DD222782A1

DD222782A1 - Verfahren zur herstellung stabiler loesungen von undekapeptiden und ihren partialsequenzen

Info

Publication number: DD222782A1
Application number: DD25941384A
Authority: DD
Inventors: Peter Oehme; Klaus Fechner; Burkhard Mehlis; Wolf-Eckehard Vogt; Klaus Treptow; Karl Hecht; Marianne Poppei; Elena Wachtel; Ija Kolometsewa; Mikael G Airpetjanz; Bettina Rose; Hansgeorg Hueller; Heidemarie Apelt
Original assignee: Adw Der Ddr Inst F Wirkstoffor
Priority date: 1984-01-16
Filing date: 1984-01-16
Publication date: 1985-05-29

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung stabiler Loesungen von Undekapeptiden, vor allem solcher der Substanz P-Reihe sowie den Substanz P-Partialsequenzen. Die Peptide werden in Saeuren geloest und mit Basen neutralisiert, wobei Saeuren verwendet werden, die nach Zugabe der Basen die p H-Konstanz durch Pufferwirkung garantieren. Die Loesungen eignen sich zur nasalen Applikation. Anwendungsgebiet ist die pharmazeutische Industrie.

Description

Mit erfindungsgemäß hergestellten Lösungen von Substanz P, ihren Partialsequenzen und Analoga wares möglich,

a) einen für pharmakologische Effekie ausreichenden Plasmaspiegel.des Peptides zu erreichen und

b) die von anderen Applikationsarten für Substanz P bereits bekannten Antistreßwirkungen erstmals auch nach nasaler Anwendung nachzuweisen.

Die Erfindung soll an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele ; _v ' .

Beispiel 1: _; .. ·.

1g Substanz. P wird mit TOmI 0,02 M Phosphorsäure verrührt und unter weiterer Zugabe von Phosphorsäure (90 ml, 0,02M) vollständig gelöst. Anschließend wird mit 0,01 M Natronlauge auf pH7,0 eingestellt und in Peptidlösung 100mg Benzalkoniumchlorid gelöst. ' . '

Beispiel 2: .

, Man verrührt 1 g Substanz P mit 10 ml 0,02 M Phosphorsäure und löst das Peptid unter fortgesetztem Rühren bei weiterer Zugabe von Phosphorsäure (90 ml, 0,02M) vollständig auf. Diese Peptidlösung wird mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt und mit 100mg Benzalkoniumchlorid konserviert. Diese Lösung füllt man mit einer klären 3prozentigen Lösung von Meth'ylcellulose auf 1000ml auf. \ , ,

Beispie! 3: . · ₁ ~~

Man löst analog Beispiel 2 0,8g.N-terminalesTetrapeptid von Substanz P (1-4) bzw. andere N- bzw. C-terminale Teilsequenzen bzw. Analoga in 100ml 0,02M Salzsäure und stellt mit 0,02M Trishydr'oxymethylaminomethanlösung auf pH7,0 ein. Mit einer 2,5prozenfigen Hydroxyethylcellulose/Dextran-Lösung, die 2mg Methionin, 100mg Benzalkoniumchlorid und Natrium-Ethylendiamintetraacetat enthält, wird auf 1000 ml aufgefüllt.'

Beispiel 4: - ' . '

Mit gemäß Anwendungsbeispiel 1 oder 2 hergestellter Lösung von SP-Undekapeptid (SP_1-11) wird Ratten in einem Volumen von 40μ.Ι bei einer Gesamtdosis von 125/u,g/kg Substanz P appliziert. Zur Plasmaspiegelbestimmung wird ein spezifischer Radioimmunoassay eingesetzt. Der Substanz P-Gehalt im Plasma wird vor and zu definierten Zeiten nach der Peptidgabe bestimmt. Zwischen der 1. und 3. Minute nach der Applikation wird dabei eine Zunahme des Plasmaspiegels im Vergleich zum Gehalt vor der Peptidgabe auf das 8- bis lOfache beobachtet. Gleichzeitig tritt, im Vergleich zum Verhalten nach intravenöser Anwendung, eine Verlängerung der Plasmaspiegelhalbwertszeit auf. Der damit erreichte Plasmaspiegel an Substanz P ist für das Erzielen pharmakologischer Effekte des Peptides ausreichend.

Beispiel 5: ·

Zubereitungen von SP_1-11,. SP₁^bZw. anderen,wirksamen Teilsequenzen bzw. Analoga entsprechend Beispielen 1-3 werden Ratten mit streßbedingter Schlafstörung über mindestens vier Tage je einmal pro Tag Substanz P-Peptide appliziert. Der Erfolg der Paptidgabe wird an Hand der Normalisierung des vorher gestörten Schlafprofils, d.h. des Anteils der einzelnen Schlafstadien an der Gesamtschläfzeit und der Latenzzeiten für das Auftreten der einzelnen Schlafphasen, beurteilt. ·

Tab. T Anteil der Schlafstadien (in %) am Gesamtschlaf bei Ratten nach chronischem Streß ohne und mit gleichzeitiger nasaler SP-Applikation ,

Schlafstadien .

I ' Il Ill IV V

normale Tiere 15,8 10,4 23,5 42,0 . 8,3

gestreßte , _v, · 22,6 . 23,4 29,7 . 21,2 3,1'

Ratten mit ',--'

Schlafstörungen ' . '

gestreßte/ "' 10,0 14,0 26,0 40,9 ' 9,1

Ratten mitzu-". · . "

sätziich nasaler-SP-Applikation . ... ' .

nasal) - . . ..- . _(|

Tab.2 Latenzzeiten der Schlafphasen (min) vor und nach 125/j.g/kg Substanz P intranasal bei schlafgestörten Ratten . ' Schlafphasen

Il	5,4	II!	IV	ν-
12,5	13,1	27,8	55,5
32,0	44,3	^r 84,7

normale Tiere, gestreßte

Ratten mit - . ,

Schlafstörungen . .

gestreßte Ratten 4,8 18,5 25,0 54,2 ; ^:

mit zusätzlich , . , ' ' '

nasaler SP-Applikation (4X125Mg/kg · .. . , nasal)

Insbesondere die für die Stadien IVund V angegebenen Werte können nach intranasaler Gabe von Substanz P-Psptiden denen von Versuchstieren ohne Schlafstörungen signifikant angeglichen werden. Damit normalisiert SP bei nasaler Applikation die bei Ratten nach chronischem Streß auftretenden Schlafstörungen derart, daß ein weitgehend normales Schlafprofil wiederhergestellt wird. Die gleiche Wirksamkeit wie mit der Zubereitung des Undekapeptides SP_1-11 (Beispiel 1 und 2) wird mit nach Beispie! 3 hergestellter Lösung des N-terminalen Tetrapeptides Substanz P₁^₁ erreicht. ' -.

Claims

-1- 259413 7

Erfindungsansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung stabiler Lösungen von Undekapeptiden und ihren Partialsequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß man Substanz P-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetN^- ihre Analoga sowie ihre Partialsequenzen in Säuren auflöst und danach mit Basen neutralisiert, wobei für Substanz P und ihre Analoga eine Säure verwendet wird, die nach Zugabe einer Base die pH-Konstanz durch Pufferwirkung garantiert und Hilfsstoffe zu der Lösung gegeben werden, wobei.man die Peptidlösungen weitgehend außerhalb des Bereiches kolloider Lösungen hält.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Säure Phosphorsäure verwendet wird und dadurch nach· Neutralisation mit einer Base ein Puffersystem vorliegt.
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration der Hilfsstoffe so wählt, daß kolloide Peptidlösungen weitgehend vermieden werden.
4. Verfahren nach Punkt 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß Zubereitungen des Substanz P-Undekapeptides SP_1-11 bei nasaler Applikation einen für die pharmakologische Wirkung ausreichenden Substanz P-Plasmaspiege! erreichen.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung stabiler Lösungen von Peptiden der Substanz P-Reihe für therapeutische Anwendungen. Substanz P ist ein Undekapeptid folgender Struktur:

Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetNH₂.

Diese Verbindung, ihre Analoga und ihre Partialsequenzen besitzen ein breites Spektrum biologischer Aktivitäten.

Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen _

Es ist bekannt, daß Substanz P, ihre Analoga und Partialsequenzen in der Therapie nutzbar gemacht werden. So wird z. B. die Behandlung von streßbedingten Schaden beschrieben (Oehme, P., K.Hecht, L.Piesche, M.Poppei in: CA. Marsan und W.C.Traczyk (eds.), IBRO-Symp. Series, vol.7: Neuropeptides and Neural Transmission, Raven Press, New York, 1980, pp.73-89. . ' .

Hecht, K., P.Oehme, J.A.Kolometsewa, J.P.Ljowschina, M.Poppei und M.G.Airapetjanz,:Acta biol. med. germ. 29 (1980), 141). Γ ' '' "· ' " ..- - . ' -" ^; '-^; ' V / ' ·' .'·.. ;

Peptide können nur in Ausnahmefällen oral appliziert werden, da sie einem schnellen Abbau im Magen-Darm-Trakt unterliegen. In den meisten Fällen ist deshalb eine parenteral^ Applikation erforderlich. Für den Patienten arh wenigsteh belastend ist eine nasale Verabreichung von Peptiden. So ist bekannt, daß man Oxytocin, Vasopressin uhd ihre Analoga vorteilhaft nasal appliziert (AMA Drug Evaluations, 3. Edition, Publishing Sciences Group, Inc. Littleton, Mass. USA, 619, 622). Auch das Releasing Hormon des luteinisierenden Hormons (LHRH) kann auf diesem Wege verabreicht werden (Fink, G.; G. Gennser; P. Liedholm; J.Thorell und J. Mulder, J. Endocrinol. 63, 351-360 (1974).) Da man nasal nur kleine Volumina applizieren kann, ist es erforderlich, relativ konzentrierte Lösungen der Peptide einzusetzen. Dies ist in den vorstehend beschriebenen Fällen ohne Schwierigkeiten durchzuführen, da es sich urn in Wasser leicht lösliche Substanzen handelt. Im Gegensatz dazu besitzt das Undekapeptid Substanz P eine wesentlich geringere Löslichkeit in Wasser. Auch in organischen Lösungsmitteln ist ihre Löslichkeit gering. Weiterhin beobachtet man bei Substanz P-Peptiden das Phänomen der Bildung von Multimer-Lösungen. Dies sind klare Lösungen, in dene/i durch Selbst-Assoziation der Peptidmoleküle Partikel mit einer breiten Größenverteilung bis zu einigen Hundert Nanometerrl Durchmesser vorliegen. Diese zunächst klaren Lösungen können beim längeren Aufbewahren durch Alterungsprozesse der Kolloidpartikel Trübungen und Fällungen bilden, die auch durch Erwärmen, nicht wieder gelöst werden können. Schwierigkeiten ergeben sich gelegentlich auch bei der Auflösung von Lyophilisate der Substanz P-Peptide, die längere Zeit gelagert waren. Beim Versuch der Auflösung in wäßrigen Medien verbleibt ein scheinbar unlöslicher Rückstand, der jedoch aus chemisch unverändertem Peptid besteht. Hier spielen offenbar ähnliche Alterungsprozesse eine Rolle wie bei den Multimer-Lösungen.

An Lösungen für die nasale Applikation werden eine Reihe von Forderungen gestellt. So wird verlangt, daß ihr pH-Wert neutral gehalten werden soll. Dies ist durch Anwendung geeigneter Pufferlösungen möglich, wobei die lohenstärke in der Peptidlösung erhöht wird. Hohe lonenstärke fördert jedoch die Bildung von Multimeren und setzt die Löslichkeit für Substanz P-Peptide in diesem Medium herab. Den gleichen Effekt beobachtet man auch bei Zusatz von neutralen wasserlöslichen Polymeren, die üblicherweise zu nasalen Applikationsformen zugesetzt werden, um die Viskosität der Lösungen zu erhöhen. Dabei kommt es bei längerem Aufbewahren der Lösungen ebenfalls zu unerwünschten Trübungen und Fällungen.

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, die nasale Applikation von Peptiden der Substanz P-Reihe möglich zu machen und der pharmazeutischen Industrie eine über Jahre hinweg stabile neutrale Lösung dieser Peptide in die Hand zu geben.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe sich die Schwierigketten bei der Lösung von Peptiden der Substanz P-Reihe, vor allem die Bildung von Multimer-Lösungen, die nicht restlose Auflösung von Lyophilisaten dieser Peptide sowie die Neigung zu unerwünschten Trübungen und Fällungen bei längerem Aufbewahren der Lösung nach dem Zusatz von Polymeren, umgehen lasseh. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß man Peptide der Substanz P-Reihe (das Undekapeptid Substanz P, seine Analoga sowie seine Partialsequenzen) in einer Säure auflöst und danach mit einer Base neutralisiert, wobei für Substanz P.und ihre Analoga eine Säure verwendet wird, die nach Zugabe einer Base die .pH-Konstanz durch Pufferwirkung garantiert. Dabei werden die Peptidlösungen weitgehend außerhalb des Bereiches kolloider Lösungen.gehalten. -

Vorzugsweise wird Phosphorsäure angewandt und danach mit Natronlauge auf pH 7 eingestellt. Damit wird eine gute Auflösung unter Einhaltung einer minimalen Salzkonzentration erreicht. Die Konzentration an Peptidwirkstoff, Puffersubstanz und Hilfsstoffen wird so abgestimmt, daß der Bereich, in dem Peptidmultimere vorliegen, weitgehend vermieden wird. Mit Hilfe bekannter Methoden, wie der Filtration und Sterilisation, lassen sich keimarme Lösungen der Peptide herstellen. Die erfindungsgemäß hergestellten Lösungen eignen sich zur nasalen Applikation. Sie bleiben jahrelang klar und stabil, ohne Anzeichen von Peptid-Fällungen zu zeigen.