KR20020087225A - 구강 병원성균에 대한 항균제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상백피로부터 분리된 구와논 지(kuwanon G)의 충치 유발균인 스트렙토코커스 뮤턴스(Streptococcus mutans)와 치주질환 유발균인 포피로모나스 진지바리스(Porphyromonas gingivalis)대한 항균활성에 관한 것으로 본 발명의 항균활성 물질은 저분자 물질로서 고온에서도 안정하고 종래의 대부분의 항균활성 물질에 비하여 유해 구강미생물에 대한 항균활성이 높을 뿐만 아니라 천연물로부터 분리한 성분이어서 부작용 없이 우수한 항균활성을 나타낸다.

Description

구강 병원성균에 대한 항균제{Antibacterial agent for oral pathogens}
치과 의학상 충치와 치주염은 여러 가지 원인이 있을 수 있으나, 구강 내에 상주하는 세균의 발효작용에 의하여 치아에 부착된 음식찌꺼기의 당분이나 전분 등의 탄수화물이 분해되어 생기는 젖산이 치아 경조직의 석회를 탈각시켜 충치가 발생하고, 이어서 혐기성 병원균체들이 대량 증식하면서 치주염 균주들에 의한 독소성분 등으로 인하여 잇몸 조직이 파괴되고 결국 치아가 흔들리고 탈락되는 현상이 일어난다. 이러한 충치와 치주염을 일으키는 병원성 미생물은 여러 가지 종들이 알려져 있지만 특히 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 포피로모나스 진지바리스(Porphyromonas gingivalis)가 가장 주도적으로 충치와 치주염 발생에 주 병원체요인으로 작용한다(참조 : Liljemark, W.F., 등, Crit. Rev. Oral Bio. Med., 7:180-198, 1996).
충치는 어린이부터 성인까지의 치과질병의 많은 부분을 차지하고 있으며, 최근 발증빈도가 더욱 높아지고 있다. 현재 대한치과의사협회의 보고에 따르면 우리나라 아동의 90% 이상이 치아우식(dental caries)을 경험했으며, 성인들의 80% 이상이 치주염(periodontitis)을 갖고 있다고 한다.
스트렙토코커스 뮤탄스는 균체외 혹은 균체표층에 글루코실트랜스퍼레이즈(glucosyltransferase, GTase)라는 효소를 분비하므로써 음식물내 수쿠로즈(sucrose)를 기질로 하여 글루코즈(glucose)와 프락토즈(fructose)를 생성하고, 동시에 글루코즈의 중합체인 불용성 글루칸(insoluble glucan)을 치면에 형성하게 된다. 이 글루칸에 의해 구강내 다른 미생물들이 치면에 부착하므로써 치면 세균막 즉, 치태(dental plaque)를 형성하게 된다. 이 치태내에서 스트렙토코커스 뮤탄스균을 포함한 젖산균이 증식되어 프락토즈를 탄소원으로 젖산을 생성하게 되고, 부착성 글루칸에 포집, 농축되어 고농도의 산으로 치아의 구성성분인 인산칼슘중 Ca2+를 녹아 내리게 하여 치아의 외막인 법랑질(enamel)을 용해하여 충치를 유발하게 된다(참조 : Sigmund, S.S., 등, J. Periodontol., 63:322-331, 1992).
치면세균막은 일반적으로 치면에 미생물과 미생물의 대사산물 및 타액성분 등이 부착한 것으로 양치질이나 구강청정제등으로 쉽게 제거되지 않는다. 치면세균막의 70∼80% 이상은 미생물이 차지하고 있으며, 치면세균막 1 g당 평균 2천5백억개의 미생물이 존재한다.
충치와 치주염을 억제하기 위해 사용되는 방법으로는 스포라마이신(sporamycin), 반코마이신(vancomycin), 클로로헥시딘(chlorhexidine) 등의 항생물질을 이용한 방법, 유기 또는 무기 불소에 의한 병원성 세균의 억제 방법 등이 있다(참조 : Mellberg, JR, 등, Quintessence, 41-80, 1983).
그러나, 항생물질을 이용할 경우 미생물로 하여금 내성을 갖게하거나, 설사, 구토 등의 부작용을 유발할 수 있는 단점이 있고, 또한 이러한 항생물질의 남용으로 인해 구강내 상재균들의 생육이 저해되는 문제점을 가지고 있다. 따라서, 구강내 유해 세균만을 효과적으로 제거하기 위해서는 인체에 무해하고, 부작용이 적으며 구강내 유해 병원성균에만 특이적으로 작용할 수 있는 새로운 천연 항균물질의탐색을 산업계에서는 지속적으로 요구하고 있다.
따라서 본 발명은 충치 및 치주질환의 원인이 되는 미생물인 스트렙토코커스 뮤턴스(Streptococcus mutans)와 포피로모나스 진지바리스(Porphyromonas gingivalis)에 대해 강력한 항균활성을 나타내는 물질을 상백피로부터 분리 및 정제하여 부작용 없이 식품이나 의약품으로 이용 가능한 항균활성물질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 구와논 지(kuwanon G)의 분리방법을 나타낸 그래프,
도 2는 본 발명의 정제된 구와논 지의 구조분석 결과를 보여주는13C-NMR스펙트럼,
도 3은 본 발명의 정제된 구와논 지의 구조분석 결과를 보여주는1H-NMR스펙트럼,
도 4는 본 발명의 정제된 구와논 지의 구조분석 결과를 보여주는 FAB-Mass 스펙트럼,
도 5는 균수측정법에 의하여 본 발명의 정제된 구와논 지의 스트렙토코커스 뮤턴스에 대한 항균활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 6은 대조구인 0.08% 메탄올로 처리한 스트렙토코커스 뮤탄스의 전자 현미경사진,
도 7은 본 발명의 정제된 구와논 지에 의하여 손상을 입은 스트렙토코커스 뮤턴스의 전자 현미경사진.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은 건조시킨 상백피를 분쇄하는 단계와; 분쇄한 상백피에 용매를 이용하여 추출한 후 추출용매가 제거된 항균활성물질을 건조하는 단계와; 추출성분에 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 혼합한 후 추출하여 에틸아세테이트 용해성 성분만을 추출하는 단계와; 에틸아세테이트가 제거된 에틸아세테이트 용해성 분획을 크로마토그래피법(chromatography)으로 성분의 극성차이에 의하여 분리하여 항균활성물질이 포함된 분획을 분리하는 단계를 포함하는 상백피로부터 분리되어 구강병원성균에 대한 항균활성을 가지는 구와논 지(kuwanon G)에 그 특징이 있다.
상백피는 뽕나무(Morus albaLinne) 또는 동속식물의 뿌리껍질로서 오래전 부터 소염성 이뇨제 및 혈당강하의 목적으로 널리 사용되어져 오고 있다. 상백피에서 분리된 물질로는 벤조퓨란(benzofuran)계의 모라신(moracin) 화합물, 미백효과가 있는 것으로 알려진 구와논 이(kuwanon E)화합물(일본 특허공개 98-9812747)과일부 병원성균에 대해 항균력이 있다고 보고된 바 있는 몇몇 구와논계 화합물들이 알려져 있다(일본 특허공개 57-033455, 57-033456).
그러나 본 발명의 구와논 지는 사이클로헥세닐플라본(cyclohexenylflavone)의 일종으로 혈압강하작용(일본 특허공개 55-027102)에 관하여는 알려져 있으나, 항균작용에 대해서는 지금까지 알려진 것이 없으며, 특히 구강 병원성균에 대한 항균활성은 거의 알려진 바가 없다.
이하 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
상백피로부터 조추출분획물 제조 및 항균물질을 분리 정제하는 과정은 도 1에 상세히 기재되어 있다.
먼저 상백피로부터 항균활성을 가지는 조추출물(crude extract)을 제조하는 방법에 대하여 설명한다.
채취하여 건조한 상백피를 분쇄한 후 75% 메탄올과 혼합하여 추출하고 추출용매를 제거하여 추출성분을 농축한다. 농축된 조추출물과 에틸아세테이트를 혼합하여 에틸아세테이트 용해성 성분을 추출하는데 이때 에틸아세테이트와 혼합하여 에틸아세테이트 용해성 성분이 추출되도록 하고, 추출과정은 2회 이상 반복하여 실시하는 것이 바람직하다.
상기의 과정으로 얻어진 조추출물과 에틸아세테이트 용해성 성분은 대표적인 구강병원성 균주인 스트렙토코커스 뮤탄스에 대해서 가공하지 않은 상태임에도 불구하고 그 최소저해농도(minimum inhibitory concentration)가 각각 62.5 ㎍/㎖와 31.2 ㎍/㎖이며, 포피로모나스 진지발리스에 대한 최소저해농도가 각각 125 ㎍/㎖와 31.2 ㎍/㎖로서 녹차추출물 성분인 카테친(catechin)류의 최소저해농도(250-1000 ㎍/㎖)보다 훨씬 낮다.
다음으로 상백피로부터 항균활성을 갖는 단일물질을 분리하는 방법을 설명한다.
상기 에틸아세테이트로 추출한 성분을 농축하여 에틸아세테이트를 제거한 후 건조하지 않은 상태의 에틸아세테이트 용해성 성분을 각 성분의 극성차이에 따라 각 성분별로 분리한다. 이때 분리방법으로는 실리카젤 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)법을 사용하는 것이 바람직하며, 일차적으로 전개용매로서 클로로포름, 메탄올, 물을 각각 50 : 10 : 1(v/v)의 비율로 혼합한 용매를 이용하여 전개시킴으로서 불순물을 제거하고, 이를 다시 헥산(hexane), 에틸아세테이트, 메탄올을 각각 7 : 3 : 2(v/v)의 비율로 혼합한 용매를 이용하여 최종적으로 순수한 단일 항균활성 물질을 분리하였다.
상기의 과정에 의하여 분리 및 정제된 항균활성을 가진 단일물질을 기기분석을 통하여 확인한 결과, 상백피로부터 분리 정제된 항균활성 성분은 하기 화학식 1의 구조를 가지는 구와논 지(kuwanon G)이다.
상기와 같이 분리 및 정제된 항균활성을 가진 단일물질은 대표적인 구강병원성 균주인 스트렙토코커스 뮤탄스와 포피로모나스 진지바리스 대한 최소저해농도가 모두 7.8 ㎍/㎖로 극히 낮아서 항균활성이 매우 높다.
본 발명의 항균활성을 가진 물질의 최소저해농도값을 공지의 항균활성물질과 비교할 때, 최소저해농도값이 250-1000 ㎍/㎖인 녹차 추출물인 카테친류, 최소저해농도값이 62.5 ㎍/㎖인 페놀성 물질인 신나믹 알데하이드(cinnamic aldehyde), 최소저해농도값이 12.5 ㎍/㎖인 단삼 추출 정제물 및 최소저해농도값이 31.3 ㎍/㎖인 후박피 추출 정제물에 비하여 항균활성이 매우 우수하며, 최소저해농도값이 4.9 ㎍/㎖인 강력한 항생물질인 클로르헥시딘(chlorhexidine)과도 거의 유사한 항균활성을 나타낸다.
이하 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예 및 실험예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한 하기 실시예 및 실험예들에서 특별히 부피 % 임을 명시하지 않은 %는 중량 % 를 나타낸다.
(실시예 1)
채취하여 건조한 상백피를 믹서로 분쇄하였다. 분쇄한 상백피 시료 100 g을 400 ㎖의 75부피% 메탄올을 추출용매로 사용하여 추출하였다. 추출된 시료는 와트만(Whatman) 여과지 제2번을 이용하여 여과하고, 여과된 추출액을 진공회전농축기로 농축하여 용매성분을 제거한 후 동결건조하여 물성분을 제거하여 조추출물을 얻었다.
(실험예 1)
추출물의 열안정성
열안정성측정은 실시예 1에서 제조된 75% 메탄올 조추출물을 각각 60℃, 70℃, 80℃, 90℃ 및 100℃에서 30분 동안, 121℃에서 15분 동안 각각 열처리한 후 추출물액을 각각의 웰에 0.1 ㎖씩 점적하여 상온에서 1시간 이상 확산시킨 다음 37℃에서 16시간 이상 배양하는 웰확산분석(well diffusion assay)법을 이용하여 스트렙토코커스 뮤턴스에 대한 항균활성을 측정하여 항균활성의 감소여부를 관찰하였다.
항균활성의 감소여부를 관찰한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
상기 표 1의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 60℃에서 121℃까지 열처리를 한 후 항균활성의 변화를 관찰한 결과 열처리 후에도 항균활성의 감소가 거의 일어나지 않았다. 따라서 본 발명의 항균활성성분은 고온에서도 안정하다는 것을 확인할 수 있었다.
(실시예 2)
채취하여 건조한 상백피를 믹서로 분쇄하였다. 분쇄한 상백피 시료 100 g을 75부피% 메탄올 400 ㎖와 혼합하여 상온에서 이틀동안 반복추출하였다. 추출된 시료는 와트만여과지 제2번을 이용하여 여과하므로써 조추출물을 얻었다. 이렇게 얻어진 75부피% 메탄올 조추출물을 분획여두에서 각각 에틸아세테이트, 부탄올과 1 : 1의 비율로 혼합하여 각 용매에 대한 용해성성분을 추출하고, 마지막으로 물 용해성 성분을 얻었다.
각 용매로 2회 반복하여 추출한 후 각 용매층만을 분리한 후 용매성분을 제거하여 에틸아세테이트분획, 부탄올분획, 물분획을 제조하였다.
(실험예 2)
용매분획에 따른 항균활성 측정
실시예 2에서 제조된 에틸아세테이트분획, 부탄올분획, 물분획의 3가지 분획을 0.5% 메탄올에 용해시켜, 준비된 시험관들에 혈액평판배지를 각각 1 ㎖씩 넣고, 처음 시험관에만 실시예 1의 75% 메탄올 조추출물 및 실시예 2의 에틸아세테이트분획, 부탄올분획, 물분획을 2% 농도로 각각 1 ㎖씩 넣은 다음 순차적으로 2배씩 희석하였다.
이 희석액에 스트렙토코커스 뮤턴스와 포피로모나스 진지바리스 100 ㎕를 2 ×105CFU/㎖가 되도록 각각의 시험관에 첨가하고 37℃에서 16시간 이상 배양한 후 탁도를 나타내지 않는 최소저해농도를 측정하였다.
상기의 방법으로 측정한 조추출물과 각 분획별 최소저해농도의 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
상기 표 2의 결과에서, 3가지 분획중 에틸아세테이트분획이 강한 항균활성을 나타냈고, 부탄올 분획은 약한 항균활성을 나타냈으며, 물분획은 항균활성을 나타내지 않음을 알 수 있었다. 또한 스트렙토코커스 뮤탄스와 포피로모나스 진지바리스의 두 균주에 대해서 모두 공통적으로 에틸아세테이트분획의 항균활성이 가장 높은 것을 알 수 있었다.
(실시예 3)
실시예 2에서 제조된 에틸아세테이트 용해성 성분을 실리카겔을 6×15 cm로 충진한 칼럼에서 클로로포름, 메탄올, 물을 각각 50 : 10 : 1(v/v)로 혼합한 용매시스템을 사용하여 활성물질을 제외한 비 활성물질들을 제거하고, 이렇게 분리되어 나온 활성 물질을 다시 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올을 각각 7 : 3 : 2(v/v)의 조건으로 분리하여 순수한 단일 항균활성물질만을 분리하였다.
상기의 방법으로 분리되어 나온 단일물질은 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올 7 : 3 : 2(v/v)의 전개용매로 박층 크로마토그라피(TLC, silica gel 60F254, Merck)하였을 때 Rf=0.24의 값을 가지며, 자외선(254, 365 nm, VL-6-LC, Vilber lourmat)에서 강한 흡수대를 갖는다.
상기의 방법으로 정제된 항균활성을 가진 단일물질의 분자량을 FAB-MS에 의해 측정하고,1H-NMR 스펙트럼과13C-NMR 스펙트럼은 각각 600MHz(용매 : MeOD)에서 측정하였다.13C-NMR 스펙트럼,1H-NMR 스펙트럼 및 FAB-MS 스펙트럼은 각각 도 2, 3, 4에 나타내었다.
이 물질의 구조를 분석한 결과 : Amorphous white powder (EtOAc-MeOH), [α]D-465° (c=0.87, MeOH); FeCl3test: redish brown; IRυ(KBr, cm-1) 3352, 3245, 1665, 1650; pos. FAB/MS (m/z) 693 ([M+1]+), 677, 555, 421, 365, 355,311, 299, 137, 115, 93, 23; HR pos. FAB/MS: Calcd for C40H37O11([M+1]+,m/z) 693.2336, Found 693.2338;1H-NMR (600 MHz, CD3OD) 7.18 (1H, d,J=8.0 Hz, H-14"), 7.02 (1H, d,J=8.2 Hz, H-6'), 6.64 (1H, d,J=7.8 Hz, H-20"), 6.40 (1H, br. s, H-3'), 6.35 (1H, br. d,J=8.2 Hz, H-5'), 6.03 (1H, br. s, H-11"), 5.97 (1H, dd,J=2.0, 7.8 Hz, H-19"), 5.84 (1H, s, H-6), 5.77 (1H, br. s, H-17"), 5.76 (1H, br. d,J=8.0 Hz, H-13"), 5.08 (1H, br. s, H-2"), 5.06 (1H, t,J=6.8 Hz, H-12), 4.26 (1H x 2, m, H-1", 6"), 3.25 (1H, m, H-7"), 3.09 (2H, br. s, H-11), 1.62 (1H, m, H-5"a), 1.54 (3H, s, H-14), 1.39 (3H, s, H-4"), 1.38 (1H, m, H-5"b), 1.35 (3H, s, H-15);13C-NMR (150 MHz, CO3OD) 209.38 (s, C-8"), 183.81 (s, C-4), 168.74 (s, C-12"), 166.16 (s, C-10"), 163.26 (s, C-4'), 163.05 (s, C-2'), 161.97 (s, C-7), 161.02 (s, C-9), 157.82 (s, C-2, 16", 18"), 156.93 (s, C-5), 134.29 (s, C-2"), 134.01 (d, C-6', 14"), 132.66 (s, C-13), 132.40 (d, C-20"), 124.81 (d, C-2"), 123.09 (d, C-12, 15"), 121.5 (s, C-3), 115.06 (s, C-9"), 113.72 (s, C-1'), 109.62 (d, C-13"), 108.74 (s, C-8), 107.97 (d, C-5', 19"), 105.52 (s, C-10), 103.75 (d, C-3'), 103.64 (d, C-11"), 103.34 (d, C-17"), 98.71 (d, C-6), 47.98 (d, C-7"), 39.05 (d, C-1", 6"), 30.74 (d, C-5"), 25.91 (q, C-14), 24.75 (t, C-11), 23.19 (q, C-4"), 17.72 (q, C-15) 로서 본 화합물을 EtOAc-MeOH로 재결정했을 때, 무정형의 백색분말로 얻어졌다.
IR (KBr) spectrum에서 수산기(3352 cm-1)와 공역 카보닐(1650 cm-1)의 흡수대가 관측되었고, 페릭콜로라이드(ferric chloride)로 처리하였을 때, 붉은 갈색을 나타내 플라보노이드 화합물로 추정되었다.
Positive FAB/MS에서 [M+1]+의m/zfragment ion peak가 693에서 관측되어 분자량은 692로 판명되었고, 고 분해능 FAB/MS로부터 C40H36O11로 분자식이 결정되었다.
13C-NMR (150 MHz, CD3OD) spectrum에서 40개의 탄소 시그널중에서 플라본(flavone) A환의 5번과 7번 탄소에 수산기가 결합된 것을 δ156.93 (s) 와 δ161.97 (s)시그널로부터 알 수 있었고, B환의 경우에도 2' 과 4' 탄소에 수산기가 결합되어 있는 것을 δ163.05 (s) 및 δ163.26 (s) 시그널로부터 확인할 수 있었다.
한편1H-NMR (600 MHz, CD3OD) spectrum에서는 A환에서는 단일선(singlet)으로 관측되는 1개의 수소 시그널만이 δ5.84에서 관측되었고, B환에서는 1,2,4-삼치환 벤젠구조의 특징적인 시그널들[δ7.02 (1H, d,J=8.2 Hz) δ6.40 (1H, br. s), δ6.35 (1H, br. d,J=8.2 Hz)]이 관측되어, 이 화합물은 5,7,2' 4' -테트라하이드록실플라본(tetrahydroxylflavone)의 B환의 3번 및 A환의 6번 또는 8번의 수소가치환되어 있는 구조인 것을 알 수 있었다. 또한13C-NMR spectrum에서 관측된 δ132.66 (s), 123.09 (d), 25.63 (q), 24.75 (t) 및 17.44 (q) 시그널로부터 아이소프레닐(isopentenyl) 기의 존재가 추정되었고,1H-NMR에서 관측된 δ5.06 (1H, t,J=6.8 Hz), δ3.09 (2H, br. s), δ1.54 (3H, s), δ1.35 (3H, s)시그널 및1H-1H COSY spectrum에서의 각 시그널의 상관관계로부터 아이소프레닐기의 존재가 확인되었다. 그 외에도1H-NMR spectrum으로부터 2개의 1,2,4-삼치환 벤젠구조가 더 있는 것을 확인하였고, [{δ7.18 (1H, d,J=8.0 Hz), δ6.03 (1H, br. s), δ5.76 (1H, br. d,J=8.0 Hz)} 및 {δ6.64 (1H, d,J=7.8 Hz), δ5.97 (1H, dd,J=2.0, 7.8 Hz), δ5.77 (1H, br. s)}]13C-NMR에서 각각 수산기를 2개씩 가지고 있는 것도 [δ168.74 (s), 166.16 (s), 157.82 (x2, s)] 판명되었다.
또한 1-메틸-3,4,5-치환-1-사이클로헥센의 존재가13C-NMR [δ134.29 (s), 124.81 (d), 49.57 (d), 38.76 (x2, d), 30.74 (t), 22.91 (q)] 및1H-NMR [δ5.08 (1H, br. s), δ4.26 (1H x 2, m), δ3.25 (1H, m), δ1.39 (3H, s), δ1.62 (1H, m), δ1.38(1H, m)] 및1H-1H COSY 와1H-13C COSY spectrum으로부터 확인 할 수 있었고, 1개의 케톤(ketone)의 존재도 δC209.38 (s) 로부터 확인되었다.
따라서 본 화합물은 이상의 결과를 종합한 결과 이전에 뽕나무의 근피 또는열매로부터 분리된 바가 있는 구와논 관련 화합물인 것을 알 수 있었다.
한편 δC98.71 시그널은 A환의 6번 탄소의 것으로 동정이 가능하므로(C-8의 경우는 대개 δC94-96에서 관측됨)다른 한 개의 치환기는 A환의 8번에 결합한 것으로 판명되었다. 한편 HMBC spectrum에서 H-11 (δ3.09) 과 C-3 (δC121.55) signal 사이에서와 H-1" (δ4.26) 와 C-8 (δC108.74) 시그널사이에서 각각 교차피크(cross peak)가 관측되어 아이소프레닐기는 C환의 3번에, 다른 치환기는 A환의 8번에 결합한 것으로 판명되었다.
이상의 결과들을 종합하여 이 화합물이 상기 화학식 I 에 나타난 바와 같은 구와논 지(kuwanon G)임이 판명되었다.
(실험예 3)
구와논지(kuwanon G)의 항균활성 측정
실시예 3에서 제조된 구와논 지를 0.5% 메탄올에 용해시켜, 준비된 시험관들에 혈액평판배지를 각각 1 ㎖씩 넣고, 처음 시험관에만 구와논 지를 2% 농도로 각각 1 ㎖씩 넣은 다음 순차적으로 2배씩 희석하였다.
이 희석액에 스트렙토코커스 뮤턴스와 포피로모나스 진지바리스 100 ㎕를 2 ×105CFU/㎖가 되도록 각각의 시험관에 첨가하고 37℃에서 16시간 이상 배양한 후 탁도를 나타내지 않는 최소저해농도를 측정하였다.
상기의 방법으로 측정한 구와논 지의 최소저해농도의 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
상기 표 3의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 정제된 구와논 지는 대표적인 구강병원성균인 스트렙토코커스 뮤탄스와 포피로모나스 진지바리스에 대해서 최소저해농도 값이 7.8 ㎍/㎖로 매우 강력한 항균활성을 나타내었다.
(실험예 4)
생균수측정(viable cell count)법에 의한 구와논 지의 살균활성
실시예 3에서 제조된 구와논 지를 이용하여 대표적인 구강 병원성균인 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 항균활성을 측정하였다. 즉, 구와논 지를 디메틸술폭사이드에 용해시켜 0.0005%, 0.001%, 0.002% 농도의 시료로 제조하고 제조된 시료를 스트렙토코커스 뮤턴스 균액과 혼합하여 37℃에서 각각 1분, 2분, 5분, 10분 동안 반응시킨 후 순차적으로 10배씩 희석하여 유동플레이트법(pour plate method)을 실시하였고, 이를 37℃의 인큐베이터에서 배양하여 생균수를 측정하였다. 그 결과를 도 5의 그래프에 도시하였다.
도 5의 그래프에서 ◆는 대조구인 0.02% 메탄올, ●는 0.0005% 농도의 시료, ▲는 0.001% 농도의 시료, ■는 0.002% 농도의 시료를 나타낸다.
도 5의 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, 생균수측정법에 의해 생균수를 측정한 결과 추출물의 농도가 0.002%(20 ㎍/㎖)일 때 1분 내에 균이 거의 사멸하는 것으로 나타났다. 따라서 매우 낮은 농도에서 효과적인 저해를 보인다는 점을 고려할 때 본 발명의 구와논 지는 구강병원성균에 대한 항균활성이 매우 우수함을 알 수 있다. 이는 거의 살균의 효과라고 보여지며, 일반적으로 양치질을 할 때 거의 3분 이내에 양치질을 끝내는 것을 생각한다면, 본 발명의 구와논 지에 의한 1분내 균의 사멸 효과는 실제 적용에 있어서 우수한 효과를 낼 수 있을 것으로 기대되며 상업적인 적용 측면에서도 매우 유용하다.
(실험예 5)
세포형태의 관찰
실시예 3에서 제조된 구와논 지를 0.08% 메탄올에 용해시켜 최종 농도가 0.0008%가 되도록 조절한 후 37℃ 배양기에서 30분 동안 스트렙토코커스 뮤탄스균과 반응시켜 투과전자현미경(TEM)으로 세포의 형태를 관찰하였으며 그 결과를 도 6과 7의 사진에 나타내었다.
도 6의 사진은 대조구인 0.08% 메탄올로 처리한 스트렙토코커스 뮤탄스의 사진이고, 도 7의 사진은 0.0008% 구와논 지를 처리한 후의 스트렙토코커스 뮤탄스의 사진으로서, 도 6의 대조구에서는 세포형태의 변화가 없는 반면에, 도 7의 사진에서 보는 바와 같이 0.0008%의 매우 낮은 농도의 구와논 지를 처리했음에도 불구하고 스트렙토코커스 뮤탄스균의 세포막이 분리되고, 세포벽도 윤곽이 희미해져 파괴되고 있음을 알 수 있었다. 이는 구와논 지가 스트렙토코커스 뮤탄스균의 세포벽이나 세포막에 손상을 주어 세포막이 파괴되어 삼투기능이 상실됨으로써 미생물의 생리가 중단되고, 생육이 억제되는 것을 의미한다.
상기와 같은 본 발명의 항균활성을 가진 물질은 저분자 물질로서 고온에서도 안정하여 어떤 온도에서도 가공처리가 가능하고 성분을 추출할 때 고온에서 추출할 수 있어 추출수율을 높이고 추출시간을 단축시킬 수 있다.
또한 20 ㎍/㎖의 매우 낮은 농도에서 1-2분 사이에 스트렙토코커스 뮤턴스균을 완전히 사멸시키는 강력한 항균활성을 나타냄으로서 사람들이 양치질하는 시간인 평균 3분 내외의 시간에 매우 효과적인 항균효과를 낼 수 있을 것으로 생각되며, 기존의 천연물로부터 분리한 성분들이 구강병원성균이 생산하는 효소의 활성을 억제하는 2차 적인 저해활성을 가지는 것에 반해 본 발명의 항균성분은 균 자체를 사멸시키는 1차 적인 저해활성을 가지는 점에서 큰 차이가 있다.
따라서 본 발명의 구와논 지는 천연물로부터 분리된 유용한 성분으로서 부작용을 최소화하며 식품의약 산업상 매우 우수한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. 상백피의 추출물을 유효성분으로 하는 유해 구강미생물에 대한 항균제.
  2. 제 1항에 있어서 상백피로부터 분리된 하기 화학식 1의 구와논 지(kuwanon G)를 함유하는 유해 구강미생물에 대한 항균제.
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