FR2940614A1 - Utilisation antibacterienne d'un extrait de morus australis poir et du compose kuwanone h - Google Patents

Abstract

La présente invention décrit un extrait préparé à partir d'écorce de racine de Morus australis Poir. et son utilisation en tant qu'agent antibactérien, et une utilisation nouvelle d'un composé, la kuwanone H, ayant la formule (I), séparé de l'extrait en tant qu'agent antibactérien :

Description

10 Utilisation antibactérienne d'un extrait de Morus australis Poir. et du composé kuwanone H

Domaine de l'invention La présente invention concerne une nouvelle 15 utilisation d'un extrait préparé à partir d'écorce de racine de Morus australis Poir. et du composé kuwanone H séparé de l'extrait pour le traitement d'une infection bactérienne. Arrière-plan de l'invention 20 Le document JP10-007555 décrit cinq composés séparés d'un extrait d'écorce de racine d'un mûrier tel que Morus bombycis Koidz, Morus alba L. et Morus Lhou Koidz, qui sont le mulberrofuranne C, D et G, le kuwanol A et la sanggenone G, et l'utilisation antibactérienne des 25 cinq composés contre des bactéries telles que le Staphylococcus aureus et le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (MRSA). Le document JP56-123979 décrit deux composés, les kuwanones G et H, et leur utilisation pour réduire la 30 pression sanguine d'un patient hypertendu, qui sont séparés d'un extrait préparé à partir d'écorce de racine d'un mûrier tel que Morus bombycis Koidz, Morus alba L. et Morus Lhou Koidz. 1 35 10 15 20 25 30 35 Résumé de l'invention Un objectif de la présente invention est de fournir une utilisation antibactérienne de la kuwanone H, composé ayant la formule (I) suivante : ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci. L'utilisation antibactérienne mentionnée ci-dessus de la présente invention comprend une composition pharmaceutique pour le traitement d'une infection bactérienne comprenant, en tant que composant actif, de la kuwanone H, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci ; l'utilisation de la kuwanone H ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci dans la fabrication d'un médicament pour le traitement d'une infection bactérienne chez un patient ; et un procédé de traitement d'un sujet ayant une infection bactérienne, qui consiste à administrer audit sujet une quantité thérapeutiquement efficace de kuwanone H, ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci. Un autre objectif de la présente invention est de proposer une utilisation antibactérienne d'un extrait préparé à partir d'écorce de racine de Morus australes Poir. L'utilisation antibactérienne de l'extrait de la présente invention comprend une composition (I) pharmaceutique pour le traitement d'une infection bactérienne comprenant, en tant que composant actif, l'extrait de la présente invention ; l'utilisation de l'extrait de la présente invention dans la fabrication d'un médicament pour le traitement d'une infection bactérienne chez un sujet ; et un procédé de traitement d'un sujet ayant une infection bactérienne, qui comprend l'administration audit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace de l'extrait de la présente invention. Le traitement d'une infection bactérienne selon la présente invention signifie de façon générale que l'on traite un trouble quelconque provoqué par une infection bactérienne, ou signifie plus exactement qu'on inhibe la croissance de bactéries. Description détaillée de l'invention Le Sang-Bai-Pi est une herbe traditionnelle chinoise constituée d'écorce de racine séchée de Morus alba L. pour le traitement de l'inflammation, le soulagement de la toux et la diurèse. La plante Morus alba L. est rare à Taiwan ; cependant, Morus australis Poir. se trouve facilement. Cela a motivé les inventeurs de la présente invention à préparer des extraits issus du Morus australis Poir. et à isoler des composés à partir de l'extrait, avec un potentiel industriellement intéressant. La présente invention fournit un procédé de traitement d'un sujet ayant une infection bactérienne qui consiste à administrer audit sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé répondant à la formule (I) suivante : 5 10 15 20 25 30 35 ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci. La présente invention fournit un procédé de traitement d'un sujet ayant une infection bactérienne, qui consiste à administrer audit sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un extrait préparé à partir d'écorce de racine de Morus australis Poir., l'extrait étant préparé par un processus comprenant les étapes suivantes . a) extraire de l'écorce de racine de Morus australis Poir. à l'aide d'un solvant polaire ; b) concentrer la solution d'extrait résultante de l'étape a) ; c) introduire le concentré résultant de l'étape b) dans une colonne de chromatographie à polarité de phase inversée, et éluer séquentiellement la colonne avec un premier éluant et un deuxième éluant, ledit premier éluant ayant une polarité d'environ 50 % en poids d'une solution aqueuse d'éthanol et ledit deuxième éluant ayant une polarité d'environ 95 % en poids d'une solution aqueuse d'éthanol ; et d) recueillir un deuxième éluat en éluant la colonne avec le deuxième éluant, et éliminer le deuxième éluant du deuxième éluat par évaporation. Préférentiellement, les bactéries sont des bactéries Gram-positives. OH (I) Préférentiellement, les bactéries sont des Staphylococcus aureus (Smith) ou des Streptococcus pneumoniae. Plus préférentiellement, les bactéries sont des Staphylococcus aureus (Smith). De manière préférée, les bactéries sont des Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (MRSA). Plus particulièrement préférentiellement, les bactéries sont le Streptococcus pneumoniae. De manière préférée, les bactéries sont des Streptococcus pneumoniae résistant à l'érythromycine et à l'ampicilline. Préférentiellement, l'extrait de la présente invention comprend le composé répondant à la formule (I) et un composé, la sanggenone G, ayant la formule (II) suivante : 20 25 30 35 Préférentiellement, l'extrait comprend 1-5 % du composé (I) et 1-5 % du composé (II), par rapport au poids de l'extrait. Plus préférentiellement, l'extrait comprend environ 3,7 % du composé (I) et 2,3 du composé (II), par rapport au poids de l'extrait. Préférentiellement, le premier éluant est une solution aqueuse d'éthanol à 50 % en poids et que le deuxième éluant est une solution aqueuse d'éthanol à 95 % en poids. Préférentiellement, le solvant polaire de l'étape a) est de l'eau ou une solution aqueuse d'éthanol à 95 % en poids, la solution aqueuse d'éthanol à 95 % en poids étant plus préférable. La présente invention ressortira plus clairement des exemples présentés ci-après à titre non limitatif d'illustration du cadre de la présente invention. Les pourcentages et autres proportions mentionnés dans le présent fascicule sont indiqués en poids, sauf indication contraire. Les pourcentages sont sélectionnés dans des gammes quelconques utilisées jusqu'à un total de 100 Exemple 1 : Préparation d'un extrait, EX-1 Des écorces de racines séchées et tranchées de Morus australes Poir. (Moraceae) ont été pulvérisées et tamisées. 100 g de poudre obtenue ont été mélangés à 1000 ml d'une solution aqueuse d'éthanol à 95 % (10:1 (v/p)) dans un flacon à fond rond, et le mélange obtenu a été porté à ébullition sous reflux pendant une heure et filtré à l'aide d'un tamis ayant une ouverture de maille de 350 et d'un papier filtre # 2 pour obtenir un filtrat et un résidu. Le résidu a été soumis à l'extraction sous reflux et à une filtration dans les mêmes conditions que ci-dessus. Les deux filtrats obtenus ont été combinés et une petite partie de ceux-ci a été séchée par évaporation pour calculer le poids d'une poudre sèche du filtrat combiné, à savoir de 10,21 g, cela correspondant à un rendement en extrait brut de 10,21 % en poids. Le filtrat combiné a été concentré à 1/10 de son poids initial et un poids égal d'eau a été ajouté au concentré obtenu. Le mélange obtenu a été introduit dans une colonne chromatographique à polarité de phase inversée garnie d'une résine d'adsorption de polystyrène (Diaion HP20, Mitsubishi, Japon) à raison de 30 fois le poids sec du concentré du filtrat combiné, qui a ensuite été élué séquentiellement par 2 volumes de lit (volume de lit = 600 ml) d'une solution aqueuse d'éthanol à 50 % en poids (1200 ml), puis par 2 volumes de lit d'une solution aqueuse d'éthanol à 95 % en poids (1200 ml). L'éluat provenant de la solution aqueuse d'éthanol à 95 % en poids a été recueilli et concentré à sec sous vide. On a ainsi obtenu 2,75 g d'un extrait sec ayant pour nom de code EX-1 avec un rendement de 26,7 % par rapport au poids sec du concentré du filtrat combiné, et de 2,73 % par rapport au poids des écorces de racines séchées.

Exemple 2 : Séparation de l'extrait, EX-1 À une solution homogène de 2 g de EX-1 dans 10 ml de méthanol, on a ajouté 10 ml d'eau pure puis on a énergiquement agité le mélange obtenu pour favoriser une précipitation dans celui-ci, cela ayant été suivi d'une centrifugation à 10 000 tr/min pendant 15 minutes. Le solide résultant de la centrifugation a été soumis à des étapes de dissolution, de précipitation et de centrifugation. Au total six cycles ont été réalisés. Les six liquides obtenus lors des six centrifugations ont été combinés et ont été concentrés à sec sous vide (poids : 1,3 g). La poudre sèche obtenue a été introduite dans une colonne de gel de silice (3,2 cm x 48,5 cm) garnie de Silica Gel 60 à raison de 30 fois le poids de la poudre sèche, qui a ensuite été éluée par 15 volumes de lit (volume de lit = 250) d'une phase mobile de toluène : acétate d'éthyle = 7:3 (3750 ml). L'éluat a été recueilli séquentiellement dans un nombre prédéterminé de flacons. Le liquide contenu dans chaque flacon a été concentré à sec sous vide et une petite quantité de méthanol a été réintroduite pour dissoudre la poudre sèche ainsi obtenue, qui a ensuite été introduite dans une colonne de gel de dextrane (1,5 cm x 40 cm) garnie de résine Sephadex LH-20 à raison de 100 fois le poids de la poudre sèche. La colonne a été éluée par un volume de lit de méthanol (30 ml), et des fractions de composés P2-1, P2-2, P3-1 et P3-2 ont été obtenues. Chaque fraction a été concentrée à sec sous vide, puis a été soumise à une purification par une HPLC de préparation (chromatographie liquide à haute performance). Des composés P2-1, P2-2, P3-1 et P3-2 ont été obtenus. Le rendement en composé P3-1 est de 2,3 % (46 mg) par rapport au poids de EX-1 et le rendement du composé P3-2 est de 3,65 % (73 mg) par rapport au poids de EX-1.

Le résidu obtenu après six centrifugations a été dissous dans du méthanol et la solution qui en a résulté a été concentrée à sec sous vide. La poudre sèche ainsi obtenue a été introduite dans une colonne de gel de silice (3,2 cm x 48,5 cm) garnie de Silica Gel 60 à raison de 30 fois le poids de la poudre sèche, qui a ensuite été éluée par deux volumes de lit (volume de lit = 250) d'une phase mobile mixte de toluène:acétate d'éthyle = 9:1 (500 ml). L'éluat a été recueilli séquentiellement dans un nombre prédéterminé de flacons. Le liquide contenu dans chaque flacon a été concentré à sec sous vide et une petite quantité de méthanol a été réintroduite pour dissoudre la poudre sèche ainsi obtenue, qui a ensuite été introduite dans une colonne de gel de dextrane (1,5 cm x 40 cm) garnie de résine Sephadex LH-20 à raison de 100 fois le poids de la poudre sèche. La colonne a été éluée par un volume de lit de méthanol (30 ml), et les composés P3-3 et P3-4 ont été obtenus.

35 5 10 15 20 25 30 Analyse de structure des composés P2-1, P2-2, P3-1, P3-2, P3-3 et P3-4 P2-1 Mulberrofuranne C C,;H8O9 PM = 580,59 [2-[2,6-dihydroxy-4-(6-hydroxybenzofurann-2-yl)-phényl]-6-(2, 4dihydroxy-phényl)-4-méthylcyclohex-3-ényl]-(2,4-dihydroxyphényl) -méthanone P2-2 Kuwanone G (Albanine F) C40H36011 PM = 692, 72 [6-(2,4-dihydroxy-benzoyl)-5-(2,4-dihydroxy-phényl) -3-méthylcyclohex-2-énylj-2-(2,4-dihydroxyphényl)-5,7-dihydroxy-3- (3-méthylbut-2-ényl)-chromén-4-one HO OH HO OH O OH P3-I Sanggenone G C40H3eO1, PM = 694,74 [6-(2,4-dihydroxy-benzoyl)-5-(2,4-dihydroxy-phényl)-3-(méthyl-pent-3-ényl) -cyclohex-2-ényl]-2-(2,4-dihydroxy-phényl)-5,7-dihydroxychroman-4-one P3-2 Kuwanone H (Albanine A) C45H44011 PM = 760,84 8-[6-[2,4-dihydroxy-3-(3-méthylbut-2-ényl)-benzoyl]-5-(2, 4dihydroxy-phényl)-3-méthylcyclohex-2-ényl]-2-(2,4-dihydroxyphényl)-5, 7-dihydroxy-3-(3-méthylbut-2-ényl)-chromén-4-one 110 OH HO OH 35 10 15 20 25 30 35 P2-1 : ESI-MS (Ionisation électrosprayspectrométrie de masse) : m/z 603,3 ([M+Na]+) et m/z 579,2 ([M-H] ). L'analyse RMN a également été effectuée. Les données ESI-MS et RMN indiquent que la formule du P2-1 est le C34H2809. Les données RMN ont été comparées à l'étude réalisée par Fukai, T. ; Hano, Y. ; Hirakura, K. ; Nomura, T. ; Uzawa, J. ; Fukushima. K., Structure of mulberrofuran J, a 2-arylbenzofuran derivative from the cultivated mulberry tree (Morus Thou Koidz.), Heterocycles 1984. 22, 1007-1011, et il est confirmé que le composé P2-1 est le mulberrofuranne C mentionné dans cette étude. Le mulberrofuranne C est également mentionné dans la publication du brevet japonais JP57-144223. P2-2 : ESI-MS : m/z 715,3 ([M+Na]+) et m/z 691,3 ([M-H]-). L'analyse RMN a également été effectuée. Les données ESI-MS et RMN indiquent que la formule du P2-2 est le C40H36011 • Les données RMN ont été comparées à l'étude effectuée par Nomura, T. ; Fukai, T. ; Narita, T., Hypotensive constituent, kuwanon H, a new flavone derivative from the root bark of the cultivated mulberry tree (Morus alba L.), Heterocycles 1980, 14, 1943-1951, et il est confirmé que le composé P2-2 est l'albanine F P3-3 Morusine C2H240, PM = 420,46 2-(2,4-dihydroxy-phényl)-5-hydroxy-8,8-diméthyl-3-(3-méthylbut-2-ényl) -8H-pyranno[2,3-f]chromén-4-one P3-4 Mulberrofuranne D C29H3404 PM = 446,59 (3,7-diméthyl-octa-2,6-diényl)-6-hydroxy-benzofurann-2-yi]-4- (3-méthyl-but-2-ényi)-benzène-1,3-diol HO O H O (kuwanone G) mentionnée dans cet article. L'albanine F (kuwanone G) est également mentionnée dans la publication du brevet coréen KR20020087225. P3-1 : ESI-MS : m/z 695,4 ([M+H)+) et m/z 693,7 ([M-H]-). L'analyse RMN a également été effectuée. Les données ESI-MS et RMN indiquent que la formule du P3-1 est le C40H38011 • Les données RMN ont été comparées à l'étude effectuée par Fukai, T. ; Hano, Y. ; Fujimoto, T. ; Nomura, T., Structure of sanggenon G, a new Diels-Alder adduct from the Chinese crude drug Sang-Bai-Pi (Morus root barks), Heterocycles, 1983, 20, 611-615, et il est confirmé que le composé P3-1 est la sanggenone G. La sanggenone G est également divulguée dans la publication du brevet japonais P10-007555.

P3-2 : ESI-MS : m/z 761 ([M+H]+), 783 ([M+Na]+) et 759 ([M-H]-). Le poids moléculaire calculé pour le P3-2 était de 760. L'analyse RMN a également été effectuée. Les données ESI-MS et RMN indiquent que la formule du P3-2 est le C45H94011. Les données RMN ont été comparées aux études effectuées par Nomura, T. ; Fukai, T. ; Narita, T. ; Terada, S. ; Uzawa, J. ; Iitaka, Y. Takasugi, M. ; Ishikawa, S. I. ; Nagao, S. ; Masamune, T., Confirmation of the structures of kuwanons G and H (albanins F and G) by partial synthesis, Tetrahedron Letters 1981, 22, 2195-2198 ; Oshima, Y. ; Konno, C. ; Hikino, H., Structure of moracenin A, a hypotensive principle of Morus root barks, Heterocycles 1980, 14, 1287-1290 ; et Oshima, Y. ; Konno, C. ; Hikino, H. ; Matsushita, K., Structure of moracenin B, a hypotensive principle of Morus root barks, Tetrahedron Letters 1980, 21, 3381-3384, et il est confirmé que le composé P3-2 est la kuwanone H (également connue sous le nom d'albanine A ou de moracénine A). La publication du brevet japonais JP56-123979 mentionne que la kuwanone H a le potentiel de réduire la pression sanguine d'un patient hypertendu.

P3-3 : ESI-MS : m/z 421 ([M+H]+). L'analyse RMN a également été effectuée. Les données ESI-MS et RMN indiquent que la formule du P3-3 est le C25H24O6. Les données RMN ont été comparées à l'étude réalisée par Nomura, T. ; Fukai, T. ; Yamada, S. ; Katayanagi, M., Phenolic constituents of the cultivated mulberry tree (Morus alba L.), Chem. Pharm. Bull. 1976, 24, 2898-2900, et il est confirmé que le composé P3-3 est la morusine. La morusine est également divulguée dans la publication du brevet U.S. 2008/0286213. P3-4 : ESI-MS : m/z 447,0 ([M+H]+). L'analyse RMN a également été effectuée. Les données ESI-MS et RMN indiquent que la formule du P3-1 est le C29H34O4. Les données RMN ont été comparées à l'étude effectuée par Nomura, T. ; Fukai, T. ; Shimada, T. ; Chen, Mulberrofuran D, a new 2-arylbenzofuran from the root barks of the mulberry tree (Morus australis Poir.), Heterocycles, 1982, 19, 1855-1860, et il est confirmé que le composé P3-4 est le mulberrofuranne D. Le Mulberrofuranne D est également divulgué dans la publication du brevet japonais JP10-007555. Essai antimicrobien Bactéries in vitro Staphylococcus aureus (Smith) et Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (ATCC 33591) La concentration inhibitrice minimale (CIM) d'échantillon sur Staphylococcus aureus (Smith) et sur Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (ATCC 33591) a été déterminée par la méthode de dilution en milieu liquide [Edwards J. R. et al. In vitro antibacterial activity of SM-7338, a carbapenem antibiotic with stability to dehydropeptidase I. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 33 : p. 215-222, 1989]. La substance d'essai a été dissoute (généralement dans du DMSO à 100 %) et a été diluée en série dans un solvant jusqu'aux concentrations souhaitées de la solution de base. Pour chaque concentration soumise à l'essai, on a ajouté une quantité aliquote de 0,01 ml (concentration finale en DMSO de 1 %) à une plaque à 48 puits, puis on a ajouté 0,99 ml de milieu de Mueller-Hinton (DIFCO, USA) avec 1-5 x 105 CFU/ml de Staphylococcus aureus (Smith) ou de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (ATCC 33591). La concentration maximale finale en DMSO était donc de 1 % et la concentration initiale en substance d'essai était de 100 pg/ml, soit 30 pM. Les plaques ont été mises à incuber à 37 °C pendant 20 heures, puis ont été examinées visuellement et notées comme étant positives (+) dans le cas d'une inhibition de la croissance ou de la turbidité, ou négatives (-) en l'absence d'effet sur la croissance ou la turbidité. Des agents de référence témoins pour le véhicule et actifs ont été respectivement utilisés en tant que témoins neutres et positifs. Chaque concentration a été évaluée en double. Les résultats sont indiqués dans le tableau 1. 25 30 35 5 10 15 20 30 35 Tableau 1 - Concentration inhibitrice minimale (CIM) de l'extrait EX-1 et du composé seul lors de l'essai antimicrobien CIM (pg/ml) Échantillon SA (Smith) MRSA SP SP (rés. à l'EN et à l'AM) EX-1 0,3 1 30 30 P2-1 3 > 100 100 30 P2-2 3 > 100 30 30 P3-1 1 3 30 10 P3-2 0,3 0,3 10 10 P3-3 10 100 100 30 j P3-4 3 100 30 10 Gentamicine 0,1 1 100 100 Ampicilline 0,1 30 0,01 3 SA (Smith) : Staphylococcus aureus (Smith) ; MRSA : Staphylococcus aureus, résistant à la méthicilline ; SP : Streptococcus pneumoniae ; SP (rés. à l'EM et à l'AM) . Streptococcus pneumoniae, isolats cliniques, résistants à l'érythromycine et à l'ampicilline. On peut voir d'après le tableau 1 que le composé P3-2 est très actif du point de vue de l'inhibition de la croissance du SA (Smith) et du MRSA avec dans les deux cas une CIM égale à 0,3 ug/ml. En revanche, la CIM de la gentamicine sur le MRSA est 10 fois supérieure à celle observée sur le SA (Smith). Le composé P3-1 présente une certaine activité d'inhibition de la croissance sur le SA (Smith) et sur le MRSA avec des CIM respectivement égales à 1 et à 3 pg/ml. Le composé P3-1 est relativement moins actif du point de vue de l'inhibition de la croissance sur le SP et sur le SP (rés. à l'EM et à l'AM) avec des CIM respectivement égales à 30 et à 10 pg/ml.

Fait surprenant, l'extrait EX-1 de la présente invention présente une très forte inhibition de la croissance du SA et du MRSA avec des CIM respectives de 0,3 et de 1 pg/ml, sachant que les teneurs en P3-2 et P3-1 dans celui-ci sont respectivement de 3,65 % en poids et de 2,3 % en poids. On peut noter que les constituants que contient l'extrait EX-1 produisent un effet synergétique sur l'inhibition de la croissance du SA et du MRSA, de sorte que l'extrait EX-1 possède de très faibles valeurs de la CIM sur le SA et sur le MRSA. Bien que la présente invention ait été décrite en référence à des détails particuliers de certains de ses modes de réalisation, ces détails ne doivent pas être considérés comme étant limitatifs du cadre de l'invention autrement que par l'étendue couverte par les revendications annexées. De nombreuses modifications et variantes sont envisageables en conformité avec la description présentée ci-dessus. 25 30 35 5 10 15 20 30 35

Claims (19)

1. REVENDICATIONS1. Utilisation d'un composé ayant la formule (I), ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, dans la préparation d'un médicament pour le traitement d'un sujet ayant une infection bactérienne :
2. 2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle les bactéries sont des bactéries Gram-positives.
3. 3. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle les bactéries sont des Staphylococcus aureus (Smith) ou des Streptococcus pneumoniae.
4. 4. Utilisation selon la revendication 3, dans laquelle les bactéries sont des Staphylococcus aureus (Smith).
5. 5. Utilisation selon la revendication 4, dans laquelle les bactéries sont des Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline.
6. 6. Utilisation selon la revendication 3, dans laquelle les bactéries sont des Streptococcus pneumoniae.
7. 7. Utilisation selon la revendication 6, dans laquelle les bactéries sont des Streptococcus pneumoniae, résistant à l'érythromycine et à l'ampicilline.
8. 8. Utilisation d'un extrait préparé à partir d'écorce de racine de Morus australes Poir. dans la préparation d'un médicament pour le traitement d'un sujet (I) ayant une infection bactérienne, dans laquelle l'extrait comprend le composé ayant la formule (I) selon la revendication 1 et un composé ayant la formule (II) suivante : 10 15 20 25 30 35 , et dans laquelle l'extrait est préparé par un processus comprenant les étapes suivantes : a) extraire de l'écorce de racine de Morus australis Poir. avec un solvant polaire ; b) concentrer la solution d'extrait résultante de l'étape a) ; c) introduire le concentré résultant de l'étape b) dans une colonne de chromatographie à polarité de phase inversée, et éluer séquentiellement la colonne avec un premier éluant et un deuxième éluant, ledit premier éluant ayant une polarité d'environ 50 % en poids d'une solution aqueuse d'éthanol et ledit deuxième éluant ayant une polarité d'environ 95 % en poids d'une solution aqueuse d'éthanol ; et d) recueillir un deuxième éluat par élution de la colonne avec le deuxième éluant, et éliminer le deuxième éluant du deuxième éluat par évaporation.
9. 9. Utilisation selon la revendication 8, dans laquelle l'extrait comprend 1-5 % du composé (I) et 1-5 % du composé (II), par rapport au poids de l'extrait.
10. 10. Utilisation selon la revendication 9, dans laquelle l'extrait comprend environ 3,7 % du composé (I) et 2,3 % du composé (II), par rapport au poids de l'extrait.
11. 11. Utilisation selon la revendication 8, dans laquelle le premier éluant est une solution aqueuse d'éthanol à 50 % en poids et le deuxième éluant et une solution aqueuse d'éthanol à 95 % en poids.
12. 12. Utilisation selon la revendication 8, dans laquelle le solvant polaire de l'étape a) est l'eau ou une solution aqueuse d'éthanol à 95 % en poids.
13. 13. Utilisation selon la revendication 12, dans laquelle le solvant polaire est une solution aqueuse d'éthanol à 95 % en poids.
14. 14. Utilisation selon la revendication 8, dans laquelle les bactéries sont des bactéries Gram-positives.
15. 15. Utilisation selon la revendication 8, dans laquelle les bactéries sont des Staphylococcus aureus (Smith) ou des Streptococcus pneumoniae.
16. 16. Utilisation selon la revendication 15, dans laquelle les bactéries sont des Staphylococcus aureus (Smith). 20
17. 17. Utilisation selon la revendication 16, dans laquelle les bactéries sont des Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline.
18. 18. Utilisation selon la revendication 15, dans laquelle les bactéries sont des Streptococcus pneumoniae.
19. 19. Utilisation selon la revendication 18, dans laquelle les bactéries sont des Streptococcus pneumoniae résistant à l'érythromycine et à l'ampicilline. 10 15 25 30 35