HU199691B - Process for producing phosphatidyl-inozit from biological materials - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás lipidek előállítására, különösen foszfatidil-inozit előállítására, biológiai forrásból.

A foszfatidil-inozit a foszfolipidek körébe tartozik, és biokémiai reagensként kerül felhasználásra olyan membránrendszerek előállításánál, amelyek az élő szervezet folyamatait modellezik; olyan liposzómák képzésére, amelyek fajidegen genetikai információknak az élő szervezet sejtjeibe való bevitelére szolgálnak; fajidegen fehérjéknek, vakcináknak és enzimeknek a szervezet membránhatárain való átvitelére; valamint gyógyszereknek és más hatóanyagoknak a célszervekbe való szállítására.

Számos, különféle biológiai forrásokból, például állatok agyából és szívéből, baktériumokból vagy magvakból kiinduló eljárás ismeretes foszfatidil-inozit előállítására. Ismeretes egy olyan eljárás is, amelynél foszfatidil-inozitot élesztőből állítanak elő („Preparativnaja khimija lipidov pod redukciejj Bergelsona L.D. i. Djatlovickojj E.V., 1981, Nauka (Moszkva), 178. old.’’, (A lipidek preparatív kémiája, szerkesztő: Bergelson, L.D. és Djatlovickaja E.V., Nauka (Moszkva), 1981.).

A foszfatidil-inozitnak élesztőből való előállítása a következő műveletekből áll. Az élesztő toluolban 5 óra alatt autolizálják, az autolizátumból a foszfolipideket kloroform és metanol 1:1 arányú elegyével 7 órán belül extrahálják, az extraktumot'szűrik, a csapadékot az előzőekben megnevezett oldószereleggyel a szűrőn mossák, a szürletet desztillált vízzel elegyítik 20 órán belül, a szűrletet vizes és kloroformos fázisra választják szét, a kloroformos fázist bepárolják, a bepárolt kloroformos fázist izopropil-alkohollal kezelik, majd üvegszűrőn szűrik. A továbbiakban a szűrletben lévő foszfolipideket szilikagél oszlopra viszik, az oszlopot először 5—7 liter 80:20:2 arányú kloroform:metanol:ammónia eleggyel, majd 1—2 liter etil-alkohollal mossák, majd az így kapott foszfatidil-inozit-ammóniumsót nátrium sóvá alakítják.

Az ismertetett eljárás elvégzéséhez igen nagy mennyiségű, költséges szerves oldószer szükséges. így 1 g foszfatidil-inozit előállításához több mint 5 liter kloroform, több mint 3 liter metanol, mintegy 1 liter etil-alkohol és egyéb oldószerek szükségesek. Az eljárás több munkaigényes műveletből áll, amelyek igen időigényesek is. Mindez jelentősen megnöveli a végtermékre jutó költségeket (a Calbiochem 1986-os katalógusa szerint 1 g foszfatidil-inozit ára 6950 dollár). A nagy mennyiségű oldószerekkel végzett munka kedvezőtlen munkakörülményeket teremt, ami megnehezíti, hogy a dolgozóknak megfelelő körülményeket teremtsenek.

A találmány célja olyan eljárás kidolgozása foszfatidil-inozit előállítására, amellyel lehetővé válik a szerves oldószer felhasználás jelentős csökkentése, a munka- és időigény csökkentése, a munkakörülmények javítása, és a termék árának jelentős csökkentése. 2

A célul kitűzött feladatot olyan eljárással valósítjuk meg, amelyben a foszfatidil· -inozit előállítására egy biológiai anyago* alkalmazunk, azt homogenizáljuk, és extraháljuk. A találmány szerint a biológiai anyag homogenizálását 0,005—1 mól/literes vizes sóoldattal végezzük, pH=5,0 és 11,0 között. A kapott .homogenizátumot sejtmentes vizes sóoldat-fázisra és csapadékra választjuk szét. A sejtmentes vizes sóoldat-fázis tartalmazza a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket, míg a csapadékban találhatók az egyéb foszfolipideket tartalmazó szét nem tört sejtek és részecskék. A csapadéknak a vizes fázistól való elválasztását 3000—30000 g közötti nehézségi gyorsulás mellett végzett centrifugálással, illetve 3—50 pm pórusátmérőjű szűrön való szűréssel végezzük. Ezután a sejtmentes vizes sóoldat-fázisból elválasztjuk a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket, majd az elkülönített fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskékből extraháljuk a foszfatidil-inozitot. A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéknek a sejtmentes vizes sóoldat-fázisból való elválasztását végezhetjük gélkromatográfiás eljárással olyan szorbensen, amely képes az 1 000 000 dalion feletti molekulatömegű anyagok elválasztására, vagy alkalmazhatunk ultraszűrést olyan szűrő alkalmazásával, amelynek pórusátmérői legalább 0,2 pm-esek. Megvalósíthatjuk a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex-részecskéknek az említett vizes sóoldat-fázisból való elkülönítését továbbá az oldatnak lúgos vagy neutrális proteázokkal való kezelésével, amely eljárásnál a megnevezett részecskék összetapadnak és könnyen elválaszthatóvá válnak. A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék elkülönítésének ezeket a változatait azért választottuk, mert egyszerűen megvalósíthatók, és niert az említett reagensek — proteázok — hozzáférhetőek és viszonylag olcsóak.

Az elkülönített fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskékből a végterméket metanolos extrahálással, illetve metanol és kloroform elegyével végzett extrahálással vagy metanol és desztillált víz elegyével végzett extrahálással különítjük el. Biológiai anyagként célszerű a fűfélék magvainak feldolgozási termékét alkalmazni, mivel ez a nyersanyag különösen jól hozzáférhető és olcsó, továbbá a végtermék jó hozammal nyerhető belőle.

A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy a szerves oldószer felhasználást mintegy századrészére csökkentsük, az eljárás időszükségletét felére, negyedére rövidítsük, a «termék költségeit jelentősen csökkentsük és a munkakörülményeket javítjuk.

Az eljárás könnyen megvalósítható nagyüzemi méretekben.

A találmány szerinti eljárás előzőekben említett előnyeit a foszfatidil-inozit előállítását bemutató példák leírásánál mutatjuk be.

-2HU 199691 Β

Biológiai anyagként alkalmazhatunk növényi magvakat, ezek feldolgozási termékeit, gyökereket, leveleket, szárakat, valamint állati szerveket és mikroorganizmusokat, előnyösen azonban fűfélék magvait és ezek feldolgozási termékeit alkalmazzuk, például korpát alkalmazunk. Az említett biológiai anyagok előnyös volta arra vezethető vissza, hogy ezek a nyersanyagok könnyen hozzáférhetőek és olcsóak, egyidejűleg lehetővé teszik, hogy a foszfatidil-inozitot magas hozammal nyerjük ki belőlük.

A biológiai anyagot mozsárban való szétdörzsöléssel, homogenizátorban vagy más alkalmas berendezés alkalmazásával homogenizáljuk. A találmány szerint a biológiai anyag homogenizálását 0,005—1 mól/liter koncentrációjú vizes sóoldatban végezzük. A sóoldatnak ezt a koncentrációtartományát az indokolja, hogy a 0,005 mól/liter alatti sókoncentráció nem kívánatos, mivel a fehérje-foszfatidil-inozit-komplexet oldja, ezáltal a termék előállítását megnehezíti. A sóoldat koncentrációjának felső határa, az 1 mól/liter érték felett a sónak szobahőmérsékleten való oldhatósági határáig alkalmazható a sóoldat. Nem célszerű azonban az 1 mól/liter feletti koncentrációjú sóoldat alkalmazása, mivel az ilyen sóoldat nem növeli a hozamot, nehezebbé teszi az oldat előállítását és felesleges reagens-felhasználással jár. Az előzőekben megadott tartományon belül az optimális sóoldat-koncentráció a 0,050,1 mól/liter.

A vizes sóoldat elkészítéséhez tetszés szerinti szerves vagy szervetlen só használható azokon a sókon kívül, amelyek kaotróp tulajdonságokkal bírnak, és amelyek képesek a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex bontására. Különösen célszerűn alkalmazhatjuk a semleges, illetve gyengén lúgos tulajdonságokkal bíró sókat, például a nátrium-kloridot, a foszforsav nátrium-, illetve káliumsóit, valamint a trihidroxi-amino-metán-klorid-, foszfát- vagy szulfátsóit.

A biológiai anyagok homogenizálását a találmány szerint egy 5—11 pH-jú vizes sóoldatban végezzük. A vizes sóoldatnak ezt a pH-tartományát az határozza meg, hogy 5 alatti és 11 fölötti pH-értéknél a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék szétbomlanak, ami nem megengedhető.

Az említett anyagoknak az említett vizes sóoldatokban való homogenizálása során a biológiai anyag szétbomlása következik be, miközben a fehérje-foszfati dil-inozit-komplex részecskék kiválnak, és a vizes sóoldat-fázisba jutnak. A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéknek a szét nem roncsolt sejtektől és részecskéktől való elválasztására, amely utóbbiak egyéb foszfolipideket tartalmaznak, a homogenizátumot a találmány szerint centrifugálással vagy szűréssel szétválasztjuk. A homogenizátum centrifugálását 3000 és 30000 g közötti nehézségi gyorsulás mellett végezzük. A nehézségi gyorsulás ha4 tárértékeit az szabja meg, hogy 300.0 g érték alatt azok a részecskék, amelyek más foszfolipideket tartalmaznak, nem ülepednek le, hanem a vizes sóoldat-fázisban maradnak, ami a foszfatidil-inozit-terméknek egyéb foszfolipidekkel való szennyeződéséhez vezet.

A 30 000 g érték felett már a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék is ülepednek, ami lényegesen csökkenti a termék hozamát. A nehézségi gyorsulás optimális tartománya a 8000 és 10 000 g közötti érték.

A homogenizátum elválasztását végezhetjük szűréssel is, olyan szűrőn, amely 3— 5 pm-es pórusátmérővel bír. A homogenizátumnak 3 μπι-nél kisebb pórusátmérőjü szűrőn való szűrése nem célszerű, mivel ilyen esetben a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék is a szűrőn maradnak, miáltal a végtermék hozama csökken. Ugyancsak nem kívánatos az 50 μιη pórusátmérőnél nagyobb pórusátmérőjű szűrő alkalmazása, mert ezen a vizes sóoldat-fázisba olyan részecskék is bejutnak, amelyek egyéb foszfolipideket tartalmaznak, ezáltal a végtermék minősége lényegesen romlik.

A homogenizátumot a fenti eljárások valamelyikével elválasztva sejtmentes vizes sóoldat-fázist nyerünk, amely a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket tartalmazza, valamint egy csapadékot nyerünk, amely más foszfolipideket tartalmaz, ezt a csapadékot eltávolítjuk.

A sejtmentes vizes sóoldat-fázisból a fehérje-foszfatidil-inozit részecskéket gélkromatográfiás eljárással különíthetjük el olyan szorbens alkalmazásával, amely lehetővé teszi az 1 000 000 dalion feletti molekulatömegű anyagok elválasztását. Az olyan szorbensek, amelyek az 1 000 000 dalton alatti molekulatömegű anyagokat elválasztják, nem alkalmasak, mert nem teszik lehetővé a fehérje-foszfatidil-inozit-kompiex elkülönítését. Legjobb szorbensnek tartjuk a „Sepharose”, a „Sephakryl géleket (Pharmacia, Svédország), az „Ultragel'’-t (LKB, Svédország), a „Biogel A-t (Biorad, Amerikai Egyesült Államok), illetve a „Toyapearl-t (Toya-soda, Japán).

A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéknek a sejtmentes vizes sóoldat-fázisból való elkülönítését végezhetjük ultraszűréssel is legfeljebb 0,2 pm pórusátmérőjü szűrőn. A 0,2 pm feletti pórusátmérőjű szűrők alkalmazása nem kívánatos, mert a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék a szűrletbe átmennek, miáltal a végtermék hozama csökken.

A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéknek a vizes sóoldat-fázisból való elkülönítését végezhetjük ultracentriíugáiá? sál való kiülepítéssel is 30 000 és 100 000 g közötti értéken. Ezt a tartományt az szabja meg, hogy 30 000 g alatt a fehérje-foszía·:dil-inozit-komplex részecskék kiülepedése nem tökéletes, míg a 100 000 g fölötti értéknél

-3HU 199691 Β nem célszerű végezni az ultraszűrést, mivel a termék hozama nem nő, viszont felesleges elektromos-energia-felhasználás válik szükségessé.

A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéknek a vizes sóoldat-fázisból való elválasztására még egy további változat is lehetséges; a vizes sóoldat-fázisnak lúgos vagy semleges proteázokkal való kezelése. Az említett proteázok jelenlétében a nevezett részecskékről a fehérje nagy része eltávolítható, ezáltal a részecskék egymással összetapadnak és papíron vagy üvegszűrőn könynyen szűrhetővé válnak, így könnyen elkülöníthetők vagy centrifugálással alacsony, 500—1000 g nehézségi gyorsulás értékek mellett elválaszthatók. Ennél a változatnál a proteázokat 5—100 pg mennyiségben alkalmazzuk 1 ml vizes sóoldat-fázisra. Az említett tartományt az szabja meg, hogy az 5 pg/ml alatti proteázmennyiség nem elégséges a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék teljes elkülönítéséhez, míg a 100 pg/ml érték azért nem célszerű, mert nem hoz többlethatást, de felesleges reagens felhasználást jelent.

A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék elválasztása az említett proteázokkal előnyös az egyéb eljárásváltozatokhoz képest. Ez az előny arra vezethető vissza, hogy a lúgos, illetve neutrális proteázok jelenlétében a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék összetapadása következik be, amelyek már papír- vagy üvegszürőn könnyen és egyszerűen elkülöníthetők. A proteázok viszonylag olcsóak és hozzáférhetőek.

Ezt követően az elkülönített fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket dietil-éterrel vagy acetonnal vagy egyéb hasonló szerves oldószerrel kezeljük, hogy eltávolítsuk belőle a lipid szennyeződéseket. Ezután a terméket metanollal, metanol és kloroform elegyével vagy desztillált vízzel extraháljuk. A foszfatidil-inozit a biológiai kiindulási anyagban lévő mennyiségre vonatkoztatva 90%-os hozammal nyerhető ki ezzel az eljárással.

Amint az a későbbiekben ismertetendő részletes leírásból kitűnik, a találmány szerinti eljárás technológiai kivitelezése egyszerű, az eljárás nem igényel nagy oldószermenynyiséget, javítja a munkakörülményeket, a szükséges időtartamot körülbelül felére-negyedére csökkenti és jelentősen csökkenti a termék költségeit.

A következőkben részletesen ismertetjük a találmány szerinti eljárás legjobb megvalósítási módját.

Biológiai anyagként gabonakorpát, például búzakorpát alkalmazunk. A korpa homogenizálását pH=8,3—8,5-ös, 0,05—0,1 mól/literes trisz-hidroxi-amino-metán-klorid oldattal való eldőrzsöléssel végezzük, miközben a korpaszemcsék szétroncsolódnak, és a fe4 fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék a; vizes sóoldat-fázisba jutnak. A kapott homogenizátumot lO 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig végzett homogenizálással szétválasztjuk. A centrifugálás során a sejtmentes vizes sóoldat-fázisba kerülnek a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék, és így elkülönülnek az egyéb foszfolipideket tartalmazó szétroncsolatlan sejtektől és részecskéktől. A kapott sejtmentes vizes sóoldat-fázisból a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket l ml sóoldat-fázisra számított 0,05 mg (50 pg) lúgos- vagy semleges-proteázzal végzett kezeléssel különítjük el. A kezelés során a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék összetapadnak és 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett végzett centrifugálásnál a fázisból kiválnak. A kivált fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecske csapadékot dietil-éterrel kezelve eltávolítjuk belőle a szennyeződésként jelenlévő lipideket. A tisztított fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecske csapadékot metanollal extraháljuk. A hozam mintegy 93%-os a kiindulási anyagként szolgáló búzakorpában való elfordulásra vonatkoztatva.

A továbbiakban a jobb megértés kedvéért a találmányt példákkal világítjuk meg.

1. Példa g kukoricalisztet pH=9,0-es, 0,05 mól/liter vizes dinátrium-hidrogén-foszfátban porcelánmorzsában homogén állapotig dörzsöljük. A sejtmentes vizes sóoldat-fázis elkülönítésére a homogenizátumot 5 pm-es pórusátmérőjű szűrőn szűrjük. A sejtmentes vizes sóoldat-fázist gélkromatográfiás eljárással Sepharose 4B-töltetü oszlopon engedjük át, a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecske tartalmú frakciókat összegyűjtjük, és vákuumbepárlón szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot 50 ml acetonnal kezeljük a lipidszennyezések eltávolítása céljából. A kapott terméket kétszer desztillált vízzel extránál juk. Ily módon 8,9%-os hozammal 0,09 g terméket nyerünk.

2. Példa g borsószemet malomban megőrlünk, majd az Őrölt anyagot késes homogenizátorban pH=ll,0 értékű, 0,1 mól/literes nátrium-karbonát-oldattal homogenizáljuk. A homogenizátumot 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig centrifugáljuk. A kapott sejtmentes vizes sóoldat-fázist 30 000 g nehézségi gyorsulás mellett végzett centrifugálással kiülepítjük. A csapadékot 50 ml dietil-éterrel átmossuk, a mosott anyagot 5 ml metanollal extraháljuk. így 65%-os hozammal 0,02 g terméket nyerünk.

3. Példa g makkot malomban megőrlünk. A kapott lisztet pH=5 értékű, 0,1 mól/literes nátrium-acetáttal eldörzsöljük. A kapott homogenizátumot 10 000 g nehézségi gyorsu-4HU 199691 Β lás mellett 10 percig centrifugáljuk. A kapott sejtmentes vizes sóoldat-fázist gélkromatográfiás eljárással kezeljük, Toyapearl H W 65 szorbensen választjuk el. A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és vákuumbepárlóban bepároljuk. A visszamaradó anyagot 50 ml dietil-éterrel kezeljük a lipidszenynyeződések eltávolítására. A terméket 5 ml metanollal extraháljuk, fgy 20%-os hozammal 0,01 g terméket nyerünk.

4. Példa g árpakorpát pH=7,0-es, 0,005 mól/literes, vizes kálium-klorid-oldattal eldörzsöljük. A kapott homogenizátumot 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig centrifugáljuk. A sejtmentes vizes sóoldat-fázist az oldat 1 ml-ére számított 50 pm papainnal kezeljük 4 órán át. Az összetapadt fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett végzett centrifugálással 10 perc alatt kiülepítjük. A csapadékot a lipidszennyezések eltávolítására 50 ml dietil-éterrel öblítjük át, majd a mosott csapadékot 5 ml 2:1 arányú metanol kloroform eleggyel extraháljuk. Ily módon 50%-os hozammal 0,05 g terméket nyerünk.

5. Példa g rízsszemet megőrlünk, majd pH=7-es, 0,05 mól/literes, vizes nátrium-klorid-oldattal homogenizáljuk. A kapott homogenizátumot 3000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig centrifugáljuk. A kapott sejtmentes vizes sóoldat-fázist elkülönítjük és az oldat 1 ml-ére számított 50 pg tripszinnel kezeljük. Az összetapadt fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket papírszűrőn kiszűrjük. A szűrőn lévő csapadékot 50 ml petroléterrel öblítjük a lipidszennyeződések eltávolítására. A csapadékot ezután 5 ml metanollal extraháljuk. így 90%-os hozammal 0,7 g terméket nyerünk.

6. Példa g rízsmagkorpát 0,05 mól/literes vizes trisz-hidroxi-amino-metán-foszfát-oldattal porcelánmozsárban homogenizáljuk. A kapott homogenizátumot 30 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig centrifugáljuk. A sejtmentes vizes sóoldat-fázist az oldat minden ml-ére számítva 50 pg kimotripszinnel kezeljük 8 órán át. Az összetapadt fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig végzett centrifugálással kiülepítjük. A csapadékot 50 ml dietil-éterrel keverjük a lipidszennyeződések eltávolítására. A csapadékot ezután 5 ml metanollal extraháljuk. így 18%-os hozammal 0,02 g terméket nyerünk.

7. Példa g búzakorpát pH=8,5-ös, 0,1 mól/literes vizes trisz-hidroxi-amino-metán-szulfáttal 10 percig homogenizálunk. A kapott homo8 genizátumot 50 pm póriisátmérőjű szűrőn átszűrjük. Az elkülönített sejtmentes vizes sóoldat-fázist az oldat 1 ml-ére számított 50 pg papainnal kezeljük 4 órán át. Az összetapadt fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig végzett centrifugálással kiülepítjük.

A kapott csapadékot 20 ml dietil-éterrel mossuk a lipidszennyeződések eltávolítására. A csapadékot ezután 2 ml metanollal extraháljuk. így 85%-os hozammal 0,07 g terméket nyerünk.

8. Példa g búzakorpát pH=8,5-ös, 0,05 mól/literes, vizes trisz-hidroxi-amino-metán-triklorid-oídattal eldörzsölünk. A kapott homogenizátumot 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig centrifugáljuk. A kapott sejtmentes vizes sóoldat-fázist az oldat 1 ml-ére számított 50 pg papainnal kezeljük 8 órán át. Az összetapadt fehérjefoszfatidil-inozit-komplex részecskéket 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig végzett centrifugálással ülepítjük ki. A csapadékot 50 ml dietil-éterrel mossuk a lipidszennyeződések eltávolítására, majd 5 ml metanollal extraháljuk. így 95%-os hozammal 0,11 g terméket nyerünk.

Θ. Példa g búzakorpát pH=7-es, 0,05 mól/literes, vizes nátrium-klorid-oldatban homogenizáljuk homogenizátorban. A kapott homogenizátumot 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig centrifugáljuk. Az így nyert sejtmentes vizes sóoldat-fázist 0,2 pm pórusátmérőjű ultraszűrőn engedjük át. A csapadékot a szűrőről eltávolítjuk és 50 ml dietil-éterrel mossuk a lipidszennyeződések eltávolítására. Ezután a csapadékot 2 ml metanollal extraháljuk. így 63%-os hozammal 0,06 g terméket nyerünk.

Az ismertetett találmány a kémiai iparban, a biotechnológiában és a gyógyászatban realizálható.

Az 1—9 példák termékét vékonyrétegkromatográfiás eljárással szilikagél lemezen vizsgáljuk. Az alábbi, foszfolipidek elválasztására alkalmas oldószerrendszereket alkalmazzuk:

1) kloroform, metanol és 7 n ammónia 35:60:5 térfogatarányú elegye és

2) kloroform, metanol, ecetsav és víz 50:25:8:

:4 térfogatarányú elegye.

Mindkét oldószerrendszerben minden termék vizsgálatakor egyetlen foszfolipid-folt észlelhető, amely a foszfatidil-inozitnak felel meg.

Az 1) oldószerrendszerben a foszfatidil-inozit R/ értéke 0,31, a 2) oldószerrendszerben 0,71.

Claims (6)

1. Eljárás foszfatidil-inozitnak biológiai anyagokból való előállítására a biológiai anyag homogenizálásával és a termék extrahálásával, azzal jellemezve, hogy a biológiai anyagot 5,0 és 11,0 közötti pH-értékíí 0,005—1 mól/liter koncentrációjú vizes sóoldattal homogenizáljuk, a homogenizátumot a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket tartalmazó vizes sóoldat-fázisra és az egyéb foszfolipideket tartalmazó szét nem roncsolt sejteket és részecskéket magában foglaló csapadékra választjuk szét 3000 és 30 000 g közötti nehézségi gyorsuláson végzett centrifugálással vagy 3—50 pm pórusátmérőjű szűrőn való szűréssel;

a sejtmentes vizes sóoldat-fázisbói a fehér je-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket elkülönítjük;

— az elkülönített fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskékből a foszfatidil-inozitot extraháljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biológiai anyagot 0,05— 0,1 mól/literes vizes sóoldattal homogenizáljuk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéknek a sejtmentes vizes sóoldat-fázisbói való elválasztását gélkroma5 tográfiásan végezzük 1 000 000 dalton fölötti molekulatömegű anyagok elválasztására alkalmas szorbensen.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérje-foszfatidil-inozit¹⁰ -komplex részecskék elválasztását a sejtmentes vizes sóoldat-fázisbói legfeljebb 0,2 pm pórusátmérőjű szűrőn végzett ultraszűréssel végezzük.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal

15 jellemezve, hogy a fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskék elválasztását a sejtmentes vizes sóoldat-fázisbói lúgos, illetve semleges proteázokkal végezzük.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal

20 jellemezve, hogy az elkülönített fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskékből a foszfatidil-inozitot metanollal vagy metanol és kloroform elegyével vagy desztillált vízzel extrah'áljuk.

25 7. Az 1—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként fűfélék magfeldolgozásának termékét alkalmazzuk.