HU203981B

HU203981B - Process for producing pharmaceutical compositions assisting healing of wounds

Info

Publication number: HU203981B
Application number: HU852229A
Authority: HU
Inventors: Peter Buntrock; Klaus-Dieter Jentzsch; Klaus Neubert; Peter Oehme; Andreas Kohl
Original assignee: Berlin Chemie Veb
Priority date: 1984-05-22
Filing date: 1985-06-05
Publication date: 1991-11-28
Also published as: HUT40916A; DE3586752D1; JPS624236A; DD248961A1; EP0165492A2; JPH0662428B2; EP0165492B1; EP0165492A3; ATE81464T1

Description

A találmány tárgya eljárás hatóanyagként H-Lys-ProOH-t, ciklo(Lys-Pro)-t vagy H-Lys-pirrolidinót, vagy a lizin E nitrogénatomján 4-nitro-benziloxi-karbonil-, benziloxi-karbonil-, vagy legfeljebb 20 szénatomos alkanoil-csoporttal szubsztituált származékát, vagy HArg-Pro-Lys-Pro-OH-t vagy H-Arg-Pro-Lys-Pro-GlnGln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂-t vagy ezek valamely savaddíciós sóját tartalmazó sebgyógyulást elősegítő új kozmetikumok vagy gyógyászati készítmények, továbbá kötszerek előállítására.

A találmány szerinti eljárást úgy végezzük, hogy

a) az ismert módon előállított hatóanyagot szokásos segéd- és vivőanyagokkal összekeverve sebgyógyulást elősegítő kozmetikummá vagy gyógyászati készítménnyé alakítjuk,

b) az ismert módon előállított hatóanyaggal kezelve a kötszereket, sebgyógyulást elősegítő kötszeranyagot állítunk elő.

A származékok közül figyelembe jöhetnek a sók, a védőcsoporttal ellátott származékai vagy Lys-Pro szekvenciát tartalmazó lineáris vagy gyűrűs peptidek. E vegyületek serkentik a sarjszövet (granulációs szövet) képződését, és így elősegítik a hcgesedés megindulását, valamint az ezt követő hámosodási folyamatot bőrés nyálkahártyasebek esetében vagy sajátbőr átültetése során. E készítmények alkalmasak mind közvetlen, mind közvetett, helyi (lokális) alkalmazásra a sebekben, a sebekre és a sebeken. A találmány révén lehetségessé válik olyan készítmények előállítása, amelyek kitűnő tolerabilitás mellett (kitűnő tűréssel) kedvezők a sebgyógyulási folyamat számára, és azt meggyorsítják.

A találmány alkalmas az ember- és állatgyógyászatban való felhasználásra.

Számos, különböző hatóanyagokat vagy hatóanyagkombinációkat tartalmazó gyógyszerkészítmény ismeretes, amelyek - a seb közelébe vagy magára a sebre helyezve - gyulladásgátló hatást (lásd a 2 945 239 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratot és a 3 965 260 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást) vagy csíragátló vagy csírairtó hatást (fertőtlenítőszerek, antibiotikumok, szulfonamidok) fejtenek ki [Hauschield E: Pharmakologie und Gniudlagen dér Toxikologie, VEB Georg Thieme (kiadó), Lipcse, 1973; Forth, W„ Henschler, D., Rümmel, W.; Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie, Bibliographisches Institut Mannheim, Wien, Zürich, Β. I. - Wissenschaftsverlag (kiadó), 1980]. Ismert továbbá az a lehetőség, hogy a sebeket tapaszokkal (2 165 549 és 2 443 180 szánni német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratok; 102078 számú német demokratikus köztársaságbeli szabadalmi leírás) vagy adszorbeáló granulátumokkal (például eellulóz-regenerátummal) vagy szintetikus borpót]ó\al (2 708 822 és 2 845 686 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási íratok) fedik, amelyek kívánt esetben alkalmas hatóanyaggal impregnáltak lehetnek (145225 számú német demokratikus köztársaságbeli szabadalmi leírás). Jóllehet az említett készítmények és sebfedő anyagok kedvező hatást gyakorolnak a seb gyógyulására, mert a hatóanyag fajtájától és mennyiségétől függően gátolják a gyulladásos folyamatot, csökkentik vagy meggátolják a fertőző csírákkal való szennyeződést, vagy gátolják vagy elölik a sebbe már bejutott kórokozókat; vagy kedvezően befolyásolják fizikai hatással (a seb fedésével, a váladék felvételével és a seb kiszáradásának megakadályozásával, stb.) a seb gyógyulását, de semmi esetre sem fejtenek ki specifikus és közvetlen hatást a sebgyógyulás biológiai alapfolyamatára, azaz a seb alapját kitöltő sarjszövet képződésére.

Ismert a saqszövet képződésének serkentése vágóhídi állatok agyvelejéből származó nyers kivonattal, amely „fibroblast-növesztő faktor’-aktivitást mutat, és sebfedő anyagok impregnálására alkalmas (145225. számú német demokratikus köztársaságbeli szabadalmi leírás). Ennek a nyers kivonatnak a hátránya abban áll, hogy nemcsak a hatóanyagot, hanem további kísérő fehérjéket és egyéb, az agyvelő felépítésére és funkciójára szolgáló anyagot tartalmaz, amelyek összetétele önmagában ismert és amelyek aránya tételről tételre változik, aminek következtében a készítmény kielégítő kémiai jellemzése nem lehetséges. Még intenzív tisztítási folyamat ellenére is allergiás mellékreakciók várhatók ismételt alkalmazás esetén ezeknek az anyagoknak az idegek mielinanyagával való szoros kapcsolata következtében [Gospodarowicz, D: Mól. Cell. Biochem, 25, 79 (1979)].

Végül ismert az L-kamozin (β-alanil-L-hisztidin) gyulladásgátló és sebgyógyulást elősegítő hatása (Nagai, K. és munkatársai: Arzneimittel-Forsch, 20, 1876 (1970); Nagai, K., T. Yamane: Heterocycles 10, 277 (1978)]. E vegyület intraperitoneális alkalmazása során kísérleti állatok (patkányok) kísérletes úton előidézett sebeire, valamint lokális alkalmazás során (kenőcs, pezsgőtabletta) foghúzás következtében keletkezett sebekre az emberen is kedvező hatást fejtett ki. E célra azonban rendkívül magas dózisok szükségesek (patkány esetében intraperitoneálisan 20 mg/kg). Ez a tény más szerzők azon megfigyeléseivel együtt [D. Fitzpatrick és H. Fischer: Fed. Proc. 40, 2514 (1981)], amelyek szerint az L-kamozinnak tulajdonképpen nincsen saját hatása, hanem csupán a hisztidin aminosavat és ezáltal a sejt szintéziséhez szükséges hisztamint szolgáltatja, ahhoz a következményhez vezetett, hogy ez a hatóanyag nem terjedt el az orvosi gyakorlatban.

A találmány szerinti megoldáshoz alkalmazott, LysPro peptidek különböző farmakológiai hatását több közlemény ismerteti. így a 132 846 számú NDK-beli szabadalmi leírásban a Lys-Pro peptidek emlékezet- és tanulási készséget erősítő hatását, valamint a stressz által okozott károsodás kezelésénél mutatott kedvező hatást ismertetik. A 2 163 266 számú nagy-britanniai, a 3 862 114 számú amerikai egyesült államokbeli és a 160 307 számú európai szabadalmi leírásban a peptidek vérnyomáscsökkentő hatását írják le. A 124 317 számú európai szabadalmi leírásban a Lys-Pro szekvenciát tartalmazó peptideknek a degeneratív állapotokat kedvezően befolyásoló hatását ismertetik. E hatások ismerete alapján nem volt várható, hogy a Lys-Pro szekvenciát tartalmazó peptidek sebgyógyulást elősegítő hatással rendelkezzenek. Ez a találmányi felisme-21

HU 203 981 Β rés teljesen új, az irodalmi ismertetéseknek ellentmondó.

Az ismert fiziológiai regulátor hatásából (Oehme, Löwe, Göres: Beitrage zűr Wirkstoí'í’-forschung (12. füzet) Akademie-Industrie-Komplex „Arzneimittelforschung, 1136 Berlin, Alfréd Kowalke Str. 4) a találmány szerinti eljárással előállított készítmények sebgyógyulást elősegítő hatására nem lehetett következtetni. A regulátor hatást mutató peptidekie jellemző, hogy a parciális szekvenciákban egészen eltérő biológiai hatások is rejtve lehetnek; ezeknek a rejtve lévő hatásoknak a kiemelése és felerősítése (például derivátok képzése révén) a farmakológiai kutatás fontos feladata. A már ismert emlékezeterősítő hatás, eredményes stresszkezelés, vérnyomáscsökkentő hatás alapján nem volt válható a sebgyógyulást elősegítő hatás.

A fent említett irodalmi helyen a szívre és vérkeringésre, továbbá a gasztrointesztinális traktusra kifejtett kedvező hatásról történik említés. A sebgyógyulás ezen effektusoktól alapvetően eltér, ezekből a sebgyógyulásra nem lehet következtetni.

A találmány célja az, hogy olyan készítményeket biztosítson, amelyek közvetlen vagy közvetett alkalmazás útján a seb területén a gyógyulási folyamat első lépését, azaz a saijszövet képződését serkentik és gyorsítják, hatóanyagtartalmuk szempontjából kémiailag egyértelműen definiálhatók, jól elviselhetők, kívánt esetben hatásukat alátámasztó, biológiai hatékonysággal bíró ismert hatóanyagokkal kombinálhatók, és a formulázáshoz szükséges, gyógyászati szempontból alkalmas vivőanyagokat tartalmaznak, aminek következtében az emberen való alkalmazása lehetővé válik, és amely készítmények az eddig ismert lehetőségeken túlmenően a sebgyógyulást, elsősorban a saqszövet képződését kedvezően befolyásolják, és ezáltal a seb gyógyulási folyamatát egészében elősegítik.

A találmány feladata olyan, a sebgyógyulást elősegítő hatású készítmények előállítási eljárásának a kidolgozása, amelyek a sebgyógyulás alapvető folyamatát, azaz a saqszövet képződését serkentik. Erre a célra biológiailag hatékony peptideket választás szerint vagy a célhoz kötötten meghatározott hatású, már ismert anyagokkal például antibiotikumokkal vagy szulfonamidokkal - kiegészítve kémiailag közömbös, a gyógyszeikészítésben szokásos oldószerekkel és vivőanyagokkal olyan formába hozunk, amely lehetővé teszi a seb területén a közvetlen vagy közvetett, lokális alkalmazást.

Ezt a feladatot úgy oldottuk meg, hogy a H-Lys-ProOH pepiidet, amely részszekvenciája többek között a fiziológiai regulátor JP” pepiidnek [P. Oehme és munkatársai: Substanz P; a következő helyen: Oehme, Löwe, Göres: Beitrage zűr Wiikstoff-forschung (12. füzet), Akademie-Industrie-Komplex „Arzneimittel-forschung”, 1136 Berlin, Alfréd-Kowalke-Str. 4), H-LysPro-OH-származékokat - például H-Lys-Pro-OH sókat, védőcsoportot tartalmazó H-Lys-Pro-OH-származékokat -, valamint a Lys-Pro szekvenciát tartalmazó egyes lineáris vagy ciklusos peptideket minőségileg új, azaz a saqszövet képződését serkentő hatás hordozójaként alkalmaztunk.

E célra alkalmazható egyik előnyös vegyület az N(4-nitro-benzil-oxi-karbonil)-lizil-prolin-hidroklorid. Ezt úgy állítjuk elő, hogy egy (I) általános képletű lizinszármazékot egy (II) általános képletű prolinszármazékkal - ahol az (1) általános képletben X jelentése tercier-butoxi-karbonil-, 4-metoxi-benziloxi-karbonil-, bifenil-izopropil-oxi-karbonil-, α,αdimetil-3,5-dimetoxi-benzil-oxi-karbonil-, 2-nitrofenil-szulfenil- vagy 9-fluorenil-metoxi-karbonilcsoport;

Y jelentése hidroxil-, pentafluor-fenil-, pentaklór-fenil-, triklór-fenil-, 4-nitro-fenil-, N-hidroxi-szukcinimid-észter- vagy hidrazincsoport; és a (II) általános képletben

A hidroxil-, metil-, etil-, tercier-butil-, fenil- vagy fenacil-észter-csoportot jelent a peptidkémia területén szokásos kapcsolási módszerek alkalmazásával [E. Wünsch: Synthese von Pepiiden; a következő helyen: Houben Weyl 15/11 kötet, Methoden dér organischen Chemie, szerk. E. Müller, Georg Thieme (kiadó) Stuttgart 1974] Ν,Ν’-diciklohexil-karbodiimid vagy Ν,Ν’-diciklohexiI-karbodiimid/segédanyag (előnyösen 1-hidroxi-benzotriazol) vagy vegyes anhidrid, aktív észter vagy azid segítségével kondenzáljuk, és az így kapott dipeptidszármazék kristályosítással vagy adszorpciós kromatográfiával való tisztítása után az amino- és kaiboxilcsoport védőcsoportját a peptidkémia területén ismert lehasítási eljárások (lásd E. Wünsch fentebb idézett helyen), elsősorban sósavval dioxánban vagy jégecetben vagy trifluor-ecetsavval cink/ecetsav segítségével, piperidinnel vagy alkalikus hidrolízissel eltávolítjuk, és az így kapott

H-Lys-[Z(NO₂)]-Pro-OH dipeptidet előnyösen hidroklorid alakjában elkülönítjük.

A peptidkapcsolást előnyösen aktív észter segítségével végezzük úgy, hogy az N-(tercier-butoxi-karbonil)N-(4-nitro-benzil-oxi-karbonil)-lizin-(pentafluor-fenil)észtert prolinnal egy mól trietil-amin jelenlétében 10:1 arányú dimetil-formamid víz elegyben reagáltatjuk. A reakcióelegyet egy órán át 0 °C hőmérsékleten, majd 12 órán át szobahőmérsékleten keveqük, utána kálium-hidrogén-szulfát oldatba öntjük, és a nyersterméket etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves kivonatot előtt kálium-hidrogén-szulfát oldattal, majd vízzel mossuk, és vízmentes nátrium-szulfáton megszáritjuk. Az etil-acetát vákuumban való lepárlása után a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat alapján egységes terméket az N-(tercier-butoxi-karbonil)-védőcsoport eltávolítása céljából 40 percen át 4,2 n sósavval kezeljük dioxános oldatban, és az így kapott HLys[Z(NO₂)]-Pro-OH dipeptidet (R_f értéke n-butanol, jégecet és víz 4:1:1 arányú elegyében kifejlesztve 3,9; n-butanol, jégecet. víz, etil-acetát 1:1:1:1 arányú elegyében 5,6; Kieselgel készlemezeken (Kavalier-Csehszlovákia) hidrokloridja alakjában vizsgáljuk és értékeljük: [a]§ = -35,8° (c = 1, vízben).

HU 203 981 Β

Előnyös készítményekként a granulátumok, oldatok, emulziók, szuszpenziók és az aeroszolok vehetők számításba. Az oldatok és az emulziók a hatóanyag (ok)on kívül a szokásos vivőanyagokat - így oldószereket és oldásközvetítőket - tartalmazhatják. Oldószerként elsősorban vizet vagy rövid szénláncú alkoholokat, például rövid szénláncú glikolokat - így propilénglikolt és 1,3-butilénglikolt - alkalmazhatunk. Oldásközvetítőkként poliglikolokat használhatunk, amelyek még olajokkal vagy glicerinnel is keverhetők.

A szuszpenziók a hatóanyag(ok)on kívül a szokásos vivőanyagokat, például folyékony hígítőszereket (így vizet, etanolt, propilénglikolt) és szuszpendálószereket tartalmazhatnak, azzal a feltétellel, hogy ezek a seb számára elviselhetők.

A találmány szerint a hatóanyag kozmetikumokhoz adott adalékként is alkalmazható. Borotválkozó öblítővízben a borotválkozás után a borotva által ejtett vágási sérülések vagy a már fennálló más jellegű sebek gyógyulását elősegíti. Kozmetikai eszköz formájában lehetővé teszi kis felületű, különféle eredetű bőrsérülések célszerű kezelését Fogkrémek alkatrészeként gyógyító hatást fejt ki a foghús sérüléseire. Száj- és öblítővizek adalékaként kedvezően befolyásolja a száj- és toroküregben fennálló gyulladásos-fekélyes nyálkahártyahiányokat, például vírusbetegségek lefolyása során. Ez ugyanígy érvényes állatok ilyen típusú sérüléseinek kezelésére, például vírusos exanthémák (bőrkiütések) vagy egyes anyagcserezavarok következtében fellépő kóros elváltozások során.

A találmány szerinti készítmények egy további indikációs területe nagy felületű bőrsérülések kezelése és kondicionálása, például műtéti sebek esetében, amelyek plasztikai fedés előkészítése céljából keletkeznek, valamint lábszárfekélyek esetében vagy égési sebek esetében. Ezekben az esetekben a seb alapjának megtisztítása után a saq'szövet képződését úgy segítjük elő és célzottan úgy gyorsítjuk, hogy a seb lefedésére használt anyagot például műanyagból készült lágyhabkötést - így SYSpur-derm kötést - a hatóanyaggal impregnáljuk vagy a fizikai úton ható granulátumot - például a Deshisan nevű összetett cellulóz-regenerátumot - a hatóanyaggal összekeverjük.

A találmány értelmében a készítmény a saijszövet képződését elősegítő hatóanyagot milliliterenként, illetve grammonként 10 és 100 pg koncentrációban tartalmazza.

A találmány jelentősége abból adódik, hogy a találmány szerinti hatóanyagok segítségével vagy e hatóanyagoknak más alkalmas hatóanyaggal alkotott kombinációjának segítségével - amelynek különböző támadáspontja van -, valamint nem toxikus, közömbös, gyógyászati szempontból alkalmas vivőanyagokkal olyan készítmények állíthatók elő, amelyek mind a gyógyászatban sebek gyógyulásának elősegítésére - különösen erősen szövethiányos sebek gyógyulásának elősegítésére - amelyek esetében a saijszövet képződésének kiváltása, serkentése és erősítése a gyógyulási folyamatra döntő jelentőségű, és egyidejűleg gátló hatást kell kifejteni nemkívánt kísérő folyamatokra - például a gennyesedésre -, valamint a kozmetikában, a bőr-, fog-, illetve foghús ápolására előállított gyártmányok hatásminőségének és hatáserősségének javítására alkalmazhatók.

A találmányt az alábbi kiviteli példák segítségével részletesen ismertetjük.

A példákban alkalmazott rövidítések:

FG:	nedvessúly
FG%:	a nedvessúly százalékos változása
TG:	szárazsúly
TG%:	a szárazsúly százalékos változása
TZ: x:	állatszám a nedves- és szárazsúlyok növekvési sebessége a Student-féle „t”-próbával szignifikánsnak igazolható.

Az „ismert módon előállított” kifejezés a jelen találmány elsőbbségi napja előtt publikált eljárásokat öleli fel.

1. példa

A H-Lys[Z(NO₂)]-Pro-OHxHCl hatóanyag alkalmazása vizes oldatban a Rudas-féle patkányseb-gyógyulási modellen

Két hónapos patkányok (testsúlyuk 220-270 g) hátbőre alá 19 mm alapátmérőjű polivinil-gyűrűket ültetünk steril körülmények között [Beck, Wiegers-Hausen és Jung által módosított Rudas-féle vizsgálati módszer Acta bio. med. Germ. 13, (1964)]. A gyűrű a hátizomkötegén nyugszik. A műtét napján 1,0 ml steril, izotóniás konyhasóoldatot (a kontroli-állatokon), illetve a hatóanyagot tartalmazó, azonos térfogatú konyhasóoldatot alkalmazunk. Ezután a gyűrű fölött a hátbőrön lévő sebet zárjuk. A műtét utáni 2., illetve 2„ 4. és 6. napon a bőrön keresztül további befecskendezést végzünk, minden alkalommal 0,2 ml steril, izotóniás konyhasóoldattal, amely a műtét napján adott hatóanyagmennyiség 20%-át tartalmazza.

A kontroli-állatoknak 0,2 ml konyhasóoldatot fecskendezünk be, amely hatóanyagot nem tartalmaz.

A műtét után 3 és 7 nappal a gyűrűben újonnan képződött sarjszövetet (sebszövetet) mennyiségi módon értékeljük úgy, hogy a szövet nedvessúlyát torziós mérleggel meghatározzuk. A szárazsúlyt úgy határozzuk meg, hogy a vizet éterben való kétszeres 24 órás áztatással extraháljuk, majd a sarjszövetet 56 °C hőmérsékleten 48 órán át szárítjuk [Neumann és Logan: J. Bioi. Chem. 184, 299 (1950)].

2. példa

A hatóanyag alkalmazása szintetikus bőipótló impregnálásához.

A „SYSpur-deim” nevű szintetikus bőrpótlóból (előállítja a VEB Synthesewerk, Schwarzheide, Német Demokratikus Köztársaság) éles lyukasztóvas segítségével steril körülmények között 13 mm átmérőjű lemezeket vágunk ki. Ezeket a lemezeket vagy steril, izotóniás konyhasóoldatba (0,14 mólos; a kontroli-állatok számára) vagy 50 pg/ml Lys-Pro hatóanyagot tartalmazó, izotóniás konyhasóoldatba helyezzük. A folyadékfelvétel lemezenként körülbelül 0,07 ml, ami körülbelül 5 pg H-Lys-Pro-OH tartalomnak felel meg.

HU 203 981 Β

Megközelítőleg két hónapos, 230-270 g testsúlyú, hím patkányok hátbőre alá polivinil-gyűriíket ültetünk be steril körülmények között (Rudas-féle vizsgálati módszer, lásd az 1. példát). A hatóanyagot nem tartalmazó, illetve hatóanyaggal impregnált „SYSpur- 5 derm”-lemezeket a műtét során a hátizomzat kötegére helyezett gyűrűn belül helyezzük el. Ezek a lemezek a sebek legnagyobb részét befedik, és az izomkötegen megtapadnak. Ezt követően a gyűrű fölött a sebet bőrkapcsokkal zárjuk. A műtét után 3, illetve 7 nappal a 10 gyűrűben újonnan képződött saijszövetet, illetve sebszövetet mennyiségi módon kiértékeljük (lásd az 1. példát). Ebből a célból minden egyes „SYSpur-derm” lemezt elválasztunk a sarjszövettől, és a sarjszövetet is különválasztjuk az izomköteg felületétől. A további 15 feldolgozás az 1. példában leírt módon történik.

A következő kísérleti csoportokat állítjuk össze:

1. csoport: 3 nappal a műtét után „SYSpur-derm”-lemezes kontrollok (steril izotóniás konyhasóoldatot alkalmazunk); 20

2. csoport: 3 nappal a műtét után impregnált „SYSpur-denrí’-lemezek (a fentebb leírtak szerint);

3. csoport: 7 nappal a műtét után „SYSpur-derm”-lemezes kontrollok (steril izotóniás konyhasóoldatot alkalmazunk);

4. csoport: 7 nappal a műtét után impregnált „SYSpur-derm-lemezek a fentebb leírtak szerint).

A sebgyógyulás során a zavarok nem voltak gyakoriak. Három állat esetében a seb zárókötésének kiharapása következtében fertőzés következett be. Ezeket az állatokat a kísérletből kizártuk. A műtét után 7 nappal a „SYSpur-derm lemezek az újonnan képzett sarjszövettel szilárdan összenőttek, és leválasztásuk során - az operáció után 7 nappal erősebben, mint az operáció után 3 nappal - a sebek pontszerű vérzései voltak megfigyelhetők.

A Student-féle „t” próba segítségével igazolható volt, hogy a nedves- és szárazsúlyok növekvési sebessége szignifikáns (+).

A hatóanyagot tartalmazó oldat (lásd az 1. példát) ismételt adásával kapott eredményekkel összehasonlítva kisebb növekvési sebességek - különösen a műtét után 7 nappal vizsgált patkányok esetében - a lemezenként felvett csekélyebb mennyiségű hatóanyaggal (5 ,ug alatt) magyarázhatók.

Izotóniás konyhasóoldatban milliliterenként oldott különböző mennyiségű H-Lys-[Z(NO₂)]-Pro-OHxHCl hatása

1. táblázat

Két hónapos patkányok saijszővetének nedves súlya (FG) és száraz súlya (TG), valamint víztartalma a műtét után 3 nappal

	Kontroll	5 Ug/ml	50 pg/ml	100 Ug/ml	500 Ug/ml
FG [mg]	125,2±5,6	125,0±7,8	231,4+3,2	188,6±34,2	209±14,2
TG [mg]	11,9+0,5	12,6+0,8	24,5±1,6	18,8±3,4	21,3+2,1
H₂O%	90,4+0,3	89.8±0,6	89,4±0,7	89,8+0,4	89,8+0,7
TZ	21	6	7	7	7
FG%	100	99,8	184,8	150.6	167,4
TG%	100	105,9	205.9	158,0	179,0

Izotóniás konyhasóoldatban milliliterenként oldott különböző mennyiségű H-Lys-[Z(NO2)]-Pro-OHxHCl hatása

2. táblázat

Két hónapos patkányok saijszővetének nedves súlya (FG) és száraz súlya (TG), valamint víztartalma a műtét után 7 nappal

	Kontroll	5 Ug/ml	50 Ug/ml	100 ug/ml	500 ug/ml
FG [mg]	162,2 ±9,9	260,7±21,2	235,0±9,7	242,8±20,2	223,6±5,0
TG [mg]	14,7±1,1	27,4+2,3	26,6±1,6	24,9±2,2	26.3+0,6
H₂O%	90,9±0,3	89,4+0,4	88,7+0,3	89,4+0,4	88,2 ±0,3
TZ	9	7	7	7	7
FG%	100	160,7	144,9	149,7	137,9
TG%	100	186,4	181,0	169,4	179,0

HU 203 981 Β

3. táblázat

A műtét után 3 nappal kapott vizsgálati eredmények

	I. csoport Kontroll	2.csoport Impregnált lemez	Növekvés %
Nedves súlyok (mg)	138±15,9	187 ±13,9	35,5⁺⁾
Száraz súlyok (mg)	13,5±1,7	17,6±l,0	30,4⁺⁾
Allatszám	9	10

4. táblázat

A műtét után 7 nappal kapott vizsgálati eredmények

5. táblázat

Izotóniás konyhasóoldatban milliliterenként oldott különböző mennyiségű H-Lys-Pro-OHx2HBr hatása:

hónapos patkányok saijszövetének nedves súlya és száraz súlya, valamint víztartalma a műtét után 3 nappal

	Kontroll	50 pg/ml	500 pg/ml
FG	125,2±5,6	170,7±8,7⁺⁾	193,6±20,3⁺⁾
TG	11,9±0,5	16,6±l,5⁺⁾	18,7 ±2,0⁺⁾
H₂O	90,4±0,3	90,3±0,7	90,3±0,2
TZ	21	7	7
FG%	100	136,3	154,6
TG%	100	139,5	157,1

	3.csoport Kontroll	4. csoport Impregnált lemez	Növekvés %
Nedves súlyok (mg)	140 ±10,7	169 ±7,2	21,7⁺⁾
Száraz súlyok (mg)	16,2±1,1	18,6±0,6	14,8⁺⁾
Allatszám	11	13

3. példa

H-Lys-Pro-OHx2HBr vizsgálata; az 1. példában leírt módon járunk el.

6. táblázat

hónapos patkányok saijszövetének nedves súlya és száraz súlya, valamint víztartalma a műtét után 2 nappal

	Kontroll	50 Ug/ml	500 Ug/ml
FG	132,5±6,9	184,2±13,5⁺⁾	186,0±10,4⁺⁾
TG	13,6±1,1	25,4±l,9⁺⁾	25,4±2,8⁺⁾
H₂O	89,6±0,7	85,7±1,7	85,9±2,1
TZ	10	6	6
FG%	100	139,0	140,4
TG%	100	186,8	186,8

4. példa H-Lys(Z)-Pro-OH-vizsgálata; az 1. példában leírt módon járunk el.

7. táblázat

Izotóniás konyhasóoldatban milliliterenként oldott különböző mennyiségű H-Lys-Pro-OH hatása:

hónapos patkányok sarjszövetének nedves súlya és száraz súlya, valamint víztartalma a műtét után 3 nappal

3d	Kontrol]	5 pg/ml	10 pg/ml	20 Ug/ml	40 pg/ml
FG	125,2±5,6	121,0±6,4	147,5+14.5	206,7±17,8⁺⁾	187,5±15,3⁺⁾
TG	ll,9±0,5	9,4±0,4⁺⁾	14,1±2,3	16,5±2,3^+>	12,1±1,1
H₂O	90,4±0,3	92,l±0,4⁺'	90,6±0,8	92,7±1,8	93,5±0,6⁺⁾
TZ	21	5	6	6	4
FG%	100	96,6	117,8	165,1	149,8
TG%	100	79,0	118,5	138,7	101,7

8. táblázat

Izotóniás konyhasóoldatban milliliterenként oldott különböző menny iségű H-Lys-Pro-OH hatása:

hónapos patkányok saijszövetének nedves súlya és száraz súlya, valamint víztartalma a műtét után 7 nappal

	Kontroll	5 pg/ml	10 pg/ml	20 pg/tnl	40 Ug/ml
FG	162,2±9,9	121,0±ll,l⁺⁾	U9,5±13,0⁺⁾	114,0±ll,2⁺⁾	125 ±12,0⁺⁾
TG	14,7±1,1	13,1±1,1	1 l,8±O,8	12,6±1,2	13,1+1,5
H₂O	90.9+0.3	89,l±0,4^+l	90,0±0,6	88,9+O,3^+l	89,6±0,4⁺⁾
TZ	9	5	6	5	6
FG%	100	74,6	73,7	70,3	77,1
TG%	100	89,1	80,3	85,7	89,1

HU 203 981 Β

5. példa SP'^-Tetrupepiid (H-Arg-Pro-Lys-Pro-OH) vizsgálata; az 1. példában leírt módon járunk el.

9. táblázat

Izotóniás konyhasóoldatban milliliterenként oldott különböző mennyiségű SP^íi_4’ hatása:

3d	Kontroll SP'¹ ⁴’	5 pg/ml	10 pg/ml	50 pg/ml	100 pg/ml
FG	125,2±5,6	200,7±24,9⁺⁾	344,0±57,9⁺⁾	342,9±27,l⁺⁾	371,4±30,4⁺⁾
TG	11,9+0,5	21,5±2,6⁺⁾	43,2±2,l⁺⁾	37,9±3,5⁺⁾	39,9±2,2⁺⁾
H₂O	90,4+0,3	89,2±0,3⁺⁾	88,9±0,4⁺⁾	89,0±0,4⁺⁾	89,l±l,4⁺⁾
TZ	21	7	7	7	7
FG%	100	160,3	274,8	273,9	296,6
TG%	100	180,7	363,0	318,5	335,3

10. táblázat

Izotóniás konyhasóoldatban milliliterenként oldott különböző mennyiségű SP^,I_4) hatása:

hónapos patkányok sarjszövetének nedves súlya és száraz súlya, valamint víztartalma a műtét után 7 nappal

	Kontroll	5 pg/ml	10 pg/ml	50 pg/ml
FG	162,2±9,9	209,2±14,5⁺⁾	290,7±24,9⁺⁾	256,7±21,2⁺⁾
TG	14,7±1,1	24,0±l,8⁺⁾	33,3±2,9	31,6±2,9⁺⁾
h₂o	90,9+0,3	88,3±1,2	88,3±O,5^+>	87,6±0,7⁺⁾
TZ	9	6	7	6
FG%	100	128,9	179,2	158,3
TG%	100	163,3	226,5	215,0

11. táblázat

6. példa

A H-Lys[Z(NO₂)]-Pro-OHxHCl érfalképződést elősegítő hatásának kimutatása szövettani-alaktani vizsgálattal. 35

Szövettani metszeteken minőségileg (differenciálisán) megszámoltuk az összsejtszámot (N_nvc). vörösvértestek (N_nrc) és endotheliumsejtek (N_nec) sejtmagvainak száma szerinti megoszlásban, 100-szoros nagyítás mellett, olajimmerziós mikroszkóppal és hálózatos 40 okulármikrométerrel [P. Buntrock: Zbl. alig. Pathol. u. alig. pathol. Anat., 124, 48 (1980)]. E vizsgálatunk eredményeit all. táblázatban foglaltuk össze. Kontroli-állatokként izotóniás konyhasóoldattal kezelt patkányokat alkalmaztunk, amelyek számértékeit 100%- 45 nak vettük. Ebből az adódik, hogy a kapillárisok endothelium-sejt-magvainak a száma szignifikánsan növekszik. A kezelés során az 1. példában leírt módon jártunk el.

A pontszámláló eljárás segítségével [Buntrock és munkatársai: Exper. Pathol. 27, 62 (1982)] meghatároztuk a kapillárisok százalékos térfogathányadát (VV_CAp) az endotheliumsejtek (VV_EC), az endotheli- 55 um-sejtmagvak (VV_NEC), az endotheliumsejt-citoplazma (VV^n·), valamint a kapilláris lumene (VV_CAPL) vonatkozásában. A kontrollokat itt is 100%nak vettük. Az eredményeket a 12. táblázatban foglaltuk össze. 60

A kontrollok sejtmagszámának a százalékos változását 100%-nak vettük

A seb kora	Műtét után 3 nap	Műtét után 7 nap
Kezelés:	H-Lys[Z(NCh)]-Pro-OHxHCl ismételt adagolása
50 pg/mJ	500 pg/ml	50 pg/ml	500 pg/ml
Nnvc	96	108	95	85
Nnotc	95	117	71	66
Nngc	99	24	85	86
Nnrc	61	67	90	78
Nnec	230	292	174	148

72. táblázat

A kapillárisok morfometriája

A seb kora:	Műtét után 3 nap	Műtét után 7 nap
Kezelés:	H Lys[Z(N(>>)]Pro-OHxHCl ismételt adagolása
50 ug/ml	500 pg/ml	50 pg/ml	500 Ug/ml
VVcAF	140	157	200	300
VV_EC	155	185	192	266
Wnec	214	274	260	409
Wcyt	127	142	157	193
W_CAPL	109	114	230	374

HU 203 981 Β

13. táblázat

Sebgyógyulás Rudas-féle vizsgálata patkányokon (az 1. példában leírtak szerint)

Vizsgált anyag mennyisége (Ug/ml)	Nedves súly mg	Száraz súly mg
1. Ciklo{Lys[Z(NOi)]-Pro} vizsgálata
kontroll	132,0	7,0
10	175,0	29,0
50	192,1	15,1
100	225,0	37,8
2. H-Lys[Z(NO₂)]-Nj xHCl vizsgálata
kontroll	132,0	7,0
10	182,8	16,8
50	196,4	17,9
100	205,6	11,4
3. H-Lys(kapronil)-Pro-OH vizsgálata
kontroll	132,0	7,0
10	168,6	8,7
50	137,0	12,6
100	143,6	10,3
4. H-Lys(palmitil)-Pro-OHxHCl vizsgálata
kontroll	132,9	9,0
3	180,0	10,9
27	637,0	10,5
81	154,3	4,6
5. P( 1—11) jelzésű (H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-PheGly-Leu-Met-NH2) vegyület vizsgálata
kontroll	162,0	9,9
5	193,0	12,0
50	318,0	17,3

Az eredmények alapján a H-Lys[Z(NO₂)]-ProOHxHCl dipeptidnek az érfalképződést elősegítő hatása idézi elő a saijszövet erősebb képződését és a seb gyorsabb gyógyulását

7. példa

Sebgyógyulást elősegítő borotválkozó arcszesz

Etanol, összehúzó szerek (például fémsók, fenol, csersav, timsó) bakteriosztatikus hatóanyagok (például p-hidroxi-benzoesav-észterek, zsályaolaj, kakukkfű olaj), továbbá illatanyagok keverékéhez 0,0001-0,1 tömeg# H-Lys-Pro-OH képletű hatóanyagot hozzáadva sebgyógyulást elősegítő borotválkozó arcszeszeket állítunk elő.

Összetétel:

H-Lys-Pro-OH 100/ug

Etanol 80 ml

Zsályaolaj 3 ml

Víz ad 100

8. példa

Sebgyógyu lást előseg ítőfogpaszták

Tisztító szerek (így például kalciumkarbonát, kalcium-hidrogén-foszfát, alumínium-oxid-hidrát, kalciumpirofoszfát, magnézium-szilikát), habképzőszerek (alkánszulfonátok, mint például parafinszulfonsavak nátriumsói, zsírsav alapú felületaktív anyagok és/vagy ezek elegye), kiszáradást gátló szerek (így például több értékű alkoholok, mint glicerin, szorbit, mannit, glükózszirup, polietílénglikol, polivinilpirrolidon) aromás anyagok (például illó olaj, borsmentaolaj, ánizsolaj, mentol, citrusolaj, metil-szalicilát), tartósítószerek (például p-hidroxi-benzoesav-észterek, hexakloroprén, hidroxi-benzoesav-metil- és propil-észter), sűrítőszerek (például poliakrilsav és ennek alkáli sója, polivinilpirrolidon, alignát, tragakant, mikrokristályos cellulóz, metil-cellulóz, karboxi-metil-cellulóz) keverékéhez hatóanyagként 0,0001-0,1 tömeg# H-Lys-ProOHx2HBr-ot adva sebgyógyulást elősegítő fogpasztákat állítunk elő:

Összetétel:

H-Lys-Pro-OHx2HBr	0,0001%
Alumínium-oxid-hidrát	35,07c
Pentadecilszulfonát-
nátriumsó	2,17c
Glicerin	7,07c
Borsmentaolaj	1,2%
p-hidroxi-benzoesav-észterek	0,1%
karboxi-metil-cellulóz	14,57c
Víz ad 100

9. példa

Sebgyógyulást elősegítő száj- és/vagy öblítővizek

Etanol és aromaanyagok (például illóolajok, mint borsmentaolaj, ánizsolaj, mentol, citmsolaj, metil-szalicilát) keverékéhez 0,0001-0,1 tömeg# H-Lys-ProOH hatóanyagot adva olyan száj- és/vagy öblítővizeket állítunk elő, amelyek elősegítik a száj- és a toroküregben lévő nyálkahártya-sérülések gyógyulását.

Összetétel:

H-Lys-Pro-OH 0,0001 %

Mentol 0,07 %

Etanol 20,0 %

Víz ad 100

10. példa

Sebkezelő stiftek

Ajakrúzs, alapozó anyag

Például olajok, mint ricinusolaj, paraffinolaj, édesmandulaolaj, avokadóolaj, olívaolaj, ásványolaj, szilikonolaj, lenolaj, alkohol, viasz, mint méhviasz, ozokerit (földi viasz), lanolin, kandellin viasz, vazelin, kamauba-kakaóvaj, szilikon viasz, hidrogénezett olajok, mint olajsav-, sztearinsav-kalcium-, magnézium-, alu-81

HU 203 981 Β mínium sója; olajok (az olajokat és a viaszokat az alapmasszához 5:2 arányban elegyítjük) és 0,00010,1 tömeg% H-Lys-Pro-OH vegyület összekeverésével sebkezelő stifteket állítunk elő.

Összetétel:
H-Lys-Pro-OH	0,0001%
Polivinil-laurát	24,0%
Polietilén-zsír	35,0%
Lanolin	19,0%
Polietilén viasz	15,0%
Ásványolaj	6,7%
Metil-hidroxi-benzoát	0,299%

11. példa

Sebgyógyulást elősegítő kötözőanyag

Kötözőanyagot (kötszer anyagot) - előnyösen műanyag, lágybab kötözőanyagot (így SySpur-derm, Epigard) vagy az ipari előállítás során, például párhuzamosan elhelyezett szórófejek segítségével előnyösen 5x10‘³-5x10'^s mólos, steril, vizes H-Lys-Pro-OH tartalmú oldattal csíkosán átitatunk, megszárítunk és sterilen csomagolunk; vagy a klinikai gyakorlatban közvetlenül az alkalmazás előtt ugyanilyen koncentrációjú, csíramentes H-Lys-Pro-OH tartalmú oldatba áztatjuk, és közvetlenül a sebfelületre helyezzük.

12. példa

Sebgyógyulást elősegítő sebhiníőpor

Adszorbeáló sebhintőport, előnyösen összetett cellulóz regenerátumot H-Lys(Z)-Pro-OHxHCl tartalmú szárazanyaggal, előnyösen 1:100—1:10000 arányban összekeverünk.

Összetétel:

H-Lys-Z-Pro-OHxHCl 0,01 g

Cellulóz regenerátum: 100 g

13. példa

H-Lys[Z(NO₂)]-Pro-OHxHCl hatóanyag előállítása

1. Pentafluor-fenil-észteren keresztül történő előállítás g Boc-Lys[Z(NO2)]OPfp-t 50 ml N,N-dimetil-formamidban oldunk 0 °C hőmérsékleten, ehhez 1,45 g L-prolinnak és 1,85 ml trietil-aminnak 7 ml vízzel készült oldatát adjuk. Az elegyet 1 óra hosszat 0 °C-on, majd 5 óra hosszat szobahőmérsékleten kevertetjük, majd ezután 5%-os KHSO₄-oldathoz adjuk és ecetsavetil-észterrel háromszor kirázzuk.

Az egyesített ecetsav-etil-észter fázisokat ezután nátrium-kloriddal telített vízzel kétszer, majd 5%-os KHSO₄-oldattal háromszor, ezt követően vízzel háromszor mossuk és Na₂SO₄-tal szárítjuk. Az oldószert ledesztilláljuk, az amorf maradékot petroléterrel eldörzsöljük, szűrjük, majd P₂O₅/KOH felett szárítjuk. Hozam: 5,6 g

5,23 g Boc-LysfZfNO^l-Pro-OH-t 30 ml 1,1 n HCl/ecetsavval elegyítünk, majd 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután az elegyet vákuumban betöményítjük, a nyers terméket éterrel eldőrzsöljük, szűrjük, majd metanol és éter elegyéből kicsapjuk, P₂O5/KOH felett szárítjuk.

Hozam: 4,3 g

Olvadáspont 102-105 °C.

[a]g— 35,8° (c-1, víz) [a] d “ -31,8° (c -1, ecetsav)

Vékonyréteg-kromatográfia:

A oldószereleggyel R_f = 0,39

B oldószereleggyel R_f=0,56.

2. N-hidroxi-szukcinimid-észteren keresztül történő előállítás

13,05 g Boc-LysfZÍNO^j-ONSu-t és 3,0 g L-prolint 50 ml Ν,Ν-dimetil-formamidban szuszpendálunk 0 °C hőmérsékleten, majd 3,35 ml trietil-amint adunk hozzá. Az elegyet 1 óra hosszat 0 °C-on, majd egy éjszakán át szobahőmérsékleten kevertetjük, ezután 5%-os KHSO₄-oldathoz adjuk és ecetsav-etil-észterrel háromszor kirázzuk, az 1. pont alatt leírtak szerint folytatjuk a feldolgozást Hozam: 11,7 g.

11,5 g Boc-Lys[Z(N0₂)]-Pro-OH-t 70 ml 1,1 n HCl/ecetsav eleggyel keverünk össze. 30 perc eltelte után az elegyet vákuumban betöményítjük, éterrel a maradékot felvesszük, leszűrjük, a kapott nyers terméket metanol és éter elegyéből kicsapjuk, P₂O5/KOH felett szárítjuk. Hozam: 9,4 g.

Olvadáspont 103-105 °C.

[a] d = -31,1° (c = 1, ecetsav)

Vékonyréteg-kromatográfia:

A oldószereleggyel R_f=0,40,

B oldószereleggyel R_f=0,56.

A fenti példában alkalmazott rövidítések jelentése:

Az aminosavak és peptidek rövidítése az IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature ajánlása szerint [Biochem. J. 219, 345 (1984)].

Boc: terc-butil-oxi-karbonil,

ONSu: N-hidroxi-szukcinimid-észter,

Z(NO₂): 4-nitro-benzil-oxi-karbonil,

OPfp: pentafluor-fenil-észter.

A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatot Silufol kész lemezeken (Kavalier, Csehszlovákia) végezzük: az oldószer-rendszer összetétele térfogat arányokban kifejezve:

A oldószerelegy: n-butanol - ecetsav - víz 40:10: 10;

B oldószerelegy: n-butanol - ecetsav - víz - ecetsav - etil-észter 20:20:20:20.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás hatóanyagként H-Lys-Pro-OH-t, ciklo(Lys-Pro)-t vagy H-Lys-pirrolidinót, vagy a lizin E nitrogénatomján 4-nitro-benziloxi-karbonil-, benziloxi-karbonil-, vagy legfeljebb 20 szénatomos alkanoilcsoporttal szubsztituált származékát, vagy H-Arg-ProLys-Pro-OH-t vagy H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-PhePhe-Gly-Leu-Met-NH₂-t vagy ezek valamely savaddíciós sóját tartalmazó kozmetikumok vagy gyógyászati készítmények, továbbá kötszerek előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) az ismert módon előállított hatóanyagot szokásos segéd- és vivőanyagokkal összekeverve sebgyógyulást elősegítő kozmetikummá vagy gyógyászati készítménnyé alakítjuk,

HU 203 981 Β

b) az ismert módon előállított hatóanyaggal ismert módon kezelve a kötszereket, sebgyógyulást elősegítő kötszeranyagot állítunk elő.
2. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás arcszesz előállítására, azzal jellemezve, hogy segéd- és vivőanyagként etanolt, összehúzószereket, bakteriosztatikus hatású anyagokat és illatanyagokat alkalmazva, ezek keverékéhez 0,0001-0,1% mennyiségben 1. igénypont szerinti hatóanyagot adunk.
3. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás fogpaszta előállítására, azzal jellemezve, hogy segéd- és vivőanyagként tisztítószereket, habképzőszereket, kiszáradást gátló szereket, aromaanyagokat, tartósítószereket és sűrítőszereket alkalmazva ezek keverékéhez 0,0001-0,1% mennyiségben 1. igénypont szerinti hatóanyagot adunk.
4. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás száj- és öblítővíz előállítására, azzal jellemezve, hogy segéd- és vivőanyagként etanolt és aromaanyagokat alkalmazva ezek keverékéhez 0,0001-0,1%-ban 1. igénypont szerinti hatóanyagot adunk.
5. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás sebkezelő szájstift előállítására, azzal jellemezve, hogy ajakrúzs-alapanyaghoz 0,001-0,1% mennyiségben 1. igénypont szerinti hatóanyagot adunk.
6. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy kötszeranyagként előnyösen miíanyag-lágyhab-kötszeranyagot alkalmazva vagy az ipari méretű előállítás során, célszerűen párhuzamosan elhelyezett szórófejek rendszerével, előnyösen 5xl0'³-5xl0'⁵ mól koncentrációjú steril, vizes, 1. igénypont szerinti hatóanyag tartalmú oldattal kezelést végzünk, a kötszert csíkozottan átitatjuk, megszárítjuk és steril körülmények között csomagoljuk.
7. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás sebhintőpor előállítására, azzal jellemezve, hogy adszorbeáló sebhintőporként előnyösen összetett cellulóz-regenerátumot alkalmazva, ezt 1. igénypont szerinti hatóanyaggal előnyösen 1:100—1:10000 arányban összekeveqűk.
8. Az 1. igénypont vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként NE-(4-nitro-benzoil-oxi-karboniI)-L-lizil-L-prolin-hidrokloridot alkalmazunk.