HU203278B

HU203278B - Process for producing compositions containing liposomes

Info

Publication number: HU203278B
Application number: HU88892A
Authority: HU
Inventors: Naoru Hamaguchi; Katsumi Iga; Yasuaki Ogawa
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1987-02-25
Filing date: 1988-02-24
Publication date: 1991-07-29
Also published as: DK86988D0; EP0280492B1; KR880009636A; DE3867866D1; HUT52943A; EP0280492A3; CN88100965A; DK86988A; EP0280492A2; ATE71834T1; CA1322171C; US5019394A

Description

A találmány liposzóma készítmények előállítási eljárására vonatkozik, amelyek liposzoma membránja a felületaktív anyagot és a foszfolipidet is magában foglalja.

A „hatóanyagot szállító rendszer” (Drug Delivery System, DDS) ötlete, amely a hatóanyagot magába foglaló liposzoma készítmény intravénás adagolásakor a hatóanyagot specifikus helyre irányítja, ismert [G. Gregoriadis és munkatársai, Receptormediated targeting of drugs, Plenum Press, New York, p 243-266 (1980)]. Az ilyen liposzóma készítménnyel szemben támasztott elsődleges követelmény, hogy az intravénásán adagolt liposzóma a vérben hosszabb időn át is stabil legyen. A liposzóma azonban a vérben nem nagyon stabil, mivel kölcsönhatásba lép a vérben lévő lipidekkcl, a membrán komponensekkel és a vérben lévő lipoproteinekkel. Továbbá, az intravénásán adagolt liposzómát mint idegen anyagot, fizikai és biokémiai tulajdonságai alapján a reticuloendotheliális rendszer (RÉS) felismeri és a vérből eliminiálni képes. íly módon a várakozástól eltérően a liposzóma a vérből igen gyorsan távozik. Ezért fontos, hogy a liposzóma a vérben stabilizálható legyen és elkerülhető legyen a RÉS által való felismerés. C.G. Knighyt vizsgálatai szerint a liposzóma stabilitása a vérben koleszterin, mint a liposzóma membrán komponensének adagolásával, növelhető [”Liposomes; from physical structure to therapeutic applications”, Elsevier, North Holland p 310-311 (1981)], eza hatás azonban nagymértékben függ a liposzóma membrán összetételétől [Biochemica et Biophysica Acta, 839, 1-8 (1985)]. Ismertették azt is, hogy a RES-hez való szállítás szabályozható, ha a liposzóma membrán felületét sziálcsoportot tartalmazó glukoproteinnel vonják be [Chem. Pharm. Bull., 34, 2979-2988 (1986)]. Ez azonban ellentmond egy másik vizsgálatnak, amely szerint az ilyen glukoproteint tartalmazó sziálsav főleg a májhoz, a RÉS egyik szervéhez szállítódik [Biochemica et Biophysica Acta, 497, 760-765 (1977)].

Kevés vizsgálat vonatkozik azonban arra, hogy a liposzóma membránokban felületaktív anyagot alkalmaznak. Ennek oka az, hogy a felületaktív anyagokat általában úgy tekintették, mint amelyek a liposzóma membránt destabilizálják [Cell Technology (Saibo Kougaku), 2, 1136 (1983)] és főleg a membrán megbontására alkalmazták [Biochemica et Biophysica Acta, 557, 295 (1979)]. Talán egyetlen olyan hivatkozás ismert, ahol a liposzóma készítésénél felületaktív anyagot alkalmaznak, és pedig oly módon, hogy ionos felületaktív anyag és egy lipid homogén keverékét a felületaktív anyag kritikus micella koncentrációja alatti értéknél egy vizes fázisban szuszpendálják, amikoris egy lamellás liposzómát nyernek (Gazetta of Japanese Unixamined Patent Publication, No. 89633/1984). Az így nyert liposzóma készítmények azonban intravénás adagoláskor a vérből gyorsan távoznak és a DDS a szerepét nem tölti be kielégítően.

A fentiek alapján az ismert megoldások a hatóanyagot magában foglaló liposzóma készítmények intravénás adagoláskor DDS-ként való alkalmazásra nem kielégítöek, a liposzóma készítmények a vérből való gyors eliminálódása miatt.

Fentiek alapján találmányunk célja olyan liposzóma készítmény biztosítása, amely a vérben hosszabb időn át is stabil.

Felismertük, hogy a fenti célkitűzést elérhetjük, 5 ha a liposzóma membrán összetevőjeként telített acilcsoportokat tartalmazó foszfolipideket alkalmazunk bizonyos más felületaktív anyagok, azaz anionos felületaktív anyagok, amelyek Krafft pontja 37 °C vagy e fölötti érték, jelenlétében. Az íly mó10 dón előállított liposzoma készítmények a vérben stabilak.

A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás gyógyászati hatóanyagot — amelynek oktanol és víz közötti megoszlási koefficiensének logaritmusa 10 vagy ennél kisebb — valamint foszfolipideket tartalmazó liposzóma készítmény előállítására oly módon, hogy

1. a kritikus micella koncentráció feletti koncentrációban anionos felületaktív anyagot — amelynek Krafft pontja 37 ’C vagy a fölötti érték — vízzel elkeverünk,

2. a kapott vizes közeghez telített acilcsoportokat tartalmazó foszfolipideket adagolunk, az anionos felületaktív anyagot 0,5-50 tömeg25 rész mennyiségben alkalmazzák 100 tömegrész foszfolipidre számolva és a hatóanyagot vagy az 1) vagy a 2) lépésnél adagoljuk, majd

3. a kapott szuszpenziót vagy emulziót ismert módon liposzóma készítménnyé alakítjuk, amely30 nek liposzóma membránja a felületaktív anyagot és a foszfolipidet is magában foglalja.

A találmány szerinti eljárásnál alkalmazott foszfolipidek lehetnek telített acilcsoportokat tartalmazó glicerofoszfolipidek és sfingofoszfolipidek. Ezen foszfolipidek olyanok, amelyekkét acilcsoportja telített, 8 vagy több szénatomos alkilcsoportot tartalmaz és legalább az egyik legalább 10, előnyösen 1218 szénatomos telített alkilcsoport. Különösen előnyösek azok a foszfolipidek, amelyeknél mindkét acilcsoport 12-18 szénatomos telített alkilcsoportot tartalmaz. Ilyen foszfolipidek közé tartoznak a hidrogénezett lecitinek, amelyeket növényi vagy állati eredetű lecitinek (például tojássárgája vagy szójabablecitin) hidrogénezésével nyerünk, továbbá szemiszintetikus foszfolipidek, amelyeket például lauroil, mirisztoil sztearoil, stb. és foszfatidil etanol-amin, foszfatidil-szerin, foszfatidil glicerin, foszfatidil inozit és sfingomielin kombinálásával nyerünk. Ezek fázis átmeneti hőmérséklete előnyö50 sen 20-80 ’C közötti érték. Előnyösen például a következőket alkalmazzuk (zárójelben a fázis átmeneti értékeket tüntetjük fel): dimirisztoil-foszfatidü kolin (DMPC, 23,9 °C), palmitoil-mirisztoü-foszfatidü kolin (PMPC, 27,2 ’C), mirisztoil-palmitiil55 foszfatidil kolin (MPPC, 35,5 ’C), dipalmitoil-foszfatidil-kolin (DPPC, 41,4 ’C), sztearoil-palmitoilfoszfatidil kolin (SPPC.44,0 ’C), palmitoü-sztearoil-foszfatidil kolin (PSPC,47,4 ’C), disztearoil-foszfatidil kolin (DSPC, 54,9 ’C), dimirisztoil-foszfati60 dil etanol-amin (DMPE, 50 ’C), diaplmitoil-foszfatidil etanol-amin (DPPE, 60 ’C), disztearoil-foszfatidil etanol-amin (DSPE, 60 °C felett), dimirisztoilfoszfatidil szerin (DMPS, 38 ’C), dipalmitoil-foszfatidil szerint (DPPS, 51 ’C), disztearoil-foszfatidil szerin (DSPS, 50 ’C vagy több), dimirisztoil-foszfa-2HU 203278Β tidil-glicerin (DMPG, 23 ’C), dipalmitoil-foszfatidil glicerin (DPPG, 41 ’C), disztearoil-foszfatidil glicerin (DSPG, 55 °C), dipalmitoil-sfingomielin (DPSM, 41 ’C), kés disztearoil sfingomielin (DSSM, 57’C).

A találmány szerinti eljárásnál alkalmazott anionos felületaktív anyagok, amelyek Krafft pontja 37 ’C vagy a fölötti érték, előnyösen olyanok, amelyek szulfát vagy szulfonát csoportot tartalmaznak és Krafft pontjuk előnyösen 37 ’C és 90 ’C közötti érték Ezeket a felületaktív anyagokat a következő általános képlettel írjuk le:

R -X_m - (Y ί vagy Y2)n - Z amely képletben

R jelentése 12 vagy több szénatomot tartalmazó, adott esetben szulfátcsoporttal szubsztituált alkilcsoport,

X jelentése -CONH-, -COO-, <ON-vagy CH5

1,4-fenilén-csoport;

Yl jelentése-CH2CH2-_i2£HCH2CHJ

-CH2CHCH₃ vagy -CH2CH2CH2-csoport;

Y2 jelentéseOCH2CH2=^OCHCH2-,

CHá

-OCH2CHCÍI3 vagy OCH2CH2CH2-csoport

Z jelentése -SO₃-M⁺ vagy -SO4-M⁺ képletű csoport, ahol M jelentése alkálifém ion;

m jelentése 0 vagy 1; n jelentése 0,1 vagy 2, feltéve, hogy ha X jelentése -CONH- vagy CONL_^csoport, ^-CH₃

Y2 helyén vegyértékkötés van, és ha X jelentése

1,4-fenüén-csopor t, n értéke 0.

R jelentésében az alkilcsoport előnyösen 12-25 szénatomos alkilcsoport vagy 16-25 szénatomos szulfátcsoporttal helyettesített alkilcsoport, amelyben a szulfátcsoporthoz alkálifém-ion, például nátrium-, kálium- vagy lítium-ion kapcsolódhat.

A következő anionos felületaktív anyagokat alkalmazhatjuk például: szulfát csoportot tartalmazó anyagok: alkil-szulfát észtereksói, például nátriumhexadecil-szulfát (Krafft pont 43 ’C) és nátriumoktadecil-szulfát (58 ’C), alkil-diszulfát-észterek sói, például nátrium-hexadecil-diszulfát-észter (39 °C) és nátrium-oktadecil-diszulfát-észter (45 ’C), alkil-éter-szulfát-észterek sói, így például nátriumoktadecil-éter-szulfát-észter (46 ’C) és nátrium-ok tadecil-diéter-szulfát-észter (46 ’C), zsírsav alkanoilamid-észterek sói, például nátrium-palmitoiletanolamid-szulfát-észter (42 ’C), nátrium-sztearoil-etanolamid-szulfát-észter (53 ’C), nátriumpalmitoil-propanolamid-szulfát-észter (47 ’C) és nátrium-sztearoil-propanolamid-szulfát-észter (57’C);

szulfonátcsoportot tartalmazó anyagok: alkánszulfonsavak sói, így például nátrium-dodekánszulfonát (38 ’C), nátrium-tetradekánszulfonát (48 ’C), nátrium-pentadekánszulfonát (48 ’C), nátrium-hexadekánszulfonát (57 ’C), nátrium-heptadekánszulfonát (62 ’C) és nátrium-oktadekánszulfonát (70’C);

alkilbenzolszulfonátok sói, így például nátriumdodecil-benzolszulfonát (40 ’C), nátrium-tetradecil-benzolszulfonát (43 ’C), nátrium-hexadecübenzolszulfonát (46 ’C) és nátrium-oktadecü-benzolszulfonát (56 ’C);

aciloxi-etánszulfonsavak sói, például nátrium-mirisztoil-oxi-etánszulfonát (39 ’C), nátrium-palmitoil-oxi-etánszulfonát (51 ’C) és nátrium-sztearoiloxi-etánszulfonát (51 ’C), acil-taurinoksói, így például nátrium-palmitoil-taurin (43 ’C), nátriumsztearoil-taurin(58 ’C), nátrium-palmitoil-metiltaurin (43 ’C) és nátrium-sztearoil-metil-taurin (58 ’C).

A fenti anyagok közül előnyösek az acil-taurinok és acil-metil-taurinok sói, mivel különösen nagy stabilitást biztosítanak a liposzóma készítményeknek a vérben, továbbá ipari hozzáférhetőségük is jó.

A találmány szerinti eljárásnál előnyösen a fázis átmeneti hőmérsékletet 37 ’C és 60 ’C, előnyösen 40 és 55 ’C közötti értékre állítjuk be. Ezt a foszfolipidek és anionos felületaktív anyagok megfelelő fajtájának és a kettő közötti arány alkalmas megválasztásával biztosíthatjuk. A liposzóma membrán fázis átmeneti hőmérsékletének értékét calorimetriával, így például DSC-vel (Differenciál Scanning Calorimeter) végezzük vagy pedig a liposzómából felszabaduló hatóanyag mennyiségi meghatározásával követjük. A fenti értékek beállításához a 0,550 tömegrész, előnyösen 5-20 tömegrész anionos felületaktív anyagra 100 tömegrész foszfolipidet alkalmazunk. A liposzóma membrán fázis átmeneti hőmérsékletének fenti értékre való beállítására azért van szükég, mert így a liposzóma készítménynek a vérben való clearance-t hosszabb időn át előnyösen tudjuk befolyásolni.

A találmány szerinti eljárásnál a liposzóma készítmények előállításához az anionos felületaktív anyagokat a vizes közegben a kritikus micella koncentráció feletti koncentrációban alkalmazzuk. A kritikus micella koncentrációt ismert eljárások szerint határozzuk meg, így például a fizikai tulajdonságok, például felületi feszültség, ozmózisos nyomás és elektromos vezetőképesség és az anionos felületaktív anyag koncentrációja közötti összefüggések vizsgálatával [Masayuki Nakagaki and Naofumi Koga, „Drug Physicochemistry (Yakuhin Butsurikagaku)”, 3. kiadás, p 111 (1969), Nankodoj. Az íly módon meghatározott koncentráció feletti koncentrációt és a fentiek szerinti arányokat alkalmazva állítjuk elő a vizes közeget oly módon, hogy az anionos felületaktív anyagot a Krafft pontnál magasabb hőmérsékleten a vizes közegben oldjuk, vagy a Krafft pontnál alacsonyabb hőmérsékleten szuszpendáljuk. A vízben oldható hatóanyagot az így nyert vizes oldatban oldjuk és adott esetben más egyéb adalékanyagokat is (például cukrok és sók az ozmózis nyomás beállítására, pH beállítához szükséges pufferek) adagolunk. A hatóanyag mennyisége függ a gyógykezelés céljától és a gyógyszer hatásosságától.

A fentiek szerint nyert vizes közegből és foszfoli3

-3HU 203278Β pidekből ismert módon szuszpenziót vagy emulziót kpezünk. Például a RÉV, MLV, SUV vagy más liposzómák előállításnál ismét eljárást alkalmazzuk, és például a következők szerint járunk el: a foszfolipidet először szerves oldószerben (például dietil-éter, izopropil-éter, kloroform, vagy ezek bármilyen elegye) oldjuk, ehhez hozzáadjuk a fentiek szerint nyert vizes oldatot és v/o típusú emulziót állítunk elő. Az így kapott v/o emulzióból a liposzóma készítményt például a következő irodalmi helyeken leírtak szerint nyerjük: Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 75, 4194 (1978) és Gazetta of Japanese Unexamined Patent Publication No. 118415/1980. A felhasznált szerves oldószer mennyisége általában 2-10-szerese a befoglalni kívánt folyadéknak. A foszfolipid mennyisége 10-100 pjnólper 1 ml befoglalni kívánt folyadék és általában előnyös, ha a foszfolipidet az oldószerben előzőleg oldjuk.

A v/o emulziókat általában keveréssel, nyomás alatti kezeléssel vagy ultrahangos kezeléssel nyerjük. homogén emulziót nyerünk például 20 KHz-es teljesítményű ultrahangos berendezéssel 1-20 percig végzett kezeléssel. A találmány szerinti eljárásnál alkalmazott anionos felületaktív anyagokkal homogén és finomeloszlású emulziót nyerhetünk.

A kapott v/o emulzióból ezután az oldószert ismert módon eltávolítjuk. Az eltávolításhoz alkalmazhatunk például forgó bepárló berendezést. A párologtatást 40 ‘C-on vagy e fölött végezzük a kezdeti lépésben 60-400 Hgmm, majd a gélképződés megindulásakor 100-700 Hgmm nyomáson. A további párologtatás során nyerjük a RÉV (reverse phase vesicle) liposzóma készítményt. Az így előállított liposzóma ey- vagy oligo-lamellás (általában 10 vagy kevesebb rétegből álló lipid kettős membrán), a hatóanyagot is magában foglaló liposzóma.

A multi-lamellás hólyag-típusú liposzóma készítményeket (MLV) úy nyerjük, hogy a fentiek szerint nyert szerves oldószerből és foszfolipidből álló oldatból az oldószert elpárologtatjuk, amikoris a foszfolipidet vékony film formájában nyerjük, ehhez hozzáadjuk a hatóanyagot és anionos felületaktív anyagot tartalmazó vizes oldatot és 40 ‘C-on vagy e fölött diszpergáljuk. Az így kapott MLV készítményt laboratóriumi ultrahangos készülékben rázatva kis unilamellás szerkezetű (SUV) liposzóma készítményt nyerünk.

A találmány szerinti eljárást a stabil, több-lamellás hólyag (stable plurilamellar vesicle, SPLV) módszerhez (Gazetta of Japanese Unexamined Patent Publication No. 500952/1984) és a dehidrációs-rehidrációs hólyag módszerhez (C. Kirby és munkatársai Biotechnology, nov. 979, 1984) is alkalmazhatjuk. Ha a hatóanyag zsírban jól és vízben csak kissé oldódik a liposzóma készítményt úgy nyerjük, hogy a hatóanyagot valamely fenti oldószerben oldott lipidben oldjuk. Az ilyen liposzóma készítményt közvetlenül is f elhasználhatjuk, vagy szükség esetén a kívánt részecskeméretüre alakítjuk, például megfelelő pórusméretű szűrőn való szűréssel vagy gélszűréssel. Felhasználás előtt előnyös, ha a szabad, nem liposzóma szerkezetben foglalt hatóanyagot eltávolítjuk, így például gélszüréssel, centrifugálással vagy dialízissel.

A találmány szerinti eljárással előállítható lipo4 szóma készítményeknél a hatóanyag bármilyen lehet, így például lehetnek tumor-ellenes szerek, például platina vegyületek, például cisplatin, carboplatin, spiroplatin, továbbá adriamicin, mitomicin C, actinomicin, ansamitomicin, bleomicin, 5-FU és metotrexát, továbbá lymphokeinek, így például természetes vagy gén rekombináns interferonok (α, β, -γ) és természetes és gén rekombináns interleukinok, fiziológiailag aktív peptidek, így például mangánszuper-oxid dezmutáz (SÓD) és ezek származékai, szuperoxid dezmutáz PEG (PEG-500) (Gazetta of Japanese Unexamined Patent Publication No. 16685/1982 és 0210761. számú európai szabadalmi bejelentés); béta-laktam antibiotikumok, így például gentamicin, streptomicin, kanamicin; vitaminok, így például cianocobalamin és ubiquinon anti-protazoális szerek, így például meglumin-antimonát; enzimek, így például alkil-foszfatáz; antikoagulánsok, így például heparin; antiallergiás szerek, így például amlexanox,; immun aktiváló szerek, így például muramii dipeptid és TMD-66 [Cancer, Gann 74 (2) 192-195, 1983]; keringési rendszerre ható szerek, így például propanolol; metabolizmust aktiváló szerek, így például glitatoin. A találmány szerinti eljárásnál előnyösen vízben oldható hatóanyagokat alkalmazunk, ezeket úgy jellemezzük, hogy az oktanoi és víz közötti megoszlási koefficiensük logaritmusa kisebb mint 10 vagy egyenlő mint 10.

A találmány szerinti eljárással előállított liposzóma készítményeket intravénásán injekció vagy infúzió formájában alkalmazzuk. Infúziónál a megfelelő mennyiségű oldatot vagy emulziót fiziológiás sóoldatban szuszpendáljuk.

A találmány szerinti eljárással előállított liposzóma készítmények a vérrel hosszú időn keresztül képesek keringeni a szervezetben az intravénás adagolást követően, így csökkentik a hatóanyag toxicitását és fokozzák a hatóanyag irányítottságát a kívánt szövethez és növelik annak hatásosságát. Különösen az anti-tumor-ellenes hatású hatóanyagot tartalmazó készítmények esetében várható a megnÖvekedett hatás rendellenes magas láznál való adagolás esetén. Ilyen esetekben olyan liposzóma készítményeket alkalmazunk, amelyekben a liposzóma membrán fázis átmenet hőmérséklete 40-55 °C közötti érték.

Ábrák rövid ismertetése:

Az 1., 2. és 3. ábrán a 6-CF hatóanyagot tartalmazó liposzóma készítmények intravénás adagolása után a vérben mért 6-CF szinteket ábrázoltuk az idő függvényében, patkányok esetében. A 4. ábrán a 6CF vagy CDDP tartalmú liposzóma készítmények vérszintjét ábrázoltuk az idő függvényében.

A vérszintet a dózis %-ában adjuk meg, feltételezve, hogy a vér térfogata 10%-a a testtömegnek.

A következő példákkal a találmányt közelebbről mutatjuk be.

1. példa

270 mg DPPC-t és 30 mg DSPC-t feloldunk kloroform és izopropil-éter 1:1 arányú elegyében. 10 ml 6-karboxi-fluoresceint (6-CF) tartalmazó vizes oldathoz, amelyet úgy állítottunk elő, hogy az ozmózisos nyomása a fiziológiás sóoldatéval azonos legyen, szobahőmérsékleten 30 mg nátrium-sztea-4HU 203278Β roil-etil-taurint (SMT) adunk. Az SMT oldhatatlan, de gyorsan oldódik micella képződés közben a Krafft pont feletti hőmérsékleten. Ekkor ezt az oldatot a fenti foszfolipid oldathoz adagoljuk és laboratóriumi ultrahangos készülékkel (Ohtake, Japan) v/o típusú emulziót képezünk. Az ultrahangos kezelést 50 watt teljesítmény mellett 3 np-ig végezzük, ötször ismételve. Akapott emulziót ezután forgó bepárlóba tesszük és az oldószert csökkentett nyomáson 60 ’C hőmérsékleten elpárologtatjuk, így REVet nyerünk. A párologtatás elején a nyomást erősen lecsökkentjük, majd később úgy állítjuk be, hogy a buborékképződést elkerüljük. Á REV-ben visszamaradó kevés szerves oldószert nitrogén-átfúvással távolítjuk el. Ezután annyi fiziológiás sóoldatot adunk a REV-hez, hogy a térfogata 10 ml legyen, majd 1,2 mikronos szűrőn (Acrodisc, Gelman) átszűrjük és fiziológiás sóoldattal szemben dializáljuk (Spectrapor, Spectrum Medical) 24 órán át. A kapott, 6-CF-et magában foglaló liposzóma készítményben a 6-CF mennyisége 33,2%, amelyet a következőképpen határoztunk meg:

0,1 ml liposzóma készítményt foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal (PBS, pH» 7,2) 100-szoros mennyiségre hígítottunk, majd ismét 100-szoros hígítást végeztünk 0,02% TritonX 100-at tartalmazó PBS-sel, majd 60 ’C-on 30 percig melegítettük, a liposzóma megbontására. A liposzóma szuszpenzióban lévő 6-CF teljes mennyiségét fluoreszcencia méréssel határoztuk meg (Hitachi, F3000 Fluorospectrometer, extinkciós hullámhossz 494 nm, mérési hullámhossz 515 nm). Külön készítettünk 0,1 ml liposzóma készítményből PBS-sel 1000-szeres hígítású oldatot, ennek 2,5 mi-ét centrifugálisan szűrtük (Centrisart, SM13249E, Sartorius), és a nem befoglalt szabad 6-CF mennyiségét a szuszpenzíóban a szűrletből fluoreszcenciás vizsgálattal határoztuk meg.

A befoglalt mennyiség - 100 x (a 6-CF teljes mennyisége) - (a szabad 6-CF mennyisége) / a liposzoma előállításához felhasznált 6-CF mennyisége

2. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, csak 30 mg SMT helyett 150 mg SMF-t használunk. A készítmény 34,9% 6-CF-et tartalmaz kötve.

3. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, csak a 30 mg SMT helyett 45 mg SMT-t használunk. A liposzóma 39,4% 6-CF-et tartalmaz.

4. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, csak a 30 mg SMT helyett 60 mg SMT-t használunk a liposzóma 46,3% 6-CF-et tartalmaz kötve.

5. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, csak a 30 mg SMT helyett 30 mg nátrium-palmiíoil-metiitaurint (PMT) alkalmazunk. A liposzóma 32,8% 6CF-et tartalmaz kötve.

6. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, csak a mg SMT helyett 30 mg oktadekán-szulfonátot (ODS) alkalmazunk. A liposzóma 33,3% 6-CF-et tartalmaz kötve.

7. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, csak a 30 mg SMT helyett 15 mg ODS-t alkalmazunk. A liposzóma 24,1% 6-CF-et tartalmaz.

8. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, csak a 30 mg SMT helyett 45 mg ODS-t használunk. A liposzóma 38,3% 6-CF-et tartalmaz.

9. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, csak a 30 mg SMT helyett 60 mg ODS-t használunk. A liposzóma 40,1% 6-CF-et tartalmaz.

10. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, csak 210 mg OPPC-t és 90 mg DSPC-t használunk a 270 mg DPPC és 30 mg DSPC helyett. A liposzóm a24,l% 6-CF-et tartalmaz.

11. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, csak a 270 mg DPPC helyett 300 mg DPPC-t használunk. A liposzóma 35,2% 6-CF-et tartalmaz.

12. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, csak a 270 mg DPPC és 30 mg DSPC helyett 210 mg DPPC-t és 90 mg DSPC-t használunk. A liposzóma 28,3% 6-CF-et tartalmaz,

13. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, csak a 270 mg DPPC helyett 300 mg DPPC-t használunk. A liposzóma 34,6% 6-CF-et tartalmaz.

14. példa

Az 1. példában leírtak szerint járunk el, csak a 30 mg SMT helyett 30 mg nátrium-palmitoil-taurint használunk. A liposzóma 22,4% 6-CF-et tartalmaz.

15. példa

360 mg DPPC-t és 40 mg DSPC-t feloldunk 40 ml kloroformban. A szerves oldószert forgó párologtatóban eltávolítjuk, amikoris a lombik falán lipidfilm képződik. A filmben lévő oldószemyomatokat nitrogéngáz-fúválással eltávolítjuk. A kapott filmhez ezután 10 ml 6-CF-et és 40 mg SMT-t tartalmazó oldatot (1. példa szerint előállítva és 60 ’C-ra melegítve) adagolunk, 60 ‘C hőmérsékleten diszpergáljuk, amikoris MLV-t nyerünk. A kapott MLV-t ezután 50 watt teljesítménnyel 10 percig ultrahanggal kezeljük, így SUV-t nyerünk. Ezután az 1. példában leírtak szerint a készítményt szűrjük, dializáljuk, amikoris 5,7% 6-CF-tartalmú liposzóma készítményt nyerünk.

16. példa

A15. példa szerint járunk el, csak 280 mg DPPC5

-5HU 203278Β t és 120 mg DPSC-t alkalmazunk. A kapott liposzoma 6,3% 6-CF-et tartalmaz.

17. példa

A 15. példa szerint járunk el, csak 400 mg OPPCT-t és 40 mg DSPC-t alkalmazunk. A kapott liposzoma 6% 6-CF-et tartalmaz.

18. példa

A 15. példában leírtak szerint járunk cl, csak 40 mg PNT-t alkalmazunk a 40 mg SMT helyett. A kapott liposzoma 6,8% 6-CF-et tartalmaz,

19. példa

A 15. példa szerint járunk el, csak 40 mg ODS-t alkalmazunk a 40 mg SMT helyett. A kapott liposzoma 5,4% 6-CF-et tartalmaz.

20. példa

A 15. példa szerint járunk el, csak 40 mg nátrium-palmitoil-taurint (PT) alkalmazunk a 40 mg SMT helyett. A kapott liposzoma 6% 6-CF-et tartalmaz.

1—1. kísérlet

Azl., 10., 11., 15., 16. és 17. példa összetételének megfelelő liposzóma készítményt állítunk elő kontrollként azzal az eltéréssel, hogy nem alkalmazunk anionos felületaktív anyagot. Ugyancsak kontroll készítményt állítunk elő az 1. példában leírtak szerint, azzal az eltéréssel, hogy a 270 mgDPPC. 30 mg DSPC és 30 mg SMT helyett 200 mg, telített acilcsoportokat tartalmazó tojás-sárga foszfatidil kolint, 100 mg koleszterint és 30 mg SMT-t alkalmazunk. SMT-mentes liposzóma készítményt is előállítunk, amelynek összetétele egyébként az előzőeknek megfelel. Egymásikkontrollkészítmény összetétele azonos a 15. példa szerintivel, azzal a különbséggel, hogy az SMT helyett nátrium-dodecil-szulfátot (SDS, Krafft pont 9 °C) alkalmazunk.

1-2. kísérlet

Az 1. példa szerinti liposzóma készítményt és hasonló összetételű, de anionos felületaktív anyagot nem tartalmazó készítmény 10,1 -0,5 ml-es mennyiségben intravénásán patkányoknak adagolunk és vizsgáljuk a vérből való eliminálódását (a módszert lásd később). A kapott eredményeket az 1. ábrán mutatjuk be. Az ábrából látható, hogy az anionos felületaktív anyagot tartalmazó készítmény esetében (—.—) a vérszint sokkal magasabb, mint a kontroll készítmény esetében (—x—).

Az 1., 6., 10., 15., 18., 19. és 20. példák szerinti liposzóma készítményeket 0,1-0,5 ml-es mennyiségben intravénásán patkányoknak adagoltuk, és megállapítottuk, hogy 1 órával az adagolás után a vérben maradó liposzóma mennyisége 9,7-, 11,9-,

26,4-, 2,7-, 2,3-, 2,8- éls 2,2-szer nagyobb volt, mint a hasonló összetételű, de anionos felületaktív anyagot nem tartalmazó kontroll készítményé. A 2. ábrából látható, hogy az anionos felületaktív anyagot tartalmazó, toljás-sárga foszfatidilből és koleszterinből nyert liposzóma (—.-) ugyanolyan gyorsan eliminálódik a vérből, mint a kontroll (—x—). A 3. ábrán a —x— görbe mutatja az SDS-tartalmú, 1-1.

példa szerint nyert liposzóma vérből való eliminálódását (0,2 ml-es dózis esetén) a (—.—) görbe pedig a hasonlóan készült, de SDS-et nem tartalmazó liposzómánál kapott értékeket mutatja. Ezek az eredmények világosan bizonyítják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított, telített acilcsoportokat tartalmazó foszfolipidekkel és 37 ”C-nál magasabb Krafft-pontú anionos felületaktív anyagok alkalmazásával előállított liposzóma készítmények intravénás adagolás után sokkal hosszabb ideig vannak a vérben, mint a kontroll készítmények.

1-3. kísérlet

Az 1., 15., 18. és 19. példák szerint nyert liposzóma készítményeket intravénásán patkányoknak adagoltuk és mértük a 6-CF szintet a májban a liposzóma RES-hez való irányításának vizsgálatára. A kapott eredményeket a következő 1. táblázatban foglaljuk össze. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a liposzóma vérszintje hosszabb időn át megmarad és a májhoz való eljutása csökken.

1. táblázat

Liposzóma szint a májban, 1 órával az adagolás után(%)

Liposzóma készítmény	Anionos felületaktív anyaggal	Anionos felületaktív anyag nélkül
1.példa	16,7	30,1
15.példa	16,9	44,7
18.példa	19,1	44.7
19.példa	15,0	44,7

6-CF-szint meghatározása a vérben és a májban

A caudális vénából levett 0,2 ml heparinizált vérhez 10 ml PBS-t adagoltunk, a kapott szuszpenziót 10 percig 3000 ford?perc mellett centrifugáltuk, a kapott 5 ml felülúszóból 0,05 ml Triton Χ-100-at adtunk és 60-70 °C hőmérsékleten a liposzóma megbontására melegítettük. A liposzóma szintet a vérben a felszabaduló 6-CF fluoreszcein vizsgálatával mértük. A has f elmetszése után a májat eltávolítottuk, kivéreztettük és 0,02%-os PBS-be merítettük. A szövetet homogenizáltuk (Polytron, Kinematica), 60-70 °C-ra felmelegítettük, amikoris a 6-CF felszabadul. A kapott homogenizátumokat ezután ultracentrifugáltuk (50 000 g, 10 perc) 20-50-szeresre hígítottuk és 0,45 mikronos membrán szűrőn szűrtük (Acrodisk, Gelman). A liposzóma szintet a szurletből fluoreszcencia viszgálattal határoztuk meg.

1-4. kísérlet

1000-szeresre hígított (PBS, 3% plazma) 1., 2., 6, példa szerinti, valamint a megfelelő, anionos felületaktív anyagot nem tartalmazó kontroll készítményekből melegítéssel felszabadítottuk a 6-CF-et és folyamatosan mértük programozott hőmérsékletű rendszerekben a 6-CF mennyiségét a hozzácsatlakoztatott fluoreszcencia spektrométerrel, amikor

-6HU 203278Β a liposzóma fázis transzformációja végbement (a gél folyadékkristályos szerkezetté alakul). A termikus felszabadulás kezdeti hőmérsékletét és a fázis átmeneti hőmérsékletet, amelyet a termikus felszabadulás görbéjéből állapítottunk meg, a 2. táblázatban foglaljuk össze. A fázis átmeneti hőmérsékleteket termikus analizáló rendszerrel mértük (Seiko I and E, SSC 5000 tip. 2 °C/perc). A két hőmérsékletérték szorosan összefügg.

2. táblázat

A liposzóma membrán fázis átmeneti hőmérséklete (°C) és a 6-CF liposzómából való felszabadulásának kezdeti hőmérséklete (”C)

Liposzóma készítmény	Fázis átmeneti hőmérséklet	Felszabadulás kezdeti hőmérséklete
1.példa	42,3	36,1
ó.példa	43,7	39,3
lO.példa	42,8	36,3
felületaktív
anyag nélkül 41,9	37,9

27. példa

Az 1. példa szerint járunk el, csaka 6-CF helyett 500 pg cisplatint (CDDP) alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 23,5% CDDP-t tartalmaz, fázis átmeneti hőmérséklet 42,7 °C.

CDDP-tartalom meghatározása liposzómában

0,1 ml liposzómát 5 ml fiziológiás sóoldatban szuszpendálunk, 2,5 ml így kapott szuszpenziót fagyasztva szárítunk, majd melegítjük, a kapott oldatot, amely a megbontott liposzómát tartalmazza Centrisalt-on szűrjük és 0,1 ml szürlethez 2 ml 0,1 n NaOH-ot adunk, amely 10% dietil-ditio-karbamidot (DDTC) tartalmazott és a kapott keveréket szobahőmérsékleten 30 percig tartjuk. A kapott adduktumot 5 ml n-hexánnal extraháljuk és az extraktumot HPLC-vel analizáljuk (Zorbax CN, n-hexán/izopropü-alkohol= 8/2, UV= 250 nm) a CDDT tartalom meghatározására. A visszamaradó fiziológiás liposzóma oldatot (körülbelül 2,5 ml) Centrisalt-on szűrjük és a szabad, nem kötött CDDP mennyiségét a fentiek szerint meghatározzuk.

22. példa

A 2. példában leírtak szerint járunk el, csak 6-CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 21,4% CDDP-t tartalmaz.

23. példa

A 3. példában leírtak szerint járunk el, csak 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban a 6-CF helyett. A liposzóma 25,8% CDDP-t tartalmaz.

24. példa

Az 5. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 24% CDDP-t tartalmaz.

25. példa

A 6. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 21,8% CDDP-t tartalmaz, a fázis átmeneti hőmérséklet 43,9 °C.

26. példa

A 7. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6CF helyettt 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 21,9% CDDP-t tartalmaz.

27. példa

A 8. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 24,9% CDDP-t tartalmaz.

28. példa

A 10. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 23,3% CDDP-t tartalmaz.

29. példa

All. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 27,7% CDDP-t tartalmaz, a fázis átmeneti hőmérséklet 41,9%.

30. példa

A 12. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 24% CDDP-t tartalmaz.

57. példa

A 13. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 24,5% CDDP-t tartalmaz, a fázis átmeneti hőmérséklet 42,5 °C.

32. példa

A 14. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 25% CDDP-t tartalmaz.

33. példa

A 15. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 4,8% CDDP-t tartalmaz.

34. példa

A16. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 5% CDDP-t tartalmaz.

35. példa

A 17. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 5,2% CDDP-t tartalmaz.

36. példa

A 18. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk fiziológiás sóoldatban. A liposzóma 43% CDDP-t tartalmaz.

-7HU 203278Β

37. példa

A 19. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk. A liposzóma 4,9% CDDP-t tartalmaz.

38. példa

A 20. példában leírtak szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 500 pg CDDP-t alkalmazunk. A liposzóma 7% CDDP-t tartalmaz.

2-1 kísérlet

A 21., 28., 29., 33. és 35. példák szerint eljárva kontroll készítményeket állítottunk elő anionos felületaktív anyag nélkül.

2-2. kísérlet

A 6-CF vérszintet és a CDDP-szintet hasonlítottuk össze az 1. példa, illetve a 15. példa szerinti készítmények patkányoknak való intravénás adagolás a után 6 órával és a kapott eredményeket a 4. ábrán ábrázoltuk. Minden időpontban a CDDP szint azonos volt a 6-CF szintjével, mutatva, hogy a CDDP liposzóma készítmény (—.—) azonosan viselkedik a 6-CF liposzóma ksézítménnyel (—x—). A 21., 22., 25., 26. és 29. példák szerinti készítmények ugyancsak a 6-CF liposzóma készítmények magas értékeit mutatják. Ezek az eredmények is bizonyítják, hogy a találmány szerinti eljárással nyert liposzóma készítmények tartózkodási ideje megnövekszik a vérben intravénás adagolás után.

A CDDP szint meghatározása a vérben

A caudális vénából levett 0,2 ml heparinizáltvérhez 2 ml PBS-t adagolunk, majd a kapott szuszpenziót centrifugáljuk és 1 ml felülúszóhoz 1 ml DDTC oldatot adagolunk. A CDDP teljes mennyiségét a vérben az előzőekben leírtakhoz hasonlóan határozzuk meg.

2-3. kísérlet

A fentiekben leírtak szerint meghatározzuk a 21. példa szerinti készítmény SMT tartalmát. Megállapítható, hogy a bemért mennyiség 90%-át tartalmazza a liposzóma. Ez az érték jóval magasabb mint a CDDP 23,5%-os megkötött értéke, mutatva, hogy az SMT valószínűleg a liposzóma membrán alkotója, valamint azt, hogy körülbelül 150 molekula SMT van jelen 1000 molekula foszfolipidre számolva a liposzóma membránban.

SMT tartalom meghatározása mg metilén-kéket, 6 g koncentrált kénsavat és 25 g vízmentes nátriumszulfátot desztillált vízben oldunk úgy, hogy 500 ml oldatot nyerjünk. Ezen oldat 5 ml-éhez hozzáadunk 10 ml 1000-szeresre hígított liposzóma készítményt és 5 ml kloroformot, majd rázással két fázisra választjuk és mérjük a klorofonnos fázis adszorpcióját. Különböző koncentrációjú SMT oldatokkal (kevesebb mint 10 ppm) kalibrációs görbét vettünk fel. Vakpróbaként 2-1. példa szerinti SMT-mentes liposzóma készítményt alkalmaztunk.

39. példa

A 11. példa szerint járunk el, csak a 6-CF helyett

308 g protein/ml koncentrációjú interleukin-2 oldatot (IL-2) (25 mmólos vizes ammónium acetáttal pH= 6-nál előállítva) alkalmaztunk.

40. példa

A13. példa szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 308 g protein/ml IL-2 oldatot alkalmaztunk.

41. példa

All. példa szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 100 pg/ml koncentrációjú vizes ansamitocin oldatot alkalmaztunk.

42. példa

A 13. példa szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 100 pg/ml koncentrációjú vizes ansamitocin oldatot alkalmaztunk.

43. példa

All. példa szerint járunk el, csak a 6-CF helyett pg/ml koncentrációjú metotrexánt alkalmaztunk fiziológiás sóoldatban.

44. példa

A 13. példa szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 5 pg/ml koncentrációjú metotrexánt alkalmaztunk fiziológiás sóoldatban.

45. példa

All. példa szerint járunk el, csak a 6-CF helyett

200 pg/ml koncentrációjú mitomicin C-t alkalmaztunk fiziológiás sóoldatban.

46. példa

A 13. példa szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 200 pg/ml koncentrációjú mitomicin C-t alkalmaztunk fiziológiás sóoldatban.

47. példa

All. példa szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 1 mg/ml koncentrációjú adriamicin-t alkalmaztunk fiziológiás sóoldatban.

48. példa

All. példa szerint járunk el, csak a 6-CF helyett mg/ml koncentrációjú adriamicin-t alkalmaztunk fiziológiás sóoldatban.

49. példa

All. példa szerint járunk el, csak a 6-CF helyett mg/ml koncentrációjú bleomicint alkalmaztunk fiziológiás sóoldatban.

50. példa

All. példa szerint járunk el, csak a 6-CF helyett 3 mg/ml koncentrációjú bleomicint alkalmaztunk fiziológiás sóoldatban.

Claims

60 SZABADALMIIGÉNYPONTOK

1. Eljárás gyógyászati hatóanyagot — amely oktanol és víz közötti megoszlási koefficiensének logaritmusa 10 vagy ennél kisebb—valamint foszfolipi65 deket tartalmazó liposzóma készítmény előállításá-8HU 203278Β ra, azzal jellemezve, hogy

1. a kritikus micella koncentráció feletti koncentrációban anionos felületaktív anyagot — amelynek Kraff t pontja 37 ’C vagy a fölötti érték — vízzel elkeverünk,
2. a kapott vizes közeghez telített acilcsoportokat tartalmazó foszfolipideket adagolunk, az anionos felületaktív anyagot 0,5-50 tömegrész mennyiségben alkalmazzák 100 tömegrész foszfolipidre számolva és a hatóanyagot vagy az 1) vagy a 2) lépésnél adagoljuk, majd
3. a kapott szuszpenziót vagy emulziót ismert módon liposzóma készítménnyé alakítjuk, amelynek liposzóma membránja a felületaktív anyagot és a foszfolipidet is magában foglalja.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy anionos felületaktív anyagként

R -X_m - (Y1 vagy Y2)n - Z amely képletben

R jelentése 12 vagy több szénatomot tartalmazó, adott esetben szulfátcsoporttal szubsztituált alkilcsoport,

X jelentése -CONH-, -COO-, -CQN-vagy CH5

1,4-fenilén-csoport;

Yi jelentése-CH2CH2-.-CHCH2CH3

-CH2CHCH3 vagy -CH2CH2CH2-csoport;

Y2 jelentése -OCH2CH7--. -DCHCH?-.

-OCH2CHCH3 vagy OCH2CH2CH2-csoport

Z jelentése -SO3-M⁺ vagy -SO4-M⁺ képletű csoport, ahol M jelentése alkálifém ion;

m jelentése 0 vagy 1; n jelentése 0,1 vagy 2, feltéve, hogy ha X jelentése -CONH- vagy COLL-csoport,

CH3

Y2 helyén vegyértékkötés van, és ha X jelentése 1,4-fenilén-csoport, n értéke 0.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy anionos felületaktív anyagként acil-taurinok vagy acil-metil-taurinok sóit alkalmazzuk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként tumor-ellenes szert vagy lymphokint alkalmazunk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként platina-vegyületet alkalmazunk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 40-55 ’C fázisátmeneti hőmérsékletű membránú liposzóma készítménybe tumor-ellenes szert foglalunk be.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a liposzóma készítményt a RÉV, MLV, SUV vagy SPLV előállításához ismert módszerek szerint alakítjuk ki.