FR3065883A1

FR3065883A1 - Nouveaux complexes d’ions metalliques pour la cristallisation de macromolecules biologiques et la determination de leur structure cristallographique

Info

Publication number: FR3065883A1
Application number: FR1770467A
Authority: FR
Inventors: Christian Chapelle; Olivier Maury; Francois Riobe; Eric Girard; Sylvain ENGILBERGE
Original assignee: Polyvalan Sas
Current assignee: Polyvalan Sas
Priority date: 2017-05-06
Filing date: 2017-05-06
Publication date: 2018-11-09
Also published as: WO2018215178A2; WO2018215178A3

Abstract

L'invention concerne des nouveaux complexes ligand / ion métallique neutres ou cationiques formés d'un ion métallique choisi parmi les métaux de transitions ou de post transition, à l'exception des ions lanthanides Ln3+, et d'un ligand répondant à l'une des formules suivantes : avec n, R2, R4, R1 et R1', tels que définis en revendication 1, et leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel complexe en tant qu'aide à la cristallisation d'une macromolécule biologique ainsi que les cristaux dérivés d'une macromolécule biologique comprenant un tel complexe.

Description

Titulaire(s) :

POLYVALAN SAS.

O Demande(s) d’extension :

® Mandataire(s) : POLYVALAN SAS.

*54) NOUVEAUX COMPLEXES D'IONS METALLIQUES POUR LA CRISTALLISATION DE MACROMOLECULES BIOLOGIQUES ET LA DETERMINATION DE LEUR STRUCTURE CRISTALLOGRAPHIQUE.

(57) L'invention concerne des nouveaux complexes ligand / ion métallique neutres ou cationiques formés d'un ion métallique choisi parmi les métaux de transitions ou de post transition, à l'exception des ions lanthanides Ln³⁺, et d'un ligand répondant à l'une des formules suivantes:

pour objet l'utilisation d'un tel complexe en tant qu'aide à la cristallisation d'une macromolécule biologique ainsi que les cristaux dérivés d'une macromolécule biologique comprenant un tel complexe.

FR 3 065 883 - A1

avec n, R₂, R₄, Rj et R_r, tels que définis en revendication 1, et leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates. L'invention a également

La présente invention concerne les domaines techniques de la cristallisation et de la cristallographie des protéines, aussi appelé MX pour macromolecular crystallography. Plus précisément, l'invention concerne de nouveaux complexes ligand / ion métallique qui peuvent être utilisés en tant qu'agent d'aide à la cristallisation des protéines et/ou comme agent phasant pour la détermination de leur structure cristalline. L'invention a également pour objet leur utilisation dans ces domaines et les procédés de cristallisation et de détermination de données structurales qui les mettent en œuvre.

Les protéines sont des « nanomachines » à l'origine de tous les processus biologiques complexes (réactions enzymatique, transport de métabolite, production d'énergie, transmission de signaux). La fonction spécifique de chaque protéine est directement liée à sa structure tridimensionnelle. Ainsi, la biologie structurale s'intéresse à déterminer les structures de macromolécules biologiques et l'organisation de leur assemblage spatial afin de comprendre leur fonctionnement. Elle a des applications importantes dans le domaine de la biochimie et de l'enzymologie, pour la compréhension des mécanismes catalytiques et la reconnaissance spécifique de substrats. Elle présente donc une valeur formidable pour le développement des biotechnologies :

(a) En santé et en agriculture : connaissant la structure 3D d'une protéine, on peut par exemple modéliser sur-mesure des principes actifs capables d'interagir spécifiquement avec cette dernière (enzyme, récepteur) afin de modifier son fonctionnement. De nombreux médicaments ont été conçus grâce à de telles recherches.

(b) En génie génétique des protéines : l'observation des changements de structure obtenus suite à des mutations génétiques permet pas à pas d'optimiser les structures protéiques pour améliorer les procédés biologiques industriels exploitant ces outils tels que, par exemple, les réactions enzymatiques.

La cristallographie est la principale technique utilisée par la biologie structurale. Avec cette méthode, la détermination de la structure des protéines est basée sur l'étude de la diffraction des rayons X par leurs cristaux. Par conséquent, l'obtention de cristaux de protéines est le prérequis obligatoire pour ce type d'études. Dans ce domaine, plusieurs difficultés successives doivent être surmontées. La première difficulté relève du domaine de la biologie et concerne la préparation et la purification de protéines d'intérêt. La seconde difficulté concerne l'étape de cristallisation. Des développements méthodologiques et instrumentaux ont été mis en place afin de les lever.

En particulier, on peut citer :

- L'automatisation de la cristallisation permettant un criblage de plusieurs centaines de conditions physico-chimiques, telle que la plateforme HTX à Grenoble,

- Les sources de rayonnement synchrotron permettant d'utiliser des échantillons de petites tailles (5 à 10 microns) tel que l'European Synchrotron Radiation Facility (ESRF),

- Et plus récemment, la mise en service des sources laser à électrons libres (XFEL, projet européen à Hambourg) qui permet d'utiliser des cristaux de taille encore plus faible (inférieure au micron).

Pourtant ces développements ne suffisent pas puisqu'une analyse des statistiques des consortium de génomique structurale montre que ces deux verrous restent prédominants et seules 10 % des protéines purifiées verront finalement leur structure déterminée par MX. Cela illustre le potentiel sous-jacent de la MX, qui est déjà une méthode de choix, en particulier si le verrou majeur, la production de cristaux de protéines, est levé.

Un cristal d'une protéine, et plus généralement d'une macromolécule biologique, est constitué d'un empilement régulier et périodique des molécules qui le composent. L'empilement est maintenu par des contacts au sein du cristal (liaisons hydrogène, ponts salins, contacts hydrophobes). Les processus de cristallisation des macromolécules biologiques sont encore loin d'être compris. Les approches actuelles sont basées sur une approche empirique, de type essais/erreurs afin de déterminer les conditions favorables essentielles à une cristallisation efficace : température, pH, concentration en protéines, agents précipitant, etc.... Une des notions importantes à considérer dans la cristallogenèse, le processus de formation d'un cristal, est la notion de solubilité. En solution, une macromolécule est entourée d'une couche de solvatation qui présente un effet répulsif et isolant et permet d'éviter l'autoagrégation et la précipitation. La cristallisation va contre cet effet, puisqu'il s'agit de s'éloigner des conditions de solubilité de la macromolécule biologique par l'ajout d'un agent précipitant, également nommé agent cristallisant. Au stade de la nucléation, des molécules de protéines commencent à former des agrégats. Ces agrégats peuvent se re-dissoudre, mais, une fois qu'ils atteignent une certaine taille, ils forment des noyaux stables. Une fois que des noyaux stables ont été obtenus, une croissance spontanée des cristaux peut se produire. Le principe général de la cristallisation repose sur le diagramme présenté en Figure 1 qui correspond au schéma réalisé par Mirjam Leunissen et figurant sur httD://DeoDle.ds.cam.ac.uk/ml527/Dublications/assets/_____________________leunissenliteratureresearch.pdf· Les deux étapes principales qui surviennent dans le processus de cristallisation sont : la nucléation et la croissance cristalline.

Concentration en proteine Supei saturation

Précipitation r Zone de nucléation

Courbe de solubilité ' Zone metastable

Concentration en précipitant

FIGURE 1 : Diagramme de phase illustrant le processus de cristallisation (Extrait de httD://DeoDle.ds.cam.ac.uk/ml527/Dublications/assets/leunissenliteratureresearch.pdf)

Le but lors d'une cristallisation est de jouer sur les concentrations en macromolécule biologique et en agent cristallisant pour parvenir à atteindre la zone de nucléation représentée sur le diagramme de la Figure 1. Lorsque cette zone est atteinte, il peut se former des nucleii (points de nucléation). Ces nucleii sont des agrégats plus ou moins organisés d'une centaine de macromolécules. La formation de ces départs « cristallins » fait diminuer la concentration en macromolécule soluble. C'est le commencement de la croissance cristalline. D'autres macromolécules viennent s'agencer sur ce nucleii et forment des micro-cristaux qui vont grandir avec le temps.

Dans le cadre de la présente description, « agent précipitant » et « agent cristallisant » sont utilisés indifféremment. On entend par agent cristallisant/précipitant, une molécule ou un mélange de molécules aidant à la formation d'un cristal de macromolécules biologiques, dans certaines conditions. L'agent cristallisant induit une modification de la solubilité et donc de la position sur le diagramme en fonction du temps. Il existe trois grandes classes majeures d'agents cristallisants :

- Les sels (NaCI, tartrate de sodium ou de potassium etc...)

- Les solvants organiques (éthanol, dioxane, MPD pour méthylpentanediol etc...)

- Les polymères (PEG (Poly-Ethylène Glycol) de poids moléculaires allant jusqu'à 20000 g/mol, Jeffamine T etc...)

Ces agents ont pour effet - d'entrer en compétition avec la macromolécule biologique pour l'eau, ou plus généralement le solvant dans lequel la macromolécule est initialement en solution, et ainsi diminuer la solubilité de la macromolécule, induisant sa cristallisation, - d'écranter des charges à la surface de la macromolécule permettant le rapprochement de plusieurs macromolécules, - de modifier la constante diélectrique du solvant et par conséquent les forces entre macromolécules, et/ou - de favoriser des phénomènes de type volume exclu (exclusion hydrophobe).

Les expériences de cristallisation sont préparées par des robots permettant un criblage de différentes conditions de cristallisations commercialement disponibles (kits de la société Molecular Dimensions, par exemple) en parallèle et la phase de cristallisation est suivie régulièrement par des robots microscopes.

Cette approche à haut débit a fait passer au second plan la recherche de méthodologies alternatives permettant de favoriser la cristallisation et consistant à trouver des agents qui favorisent la cristallisation sans dénaturer la protéine. Une de ces méthodes consiste à essayer de contrôler l'étape de nucléation. Quelques travaux existent sur ce sujet dans la littérature, comme par exemple ceux portant sur l'ensemencement et l'ajout de nucléants. La méthode dite d'ensemencement insère des graines de cristaux dans des essais de cristallisation mais nécessite des cristallites de la protéine souhaitée qui ne sont pas toujours disponibles. D'autres matériaux hétérogènes ont également été proposés tels que :

- des solides minéraux (Falini, G., Fermani, S., Conforti, G., Ripamonti, A. (2002). Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58, 1649-1652. McPherson, A. & Shlichta, P. (1988). Science. 239, 385-387.). L'équipe de Naomi E. Chayen propose également l'utilisation de matériaux mésoporeux capable d'induire la nucléation dans les pores après une étape de concentration/agrégation au sein de ces mêmes pores (WO 02/088435)

- ou des composés organiques :

o D'origine biologique : comme les cheveux, les crins de chevaux, les moustaches de rat ou les algues séchées (D’Arcy, A., Mac Sweeney, A., & Haber, A. (2003). Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1343-1346).

o Mais également synthétiques (Bijelic, A., Molitor, C., Mauracher, S. G., Al-Oweini, R., Kortz, U., & Rompel, A. (2014). ChemBioChem. 16, 233-241; Pechkova, E. & Nicolini, C. (2002). J. Cell. Biochem. 85, 243-251; Sugahara, M., Asada, Y., Morikawa, Y., Kageyama, Y., & Kunishima, N. (2008). Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 686-695; Matar-Merheb, R., Rhimi, M., Leydier, A., Huché, F., Galian, C., Desuzinges-Mandon, E., Ficheux, D., Flot,

D., Aghajari, N., Kahn, R., et al. (2011). PLoS ONE. 6, el8036.). L'utilisation de MIP « molecular imprinted polymers » a également été décrite. Il s'agit de polymères préalablement « imprimés » par la protéine à cristalliser et qui en contiennent donc la trace. Ajoutés ensuite à la goutte de cristallisation, une interaction de forme peut se produire favorisant la nucléation (Saridakis, PNAS, 2001, 108,11081).

À l'exception des MIP, qui permettent d'augmenter le taux de cristallisation de l'ordre de 10 à 15 %, tous ces agents d'aide à la cristallisation sont des solides formant une phase hétérogène dans le milieu de cristallisation, chacun d'eux devant donc être ajouté manuellement dans la goutte de cristallisation, ce qui est inconciliable avec l'utilisation des plateformes de criblage robotisées.

Très récemment, des nouveaux complexes cationiques formés d'un ion lanthanide Ln³⁺ conduisant à l'obtention de conditions de cristallisation uniques et reproductibles ont été brevetés (PCT/FR2016/053539), dont certains des inventeurs de la présente demande de brevet sont à l'origine. Ils permettent d'augmenter le taux de cristallisation de l'ordre de 40 % (une quinzaine de protéines ont été évaluées jusqu'à présent).

Malgré des succès importants obtenus par ces nouveaux complexes de lanthanide Ln³⁺, ces derniers ne sont pas universels et il existe donc toujours un besoin urgent de disposer de nouveaux outils simples, stables et complémentaires afin d'élargir les possibilités d'obtention de cristaux des macromolécules biologiques dont on souhaite déterminer la structure.

Comme cela a été vu précédemment, les relations des protéines avec l'eau sont extrêmement complexes. La solubilité des protéines va dépendre d'un grand nombre de facteurs extrinsèques et intrinsèques (température, pH, tampon, ions, agents de précipitation...). La recherche des conditions physico-chimiques favorables à la cristallisation des protéines est par conséquence largement empirique et se fait par vérification expérimentale des variables qui affectent généralement la solubilité. Compte tenu que ces dernières sont multiples et variables d'une macromolécule à l'autre, il est aujourd'hui impossible de prévoir à l'avance les conditions de cristallisation (pH, tampon, ions...), des macromolécules biologiques ou de prédéterminer quelles conditions seront appropriées pour former des cristaux.

Réciproquement, toute modification apportée sur un des composés présents va affecter de façon non prédictible la solubilité des protéines dans une solution aqueuse contenant des sels, celle-ci dépendant de deux effets antagonistes liés d'une part aux interactions électrostatiques (salting in ou effet dissolvant), et d'autre part aux interactions hydrophobes {salting outou effet relargant).

De façon surprenante, les inventeurs ont découvert que des nouveaux complexes ligand / ion métallique formés d'un ion métallique choisi parmi les métaux de transitions ou de post transition, à l'exception des ions lanthanides Ln³⁺, et ayant un degré d'oxydation de +2, +3, +4 ou +5, seuls ou en mélange, permettent l'obtention de conditions de cristallisation uniques et reproductibles. Ces nouveaux complexes ligand / ion métallique sont parfaitement stables et solubles dans les kits commerciaux de cristallisation et sont donc compatibles avec les systèmes de cristallisation robotisés des grandes plateformes existantes.

Dans le cadre de la présente description, les métaux de transition sont définis selon la définition de l'IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry - https://doi.org/10.1351/goldbook.T06456 ) conduit à ranger les éléments des groupes 3 à 11 du tableau périodique y compris la plupart des lanthanides et des actinides (aussi appelées «métaux de transition internes»), tandis que les éléments du groupe 12 (zinc 3oZn, cadmium 4sCd, mercure soHg...) en sont exclus. De même, en chimie, un métal pauvre aussi appelé métal de post-transition ou métal posttransitionnel, est un élément chimique métallique situé, dans le tableau périodique, entre les métaux de transition à leur gauche et les métalloïdes à leur droite. Il est employé ici à défaut d'une terminologie validée par l'IUPAC pour désigner collectivement les éléments de cette nature.

De manière additionnelle, l'invention se propose de fournir également des nouveaux agents phasants qui soient suffisamment stables dans la plupart des conditions de cristallisation des macromolécules biologiques permettant d'obtenir des informations structurales sur la protéine macromolécule biologique d'intérêt.

Dans ce contexte, l'invention concerne des complexes ligand / ion métallique neutres ou cationiques formés :

- d'un ion métallique choisi parmi les métaux de transitions ou de post transition, à l'exception des ions lanthanides Ln³⁺, seuls ou en mélange, qui peut être

- soit divalents ²⁺, choisi de préférence parmi : Cu, Ru, Os et Pb - soit trivalent ³⁺, choisi de préférence parmi : Al, Sc, Fe, Co, Ga, Y, Rh, In, Ir et Bi - soit tétravalent ⁴⁺, choisi de préférence parmi : Hf et Ce, - soit pentavalent⁵⁺, choisi de préférence parmi : Nb, (Ta) et W,

- et d'un ligand, aussi appelé complexant, de formule (I) :

dans laquelle :

• n est égal à 1, 2 ou 3 ;

• R.2 est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle ou -CH2R5, R5 représentant un groupe phényle, pyridinyle ou picolinyle ;

· R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle ou -CH2R6, Re représentant un groupe phényle ou pyridinyle;

• Ri et Ri-, identiques ou différents, représentent :

R» avec :

o R7 qui représente un atome d'hydrogène, fluor, chlore, brome ou iode, un groupe -OH ou -NH2 ;

o Re qui représente -COO’, -CONH2, -CONHRg, -PRgOO’, ou un groupe choisi parmi :

Avec Rg qui représente un atome d'hydrogène, un groupe méthyle, éthyle ou phényle ; et et leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates.

Les ligands de formule (I) comprennent au moins 7 sites de coordination, voire plus, en fonction des structures de X et Y. Ces sites de coordination se trouvent sur les deux atomes d'azote représentés sur la formule (I), sur les deux pyridines des groupements Ri, sur les deux groupes R7, au moins un site de coordination se 15 trouvant sur X et/ou Y.

Les complexes ligand / ion métallique selon l'invention présentent une charge supérieure ou égale à 0. Ils comportent un ligand macrocyclique incorporant plusieurs groupements aromatiques formant une sphère de coordination ouverte pour l'ion métallique.

Par ailleurs, les complexes ligand / ion métallique selon l'invention présentent l'avantage d'être solubles dans l'eau et stables dans la plupart des milieux de cristallisation commerciaux. Dans le cadre de l'invention, il a été démontré que ces complexes ligand / ion métallique présentaient un intérêt, non seulement en tant qu'aide à la cristallisation mais également pour certains en tant qu'agent phasant, lors de l'obtention de données structurales. En particulier, ledit complexe est utilisé en tant qu'agent nucléant et/ou en tant qu'agent cristallisant lors de la cristallisation d'une macromolécule biologique. De telles applications n'avaient jamais été décrites ou envisagées auparavant.

De manière avantageuse, les complexes ligand / ion métallique selon l'invention, ainsi que leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates, sont formés d'un ion métallique choisi parmi : Os²⁺, Pb²⁺, Al³⁺, Sc³⁺, Y³⁺, Rh³⁺, In³⁺, Ir³⁺, Bi³⁺, Hf ⁴⁺, Ce⁴⁺, Nb⁵⁺etTa⁵⁺.

A titre d'exemple de sels des complexes ligand / ion métallique selon l'invention qui trouvent application dans le cadre de l'invention, on peut citer les sels d'un complexe cationique avec un anion (ou plusieurs anions, en fonction de la charge du complexe) choisi parmi : F’, CI’, Br, Γ, OH’, NCU, triflate, PFô', SbFô', B(Ph)<, BF<, les sulfates, sulfonates, carbonates, phosphates, phosphonates et carboxylates. Les sulfates et sulfonates pourront correspondre à SCU^2-, HSCU ou R'SO3', les carbonates à CO3²·, HCO2' ou R'CO2', les phosphates et phosphonates à ROPO3²· et R'PCh²· et les carboxylates à R'CCh', avec R' qui peut être, notamment, un groupe alkyle ou aryle, notamment un groupe alkyle comprenant de 1 à 4 atomes de carbone ou un groupe phényle.

Les complexes ligand / ion métallique selon l'invention pourront également se trouver sous la forme d'hydrate ou solvats, c'est-à-dire avec au moins une molécule d'eau ou de solvant dans la sphère de coordination du métal.

De manière préférée, les complexes ligand / ion métallique selon l'invention, et leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates, sont formés avec un ligand répondant à la formule (IA) :

dans laquelle n=l et R2=H, et R1/R1', identiques ou différents, sont tels que définis pour les composés de formule (IA) à (IF).

De manière avantageuse, dans les ligands de formule (IA) à (IF), R1/R1' 5 représentent :

avec :

• R7 qui représente un atome d'hydrogène, de fluor, chlore, brome ou iode, et • Requi représente -COO’, -CONH2, -CONRg ou -PRgOO’, ou un groupe choisi parmi :

o Avec Rg qui représente un atome d'hydrogène, un groupe méthyle, éthyle ou phényle, et leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates.

Dans le cadre de l'invention, lorsqu'un substituant représente un groupe picolinyle, il représente :

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un complexe ligand / ion métallique selon l'invention, ou d'un de leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates, en tant qu'aide à la cristallisation d'une macromolécule biologique. En particulier, ledit complexe est utilisé en tant qu'agent nucléant et/ou en tant qu'agent cristallisant lors de la cristallisation d'une macromolécule biologique.

Tous les complexes ligand / ion métallique selon l'invention présentent un intérêt pour leur effet nucléant ou cristallisant. Ledit complexe est utilisé en tant qu'agent phasant lors de la détermination structurale par diffraction des rayons X si dans le complexe, l'ion métallique est choisi parmi : Os²⁺, Ir³⁺, Bi³⁺, Hf ⁴⁺, Ce⁴⁺ et Ta⁵⁺.

En particulier, dans le cadre de l'invention, par « macromolécule biologique », on entend en particulier les peptides (enchaînement de moins de 100 acides aminés), les protéines (enchaînement d'au moins 100 acides aminés) seuls ou en association avec des ligands ou des acides nucléiques, notamment les ADN ou ARN. De telles macromolécules biologiques présenteront notamment une masse moléculaire moyenne supérieure à 1 kDa.

L'invention a également pour objet les cristaux dérivés d'une macromolécule biologique comprenant un complexe selon l'invention telle que précédemment définie, ou leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates.

L'invention a également pour objet un procédé de cristallisation d'une macromolécule biologique, de préférence choisie parmi les peptides et les protéines comprenant les étapes suivantes :

• disposer d'une solution comprenant une macromolécule et un complexe selon l'invention, • obtenir des cristaux de la macromolécule à partir de ladite solution.

Dans ces procédés de cristallisation, le complexe selon l'invention et la macromolécule biologique à cristalliser seront mis en solution généralement dans de l'eau ou dans une solution aqueuse tamponnée, par exemple dans une solution tampon acétate, cacodylate, citrate, Bis tris propane, TRIS, HEPES... Si une solution du complexe ligand / ion métallique est formée, elle ne sera pas forcément tamponnée. La solution contenant le complexe, la solution contenant la macromolécule biologique et/ou la solution contenant la macromolécule biologique et le complexe, en fonction de la technique de cristallisation utilisée présenteront, de préférence, un pH dans la gamme allant de 3 à 9.

La solution utilisée pourra comprendre, en outre, un agent précipitant, autre que le complexe, choisi parmi ceux décrits dans les kits de cristallisation commerciaux, comme par exemple, les sels tels que NaCI, le tartrate de sodium ou de potassium, le tartrate double de sodium et de potassium, le citrate de sodium, le sulfate d'ammonium ; les polymères tels que polyéthylèneglycol (PEGs) et la Jeffamine T ; l'éthanol, le dioxane, le méthylpentanediol... Celui-ci sera généralement ajouté à la solution comprenant une macromolécule et un complexe selon l'invention.

La concentration en macromolécule dans la solution sera en théorie proche de sa limite de solubilité dans ladite solution, mais pourra être plus diluée, en fonction de la solution utilisée. De manière avantageuse, dans la solution, le complexe est présent à une concentration de 1 à 100 mM et préférentiellement à une concentration de 5 à mM. L'obtention de cristaux est réalisée par cristallisation par diffusion de vapeur, par dialyse, en batch ou encore dans un procédé de cristallisation en phase cubique de lipides.

Le procédé de cristallisation selon l'invention pourra être intégré à un criblage ou à une optimisation de conditions de cristallisation d'une macromolécule biologique. Le procédé de cristallisation selon l'invention pourra être mis en œuvre de manière automatisée.

En fonction de leur structure, et en fonction des conditions de cristallisation mises en œuvre, les complexes ligand / ion métallique selon l'invention présentent au moins l'une des propriétés suivantes :

- effet nucléant : la présence dudit complexe ligand / ion métallique lors de la cristallisation provoque la croissance de cristaux dans des conditions (tampon et/ou additifs et/ou température et/ou concentration et/ou durée...) qui ne permettent pas la formation de cristaux en l'absence du complexe selon l'invention.

- effet cristallisant : la présence dudit complexe ligand / ion métallique lors de tests d'une série de conditions de cristallisation (nombre de cristaux et/ou taille des cristaux et/ou amélioration de la diffraction des cristaux obtenus...) permet d'améliorer la cristallisation obtenue, par rapport à une série de conditions différant par l'absence de complexe. En l'absence de complexe, des cristaux apparaissent mais sont de moins bonne qualité.

En particulier, les complexes ligand / ion métallique selon l'invention permettent soit d'augmenter le nombre de conditions dans lesquelles l'obtention de cristaux d'une macromolécule biologique est possible, soit de travailler dans des conditions plus faibles en macromolécule biologique et/ou en autre agent précipitant classiquement utilisé, soit d'améliorer la qualité ou le nombre de cristaux favorisant ainsi l'obtention de données structurales ultérieures, soit d'obtenir plusieurs de ces avantages.

La qualité et la pureté d'un agent cristallisant sont essentielles au bon déroulement de la cristallisation d'une macromolécule, lorsque ces derniers sont utilisés en tant qu'agent de cristallisation. Aussi, au final, les complexes ligand / ion métallique selon l'invention seront soumis à une étape de purification adaptée, notamment à une chromatographie par exclusion stérique.

Les complexes formés selon l'invention, ainsi que leurs sels avec un anion lorsque le complexe ligand / ion métallique est cationique, solvats et hydrates, pourront être utilisés en tant qu'agent cristallisant dans toute technique adaptée à la cristallisation de macromolécules biologiques comme par exemple par diffusion de vapeur, par dialyse, en batch ou encore dans un procédé de cristallisation en phase cubique de lipides.

Pour une description détaillée de telles techniques, on pourra se référer aux ouvrages de référence suivants : « Protein Crystallization, Second Edition (IUL Biotechnology Sériés) » édité par Therese Bergfors ou « Crystallization of Nucleic Acids and Proteins: A Practical Approach » édité par Arnaud Ducruix et Richard Giegé.

L'invention a également pour objet un procédé de détermination de la structure d'une macromolécule biologique comprenant les étapes suivantes :

a. disposer d'un cristal dérivé de la macromolécule biologique tel que défini dans le cadre de l'invention,

b. analyser la structure cristalline de la macromolécule biologique à partir dudit cristal dérivé.

Le cristal dérivé pourra être obtenu selon un procédé de cristallisation tel que décrit dans le cadre de l'invention ou encore par trempage d'un cristal de la macromolécule biologique dans une solution d'un complexe ligand / ion métallique selon l'invention formé d'un ion métallique choisi parmi les métaux de transitions ou de post transition, à l'exception des ions lanthanides Ln³⁺, ou d'un de leurs sels avec un anion lorsque le complexe ligand / ion métallique est cationique, solvats et hydrates. En particulier, la détermination de la structure de la macromolécule biologique est réalisée par diffraction des Rayons X (RX) et l'obtention d'information structurale à basse résolution par les méthodes SAXS (Small-Angle X-ray Scattering) ou MASC (Multiwavelength-Anomalous Solvent Contrast).

De tels cristaux dérivés peuvent être obtenus par trempage ou par cocristallisation, comme détaillé plus loin. Les complexes ligand / ion métallique selon l'invention peuvent donc être utilisés en tant qu'aide à la détermination de la structure cristalline d'une macromolécule biologique.

La détermination des phases peut être faîtes avec des cristaux dérivés obtenus dans une solution contenant de 10 à 500 mM de complexe, préférentiellement de 50 à 200 mM et de manière encore plus préférée de lOOmM ± 10% en dit complexe ligand / ion métallique. Cependant pour améliorer la qualité du phasage, un trempage dans une solution d'un complexe ligand / ion métallique, en particulier avec une concentration élevée en complexe, peut également être réalisé. Cela permet d'augmenter le taux d'occupation des sites occupés par le complexe.

La co-cristallisation consiste donc à ajouter le complexe ligand / ion métallique formé d'un ion métallique ayant un degré d'oxydation de +2, +3, +4 ou +5 et choisi parmi les métaux de transitions ou de post transition, à l'exception des ions lanthanides Ln³⁺, selon l'invention pendant le processus de cristallisation. Ainsi, lors de la cristallisation, le complexe ligand / ion métallique selon l'invention peut s'insérer dans des sites cristallins spécifiques conduisant à l'obtention de cristaux dérivés.

Par ailleurs, pour obtenir un cristal dérivé ou augmenter l'occupation de sites dans le cristal dérivé, un trempage d'un cristal d'une macromolécule biologique dans une solution de complexe ligand / ion métallique selon l'invention peut être effectué. Il est possible de réaliser un trempage rapide ou un trempage long.

Le trempage rapide consiste à prélever un cristal d'une macromolécule biologique d'intérêt et à le tremper de manière brève (notamment de 45 secondes à 5 minutes) dans une solution du complexe ligand / ion métallique selon l'invention. De manière avantageuse, la solution dans laquelle le cristal est trempé présente une forte concentration en complexe ligand / ion métallique, typiquement une concentration de 50 à 500 mM, de préférence de 100 mM ± 10%.

En particulier, un trempage rapide lors d'une phase de congélation d'un ou plusieurs cristaux peut être réalisé. Un trempage rapide lors d'une phase de congélation se déroule typiquement en trois étapes : des cristaux sont prélevés de leur goutte d'origine et trempés dans une goutte de trempage, correspondant à une solution équivalente à la solution d'origine utilisée pour la formation du(des)dit(s) cristal(aux) à laquelle est ajoutée une concentration de 50 à 500 mM, de préférence de 100 mM ± 10% de complexe ligand / ion métallique selon l'invention, ainsi qu'un cryoprotectant tel qu'utilisé par l'homme de l'art. Après une durée de 45 secondes à 2 minutes, le cristal est trempé dans une solution de cryoprotection sans complexe ligand / ion métallique afin d'en éliminer l'excès. Enfin, le cristal est plongé dans l'azote liquide et stocké à basse température, par exemple à 100K.

Cette méthode de trempage est très efficace et permet d'augmenter les taux d'occupation et d'améliorer la qualité du phasage. Un trempage court permet d'éviter que le cristal ne se dégrade et de préserver les qualités de diffraction de ce dernier.

Le trempage long consiste à prélever un cristal d'une macromolécule biologique d'intérêt et à le tremper de manière prolongée (notamment de 5 minutes à 24 heures) dans une solution du complexe ligand / ion métallique formé selon l'invention. De manière avantageuse, la solution dans laquelle le cristal est trempé présente une forte concentration en complexe ligand / ion métallique, typiquement une concentration de 50 à 500 mM, de préférence de 100 mM ± 10%.

A l'exception de la durée, le trempage long peut se dérouler selon le même protocole que celui décrit pour le trempage rapide, notamment lors d'une phase de congélation. Cependant, la goutte de trempage est placée en équilibre avec un puits contenant de la solution d'origine utilisée pour la formation du(des)dit(s) cristal(aux), afin d'éviter une déshydratation de la goutte.

Quel que soit le type de trempage, il est possible de tremper aussi bien des cristaux obtenus par co-cristallisation en présence d'un complexe ligand / ion métallique formé selon l'invention que des cristaux obtenus en l'absence d'un tel complexe (nommés cristaux natifs dans le cadre de la présente demande de brevet). Le trempage n'entraine aucune destruction ou modification de la macromolécule biologique.

Les complexes ligand / ion métallique selon l'invention permettent de former des cristaux dérivés d'une macromolécule biologique permettant l'obtention de données structurales pour ladite macromolécule biologique. En particulier, l'obtention de données structurales sera obtenue à partir d'un cristal dérivé d'une macromolécule biologique intégrant un complexe ligand / ion métallique formé d'un d'un ion métallique choisi de préférence parmi : Os²⁺, Ir³⁺, Bi³⁺, Hf ⁴⁺, Ce⁴⁺ et Ta⁵⁺, qui joue le rôle d'agent phasant. Ces données structurales pourront être obtenues par une méthode haute résolution, telle que la diffraction des Rayons X (RX) ou par une méthode basse résolution, telles que les méthodes SAXS et MASC. Les complexes ligand / ion métallique formés d'un d'un ion métallique choisi de préférence parmi : Os²⁺, Ir³⁺, Bi³⁺, Hf ⁴⁺, Ce⁴⁺ et Ta⁵⁺, pourront être utilisés en tant qu'agent phasant en diffraction des RX (cristallisation et analyse de structure) ou en diffusion des RX, ou encore en tant qu'agent de contraste en SAXS ou MASC, en microscopie électronique.

L'utilisation des complexes ligand / ion métallique formés d'un ion métallique choisi de préférence parmi : Os²⁺, Ir³⁺, Bi³⁺, Hf ⁴⁺, Ce⁴⁺ et Ta⁵⁺, et d'un ligand de formule (I), sous forme d'un sel avec un anion, éventuellement sous la forme d'un solvat ou d'un hydrate, en tant qu'agent phasant notamment, présente l'avantage de ne pas nécessiter une modification de la macromolécule biologique par génie génétique, comme dans le cas de l'obtention de protéines séléniés. Aucune liaison covalente n'intervient entre le complexe cationique et la macromolécule biologique d'intérêt.

Les complexes selon l'invention pourront être préparés selon des techniques adaptées par l'homme du métier des techniques décrites dans les exemples ou dans la demande W02014/162105. La synthèse des complexes selon l'invention est généralement réalisée dans l'eau. Les complexes, ainsi formés seront donc plutôt sous la forme d'hydrate, mais le complexe peut ensuite être mis dans un solvant autre, du type alcool ou DMSO et donner lieu à un solvat ou encore être déshydraté. Sous forme hydratée, un complexe selon l'invention comportera, notamment jusqu'à 3 molécules d'eau par complexe. En moyenne, le nombre de molécules d'eau par complexe, pourra, par contre, être différent d'un nombre entier, et être par exemple égal à 0,5. Pour les applications envisagées dans le cadre de l'invention, les complexes ligand / ion métallique selon l'invention pourront être utilisés sous forme hydratée, ou déshydratée, solvatée ou non, sous la forme de poudre ou en solution.

Exemples de réalisation

Partie I : Synthèse et caractérisation des complexes

Les abréviations ci-après sont utilisées :

BiNo3 = nitrate de bismuth

Me = méthyle

Moz = méthoxybenzyloxycarbonyle

Boc = tert-butoxycarbonyle

Ms = mésyle

Et = éthyle

TA = température ambiante

Ac = acétyle

DCM = dichlorométhane

TACN = triazacyclononane

DMF = diméthylformamide

TFA = acide trifluoroacétique

ACN = acétonitrile

CCM = chromatographie sur couche mince

Produits de départ et caractérisation

Tous les produits de départ, solvants et sels de métaux ont été achetés chez Sigma-Aldrich®, Acros Organics® et TCI® avec des puretés supérieures à 98% pour les composés organiques et supérieures à 99,99% pour les sels de nitrate de bismuth. Ces produits ont été utilisés directement sans purification supplémentaire.

Les chromatographies ont été effectuées d'une part, sur alumine neutre activité III obtenue par hydratation d'alumine Acros Organics® d'activité I (60Â), et d'autre part, sur gel de silice Acros Organics® (60Â). Les complexes formés ont tous été purifiés par colonne d'exclusion stérique LH20 de chez Sephadex®.

Les spectres RMN ¹³C) ont été enregistrés sur deux appareils Bruker® Avance opérant respectivement à 500.10 MHz et 125.75 MHz pour ^XH et ¹³C pour 5 l'un, et à 300 MHz pour ^XH pour le second. Les déplacements chimiques sont reportés en partie par million (ppm) relativement au signal du tetraméthylsilane (^XH, ¹³C), les pics résiduels des solvants étant utilisés comme référence interne. Les mesures de masses exactes ont été effectuées au Centre Commun de spectrométrie de Masse (Villeurbanne, France).

A) Préparation de ligands/complexes à base de triazacyclononane (TACN)

a) HCl (cat.) dans MeOH b) NaBH₄dans DCM/MeOH c) MsCI, Et₃N dans DCM d) Mozon, Et3N dans ACN e) Boc-O-succinimide dans DCM f) H2, Pd/C dans MeOH g) Na₂CO₃ dans MeOH/H₂O h) TFA dans DCM i) Na₂CO₃ dans ACN j) Na₂CO₃ dans H₂O 15 puis BÎNO3.

Le composé 6 a été préparé selon la procédure précédemment décrite dans la demande de brevet W02013/011236A1.

Al) Préparation du composé 1

A une suspension de 20 g d'acide dipicolinique (0,12 mol, léq.) dans 120 mL de méthanol, on ajoute 1 mL d'acide sulfurique concentré. Le mélange est porté à reflux pendant 24h. Après refroidissement, le produit cristallisé est filtré et rincé au méthanol froid pour donner, après séchage, 18 g de poudre cristalline blanche du composé 1 (R = 78%).

^-NMR (300 MHz, CDCIs) δ (ppm) = 8.26 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.99 (t, J = 8 Hz, 1H), 3.98 (s, 6H).

A2) Préparation du composé 2 g de composé 1 (92 mmol, 1 éq.) sont dissouts dans 450 ml de méthanol et refroidis à 0°C. 3,8 g de NaBH4 (101,2 mmol, 1,1 éq.) sont alors ajoutés. Le mélange est ensuite agité 30 min à 0°C et 30 min supplémentaires en laissant la température remontée lentement jusqu'à TA. La réaction est stoppée par ajout de 50 mL de HCl (IM dans H2O), puis la phase organique est extraite avec 100 mL de dichlorométhane. Après, lavage de la phase organique avec de la saumure (jusqu'à pH = 7), séchage avec Na2SO4 et évaporation, le produit obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant : DCM/AcOEt 9/1 v/v jusqu'à AcOEt pur). On obtient 6 g d'un solide blanc du composé 2 (R = 40%).

^-NMR (300 MHz, CDCI3) δ (ppm) = 8.01 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.84 (t, J = 8 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.85 (d, J = 3 Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.69 (bs, 1H).

A3) Préparation du composé 3

A une solution de 1,2 g de l'alcool 2 dans 50 mL de dichlorométhane à 0°C, on ajoute 3mL de Et3N (22 mmol, 3,2 éq.) puis, rapidement, 0,79 mL de chlorure de mésyle (10,2 mmol, l,5éq.). On laisse ensuite le mélange revenir à température ambiante avant de le chauffer pendant lh à 50°C. On ajoute ensuite 40 mL d'eau et on extrait le mélange au dichlorométhane (3x20 ml_). Le résidu huileux obtenu, après séchage et évaporation des phases organiques, est finalement purifié sur gel de silice (éluant : CH2CI2) pour obtenir une huile incolore du composé 3 qui cristallise au congélateur.

^XH NMR (500 MHz, CDCI3) δ 8.12 (d, J = U Hz, 1H), 7.93 (t, J = 7.8 Hz, 1H, H10), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.44 (s, 2H, H7), 4.01 (s, 3H, OMe), 3.15 (s, 3H, OMs).

¹³C NMR (126 MHz, CDCI3) δ 165.33 (C13), 154.59 (s), 147.92 (s), 138.45 (C10), 125.41 (s), 125.13 (s), 71.11 (C7), 53.23 (OMe), 38.24 (OMs).

A4) Préparation du composé 6

Le composé 6 est préparé par la méthode précédemment décrite, (a) W02013011236A1 ; b) l.S. J. Butler, B. K. McMahon, R. Pal, D. Parker and J. W. Walton, Chem. Eur. J., 2013, 19, 9511-9517.)

A5) Préparation du composé 7

360 mg de composé 6 (1,19 mmol) et 760 mg de carbonate de sodium (7,15 mmol, 6 éq.) sont séchés sous pression réduite dans un schlenk avant d'ajouter 100 mL d'acétonitrile. Sous argon, 710 mg de composé 3 (2,74 mmol, 2,3 éq.) sont ajoutés à la suspension avant chauffage 12h à 70°C. Après retour à la température ambiante, le mélange est filtré sur fritté (porosité 4) et concentré sous pression réduite. Le produit est purifié par chromatographie sur alumine (activité III, éluant DCM puis DCM/MeOH 96/4 v/v) pour finalement obtenir une huile jaune du composé 7 (532 mg, Rendement : 80%).

^XH NMR (500 MHz, CDCI3) δ 7.99 (dd, J = 6 Hz, 2H, Hll), 7.86 - 7.65 (m, 4H, H9), 3.98 (s, 10H, H7+OMe), 3.39 (d, J = 30 Hz, 4H, H4H5), 3.11 (s, 2H, H3H6), 2.95 (s, 2H, Η3Ή6'), 2.66 (d, J = 31 Hz, 4H, H1H2), 1.44 (s, 9H, boc).

¹³C NMR (126 MHz, CDCI3) δ 166.01, 166.09 (C13), 161.43, 161.60 (C8), 155.88(CO(boc)) 147.45(C12), 137.42 (d,C10), (s), 126.19,126.46 (C9), 123.70 (Cil), 79.48 (C(boc)), 63.70 (d, C7), 57.21 (C1C2), 55.37 (s), 55.11 (s), 54.67 (s), 53.04 (OMe), 50.54, 49.95 (C4C5), 28.72 (CHs(boc)).

A6) Préparation du composé 8

Dans 100 ml_ de dichlorométhane, 5 ml_ d'acide trifluoroacétique sont ajoutés sur une solution de 427 mg du composé 7. Après 5h d'agitation à la température ambiante, le mélange est évaporé en éliminant le TFA par entrainement avec plusieurs ajouts de toluène. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur alumine (activité III, éluant DCM/MeOH (gradient 1% jusqu'à 7%)). Le solide visqueux jaunâtre obtenu du composé 8 est conservé sous argon au congélateur (masse : 315 mg, rendement : 90%).

^XH NMR (500 MHz, CDCh) δ 7.96 (dd, J = 7.7, 0.5 Hz, 2H, Hll), 7.71 (t, J = 8 Hz, 2H, H10), 7.42 (dd, J = 7.9, 0.5 Hz, 2H), 3.98 (d, 10H, H7+OMe), 3.40 (t, J = 5 Hz, 4H, H4H5), 3.03 (t, J = 5 Hz, 4H, H3H6), 2.71 (s, 4H, H1H2).

¹³C NMR (126 MHz, CDCI3) δ 165.37 (C13), 159.43 (C8), 147.59 (C12), 137.87 (C10), 126.10 (C9), 124.02 (Cil), 60.95 (C7), 54.60 (C1C2), 53.31 (OMe), 51.66 (C3C6), 46.52 (C4C5).

NB : la synthèse de ce composé a été précédemment décrite dans la référence suivante : A. Nonat, C. Gateau, P. H. Fries, M. Mazzanti, Chem. Eur. J., 2006, 12, 7133.

A7) Préparation du composé 9

Le ligand 9 est généré in situ par saponification du diester 8 en présence de carbonate de sodium Na2CO₃ (2 éq.) dans un mélange MeOH/H2O (1/1, v/v) agité 3h à 50°C.

^XH NMR (500 MHz, D₂O) δ 7.77 (d, J = 7.1 Hz, 2H, H9), 7.69 (t, J = U Hz, 2H, H10), 7.29 (d, J = 7.2 Hz, 2H, Hll), 3.86 (s, 4H, H7), 3.08 (t, J = 5.9 Hz, 4H, H4H5), 2.91 (t, J = 5.9 Hz, 4H, H3H6), 2.65 (s, 4H, H1H2).

¹³C NMR (126 MHz, D₂O) δ 173.22 (C13), 158.44 (C8), 153.01 (C12), 138.23 (CIO), 125.17 (Cil), 122.40 (C9), 60.27 (C7), 50.53 (C1,C2), 47.12 (C3,C6), 44.10 (C4,C5).

A8) Préparation du complexe 10

Après réaction pendant 3h à 50°C de 100 mg de diester 8 (0,22 mmel) avec 120 mg de Na₂CO3 (1,13 mmcl, 5,0 éq.) et neutralisaticn par HCl (IM), la dispariticn de l'ester est vérifiée par RMN. 213 mg de nitrate de bismuth pentahydrate (0,44 mmcl, 1,0 éq.) sent ajeutés. Le mélange est ensuite agité pendant une nuit. Le produit final est ensuite séparé des sels résiduels par chrcmatcgraphie d'exelusien stérique sur Séphadex LH20 (éluant : eau) peur cbtenir 60 mg de produit pur (R= 40%).

^XH NMR (300 MHz, D₂O) δ 8.08 (dd, J = U Hz, 2H), 7.94 (s, 2H), 7.70 (s, 2H), 3.54 .2 (m, 8H), 3.30 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 3.14 - 1.75 (m, 4H).

Partie II : Etudes cristallographiques

A) Protéine modèle étudiée

La protéine commerciale sélectionnée est le lysozyme de blanc d'œuf de poule (HEWL). C'est une protéine modèle en matière de cristallogenèse. Elle est achetée sous forme lyophilisée. Elle est été solubilisée dans de l'eau milliQ juste avant les expériences de cristallogenèse à la concentration souhaitée. Elle est présentée dans le Tableau 1 ci-après.

Protéines	Nombre d'acides aminés	Référence produit Fournisseur
HEWL	129	10 837 059 001 Roche

Tableau 1 : Protéine commerciale utilisée et fournisseur associé

Les conditions de cristallisation native (c'est-à-dire sans ajout de complexe ligand / ion métallique selon l'invention) de cette protéine sont connues et décrites dans le Tableau 2 ci-après. Ces conditions ont été reprises pour caractériser l'effet des complexes ligand / ion métallique selon l'invention, sur la cristallogenèse de cette protéine commerciale.

Protéine	Tampon	Agent précipitant / cristallisant
HEWL	100 mM acétate de sodium pH 4,6	0,5 à 2 M NaCI (chlorure de sodium)

Tableau 2 : Conditions de cristallisation usuelles de la protéine HEWL

B) Cristallisations réalisées manuellement en laboratoire

Afin de mettre en évidence ce phénomène de nucléation induit par les complexes selon l'invention, des diagrammes de cristallisation ont été réalisés en déterminant les gammes de concentration en agents précipitant et en protéine qui permettent l'obtention de cristaux.

La protéine HEWL (Tableau 1) a été cristallisée manuellement selon les conditions de cristallisation usuelles connues (Tableau 2). Les conditions de cristallisation décrites dans le Tableau 2 ont donc été reproduites en présence de complexe 10 à une concentration de 10 mM. Pour réaliser ces gammes de cristallisation manuelles, les gouttes de cristallisation ont été préparées selon le schéma suivant : 1,5μΙ de solution de protéine + 1,5μΙ de solution de complexe à une concentration de 10 mM + 1,5μΙ de solution d'agent précipitant (NaCI). Afin de mettre en avant un potentiel effet des complexes ligand / ion métallique selon l'invention sur la cristallisation, la gamme en agent précipitant a été ajustée de manière à se trouver en limite de la zone de cristallisation, puis, éventuellement étendue au-delà lorsqu'un effet était observé.

Chaque condition de cristallisation a été réalisée en triplicata. Des diagrammes de cristallisation ont été déterminés après 10 jours de de croissance cristalline. Ils sont représentés sur la Figure 2.

FIGURE 2: Diagrammes de phase du lysozyme de blanc d'œuf de poule HEWL en absence (à gauche) et en présence de lOmM de complexe 10 déterminés après 10 jours de cristallisation : les conditions ayant donné des cristaux sont illustrées par des points noirs, les points blancs étant des gouttes claires.

Comme on peut le constater, l'effet nucléant du complexe 10 est très important. En particulier, des cristaux sont apparus pour 5mg/ml de lysozyme et pour une concentration en précipitant de 650 mM. Par comparaison, l'absence de complexe ligand / ion métallique selon l'invention permet seulement la formation de cristaux à cette même concentration pour des concentrations de 15 mg/ml de protéine.

Ainsi, un effet nucléant marqué a été observé. L'effet nucléant doit ici être entendu par la croissance de cristaux en présence du complexe 10 à des concentrations en précipitant faible, concentrations qui ne permettent pas la formation de cristaux natifs. Les cristaux obtenus en présence du complexe de bismuth selon l'invention apparaissent, de plus, très prometteurs pour une étude cristallographique.

A ce jour, aucun complexe à base de métaux de transitions ou de post transition, à l'exception des ions lanthanides Ln³⁺, n'avait montré ni même suggéré un tel effet nucléant compte tenu de l'ultra sensibilité des protéines au moindre changement apporté dans leur environnement lors de la cristallogenèse.

A titre de comparaison :

- Le tris-dipicolinate de lanthanide a produit une nouvelle forme cristalline du lysozyme seulement lorsqu'il a été utilisé à des concentrations supérieures à 50 mM.

- Les MIPs proposées par Naomi E. Chayen (Saridakis, E., Khurshid, S., Govada, L., Phan, Q., Hawkins, D., Crichlow, G. V., Lolis, E., Reddy, S. M., & Chayen, N.

E. (2011). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 11081-11086 and WO2010139972) conduisent à des décalages de la zone de cristallisation de seulement une à deux unités de concentration en agents précipitant. Les effets nucléants associés ne sont obtenus que pour des concentrations conventionnelles de lysozyme de l'ordre de 30 mg/ml (Khurshid et al. Automating the application of Smart materials for protein crystallization. (2014) Acta cryst D). Selon Saridakis et al. (Saridakis, E., Khurshid, S., Govada, L., Phan, Q., Hawkins, D., Crichlow, G. V., Lolis, E., Reddy, S. M., & Chayen, N. E. (2011). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 11081-11086.), la gamme de cristallisation du lysozyme en présence de leurs agents nucléants débute à partir de 480 mM de NaCI et ce, pour une concentration en protéine de 20 mg/mL. Aucun cristal de lysozyme n'a été observé en dessous de 460 mM NaCI. Concernant la protéine thaumatine (30 mg/ml) aucun cristal n'est observé en dessous de 0,2 M tartrate. En présence de leurs agents nucléants, ils obtiennent des cristaux pour 0,3 et 0,4 M tartrate (idem complexe 10) et des cristaux natifs pour 0,5 M tartrate.

- Les complexes de type POM ne présentent d'effet nucléant qu'avec des concentrations élevées de lysozyme (de l'ordre de 100 mg/ml), ce qui pose des problèmes de solubilité pour la plupart des protéines. (A. Bijelic et al Hen EggWhite Lysozyme Crystallisation: Protein Stacking and Structure Stability Enhanced by a Tellurium(VI)-Centred Polyoxotungstate ChemBioChem 2015, 16, 233 - 241).

De plus, la stabilité du complexe 10 (ligand / bismuth) a été évaluée à 3 concentrations différentes (10, 50 et 100 mM). Le complexe 10, même à une concentration de 100 mM, présente une stabilité accrue. En effet, aucun cristal du complexe n'a été observé et seule la présence de précipités a été détectée. Cette dernière n'est toutefois pas synonyme d'incompatibilité avec l'apparition de cristaux de protéine.

Claims

REVENDICATIONS

1. Complexes présentent une charge supérieure ou égale à 0 formés d'un ion métallique choisi parmi les métaux de transitions ou de post transition, à l'exception des ions lanthanides Ln³⁺, et ayant un degré d'oxydation de +2, 5 +3, +4 ou +5 et d'un ligand répondant à l'une des formules suivantes :

dans laquelle :

• n est égal à 1, 2 ou 3 ;

• R2 est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle ou -CH2R5, Rs

10 représentant un groupe phényle, pyridinyle ou picolinyle ;

• R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle ou -CH2R6, Re représentant un groupe phényle ou pyridinyle;

• Ri et Rr, identiques ou différents, représentent :

Rs avec :

o R7 qui représente un atome d'hydrogène, fluor, chlore, brome ou iode, un groupe -OH ou -NH2 ;

o Re qui représente -COO’, -CONH2, -CONHR9, -PR9OO·, ou un groupe choisi parmi :

• _ » · » · » » • · Avec Rg qui représente un atome d'hydrogène, un groupe méthyle, éthyle ou phényle ;

et leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates.
2. Complexes cationiques selon la revendication 1 sous la forme d'un sel avec un anion choisi parmi : F^-, CI’, F’, Br, Γ, OH^-, NO3·, triflate, PFô', SbFô’, B(Ph)4‘, BFy, les sulfates, carbonates, phosphates et carboxylates.
3. Complexes selon l'une des revendications 1 à 3 formés avec un ligand répondant à la formule (IA) :

dans laquelle n est égal à 1, R2 est un atome d'hydrogène et Ri et Ri·, identiques ou différents, sont tels que définis à la revendication 1, ainsi que leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates.
4. Complexes selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que Ri et

Rr, identiques ou différents, représentent :

Re avec :
5 - R7 qui représente -COO’, ou -PR9OO· avec Rs qui représente un groupe méthyle ou éthyle ou bien R7 qui représente un groupe :

- Re qui représente un atome d'hydrogène, de fluor, chlore, brome ou iode, ainsi que leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats 10 et hydrates.

5. Complexes selon la revendication 1 choisi parmi les complexes répondant à l'une des formules suivantes :

avec p > 0, p étant la charge du complexe et M étant l'ion métallique, ainsi que leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats et hydrates.
6. Complexes selon la revendication 1, 2 ou 5 formés d'un ion métallique choisi parmi : Cu²⁺, Ru²⁺, Os²⁺, Pb²⁺, Al³⁺, Sc³⁺, Fe³⁺, Co³⁺, Ga³⁺, Y³⁺, Rh³⁺, In³⁺, Ir³⁺, Bi³⁺, Hf^44-, Ce⁴⁺, Nb⁵⁺, Ta⁵⁺ ou W⁵⁺.
7. Complexes selon la revendication 1, 2 ou 5 formés de préférence d'un ion métallique choisi parmi : Os²⁺, Pb²⁺, Al³⁺, Sc³⁺, Y^34-, Rh³⁺, In³⁺, Ir³⁺, Bi³⁺, Hf ⁴⁺, Ce⁴⁺, Nb⁵⁺ et Ta⁵⁺.
8. Utilisation d'un complexe tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou d'un de leurs sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvats ou hydrates, seuls ou en mélange, en tant qu'aide à la cristallisation d'une macromolécule biologique.
9. Utilisation selon la revendication 7 caractérisée en ce que le complexe est utilisé en tant qu'agent nucléant et/ou en tant qu'agent cristallisant lors de la cristallisation d'une macromolécule biologique.
10. Utilisation selon la revendication 8 ou 9 caractérisée en ce que, dans le complexe, l'ion métallique = Os²⁺, Ir³⁺, Bi³⁺, Hf⁴⁺, Ce⁴⁺ et Ta⁵⁺ et le complexe est également utilisé en tant qu'aide à l'obtention de données structurales d'une macromolécule biologique.
11. Utilisation selon la revendication 10 caractérisée en ce que le complexe est utilisé en tant qu'agent phasant lors de la détermination structurale par diffraction des rayons X.
12. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que la macromolécule biologique comprend au moins un peptide.
13. Cristal dérivé d'une macromolécule biologique comprenant un complexe selon l'une des revendications 1 à 7 ou un de ses sels avec un anion lorsque le complexe est cationique, solvat ou hydrate.