JP6579560B2 - 重原子化化合物、膜タンパク質の結晶化を促進するための組成物、および該組成物を用いた膜タンパク質の構造解析方法 - Google Patents

Description

本発明は、重原子化化合物、膜タンパク質の結晶化を促進するための組成物、および該組成物を用いた膜タンパク質の構造解析方法に関し、より詳細には、膜タンパク質の結晶品質の低下を防止し得る、化合物および組成物、ならびに該組成物を用いた膜タンパク質の構造解析方法に関する。

膜タンパク質の構造と機能の解明は、生命科学に残された最大の課題の１つであり、医学・薬学における重要性も極めて高い。

一般に、タンパク質の構造解析には、単結晶Ｘ線解析が最も頻繁に用いられている。しかし、膜タンパク質のＸ線結晶構造解析の成功例は、水溶性タンパク質と比較して非常に少ない。現在タンパク質の立体構造データベース（ＰＤＢ）には、およそ１２万種類のタンパク質の立体構造が登録されているが、その多くは水溶性タンパク質に関するものである。膜タンパク質の立体構造は約６００種類が登録されているに過ぎない。

このように膜タンパク質の登録例が少ない理由の１つに、膜タンパク質の結晶構造の測定のために行われるフーリエ合成の際の位相角（位相情報）をどのように決定するかと言う点がある。一般的な位相情報の決定（位相決定）には、分子置換法(Molecular Replacement)、同型置換法（ＭＩＲ、ＳＩＲ）、多波長異常分散法（ＭＡＤ）または単一波長異常分散法（ＳＡＤ）のような方法がある（非特許文献１）。

しかし、これらの方法には、相同タンパク質の三次元構造が必要である、高品質の結晶が必要である、結晶化のために充分量を必要とする等の制限がある。このため、大量発現が困難な膜タンパク質には必ずしも容易に適用され得ないものであった。

これに対し、タンパク質の結晶を水銀原子や白金原子などの重原子を含有する重原子試薬（例えば、ＭｅＨｇＯＡｃおよびＫ_２ＰｔＣｌ_４）に浸漬してタンパク質と重原子との誘導体結晶を作製し、当該誘導体結晶を通じて位相決定と、当該タンパク質の構造解析とを行う方法が提案されている（非特許文献２）。

しかし、上記重原子試薬を用いて得られる誘導体結晶では、本質的に結晶化が容易でない膜タンパク質の結晶品質が維持されず、または当該品質がさらに低下して、所望の膜タンパク質について適切な構造解析の結果を得ることができないことが多い。

Jan Drenth，"Principle of Protein X-ray Crystallography"，１９９４年，ISBN 0-387-94091-X，Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg 坂部知平：監修「タンパク質の結晶化」，２００５年，ISBN 4-87698-657-6，京都大学学術出版会

本発明は、上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、膜タンパク質の結晶品質を低下させることなく容易に位相決定を行うことができ、かつ種々の膜タンパク質についての構造解析を可能にする、重原子化化合物、膜タンパク質の結晶化を促進するための組成物、および該組成物を用いた膜タンパク質の構造解析方法を提供することにある。

本発明は、以下の式（Ｉ）：

ここで、
Ｘ_１は：
単結合、
酸素原子、あるいは
−ＮＲ^１−（ここで、Ｒ^１は、水素原子；分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基であって、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、アルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；である）
であり、
Ｚは：
少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子で置換された炭素数６〜１１のアリール基であって、該アリール基の少なくとも１つの他の水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アリール基、もしくは
少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子で置換された炭素数３〜１０のヘテロアリール基であって、該ヘテロアリール基の少なくとも１つの他の水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、ヘテロアリール基、
であり、
Ａは：
分岐または環を形成していてもよい炭素数５〜２０のアルキル基であって、該アルキル基の少なくとも１つの水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アルキル基、
分岐または環を形成していてもよい炭素数５〜２０のアラルキル基であって、該アラルキル基の少なくとも１つの水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アラルキル基；
炭素数２〜２０のアルケニル基であって、該アルケニル基の少なくとも１つの水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アルケニル基；もしくは
以下の式（ＩＩ）：

（ここで、
Ｘ_２は：
単結合；
酸素原子；あるいは
−ＮＲ^２−（ここで、Ｒ^２は、水素原子；分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；である）
であり；そして
ｎは５から３０の整数である）で表される基；
である、重原子化化合物である。

１つの実施形態では、上記式（Ｉ）における、
Ｘ_１が単結合であり；
Ｚが、少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子で置換された炭素数６〜１１のアリール基であって、該アリール基の少なくとも１つの他の水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アリール基であり；そして
Ａが、以下の式（ＩＩ）：

（ここで、Ｘ_２およびｎは上記に定義した通りである）で表される基である。

さらなる実施形態では、上記式（Ｉ）における、Ｚが以下の式（ＩＩＩ）：

（ここで、Ｒ^３およびＲ^４は同一または異なっていてもよいハロゲン原子である）で表されるアリール基である。

１つの実施形態では、上記式（Ｉ）における、
Ｘ_１が−ＮＨ−であり；
Ｚが、少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子で置換された炭素数６〜１１のアリール基であって、該アリール基の少なくとも１つの他の水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アリール基であり；そして
Ａが、分岐または環を形成していてもよい炭素数５〜２０のアルキル基であって、該アルキル基の少なくとも１つの水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アルキル基である。

さらなる実施形態では、上記式（Ｉ）における、Ｚが以下の式（ＩＶ）：

（ここで、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９のうちの少なくとも１つはハロゲン原子であり、かつ残りがそれぞれ独立して、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、またはカルボキシル基である）で表されるアリール基である。

本発明はまた、膜タンパク質の結晶化を促進するための組成物であって、上記重原子化化合物および以下の式（Ｖ）：

（ここで、Ｒ^１０およびＲ^１１は同一または異なっていてもよいハロゲン原子である）
で表される重原子化化合物からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含有する、組成物である。

本発明はまた、膜タンパク質の構造解析方法であって、
脂質および界面活性剤を混合して脂質集合体を形成する工程；
該脂質集合体と膜タンパク質とを接触させて、膜タンパク質−脂質集合体結晶を形成する工程；
該膜タンパク質−脂質集合体結晶に、上記組成物を添加して、重原子誘導体結晶を形成する工程；ならびに
該重原子誘導体結晶のＸ線回折を通じて、該膜タンパク質の立体構造を判定する工程；
を包含する、方法である。

１つの実施形態では、上記脂質集合体は、バイセル、デンドリマー、およびリポソームからなる群より選択される少なくとも１種の分子群である。

さらなる実施形態では、上記脂質集合体はバイセルである。

本発明はまた、膜タンパク質の構造解析方法であって、
脂質、界面活性剤および上記組成物を混合して、重原子化化合物を含有する脂質集合体を形成する工程
該重原子化化合物を含有する脂質集合体と膜タンパク質とを接触させて、重原子誘導体結晶を形成する工程；ならびに
該重原子誘導体結晶のＸ線回折を通じて、該膜タンパク質の立体構造を判定する工程；
を包含する、方法である。

１つの実施形態では、上記重原子化化合物を含有する脂質集合体は、上記重原子化化合物を構造内部に取り込んだ形態で構成される、バイセル、デンドリマー、およびリポソームからなる群より選択される少なくとも１種の分子群である。

さらなる実施形態では、上記重原子化化合物を含有する脂質集合体は、上記重原子化化合物を構造内部に取り込んだ形態で構成される、バイセルである。

本発明によれば、膜タンパク質のＸ線結晶構造解析に必要な重原子誘導体結晶の位相決定を、当該誘導体の結晶品質の低下を招くことなく容易に行うことができる。これにより、膜タンパク質の構造解析を迅速かつより正確に行うことができる。

本発明の第１の膜タンパク質の構造解析方法に使用される重原子誘導体結晶の作製手順の例を説明するための模式図である。 本発明の第２の膜タンパク質の構造解析方法に使用される重原子誘導体結晶の作製手順の例を説明するための模式図である。 実施例７で得られた重原子誘導体結晶の全体構造を示す図であり、（ａ）は当該誘導体結晶の構造解析によって得られた実験的マップ（メッシュ）を有する全体構造（リボン状モデル）を示す図であり、そして（ｂ）は、（ａ）中に囲みを入れた部分（重原子化化合物（実施例２）の結合部位の周辺）を拡大した図である。

まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。

本明細書において、用語「炭素数１〜ｎの直鎖アルキル基」は、炭素数１からｎ（ここでｎは正の整数である）の任意の直鎖状アルキル基を包含して言う。この定義において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基」は、炭素数１から７の任意の直鎖状アルキル基、炭素数３から７の任意の分岐状アルキル基、および炭素数３から７の任意の環状アルキル基を包含し、例えば、炭素数１〜７の「直鎖状アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、およびｎ−ペプチル基が挙げられ；炭素数３から７の任意の分岐状アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル基、イソヘキシル基、ｔｅｒｔ−ヘキシル基、ｓｅｃ−ヘキシル基、イソヘプチル基、ｔｅｒ−ヘプチル基、ｓｅｃ−ヘプチル基などが挙げられ、炭素数３〜６の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどが挙げられる。また、用語「炭素数１〜３のアルキル基」は、炭素数１から３の任意の直鎖アルキル基をいい、例えば、メチル基、エチル基、およびｎ−プロピル基を包含する。さらに、用語「炭素数３〜６のシクロアルキル基」としては、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。またさらに、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数５〜２０のアルキル基」は、炭素数５から２０の任意の直鎖状アルキル基、炭素数５から２０の任意の分岐状アルキル基、および炭素数５から２０の任意の環状アルキル基を包含する。

本明細書において、用語「炭素数１〜３のアルコキシ基」は、炭素数１から３の任意の直鎖状のアルコキシ基をいい、例えばメチルオキシ基、エチルオキシ基、およびｎ−プロピルオキシ基を包含する。

本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。好ましくは、臭素原子またはヨウ素原子である。

本明細書において、用語「炭素数１〜３のアルキルアミノ基」は、アミノ基を構成する水素原子の１つまたは２つが、炭素数１から３の直鎖状のアルキル基で置換された基をいい、例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基などを包含する。

本明細書において、用語「炭素数６〜１１のアリール基」は、炭素数６から１１の任意のアリール基をいい、例えば、フェニル基、インデニル基などを包含する。

本明細書において、用語「炭素数５〜１４のアラルキル基」は、炭素数５から１４の任意のアラルキル基をいい、例えば、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基などを包含する。さらに、本明細書において、用語「炭素数５〜２０のアラルキル基」は、炭素数５から２０の任意のアラルキル基をいい、例えば、上記炭素数５〜１４のアラルキル基を包含する。

本明細書において、用語「炭素数３〜１０のヘテロアリール基」は、炭素数６〜１１のアリール基を構成する少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子および硫黄原子、ならびにこれらの組合せ）で置換された、炭素数３から１０の任意のヘテロアリール基をいい、例えば、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などを包含する。

本明細書において、用語「炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基」は、炭素数５〜１４のアラルキル基を構成する少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子および硫黄原子、ならびにこれらの組合せ）で置換された、炭素数４から１３の任意のヘテロアリールアルキル基をいい、例えば、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２−ピリジルエチル基、１−ピリジルエチル基、３−チエニルプロピル基などを包含する。

本明細書において、用語「炭素数２〜２０のアルケニル基」は、炭素数２から２０の任意の直鎖状のアルケニル基をいい、例えば、エテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基などを包含する。

本明細書において、用語「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子を包含する。

本明細書において、用語「重原子誘導体結晶」とは、脂質および界面活性剤から構成される脂質集合体と、重原子化化合物と、膜タンパク質とを含有する複合体の結晶を言い、例えば、脂質集合体内に膜タンパク質が添加されて再構成され、かつ当該脂質集合体に、重原子化化合物（本発明の重原子化化合物を包含する）が取り込まれた形態を有する、複合体の結晶を包含する。

以下、本発明について詳述する。

（重原子化化合物）
本発明の重原子化化合物は、以下の式（Ｉ）：

で表される構造を有する。ここで、式（Ｉ）において、
Ｘ_１は：
単結合、
酸素原子、あるいは
−ＮＲ^１−（ここで、Ｒ^１は、水素原子；分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基であって、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい、アルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；である）
であり、
Ｚは：
少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子で置換された炭素数６〜１１のアリール基であって、該アリール基の少なくとも１つの他の水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アリール基、もしくは
少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子で置換された炭素数３〜１０のヘテロアリール基であって、該ヘテロアリール基の少なくとも１つの他の水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、ヘテロアリール基、
であり、
Ａは：
分岐または環を形成していてもよい炭素数５〜２０（好ましくは６〜１１）のアルキル基であって、該アルキル基の少なくとも１つの水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アルキル基、
分岐または環を形成していてもよい炭素数５〜２０（好ましくは６〜１１）のアラルキル基であって、該アラルキル基の少なくとも１つの水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アラルキル基；
炭素数２〜２０（好ましくは６〜１４）のアルケニル基であって、該アルケニル基の少なくとも１つの水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アルケニル基；もしくは
以下の式（ＩＩ）：

（ここで、
Ｘ_２は：
単結合；
酸素原子；あるいは
−ＮＲ^２−（ここで、Ｒ^２は、水素原子；分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；である）
であり；そして
ｎは５から３０、好ましくは５から１６の整数である）で表される基；
である。

本発明の１つの実施形態では、本発明の重原子化化合物は、種々の膜タンパク質に対し、より安定した重原子誘導体結晶を提供することができるという点から、上記式（Ｉ）において、
Ｘ_１が単結合であり；
Ｚが、少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子で置換された炭素数６〜１１のアリール基であって、該アリール基の少なくとも１つの他の水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アリール基であり；そして
Ａが、以下の式（ＩＩ）：

（ここで、Ｘ_２およびｎは上記に定義した通りである）で表される基であることが好ましい（以下、このような構造を有する重原子化化合物を「ＨＡＣ１」ということがある）。

さらに、本発明の１つの実施形態では、上記重原子化化合物（ＨＡＣ１）は、式（Ｉ）におけるＺが、好ましくは以下の式（ＩＩＩ）：

（ここで、Ｒ^３およびＲ^４は同一または異なっていてもよいハロゲン原子である）で表されるアリール基であり、より好ましくは以下の式（ＩＩＩ’）：

（ここで、Ｒ^３およびＲ^４は同一または異なっていてもよいハロゲン原子である）で表されるアリール基である構造を有する。

本発明の重原子化化合物（ＨＡＣ１）のうち、このような構造を有するさらに具体的な化合物の例としては、以下の式（ＶＩ）：

（ここで、Ｘ_２、Ｒ^３およびＲ^４、ならびにｎは上記に定義した通りである）で表される化合物が挙げられる。

上記式（ＶＩ）の化合物は両親媒性化合物であり、後述する膜タンパク質の構造解析方法において脂質集合体との溶解性が良好であり、かつ膜タンパク質と特異的に結合する性質を有する。

本発明の１つの実施形態では、本発明の重原子化化合物はまた、種々の膜タンパク質に対し、より安定した重原子誘導体結晶を提供することができるという点から、上記式（Ｉ）において、
Ｘ_１が−ＮＨ−であり；
Ｚが、少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子で置換された炭素数６〜１１のアリール基であって、該アリール基の少なくとも１つの他の水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アリール基であり；そして
Ａが、分岐または環を形成していてもよい炭素数５〜２０のアルキル基であって、該アルキル基の少なくとも１つの水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アルキル基であることが好ましい（以下、このような構造を有する重原子化化合物を「ＨＡＣ２」ということがある）。

さらに、本発明の１つの実施形態では、上記重原子化化合物（ＨＡＣ２）は、式（Ｉ）におけるＺが、好ましくは以下の式（ＩＶ）：

（ここで、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９のうちの少なくとも１つはハロゲン原子であり、かつ残りがそれぞれ独立して、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、またはカルボキシル基である）で表されるアリール基であり、より好ましくは以下の式（ＩＶ’）：

（ここで、Ｒ^５’、Ｒ^６’およびＲ^７’は同一または異なっていてもよいハロゲン原子であり、そしてＲ^８’およびＲ^９’はそれぞれ独立して、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、またはカルボキシル基である）で表されるアリール基である構造を有する。

本発明の重原子化化合物（ＨＡＣ２）のうち、このような構造を有するさらに具体的な化合物の例としては、以下の式（ＶＩＩ）：

（ここで、Ｒ^５’、Ｒ^６’、Ｒ^７’、Ｒ^８’およびＲ^９’は上記に定義した通りであり、そしてｍは４〜１９、好ましくは４〜１２の整数である）で表される化合物が挙げられる。

上記式（ＶＩＩ）の化合物もまた両親媒性化合物であり、後述する膜タンパク質の構造解析方法において脂質集合体との溶解性が良好であり、かつ膜タンパク質と特異的に結合する性質を有する。

本発明の１つの実施形態では、本発明の重原子化化合物はまた、種々の膜タンパク質に対し、より安定した重原子誘導体結晶を提供することができるという点から、上記式（Ｉ）において、
Ｘ_１が−ＮＨ−であり；
Ｚが、少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子で置換された炭素数６〜１１のアリール基であって、該アリール基の少なくとも１つの他の水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アリール基であり；そして
Ａが、炭素数２〜２０のアルケニル基であって、該アルケニル基の少なくとも１つの水素原子が、分岐または環を形成していてもよい炭素数１〜７のアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜６のシクロアルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数６〜１１のアリール基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数５〜１４のアラルキル基；炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数３〜１０のヘテロアリール基；または炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、およびカルボキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基で置換されていてもよい炭素数４〜１３のヘテロアリールアルキル基；で置換されていてもよい、アルケニル基であることが好ましい（以下、このような構造を有する重原子化化合物を「ＨＡＣ３」ということがある）。

さらに、本発明の１つの実施形態では、上記重原子化化合物（ＨＡＣ３）は、式（Ｉ）におけるＺが、好ましくは以下の式（ＩＶ）：

（ここで、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９のうちの少なくとも１つはハロゲン原子であり、かつ残りがそれぞれ独立して、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、またはカルボキシル基である）で表されるアリール基であり、より好ましくは以下の式（ＩＶ’）：

（ここで、Ｒ^５’、Ｒ^６’およびＲ^７’は同一または異なっていてもよいハロゲン原子であり、そしてＲ^８’およびＲ^９’はそれぞれ独立して、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、炭素数１〜３のアルキルアミノ基、シアノ基、水酸基、またはカルボキシル基である）で表されるアリール基である構造を有する。

本発明の重原子化化合物（ＨＡＣ３）のうち、このような構造を有するさらに具体的な化合物の例としては、以下の式（ＶＩＩＩ）：

（ここで、Ｒ^５’、Ｒ^６’、Ｒ^７’、Ｒ^８’およびＲ^９’は上記に定義した通りであり、そしてｐとｑとの合計（すなわち、ｐ＋ｑ）は２〜１８の整数である、好ましくはｐおよびｑがそれぞれ独立して１〜１０の整数である）で表される化合物が挙げられる。

上記式（ＶＩＩＩ）の化合物もまた両親媒性化合物であり、後述する膜タンパク質の構造解析方法において脂質集合体との溶解性が良好であり、かつ膜タンパク質と特異的に結合する性質を有する。

本発明の重原子化化合物は、公知の化合物から、例えば一つの反応工程を経て製造することができる。

本発明の重原子化化合物は、膜タンパク質などのタンパク質との結晶化を促進して、重原子誘導体結晶を容易に形成し得る。このため、本発明の重原子化化合物は、例えば、タンパク質のＸ線結晶構造解析に利用される結晶化促進試薬として使用することができる。

（膜タンパク質の結晶化を促進するための組成物）
次に、本発明の膜タンパク質の結晶化を促進するための組成物（結晶化促進組成物）について説明する。

本発明の結晶化促進組成物は、膜タンパク質などのタンパク質との結晶化を促進して、重原子誘導体結晶を容易に形成することができる。本発明の結晶化促進組成物は、式（Ｉ）：

（ここで、Ａ、Ｘ_１およびＺはそれぞれ独立して、上記に定義した通りである）で表される重原子化化合物、および／または以下の式（Ｖ）：

（ここで、Ｒ^１０およびＲ^１１は同一または異なっていてもよいハロゲン原子である）
で表される重原子化化合物を含有する。

本発明の結晶化促進組成物において、式（Ｉ）で表される重原子化化合物のより好ましい例は、上記の通りである。一方、式（Ｖ）で表される化合物は疎水性化合物であり、後述する膜タンパク質の構造解析方法において脂質集合体との溶解性が良好であり、かつ膜タンパク質と特異的に結合する性質を有する。

式（Ｖ）で表される化合物の好ましい例としては、以下の式（Ｖ’）：

（ここで、Ｒ^１０およびＲ^１１は上記で定義した通りである）で表される重原子化化合物が挙げられる。式（Ｖ）または（Ｖ’）で表される化合物は公知であり、本発明の結晶化促進組成物のために、例えば市販の化合物を使用することができる。

本発明の結晶化促進組成物は、例えば、脂質集合体と膜タンパク質とを接触させて得られた膜タンパク質−脂質集合体結晶に添加することにより、脂質存在下での膜タンパク質の結晶化が高められた重原子誘導体結晶（膜タンパク質−脂質集合体結晶）を形成することができる。あるいは、当該重原子誘導体結晶は、脂質と界面活性剤と本発明の組成物とを混合して、重原子化化合物を含有する脂質集合体を形成し、その後当該脂質集合体を膜タンパク質と接触させることにより形成することもできる。あるいは、当該重原子誘導体結晶は、脂質と界面活性剤と本発明の組成物とを混合して、重原子化化合物を含有する脂質集合体を形成し、その後当該脂質集合体を膜タンパク質と接触させ、さらに本発明の組成物（同一または異なっていてもよい）を添加することにより形成することができる。

本発明の結晶化促進組成物を用いて得られた重原子誘導体結晶（膜タンパク質−脂質集合体結晶）は、例えば、膜タンパク質のＸ線結晶構造解析に利用可能な試薬として有用である。

（膜タンパク質の構造解析方法）
本発明の膜タンパク質の構造解析方法は、いくつかの重原子誘導体結晶（膜タンパク質−脂質集合体結晶）を経て行うことができる。ここで、本発明の第１の膜タンパク質の構造解析方法として、脂質集合体としてバイセル（平面状脂質二重層）を用いた場合について説明する。

図１は、本発明の第１の膜タンパク質の構造解析方法に使用される重原子誘導体結晶の作製手順の例を説明するための模式図である。

本発明の第１の方法では、まず、脂質１６および界面活性剤２０を混合して、脂質集合体１００が形成される（図１の（ａ））。

脂質１６の例としては、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、アーキオール、およびカルドアーキオール、ならびにそれらの組合せが挙げられ、より具体的な例としては、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、コレステロールおよびにスフィンゴミエリン、ならびにそれらの組合せが挙げられる。本発明において、脂質１６には、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンが好ましい。

界面活性剤２０の例としては、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、および非イオン性界面活性剤、ならびにそれらの組合せが挙げられる。アニオン性界面活性剤の例としては、コール酸ナトリウム水和物、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム水和物、タウロコール酸ナトリウム塩水和物、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩溶液、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、およびドデシル硫酸ナトリウム、ならびにそれらの組合せが挙げられる。カチオン性界面活性剤の例としては、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ならびにそれらの組合せが挙げられる。両性界面活性剤の例としては、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート水和物）、Ｃ７ＢｚＯ（３−（４−ヘプチル）フェニル−３−ヒドロキシプロピル）ジメチルアンモニオプロパンスルホナート）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホン酸分子内塩、３−（デシルメチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸、３（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、および３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホナートならびにそれらの組合せが挙げられる。非イオン性界面活性剤の例としては、Ｎ，Ｎ−ビス［３−（Ｄ−グルコンアミド）プロピル］デオキシコールアミド、Ｂｒｉｊ Ｌ２３（ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル）、Ｂｒｉｊ ５８（ポリオキシエチレン２０セチルエーテル）、２−シクロヘキシルエチルβ−Ｄ−マルトシド、６−シクロヘキシルヘキシルβ−Ｄ−マルトシド、ジヒドロウラシル、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、ウンデシルβ−Ｄ−マルトシド、デシル−β−Ｄ−１−チオマルトピラノシド、オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド溶液、オクチルβ−Ｄ−チオグルコピラノシド、ジギトニン、ジメチルデシルホスフィンオキシド、Ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミン、およびＮ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ならびにそれらの組合せが挙げられる。本発明において界面活性剤２０には両性界面活性剤が好ましく、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート）がより好ましい。

脂質集合体１００の形成は、例えば、上記脂質１６および界面活性剤２０をそれぞれ含有する水溶液を混合することにより行われる。なお、上記では脂質集合体１００がバイセルである場合について説明したが、本発明は必ずしもこれに限定されない。本発明に用いられる脂質集合体の例としては、リポソーム、バイセル（平面状脂質二重層）、およびデンドリマー（球状脂質ベシクル）ならびにこれらの組合せが挙げられる。

次いで、脂質集合体１００と膜タンパク質３０とが接触させられ、膜タンパク質−脂質集合体結晶が形成される。

膜タンパク質３０は構造解析を要するタンパク質であり、例えば、図１の（ａ）に示すように、細胞膜中で脂質１８に取り囲まれた形態で存在する。本発明では、当該脂質１８に取り囲まれた膜タンパク質３０が脂質集合体１００と接触すると、脂質集合体１００の内部に膜タンパク質３０および一部の脂質１８を取り込んで再構成が行われ、膜タンパク質−脂質集合体１１０の結晶が形成される（図１の（ｂ））。

脂質集合体１００と膜タンパク質３０との接触は、例えば、上記で得られた脂質集合体１００を、膜タンパク質３０を含有する緩衝液と混合して結晶化のための母液を調製することにより行われる。脂質集合体１００と膜タンパク質３０との混合比は、必ずしも限定されないが、体積を基準として好ましくは１：１〜１：１０、より好ましくは１：３〜１：５である。このような混合比を採用することにより、後述するような構造解析において有用な単結晶化を促すことができる。混合の際の温度は特に限定されないが、脂質集合体１００と膜タンパク質３０との混合が容易となる（温度の上昇に比例して脂質集合体１００の粘度が上昇するためである）理由から、０℃〜６℃の温度に調節されていることが好ましい。

本発明においては、膜タンパク質−脂質集合体１１０をより大きな結晶に成長させるために、ソーキング法などの当該分野において公知の手法を用いて結晶化を促進してもよい。

こうして膜タンパク質−脂質集合体１１０の結晶が形成される。

次いで、膜タンパク質−脂質集合体１１０の結晶に、本発明の結晶化促進組成物４２が添加される。

上記結晶化促進組成物４２の添加において、構成成分である重原子化化合物４０（すなわち、上記式（Ｉ）の重原子化化合物、および／または式（Ｖ）で表される重原子化化合物）は、膜タンパク質−脂質集合体結晶を含む母液に対し、最終濃度が好ましくは０．００１モル〜０．０１モル、より好ましくは０．００３モル〜０．００６モルとなる割合で添加される。添加される重原子化化合物の量が０．００１モルを下回ると、後述する重原子誘導体結晶（膜タンパク質−脂質集合体結晶）が充分に形成されず、結果として膜タンパク質の立体構造を判定する際に位相決定を適切に行うことが困難になるおそれがある。添加される重原子化化合物の量が０．０１モルを上回ると、膜タンパク質−脂質集合体結晶の品質が大きく低下するおそれがある。

本発明の結晶化促進組成物は、上記のように両親媒性分子および／または疎水性分子である化合物を含有する。これにより、膜タンパク質−脂質集合体１１０を構成する脂質二重膜の一部が溶解し、これらの化合物が当該集合体内に取り込まれる。

このようにして、脂質集合体を構成する脂質１６，１８の内部に重原子化化合物４０と、膜タンパク質３０とが取り込まれた重原子誘導体結晶（膜タンパク質−脂質集合体結晶）１２０が形成される（図２の（ｂ））。

次いで、重原子誘導体結晶１２０のＸ線回折を通じて、当該膜タンパク質の立体構造が判定される。

重原子誘導体結晶１２０のＸ線回折を通じた立体構造の解析には、単一波長異常分散法（ＳＡＤ）、同型置換法（ＭＩＲ，ＳＩＲ）、多波長異常分散法（ＭＡＤ）などの当該分野において公知の方法が採用され得る。ここで、単一波長異常分散法（ＳＡＤ）を用いる場合について例示すると、まず、上記重原子誘導体結晶の得るために用いられた本発明の結晶化促進組成物における重原子化化合物を構成するハロゲン原子（ヨウ素原子等）特有の吸収端を最も高くするＸ線波長がＸＡＦＳ測定（Ｘ線吸収微細構造測定）により設定される。そして、このＸ線波長を有するシンクロトロン放射光を当該重原子誘導体結晶に照射し、市販の自動解析ソフトを用いることにより目的とする膜タンパク質の立体構造を把握することができる。シンクロトロン放射光は、我が国においては「ＳＰｒｉｎｇ−８」（兵庫県佐用郡佐用町）または「Ｐｈｏｔｏｎ Ｆａｃｔｏｒｙ」（茨城県つくば市）の設備を利用することができる。なお、本発明においては、解析データの精度を高めるために、Ｘ線回折分解能として３．５Å以上のＸ線回折データを使用することが好ましい。

このようにして膜タンパク質の構造解析を行うことができる。

次に、本発明の第２の膜タンパク質の構造解析方法として、脂質集合体としてバイセルを用いた場合について説明する。

図２は、本発明の第２の膜タンパク質の構造解析方法に使用される重原子誘導体結晶の作製手順の例を説明するための模式図である。

本発明の第２の方法では、まず、脂質１６、界面活性剤２０および本発明の結晶化促進化組成物４２が混合され、重原子化化合物を含有する脂質集合体１０２が形成される。

本発明の第２の方法で使用する脂質１６、界面活性剤２０および結晶化促進組成物４２の種類および量は、上記本発明の第１の方法で使用する場合と同様である。第２の方法では、脂質集合体と膜タンパク質との再構成を行う前に、脂質集合体１０２内部の疎水性部分に重原子化化合物４０が予め取り込まれた形態で存在する。

重原子化化合物を含有する脂質集合体１０２の形成は、例えば、上記脂質１６、界面活性剤２０および結晶化促進組成物４２をそれぞれ含有する水溶液を混合することにより行われる。なお、上記では脂質集合体１０２がバイセルである場合について説明したが、本発明は必ずしもこれに限定されない。本発明に用いられる脂質集合体の例としては、リポソーム、バイセル（平面状脂質二重層）、およびデンドリマー（球状脂質ベシクル）ならびにこれらの組合せが挙げられる。

次いで、重原子化化合物を含有する脂質集合体１０２と膜タンパク質３０とが接触させられる。

本発明では、膜タンパク質３０が上記脂質集合体１０２と接触すると、脂質集合体１０２の内部に膜タンパク質３０および一部の脂質１８を取り込んで再構成が行われ、脂質集合体を構成する脂質１６，１８の内部に重合化化合物４０と、膜タンパク質３０とが取り込まれた重原子誘導体結晶（膜タンパク質−脂質集合体結晶）１２０が形成される（図２の（ｂ））。

次いで、重原子誘導体結晶１２０のＸ線回折を通じて、当該膜タンパク質の立体構造が判定される。

重原子誘導体結晶１２０のＸ線回折は、上記本発明の第１の方法と同様にして行なわれる。

このようにして膜タンパク質の構造解析を行うことができる。

なお、本発明の構造解析方法では、さらなる第３の方法として。上記第１の方法と第２の方法とを組み合わせてもよい。この場合、まず本発明の第２の方法と同様に、脂質１６、界面活性剤２０および本発明の結晶化促進化組成物４２が混合され、重原子化化合物を含有する脂質集合体１０２が形成される。次いで、重原子化化合物を含有する脂質集合体１０２と膜タンパク質３０とが接触させられる。そして、この段階において、上記本発明の第１の方法のように、膜タンパク質−脂質集合体（重原子化化合物を含有する）の結晶に、本発明の結晶化促進組成物が再び添加される。このようにして得られた重原子誘導体結晶（膜タンパク質−脂質集合体結晶）のＸ線回折を通じて、当該膜タンパク質の立体構造が判定され得る。

本発明の方法によれば、本来結晶化が困難な膜タンパク質であっても重原子誘導体結晶を容易に作製することが可能となる。また、本発明においては、重原子化化合物を構成する重原子の影響を受けて結晶の品質の低下（具体的には結晶中で規則正しく配列した膜タンパク質に外部から重原子が結合することにより、結晶中の膜タンパク質の配列が乱されることによる低下）を回避し得る。これにより、未知の膜タンパク質についてその立体構造解析を簡便に行うことできる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

（実施例１：５−カプリロイルアミノ−２，４，６−トリヨード−イソフタル酸（化合物２）の合成）

５−アミノ−２，４，６−トリヨード−イソフタル酸（化合物１；２５０ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）およびｎ−オクタン酸（１．０ｇ，６．９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン中で混合し、そして塩化チオニル（０．１ｍＬ，１．４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、ニート条件で室温にて１５時間撹拌した。次いで、塩化チオニル（０．１ｍＬ，１．４ｍｍｏｌ）の追加部分を添加し、そして７０℃で２時間撹拌した。得られた混合物を室温まで冷却し、そして水（２０ｍＬ）でクエンチした。沈殿物を濾過により回収し、残渣をＳｉＯ_２クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１：１）およびＳｅｐＰａｋ Ｃ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）（メタノール：水＝１：１０）を用いて精製し、標題の化合物２（１８４ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ，収率６０％）を白色固体として得た。

得られた化合物２の物性データを以下に示す。

（実施例２：５−ミリストイルアミノ−２，４，６−トリヨード−イソフタル酸（化合物３）の合成

５−アミノ−２，４，６−トリヨード−イソフタル酸（７６０ｍｇ，１．３６ｍｍｏｌ）と、ｎ−ミリスチン酸（５００ｍｇ，２．１９ｍｍｏｌ）を、ジクロロエタン（１０ｍＬ）に溶解させた。さらに、塩化チオニル（０．４ｍＬ，６０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で撹拌した後、７０℃でさらに１８時間撹拌した。反応終了後、水（２０ｍＬ）を添加して固体を回収し、テトラヒドロフランで溶解して抽出した。テトラヒドロフランを減圧留去した後、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール＝１：１）で精製した。さらに、逆相Ｃ１８カートリッジを用い、（メタノール−水、１／１０）で精製し、標題の化合物３（５２０ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ，収率５１％）を白色固体（白色粉末）として得た。

得られた化合物３の物性データを以下に示す。

（実施例３：Ｎ−オクチル−２，３，５−トリヨードベンズアミド（化合物５）の合成）

２，３，５−トリヨード安息香酸（化合物４；０．４８ｇ，０．９５ｍｍｏｌ）にジクロロメタン２０ｍＬを添加し、０℃まで冷却した。ｎ−オクチルアミン（０．２３ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ；０．２７ｇ，１．４５ｍｍｏｌ）を添加した後、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；０．１７ｇ，１．４５ｍｍｏｌ）を添加し、還流下にて２２時間撹拌した。少量の水でクエンチした後、クロロホルムで抽出し、塩化アンモニウム水溶液および塩化ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄して、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、標題の化合物５（０．４６ｇ，０．７６ｍｍｏｌ，収率８１％）を白色固体（白色粉末）として得た。

得られた化合物５の物性データを以下に示す。

（実施例４：Ｎ−オクチル−３−ブロモ−５−ヨードベンズアミド（化合物７）の合成）

３−ブロモ−５−ヨード安息香酸（化合物６；０．４７ｇ，１．４４ｍｍｏｌ）にジクロロメタン（２０ｍＬ）を添加し、０℃まで冷却した。ｎ−オクチルアミン（０．２３ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ；０．２７ｇ，１．４５ｍｍｏｌ）を添加した後、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；０．１７ｇ，１．４５ｍｍｏｌ）を添加し、還流下で２２時間攪拌した。少量の水でクエンチした後、クロロホルムで抽出し、塩化アンモニウム水溶液および塩化ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄して、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、標題の化合物７（０．４２ｇ，０．９６ｍｍｏｌ，収率７２％）を白色固体（白色粉末）として得た。

得られた化合物７の物性データを以下に示す。

（実施例５：１−Ｏ−ミリストイル−２−Ｏ−（３−ヨード−５−ブロモ−ベンゾイル）−３−ｓｎ−ホスファチジルコリン（化合物９）の合成）

反応前に、リゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ ＰＣ（Ｃ１４：０））（化合物８；６４ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）および３−ブロモ−５−ヨード安息香酸（８０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を反応フラスコに添加し、乾燥トルエンで３回共沸させた。次いで、混合物を、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｍＬ）に溶解し、そして２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物（ＮＭＢＡ；１１０ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）および４−ピロリジノピリジン（９８ｍｇ，０．６６ｍｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）溶液を、キャニュラーを用いて反応フラスコに添加した。室温で１２時間撹拌した後、反応混合物を、少量のＭｅＯＨでクエンチし、そして溶媒を減圧留去した。残渣をＳｉＯ_２フラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝３：２からクロロホルム：メタノール：水＝６５：２５：２）で精製し、標題の化合物９（６９ｍｇ，０．０８９ｍｍｏｌ，収率６４％）を白色粉末として得た。

得られた化合物９の物性データを以下に示す。

（実施例６：１−Ｏ−ミリストイル−２−Ｏ−（２，３，５−トリヨードベンゾイル）−３−ｓｎ−ホスファチジルコリン（化合物１０）の合成）

リゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ ＰＣ（Ｃ１４：０））（化合物８；２０ｍｇ，０．０４２ｍｍｏｌ）および２，３，５−トチヨード安息香酸（４２．５ｍｇ，０．０８５ｍｍｏｌ）を反応フラスコに添加し、乾燥トルエンで共沸させた。次いで、混合物を、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｍＬ）に溶解し、そして２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物（ＮＭＢＡ；７４ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）および４−ピロリジノピリジン（６１ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）溶液を、キャニュラーを用いて反応フラスコに添加した。室温で１２時間撹拌した後、反応混合物を、少量のＭｅＯＨでクエンチし、そして溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：水＝６５：２５：２）で精製し、標題の化合物１０（２７ｍｇ，０．０２８ｍｍｏｌ，収率６７％）を白色粉末として得た。

得られた化合物１０の物性データを以下に示す。

（実施例７：両親媒性重元素化化合物（化合物１１）の合成）

５−アミノ−２，４，６−トリヨードイソフタル酸（５０ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）と、塩化ステアロイル（１３６ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）に溶解し、５５℃で１２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去し、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５：１）で精製して、標題の化合物１１（５２ｍｇ，０．０６３ｍｍｏｌ，収率７０％）を白色粉末として得た。

得られた化合物１１の物性データを以下に示す。

（実施例８：両親媒性重元素化化合物（化合物１２）の合成）

オレイン酸（５８ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）に塩化チオニル（８０μＬ，１．１ｍｍｏｌ）を添加し、５５℃で１３時間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣に市販の５−アミノ−２，４，６−トリヨードイソフタル酸（２３ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を添加し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）に溶解し、７０℃で１２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去し、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５：１）で精製して、標題の化合物１２（８ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ，２４％）を得た。

得られた化合物１２の物性データを以下に示す。

（調製例１：バクテリオロドプシン（ｂＲ）の紫膜の精製）
バクテリオロドプシン（ｂＲ）は、最も研究されている膜タンパク質の１つであり、バイセル結晶化が最初に成功した膜タンパク質であることが知られている。これをモデル膜タンパク質として採用するため、バクテリオロドプシン（ｂＲ）の紫膜を、以下のようにして精製した。

ハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）野生株Ｒ１Ｍ１を、表９に示す共通成分、２つの金属栄養成分（ＭＳＭＫ）および脱イオン水を含有する培地（５００ｍＬ）にて３７℃で３日間、前培養を行った。

その後、前培養の培養液を１０Ｌの培養ボトルに採り、充分な量の新たな培地で３７℃にて７日間かけて通気培養を行うことにより本培養を行った。この本培養を経て、培養液を、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離にかけ、菌体を採取した。

次いで、この菌体を、培養液に懸濁してＤＮアーゼで処理し、透析により分離し、５，０００×ｇで４０分間遠心分離にかけ、０．１Ｍの塩化ナトリウム水溶液で洗浄することにより、バクテリオロドプシンの紫残渣（ＰＲ）を得た。さらに。得られた残渣（ＰＲ）を、７５，０００×ｇで１８時間遠心分離にかけ、３０％〜５０％のスクロース水溶液のグラジエントにかけて、紫色のバンド部分を回収した。これを水および０．３％Ｔｗｅｅｎ ２０でそれぞれ洗浄し、５０，０００×ｇで４０分間遠心分離にかけ、さらに水で洗浄して、バクテリオロドプシン（ｂＲ）の紫膜を得た。

その後、F.Lopezら、Photochem.and Photobiolog.,1999,69(5),p.599-604に記載の方法に従って、得られたバクテリオロドプシン（ｂＲ）の紫膜（１２ｍｇ）を、５ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有）とｐＨ５．０にて室温で６４時間処理し、さらに５０ｍＬの０．４％コール酸ナトリウム水溶液（０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび２５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を含有）を添加して、カラム（Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製））にかけ、溶出物を最終的に４Ｍの塩化ナトリウム水溶液（２５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．２）および０．５％のｎ−オクチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＴＧ）を含有）で可溶化することにより、精製されたバクテリオロドプシン（ｂＲ）の紫膜を得た。

（実施例９：バクテリオロドプシン（ｂＲ）のＸ線結晶解析（１））
（１）バイセル中のｂＲの結晶化
調製例１で得られたバクテリオロドプシン（ｂＲ）の紫膜の濃度を、２０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０１％（ｗ／ｖ）のＮａＮ_３を含有する、２ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で９．０ｍｇ／ｍＬに調節した。２５ｍｇの１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ；Ａｖａｎｔｉ社製）を、８３．３μＬ（１０％（ｗ／ｖ））の３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）および１０μｌの水と混合し、そして４０℃にて５分間インキュベートして、２５％（ｗ／ｖ）のＤＭＰＣ／ＣＨＡＰＳＯバイセルを調製した。次いで、上記紫膜とＤＭＰＣ／ＣＨＡＰＳＯバイセルとを４：１の混合比（体積比）で混合し、そして暗所で０℃にて３０分間インキュベートして、試料を得た。１．５ｍＬのマイクロチューブ中で、２０μＬの試料を、２０μＬの沈殿剤溶液（３．２ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３．５％（ｗ／ｖ）のトリエチレングリコールおよび１８０ｍＭの１，６−ヘキサンジオールを含有）と混合した。そして、外液には１００μＬの沈殿剤溶液を使用した。この試料を暗所にて２７℃でインキュベートし、そして１日で大きな結晶が成長した。大きな結晶を、超音波ホモジナイザー（株式会社トミー精工製ＵＤ−２１１）で破壊することにより、種結晶溶液を調製した。

Ｘ線回折のための微結晶を、ｂＲの種結晶溶液を用いる回転結晶化技術(rotational crystallization technique)を用いることにより成長させた。２．０ｍＬのマイクロチューブにて、ｂＲを含む２０μＬのバイセルを１２０μＬの沈殿剤溶液と混合し、そして２μＬのシード溶液を添加した。このマイクロチューブを、小形回転培養機（タイテック株式会社製ローテーターＲＴ−５０）に、１８ｒｐｍにて２０℃で２日間配置した。デジタルマイクロスコープ（株式会社ハイロックス製ＫＨ−８７００）を用いて観察したところ、微結晶のサイズは１０μｍと７０μｍとの間に分布していた。これに、実施例１で得られた化合物２（５−カプリロイルアミノ−２，４，６−トリヨード−イソフタル酸）を４ｍＭの最終濃度にてチューブに添加し、そしてさらに３日間回転を続けた。

（２）Ｘ線回折データの収集
Ｘ線回折データの収集の前に、ｂＲの微結晶をグリースマトリックス（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｒｅａｓｅ Ｓｕｐｅｒ Ｌｕｂｅ ＃２１０３０，Ｓｙｎｃｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）と混合し、シリンジ（ノズルの開口直径１５０μｍ）に充填した（このシリンジは、Weierstallら、Nature communications, 2014, 5, p.3309により報告されたＬＣＰインジェクタの設計に基づいて開発された）。油圧シリンダ、取り外し可能な試料リザーバおよびノズルから構成される新たなインジェクタをチャンバ内に設け、そしてインジェクタの温度を水を循環させることにより２０℃にて一定に保持した。Ｘ線回折データは、ＣＣＤ検出器を用いて、ＳＡＣＬＡ（ＳＰｒｉｎｇ−８ Ａｎｇｓｔｒｏｍ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｆｒｅｅ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｌａｓｅｒ）のビームラインＢＬ３（ＥＨ４）にて収集した。インジェクタを、回折チャンバエンクロージャ（ＳＡＣＬＡにおけるＨａｒｄ Ｘ−ｒａｙ ＤｉｆｆｒａｃｔｉｏｎのためのＤｉｖｅｒｓｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＤＡＰＨＮＩＳ））内に取り付けた。試料チャンバをヘリウムガスで満たし、そして２０℃で７０％〜９９％の湿度に維持した。流速を、０．９５μＬ／分（８９６μｍ／秒）にセットした。微結晶に、単一ＸＦＥＬパルス（光子エネルギー７．０ｋｅＶ、持続時間２〜１０ｆｓ、および繰り返し速度３０Ｈｚ）を照射した。ＸＦＥＬパルスは、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ−Ｂａｅｚミラーを用いる相互作用点で１．４μｍ（高さ）×１．７μｍ（幅）にフォーカスされた２．１×１０^１１光子／パルスから構成されていた。試料の代表的なパルスエネルギーは、２４０μＪ／パルスであった。

（３）位相決定および構造決定
得られたＸ線回折データのインデックス化を、プログラムＤｉｒＡｘ(Duisenberg、Journal of Applied Crystallography, 1991, 25, p.92-96)を用いて実行した。すべてのＸ線回折データセットは、空間群Ｃ２２２_１にインデックス化した。結晶の平均格子定数は、すべてのＸ線回折データセットについてａ＝４６．２Å、ｂ＝１０３．０Åおよびｃ＝１２８．７Åであった。すべてのＸ線回折強度を、プログラムパッケージＣｒｙｓｔＦＥＬの中にあるｐｒｏｃｅｓｓ＿ｈｋｌを用いてマージした。統計データを表１０に示す。

重原子誘導体結晶の構造を、単一波長異常分散法（ＳＡＤ）により決定した。その際の位相決定を、ＳＨＥＬＸ（Sheldrick、GM (2010) Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66(Pt 4):479-485）を用いて行った。

得られた結果をＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ(www.pdb.org)にＰＤＢ ＩＤ ５Ｂ３４（ＨＡＤ１３ａ）として登録した。また、得られたバクテリオロドプシン（ｂＲ）と結合した重原子化化合物（化合物２）の全体構造を描いた図を表した（図３）。以上のことから、実施例１で得られた重原子化化合物（化合物２）は、膜タンパク質の立体構造解析における重原子試薬として有用であることがわかる。

（実施例１０：バクテリオロドプシン（ｂＲ）のＸ線結晶解析（２））
２５ｍｇの１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ；Ａｖａｎｔｉ社製）を、８３．２８μＬの３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の１０％ｗ／ｖ水溶液と混合した。次いで、そこへ実施例５で得られた化合物９（７．７８０２ｍｇ，０．０１００２ｍｍｏｌ）を添加し、そして氷冷（０℃、約２０秒）−撹拌−加温（４５℃、約２０秒）−ピペッティングの工程を４回〜６回繰り返すことにより、化合物９を含有する４０％（ｗ／ｖ）バイセル溶液を得た。

一方、調製例１で得られたバクテリオロドプシン（ｂＲ）の紫膜の濃度を、２０ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％（ｗ／ｖ）のＮａＮ_３を含有する、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で８．０ｍｇ／ｍＬに調節した。次いで、上記紫膜と、化合物９を含有するバイセル溶液とを４：１の混合比（体積比）で混合し、そして暗所で氷上にて３０分間インキュベートして、試料を得た。マイクロチューブ中で、２０μＬの試料を、２０μＬの沈殿剤溶液（２．４ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３．５％（ｗ／ｖ）のトリエチレングリコールおよび１２０ｍＭの１，６−ヘキサンジオールを含有）と混合した。そして、外液には１００μＬの沈殿剤溶液を使用した。この試料を暗所にて３０℃でインキュベートし、そして数日後に結晶が観察された。

このようにして、実施例５で得られた化合物９を重原子化化合物として含有する重原子誘導体結晶を得た。得られた重原子誘導体結晶は、実施例９と同様にして、Ｘ線回折によるｂＲの立体構造解析に使用することができる。

（実施例１１：バクテリオロドプシン（ｂＲ）のＸ線結晶解析（３））
実施例５で得られた化合物９の代わりに、重原子化化合物として以下の式（ＶＩ）：

（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）（０．８１８９ｍｇ，０．００２５０５ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、実施例１０と同様にして、当該式（ＶＩ）の化合物を重原子化化合物として含有する重原子誘導体結晶を得た。得られた重原子誘導体結晶は、実施例９と同様にして、Ｘ線回折によるｂＲの立体構造解析に使用することができる。

本発明によれば、立体構造未知の膜タンパク質について、当該膜タンパク質の結晶品質を低下させることなく容易に位相決定を行うことができる。これにより、種々の膜タンパク質についての立体構造解析を簡便に行うことができる。本発明は、細胞膜のダイナミックな生理機能発現における研究開発において有用であり、例えば、創薬分野における標的化合物の基礎情報として活用することができる。

１６，１８ 脂質
２０ 界面活性剤
３０ 膜タンパク質
４０ 重原子化化合物
４２ 結晶化促進組成物
１００，１０２ 脂質集合体
１１０ 膜タンパク質−脂質集合体
１２０ 重原子誘導体結晶

Claims (7)

1. 膜タンパク質の結晶化を促進するための組成物であって、
   以下の式：
   で表される重原子化化合物、
   以下の式：
   で表される重原子化化合物、および
   以下の式：
   で表される重原子化化合物
   からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含有する、組成物。
2. 膜タンパク質の構造解析方法であって、
   脂質および界面活性剤を混合して脂質集合体を形成する工程；
   該脂質集合体と膜タンパク質とを接触させて、膜タンパク質−脂質集合体結晶を形成する工程；
   該膜タンパク質−脂質集合体結晶に、請求項１に記載の組成物を添加して、重原子誘導体結晶を形成する工程；ならびに
   該重原子誘導体結晶のＸ線回折を通じて、該膜タンパク質の立体構造を判定する工程；
   を包含する、方法。
3. 前記脂質集合体が、バイセル、デンドリマー、およびリポソームからなる群より選択される少なくとも１種の分子群である、請求項２に記載の方法。
4. 前記脂質集合体がバイセルである、請求項３に記載の方法。
5. 膜タンパク質の構造解析方法であって、
   脂質、界面活性剤および請求項１に記載の組成物を混合して、重原子化化合物を含有する脂質集合体を形成する工程
   該重原子化化合物を含有する脂質集合体と膜タンパク質とを接触させて、重原子誘導体結晶を形成する工程；ならびに
   該重原子誘導体結晶のＸ線回折を通じて、該膜タンパク質の立体構造を判定する工程；
   を包含する、方法。
6. 前記重原子化化合物を含有する脂質集合体が、前記重原子化化合物を構造内部に取り込んだ形態で構成される、バイセル、デンドリマー、およびリポソームからなる群より選択される少なくとも１種の分子群である、請求項５に記載の方法。
7. 前記重原子化化合物を含有する脂質集合体が、前記重原子化化合物を構造内部に取り込んだ形態で構成される、バイセルである、請求項６に記載の方法。