5 pl 0,2 mM ICl-dal 2 M nátrium-kloridban 60 másodpercig. A ¹²⁵I-LIF-et a be nem épült ^12sI-tól úgy választjuk el, hogy a reakcióelegyet átengedjük egy Sephadex G-25M oszlopon (Pharmacia), amelyet foszfáttal pufferolt (20 mM, pH = 7,4) és 0,02%, Tween 20-at és 0,02% nátrium-azidot tartalmazó sóoldatban (0,15 M) ekvilibráltunk. Az emberi ¹²⁵ILIF 8-25% gradienséi nátrium-dodecil-szulfát poliakril-amid gélen elektroforézisnek alávetve egyetlen széles sávként jelenik meg, amelynek látszólagos molekulatömege 170 000. Az emberi ¹²⁵I-LIF specifikusan kötődik az egér Ml sejtekhez és csontvelősejtekhez, megerősítve az emberi LIF-nek azt a képességét, hogy kötődni tud az egér LIF receptorokhoz. Az élesztőből származó emberi LIF-et (körülbelül 10 pg) amino-terminális aminosav szekvenálásnak vetjük alá a 2. példában leírt módon és egyetlen szekvenciát kapunk, amely a következő:

Ile-Thr-Pro-Val-X-Ala...............

Ez azonos az emberi LIF előre megjósolt aminosavszekvenciájával (26. ábra) azzal az eltéréssel, hogy a szekvencia a negyedik aminosavnál kezdődik az egér szekvencia (2. példa) - mely alább látható kezdetéhez képest.

Pro-Leu-Pro-Ile-Thr-Pro-Val-Asn-Ala...............

Ez azt jelzi, hogy az élesztőből származó tisztított emberi LIF-ből hiányzik az egér szekvencia megfelelő első három aminosava, de így is hatásos és kötődni tud

HU 207 342 Β az egér LIF receptorhoz. így az első három aminosav nélkülözhetőnek látszik a LIF biológiai hatása szempontjából.

12. példa

A következő példa egy vélelmezett természetes emberi LIF molekula azonosítására és részleges tisztítására alkalmazott lépéseket ismerteti.

32. ábra - a vélelmezett emberi LIF azonosításának második lépésére vonatkozik: emberi hólyagkarcinóma 5637 sejtvonal (ATCC szám HTB9) által kondicionált közeg (—□—) nyers vagy (—i—) DEAE nem-kötődő frakciója vagy természetes egér LIF-A (-O-) különböző hígításainak versengési képessége az egér ¹²⁵I-LIFA-val az egér hasüregi sejtekben levő sejtreceptorokhoz kötődésért. Azt is feltüntetjük, hogy az emberi G-CSF (__) nem tud versengeni a kötődésért [hígítatlan (5 pg/ml)].

33. ábra - a vélelmezett emberi LIF azonosításának harmadik lépésére vonatkozik: az emberi hólyagkarcinóma 5637 sejtvonal által kondicionált közeg frakcionálása DEAE-Sepharose CL-6B oszlopon, pontosan úgy eluálva, ahogy azt fent az egéfLlF-A frakcionálásánál leírtuk (1. példa), és az ebből a frakcionálásból nyert egyes frakciók képessége egér Ml sejtek telepei differenciálódásának kiváltására. Az A mező mutatja a só gradienst, a B mező mutatja az 5637-tel kondicionált közeg frakcionálását; a C mező mutatja a Krebs Π sejtekkel kondicionált közeg frakcionálását összehasonlításul.

34. ábra - a vélelmezett emberi LIF azonosításának harmadik lépésére vonatkozik: emberi hóiyagkarcinóma 5637 sejtvonallal kondicionált közeg frakcionálása lentil-lectin Sepharose 4B oszlopon, úgy eluálva, amint azt fent az egér LIF-A frakcionálásánál leírtuk (1. példa), és az ebből a frakcionálásból nyert egyes frakciók képessége egér Ml sejtek differenciált telepei képződésének kiváltására. Az A mező mutatja az ametil-D-mannopiranozid gradienst, a B mező mutatja az 5637 sejtvonallal kondicionált közeg frakcionálását és a C mező mutatja a Krebs II-vel kondicionált közeg frakcionálását összehasonlításul.

1. lépés

Különböző emberi sejtvonalakkal kondicionált közegek Ml egér mieloid leukémiás sejtek differenciálódását kiváltó és szaporodását gátló hatását vizsgáljuk félszilárd agaros tenyészetben (amint azt az 5. példa 4. lépésében leírtuk). Több sejtvonal bizonyult hatásosnak, ezek közül a hólyagkarcinóma 5637 sejtvonal mutatta a legmagasabb szintet. Az 5637-es sejtvonalról azonban már korábban kimutatták, hogy emberi GCSF-et termel (Nicola, N. A. és munkatársai: Natúré, 314, 625-628, [1985]; Welte, K. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 1526-1530, [1985]), amely hatásos az Ml sejtek differenciálódásának kiváltásában is (Tomida, M. és munkatársai: FEBS Lett., 207, 271275, [1986]; Neckers, L. M., Pluznik, D. H.: Exp. Hematol., 75, 700-703, [1987]). Annak megerősítésére, hogy az 5637 sejtek hiteles emberi LIF-et termelnek (a G-CSF-en kívül) 5637 sejtekkel kondicionált közeget az alábbi 2. és 3. lépésekben leírt módon kezelünk.

2. lépés

5637 sejtekkel kondicionált közeget 20-szorosára töményítünk be és megvizsgáljuk, hogy képes-e versengeni az egér hasüregi sejtek specifikus sejtreceptoraihoz kötődésért a természetes egér ¹²⁵I-LIF-A-val. Ez a kötődési versengéses vizsgálat az 5. példa 5. lépése szerinti. Az 5637 sejtekkel kondicionált közeg képes versengeni a sejtreceptorokhoz kötődésért az egér ¹²⁵I-LIF-A-val és ez a hatás az 5637 CM (LIF-A) DEAE-hez nem kötődő frakciójában összpontosul (32. ábra). Mivel az emberi és az egér G-CSF még igen nagy koncentrációban sem verseng a ^I2SI-LIF-A kötődési helyekért, ez igazolja az 5637 sejtekkel kondicionált közegben egy homológ emberi LIF hatás jelenlétét, amely specifikusan fel tudja ismerni az egér LIF receptort. Ez az egér és emberi LIF-ek erős megőrződését mutatja receptorkötődési területükön, összhangban az elsődleges aminosavszekvencia homológja magas fokával.

3. lépés

Emberi hólyagkarcinóma 5637 sejtekkel kondicionált közeget (2 liter 10 térfogat%-os magzati borjúszérumban) 40 ml-re sürítünk be és szekvenciálisán kromatografáljuk DEAE-Sepharose CL-6B-n és lentillectin-Sepharose 4B-n a Krebs Π aszcitesz sejtekkel kondicionált közegből származó egér LIF-re leírt módon. Az 5637 sejtek (vélelmezett emberi LIF), amelyet az egér LIF-hez igen hasonló módon kromatografálunk DEAE-Sepharose-on Ml differenciálódását kiváltó hatása: a hatásos anyag egy része nem kötődik az oszlophoz (LIF-A), míg a maradék megkötődik és a só gradienssel eluálódik (LIF-B), (33. ábra). Hasonlóképpen a vélelmezett emberi LIF az egér LIF-hez hasonlóan viselkedik lentil-lectin Sepharose-on végzett kromatográfiával, melyben a hatásos anyag egy része az oszlophoz kötődik és mannóztartalmú szénhidrátok jelenlétét mutatja a glikoproteinen (34. ábra). így az 5637 sejtekkel kondieionált közeg emberi hatása mutatja az egér LIF természetes emberi analógjának jellemzőit a következők miatt: keresztreaktivitás az egér Ml sejtdifferenciálódás kiváltásában, az egér LIF sejtreceptor specifikus felismerésének képessége, biokémiai frakcionálási jellemzők/jellegzetességek.

Az 5637 sejtekkel kondicionált közegből származó természetes emberi LIF-et az 1. példa 2. és 4. lépései szerint tisztítjuk, a 2. lépésben összegyűjtve a nem kötődő LIF hatású anyagot és a 4. lépésben a kötődő LIF hatású anyagot. Ezt az összegyűjtött LIF hatású anyagot reverz fázisú HPLC-vei frakcionáljuk, mintáz

1. példa 5. lépésében, azzal az eltéréssel, hogy kétszer használunk egy Brownlee RP300 C8 oszlopot, először egy 0-60% CH₃CN gradienssel 0,1% TFA-ban, majd 45-55% CH₃CN gradienssel 0,1% TFA-ban. A második gradiensnél az emberi LIF 50% CH₃CN-nél eluálódik, és amikor elektroforézisnek vetjük alá 8—25%os gradiens nátrium-dodecil-szulfát poliakril-amid géleken, egy fő ezüstre festődő sávot mutat, amelynek

HU 207 342 Β látszólagos molekulatömege 73 000. A természetes tisztított emberi LIF-et jódizotóppal radioaktívat! jelzetté tesszük a 10. példa 5. lépésében leírt módon és specifikusan egér Ml sejtekhez és egér csontvelősejtekhez kötjük, amint azt az élesztőből származó emberi ^I25I-LIF-re leírtuk (11. példa 5. lépése).

Claims (27)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás glikozilezett vagy nem-glikozilezett LIF tisztítására, azzal jellemezve, hogy

   a) a nyers LIF-et anioncserélő oszlopon kromatografáljuk és az LIF aktivitást mutató frakciót növekvő só-gradienssel eluáljuk, és

   b) az a) lépés termékét lektin mannóz affinitású affinkromatográfiás oszlopon kromatografáljuk és a LIF aktivitást mutató frakciót egy mannózszármazékkal eluáljuk, és

   c) a b) lépés termékét egy kationcserélő oszlopon kromatografáljuk és a LIF aktivitást mutató frakciót növekvő só-gradienssel eluáljuk, és

   d) a c) lépés termékét HPLC körülmények között kromatografáljuk reverz fázisú oszlopon és a LIF aktivitást mutató frakciót növekvő acetonitril-gradienssel eluáljuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nyers LIF-ként egér LIF-et alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nyers LIF-ként emberi LIF-et alkalmazunk.
4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nyers LIF-ként egy egér Krebs H aszcitesz daganatsejttel kondicionált közeget alkalmazunk.
5. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nyers LIF-ként emberi hólyagkarcinóma 5637 sejtvonallal kondicionált közeget alkalmazunk.
6. 6. Eljárás humán vagy egér LIF előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidet és kívánt esetben egy jelzőszekvenciát és/vagy fúziós partner polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciával rendelkező rekombináns kifejező vektort beviszünk egy megfelelő prokarióta, élesztő vagy emlős gazdasejtbe, a gazdasejtet tenyésztjük, és a polipeptidet kinyerjük.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 15. vagy a 26. vagy a 29. ábra szerinti aminosavszekvenciával rendelkező polipeptidet kódoló rekombináns kifejező vektort visszük be a gazdasejtbe.
8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS kifejező vektorként a pLIF.2b, PLIFNK2, PLIFNK3 vagy pHFLIFBaml kiónt visszük be a gazdasejtbe.
9. 9. A 6. igénypont szerinti eljárás a 15., 26. vagy 29. ábrán látható polipeptid aminosavszekvenciával legalább 95 %-ban homológ LIF előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő nukleotidszekvenciával rendelkező rekombináns kifejező vektort visszük be a gazdasejtbe.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás a 29. ábra szerinti aminosavszekvenciával teljesen homológ polipeptid előállítására, azzaljellemezve, hogy a megfelelő nukleotidszekvenciával rendelkező rekombináns kifejező vektort visszük be a gazdasejtbe.
11. 11. A 6. igénypont szerinti eljárás glikozilezett LIF előállítására, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként élesztő vagy emlős gazdasejtet alkalmazunk,
12. 12. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtként élesztősejtet alkalmazunk.
13. 13. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy galaktózzal indukálható hibrid GAL-CYC promotert tartalmazó rekombináns kifejező vektort viszünk be a gazdasejtbe.
14. 14. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid kiválasztását irányító jelzőszekvenciát is tartalmazó rekombináns kifejező vektort viszünk be a gazdasejtbe.
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljázás azzal jellemezve, hogy jelzőszekvenciaként a Kluyveromyces lactis killer toxin génjének jelzőszekvenciájából származó jelzőszekvenciát tartalmazó vektort viszünk be a gazdasejtbe.
16. 16. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Saccharomyces cerevisiae fajhoz tartozó gazdasejtet alkalmazunk.
17. 17. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként emlőssejtet alkalmazunk.
18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtbe retrovírus kifejező vektort viszünk be.

    A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Moloney egér leukémia vírusból származó vektort alkalmazunk.
19. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy mieloproliferatív szarkóma vírusból származó LTR enhancer-t is tartalmazó vektort viszünk be a gazdasejtbe,
20. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a természetes LIF mRNS 3’ le nem fordított szakasza nélküli vektort visszük be a gazdasejtbe.
21. 22. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként hemopoetikus sejteket alkalmazunk.
22. 23. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként E. coli sejteket alkalmazunk.
23. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glutation S-transzferáz/LIF fúziós protein kifejezését irányító vektort visszük be a gazdasejtbe.
24. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glutation S-transzferáz/trombin hasítóhely/LIF fúziós protein kifejezését irányító vektort visszük be a gazdasejtbe.
25. 26. Eljárás LIF hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy LIF aktivitású polipeptidet egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy hígítószerrel összekeverünk és a keveréket kikészítjük.
26. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 15., 26. vagy 29. ábra szerinti aminosavszekvenciával legalább 95%-ban homológ polipeptidet alkalmazunk.
27. 28. A 27. igénypont szerinti éljárás, azzal jellemezve, hogy a 29. ábra szerinti aminosavszekvenciával teljesen homológ polipeptidet alkalmazunk.