FR2773818A1 - Procede et dispositif de lyse de bacteries - Google Patents
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Abstract
Procédé et dispositif de lyse bactérienne dans lequel on réalise, en continu, un mélange liquide de bactéries et d'un agent de lyse, et l'on fait immédiatement écouler ce mélange dans un flux constant à l'intérieur d'une canalisation (7), le débit de ce flux étant adapté, en fonction du diamètre et de la longueur de la canalisation (7), de manière à obtenir un lysat bactérien sensiblement homogène à la sortie (8) de ladite canalisation.
Description
La présente invention a trait à un procédé et un dispositif de lyse de bactéries ainsi que d'extraction et de purification d'acides nucléiques, et notamment de plasmides à partir de bactéries, contenant ces plasmides.
L'obtention de plasmides d'intérêt, et notamment de plasmides dans lesquels ont été insérés un gène ou une séquence codante d'ADN, est effectuée par multicopie de ces plasmides dans des bactéries aptes à produire un grand nombre de ces plasmides, et notamment dans certaines souches d'Escherichia coli hautement productives de plasmides et souvent déjà utilisées en laboratoire ou à l'échelle industrielle.
L'une des applications qui demande une production importante d'un plasmide, à l'échelle industrielle, est la fabrication de médicaments ou vecteurs d'intérêt prophylactique ou thérapeutique à base d'un plasmide nu ou associé à des moyens de pénétration dans les cellules de l'hôte receveur. De telles appkications sont décrites par exemple dans la demande de brevet WO 90/11092.
II existe plusieurs techniques de lyse bactérienne permettant l'extraction des plasmides, suivie d'une séparation, et donc d'une purification de ces plasmides. La technique la plus recommandée est la technique de lyse alcaline par un mélange soude + SDS (dodécylsulfate de sodium), ou agent analogue, suivie d'une neutralisation par un agent acide, tel que de l'acétate de potassium, de façon à précipiter l'ensemble des constituants bactériens, dont
l'ADN bactérien, le surnageant contenant essentiellement le plasmide. La préparation purifiée de plasmide peut alors être obtenue par une séparation telle qu'une centrifugation ou une filtration (Birnboim 1983 ; Methods in
Enzymology, Viol, 243-254).
l'ADN bactérien, le surnageant contenant essentiellement le plasmide. La préparation purifiée de plasmide peut alors être obtenue par une séparation telle qu'une centrifugation ou une filtration (Birnboim 1983 ; Methods in
Enzymology, Viol, 243-254).
Cette technique, qui convient à l'échelle du laboratoire, est pénible à mettre en oeuvre à l'échelle industrielle car le milieu résultant de l'addition à la suspension bactérienne du mélange soude + SDS forme une suspension très visqueuse, de sorte que ce milieu doit être homogénéisé par agitation. De même après la neutralisation à l'acide une homogénéisation par agitation est nécessaire.
Cette agitation est délicate et est effectuée généralement de façon manuelle, l'opérateur agitant doucement les bouteilles ou flacons contenant le milieu. Une agitation insuffisante provoque une lyse de mauvaise qualité alors qu'une agitation excessive tend à morceler l'ADN génomique bactérien, qui se mélange aux plasmides ultérieurement et entraîne une diminution du rendement. En conséquence le tour de main de l'opérateur est un gage essentiel de réussite de l'opération.
Afin d'automatiser le procédé on a déjà proposé, dans le document WO 97/23601, de réaliser une lyse d'une suspension bactérienne en faisant passer, en continu, la suspension de cellules à lyser et une solution d'agents lysants à travers un mélangeur statique d'une longueur suffisante pour parachever la lyse. Le mélange lysé qui en résulte peut ensuite être amené, par une canalisation, à un second mélangeur statique dans lequel pénètre également une solution d'agents précipitants.
Un tel procédé met donc en oeuvre des moyens spécifiques, à savoir un mélangeur statique, pour remplacer l'agitation manuelle de volumes importants de mélange, par une agitation continue sur toute la longueur du mélangeur. L'utilisation de tels mélangeurs, outre qu'elle demande l'achat,
I'entretien et le nettoyage de ces dispositifs, impose pratiquement une durée fixe de lyse, sans possibilité pratique de contrôler les durées effectives de contact entre les constituants cellulaires et l'agent lysant après la sortie du mélangeur. De plus, I'agitation entretenue dans le mélangeur, même si elle est préférable à l'agitation mal contrôlée de volumes discontinus, peut provoquer des ruptures ou des dégradations de constituants cellulaires et notamment d'acides nucléiques.
I'entretien et le nettoyage de ces dispositifs, impose pratiquement une durée fixe de lyse, sans possibilité pratique de contrôler les durées effectives de contact entre les constituants cellulaires et l'agent lysant après la sortie du mélangeur. De plus, I'agitation entretenue dans le mélangeur, même si elle est préférable à l'agitation mal contrôlée de volumes discontinus, peut provoquer des ruptures ou des dégradations de constituants cellulaires et notamment d'acides nucléiques.
Un autre procédé, décrit par exemple dans le document WO 96/36106, permet également une lyse continue, mais cette fois sans utiliser de moyens provoquant une agitation du mélange. II consiste à préparer un mélange d'une suspens ion bactérienne et d'un agent, tel que du lysozyme, à incuber ce mélange pendant environ une heure puis à faire passer un flux de ce mélange par une canalisation associée à un moyen de chauffage du mélange traversant la canalisation, à forte température (70-100 "C), de façon à assurer la lyse, pour recueillir un mélange lysé. L'inconvénient d'une telle solution est de nécessiter un moyen de chauffage à des températures élevées et une adaptation de la température aux différents cas particuliers que l'on peut rencontrer.
La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients et de fournir un procédé de lyse de bactéries, applicable notamment à l'extraction et à la purification d'acides nucléiques et de plasmides à partir de bactéries, susceptible d'être mis en oeuvre sans intervention manuelle et dans des conditions extrêmement économiques.
Un autre objectif de l'invention est de fournir un tel procédé permettant d'obtenir un contrôle extrêmement précis des conditions et de la durée de la lyse et de l'extraction et ceci pour la totalité des bactéries présentes.
Un autre objectif de l'invention est d'obtenir un degré élevé de pureté de la préparation d'acides nucléiques, notamment de plasmides résultant du procédé.
Un autre objectif est de fournir un procédé susceptible d'être mis en oeuvre dans un milieu fermé, à l'abrLdes contaminations, ce qui est un avantage pour la qualité pharmaceutique des produits recherchés, par exemple des plasmides.
Un autre objectif, encore, de l'invention est d'améliorer sensiblement le rendement en plasmide purifié obtenu, par comparaison avec le procédé antérieur.
Un autre objectif est d'obtenir une réduction de la durée du contact nécessaire à la lyse bactérienne.
Un autre objectif de l'invention est de fournir un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé, dispositif simple et peu onéreux.
Un autre objectif encore, est de permettre une production à l'échelle industrielle de préparations de plasmide avec un rendement élevé et dans des conditions d'homogénéité très améliorées sur l'ensemble d'une production bactérienne.
L'invention repose sur la découverte inattendue que l'on peut, moyennant le respect d'un certain nombre de paramètre, assurer une lyse homogène et contrôlée de cellules, et notamment de bactéries, par simple mélange en continu, dans une canalisation usuelle, d'un flux de suspension de cellules et d'un flux d'agent lysant malgré la viscosité importante attendue, sans utiliser aucun des moyens de l'art antérieur tel qu'un mélangeur statique ou des températures élevées.
L'invention a donc pour objet un procédé de lyse bactérienne dans lequel on réalise, en continu, un mélange liquide de bactéries et d'un agent de lyse, et l'on fait immédiatement écouler ce mélange dans un flux constant à l'intérieur d'une canalisation, le débit de ce flux étant adapté, en fonction du diamètre et de la longueur de la canalisation, de manière à obtenir un lysat bactérien sensiblement homogène à la sortie de ladite canalisation.
De préférence ia canalisation présente un diamètre réduit facilitant l'homogénéisation très rapide du mélange.
L'un des avantages de l'invention est de permettre, sans mettre en oeuvre aucun moyen assurant une agitation du flux ou le chauffage du mélange à des températures élevées, d'obtenir, par le choix convenable de ses paramètres, une homogénéité du mélange en cours de lyse, pendant une durée sensiblement constante pour toutes les bactéries, et aboutissant à un lysat homogène.
L'obtention du lysat homogène se traduit par une forte chute de la turbidité et l'apparition d'un mélange transparent à l'oeil.
Un autre avantage de l'invention réside dans le fait que l'on peut recueillir le mélange liquide lysé après une durée parfaitement contrôlée de lyse, que l'on peut déterminer par le choix des paramètres précités, par exemple pour un diamètre et un débit donné du flux, par le choix de la longueur de la canalisation. Cette longueur peut facilement être variée en fonction des conditions particulières, par exemple en utilisant une simple canalisation souple que l'on coupe à la longueur désirée.
Le mélange homogène lysé arrivant à l'extrémité de la canalisation peut être immédiatement traité, par exemple par mélange avec un autre agent, par exemple un agent neutralisant, et la mise en oeuvre immédiate de moyens de séparation quelconque.
De préférence le mélange de bactéries et d'agent lysant est réalisé en introduisant, dans la susdite canalisation, un flux de bactéries, par exemple d'une suspension bactérienne, et un flux d'une solution d'agent lysant, de sorte que l'écoulement du flux de ce mélange produit une homogénéisation rapide, qui, si on utilise une canalisation de diamètre réduit, est presque instantanée.
L'agent lysant peut être un agent chimique, par exemple un agent alcalin, tel qu'une solution soude + SDS, ou une solution hypotonique par rapport au milieu cellulaire dans le cas où les bactéries ont été traitées au préalable de manière à ce que leur paroi soit fragilisée, par un agent tel que du lysozyme.
En général, notamment dans le cas d'un agent lysant chimique, on préférera ajouter au lysat homogène obtenu, un agent neutralisant, assurant la neutralisation de l'agent lysant.
L'invention a également pour objet un procédé d'extraction et de purification d'acides nucléiques, notamment de plasmides, à partir d'une suspension bactérienne, dans lequel on effectue une lyse des bactéries à l'aide d'un agent lysant suivie d'une neutralisation puis d'une séparation des acides nucléiques recherchés d'avec l'essentiel du reste des constituants bactériens, ledit procédé mettant en oeuvre le procédé de lyse selon l'invention, caractérisé en ce qu'on réalise, en continu, un mélange d'une suspension bactérienne et d'un agent lysant liquide, en un premier point de rencontre déterminé, à partir duquel on établit un flux constant dudit mélange dans une canalisation, pour homogénéiser le mélange de la suspension et de l'agent lysant, en ce que l'on maintient ce mélange dans ce flux constant pendant une durée déterminée, et qu'à la fin de cette durée on ajoute, en un second point de rencontre déterminé, une solution acide neutralisante, ladite durée étant déterminée par la distance séparant lesdits premier et second points de rencontre et par la vitesse de déplacement du mélange (ou débit linéaire) sur cette distance, après quoi l'on procède, d'une façon quelconque, à la séparation des plasmides restés en solution d'avec le reste des éléments cellulaires précipités ou floculés.
Ce procédé peut avantageusement être mis en oeuvre de la façon suivante:
(i) on établit un flux de la suspens ion bactérienne dans une
première canalisation;
(ii) on établit un flux de l'agent alcalin de lyse dans une deuxième
canalisation qui se jette dans la première canalisation (ou vice
versa) en un premier point de rencontre pour former une
troisième canalisation;
(iii) on établit un flux d'un agent acide dans une quatrième
canalisation qui se jette dans la troisième canalisation (ou vice
versa) en un deuxième point de rencontre situé en aval du
premier point de rencontre, pour former une cinquième
canalisation;
(iv) on établit un flux du mélange bactéries/agent de lyse réalisé
au premier point de rencontre, dans la troisième canalisation
(comprise entre le premier le deuxième point de rencontre) à
un débit linéaire adapté en fonction du diamètre et de la
longueur de la troisième canalisation de manière à permettre
l'homogénéisation du mélange et l'obtention d'un lysat
bactérien sensiblement homogène au deuxième point de
rencontre; et
(v) dans la cinquième canalisation, on établit un flux de la
préparation obtenue au second point de rencontre, par
mélange du lysat bactérien avec l'agent de neutralisation; et
(vi) on récupère à la sortie de la cinquième canalisation une
préparation comprenant une phase soluble contenant l'ADN et
une phase insoluble contenant les éléments cellulaires
précipités ou floculés et on procède de manière quelconque à
la séparation de l'ADN d'avec le reste des éléments cellulaires.
(i) on établit un flux de la suspens ion bactérienne dans une
première canalisation;
(ii) on établit un flux de l'agent alcalin de lyse dans une deuxième
canalisation qui se jette dans la première canalisation (ou vice
versa) en un premier point de rencontre pour former une
troisième canalisation;
(iii) on établit un flux d'un agent acide dans une quatrième
canalisation qui se jette dans la troisième canalisation (ou vice
versa) en un deuxième point de rencontre situé en aval du
premier point de rencontre, pour former une cinquième
canalisation;
(iv) on établit un flux du mélange bactéries/agent de lyse réalisé
au premier point de rencontre, dans la troisième canalisation
(comprise entre le premier le deuxième point de rencontre) à
un débit linéaire adapté en fonction du diamètre et de la
longueur de la troisième canalisation de manière à permettre
l'homogénéisation du mélange et l'obtention d'un lysat
bactérien sensiblement homogène au deuxième point de
rencontre; et
(v) dans la cinquième canalisation, on établit un flux de la
préparation obtenue au second point de rencontre, par
mélange du lysat bactérien avec l'agent de neutralisation; et
(vi) on récupère à la sortie de la cinquième canalisation une
préparation comprenant une phase soluble contenant l'ADN et
une phase insoluble contenant les éléments cellulaires
précipités ou floculés et on procède de manière quelconque à
la séparation de l'ADN d'avec le reste des éléments cellulaires.
De façon avantageuse, on donne à la canalisation parcourue par le flux constant du mélange, un petit diamètre.
Par canalisation de petit diamètre on entend, dans le sens de la présente invention, un diamètre de canalisation tel que la rencontre des flux de la suspens ion bactérienne et de l'agent lysant aboutisse très rapidement à un mélange presque instantanément homogène. Ce diamètre peut être déterminé expérimentalement ou par calcul et il est tel qu'il ne se forme pas, à partir du point de rencontre des flux, de veines liquides séparées. On recherchera de même un mélange rapide et homogène du flux de lyse et du flux d'agent neutralisant.
A titre d'exemple, le tableau suivant établit les rapports entre les différents paramètres: longueur de canalisation, diamètre, débit, durée de lyse.
<tb>
<SEP> Longueur <SEP> de <SEP> la <SEP> Diamètre <SEP> Débit <SEP> Durée <SEP> de <SEP> la
<tb> <SEP> canalisation <SEP> lyse
<tb> <SEP> 28 <SEP> cm <SEP> 0,3 <SEP> cm <SEP> 160 <SEP> ml/min <SEP> 2 <SEP> secondes
<tb> <SEP> 26 <SEP> cm <SEP> 0,7 <SEP> cm <SEP> 160 <SEP> ml/min <SEP> 15 <SEP> secondes
<tb> 85 <SEP> cm <SEP> + <SEP> réservoir <SEP> 0,7 <SEP> cm <SEP> ^ <SEP> <SEP> 160 <SEP> ml/min <SEP> 4 <SEP> minutes
<tb> <SEP> de <SEP> 500 <SEP> ml <SEP>
<tb>
En général un diamètre de l'ordre de 1 cm ou de préférence inférieur répond à cette définition, et l'on préfère un diamètre compris entre 2 et 8 mm.
<tb> <SEP> canalisation <SEP> lyse
<tb> <SEP> 28 <SEP> cm <SEP> 0,3 <SEP> cm <SEP> 160 <SEP> ml/min <SEP> 2 <SEP> secondes
<tb> <SEP> 26 <SEP> cm <SEP> 0,7 <SEP> cm <SEP> 160 <SEP> ml/min <SEP> 15 <SEP> secondes
<tb> 85 <SEP> cm <SEP> + <SEP> réservoir <SEP> 0,7 <SEP> cm <SEP> ^ <SEP> <SEP> 160 <SEP> ml/min <SEP> 4 <SEP> minutes
<tb> <SEP> de <SEP> 500 <SEP> ml <SEP>
<tb>
En général un diamètre de l'ordre de 1 cm ou de préférence inférieur répond à cette définition, et l'on préfère un diamètre compris entre 2 et 8 mm.
La durée de la lyse, Compte tenu des proportions usuelles de suspension et d'agent iysant peut être très substantiellement réduite et même inférieure à une ou plusieurs minutes, par exemple 5 min et même ramenée à des valeurs aussi faibles qu'une ou deux secondes, contrastant avec la dizaine de minutes nécessaire dans l'art antérieur.
En conséquence la longueur minimale de la canalisation entre le point de rencontre de la suspens ion bactérienne et de l'agent lysant alcalin et le point de rencontre du mélange obtenu et de l'agent acide neutralisant, qui est nécessaire pour atteindre l'état de lyse, peut être facilement déterminée et est fonction de la vitesse d'écoulement du mélange. Une longueur de canalisation de l'ordre de 10 cm à quelques mètres est en général convenable.
On comprend également que l'on assure, grâce à l'invention, des conditions de lyse et de neutralisation totalement homogènes dans le temps, sur l'ensemble de la solution bactérienne que l'on fait couler à travers la canalisation.
La proportion des débits, et donc des volumes mélangés répond de préférence aux définitions suivantes:
- suspension bactérienne/agent lysant (par exemple mélange soude + SDS): comprise entre 1/4 et 3/4, et de préférence de l'ordre de 1/2,
- agent lysanUagent acide neutralisant, de préférence acétate de potassium: comprise entre 1 et 2 et de préférence de l'ordre de 1,3.
- suspension bactérienne/agent lysant (par exemple mélange soude + SDS): comprise entre 1/4 et 3/4, et de préférence de l'ordre de 1/2,
- agent lysanUagent acide neutralisant, de préférence acétate de potassium: comprise entre 1 et 2 et de préférence de l'ordre de 1,3.
De préférence la concentration de la suspension bactérienne est de l'ordre de 170 grammes (en poids humide de bactéries) /litre d'un tampon classique (par exemple Tris EDTA) + glucose.
Le mélange soude SDS est de préférence un mélange NaOH 0,2
M/SDS i %.
M/SDS i %.
L'agent acide neutralisant est de préférence de l'acétate de potassium 3 M et est avantageusement choisi de façon à obtenir un pH final proche de 5,5 grâce à l'addition d'HCI 12N.
De préférence la suspension bactérienne est conservée à température basse et adressée à cette température basse dans la canalisation vers le point de rencontre avec le mélange soude + SDS, cette température étant de préférence de l'ordre de *4 "C. Le mélange soude + SDS peut être maintenu et véhiculé à température ambiante et l'agent acidifiant tel que l'acétate de potassium est de préférence maintenu à une température basse, telle que 4 "C.
L'invention a également pour objet un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé, caractérisé en ce qu'il comporte,
- à partir d'une source de suspension bactérienne, telle qu'un réservoir, une canalisation permettant l'établissement d'un flux de suspens ion bactérienne,
- à partir d'une source de mélange lysant alcalin telle qu'un réservoir, une deuxième canalisation permettant l'établissement d'un flux d'agent lysant, lesdites première et deuxième canalisations aboutissant à un premier point de rencontre'dans lequel elles débouchent l'une dans l'autre,
- une troisième canalisation de petit diamètre et de longueur déterminée s'étendant à partir dudit premier point de rencontre,
- et des moyens, tels que des moyens de pompage, pour l'établissement des flux dans lesdites canalisations,
- la longueur, le diamètre et le débit dans ladite troisième canalisation étant adaptés de manière à obtenir un mélange sensiblement homogène aboutissant à un lysat sensiblement homogène.
- à partir d'une source de suspension bactérienne, telle qu'un réservoir, une canalisation permettant l'établissement d'un flux de suspens ion bactérienne,
- à partir d'une source de mélange lysant alcalin telle qu'un réservoir, une deuxième canalisation permettant l'établissement d'un flux d'agent lysant, lesdites première et deuxième canalisations aboutissant à un premier point de rencontre'dans lequel elles débouchent l'une dans l'autre,
- une troisième canalisation de petit diamètre et de longueur déterminée s'étendant à partir dudit premier point de rencontre,
- et des moyens, tels que des moyens de pompage, pour l'établissement des flux dans lesdites canalisations,
- la longueur, le diamètre et le débit dans ladite troisième canalisation étant adaptés de manière à obtenir un mélange sensiblement homogène aboutissant à un lysat sensiblement homogène.
De façon avantageuse, notamment pour l'extraction et la purification de plasmides, le dispositif peut, en outre comporter:
- à partir d'une source d'agent neutralisant, telle qu'un réservoir, une quatrième canalisation aboutissant à un second point de rencontre à l'extrémité de ladite troisième canalisation de façon que les canalisations débouchent l'une dans l'autre, ladite troisième canalisation ayant une longueur déterminée par la distance entre ledit premier point de rencontre et ledit second point de rencontre,
- à partir dudit second point de rencontre, une cinquième canalisation de petit diamètre aboutissant à des moyens de récupération et/ou de séparation.
- à partir d'une source d'agent neutralisant, telle qu'un réservoir, une quatrième canalisation aboutissant à un second point de rencontre à l'extrémité de ladite troisième canalisation de façon que les canalisations débouchent l'une dans l'autre, ladite troisième canalisation ayant une longueur déterminée par la distance entre ledit premier point de rencontre et ledit second point de rencontre,
- à partir dudit second point de rencontre, une cinquième canalisation de petit diamètre aboutissant à des moyens de récupération et/ou de séparation.
De préférence toutes les canalisations ont de petits diamètres tels que définis précédemment.
Les petits diamètres desdites canalisations peuvent être identiques ou différents. Les différences de diamètre entre canalisations peuvent être déterminées par les moyens d'établissement des flux.
Les moyens d'établissement des flux peuvent avantageusement être des pompes, de préférence une ou plusieurs pompes péristaltiques permettant d'établir, dans les différentes canalisations, les débits, et donc, compte tenu des diamètres des canalisations, les vitesses désirées.
De façon avantageuse on peut utiliser, pour l'établissement de deux ou plusieurs des flux, une même pompe, par exemple, une pompe péristaltique à plusieurs canaux parallèles, de façon à assurer, y compris en cas de variation intempestive de débit de la pompe, une proportionnalité constante entre lesdits flux.
Bien entendu, si les quantités à traiter sont particulièrement importantes, I'agencement des canalisations selon l'invention peut être dédoublé, triplé ou multiplié, avec de préférence, des moyens d'établissement de flux, tels qu'une pompe, uniques ou plusieurs pompes solidarisées de façon à maintenir, en toute circonstance, une proportionnalité constante des flux dans chacune des installations.
Le débouché d'une canalisation dans l'autre au niveau d'un point de rencontre peut s'effectuer selon un angle quetconque. Généralement on préfère que l'une des canalisations débouche sensiblement perpendiculairement dans l'autre mais on peut également incliner les axes des débouchés.
De préférence on ne prévoit aucun moyen particulier d'homogénéisation tel que chicane ou obstacle dans la canalisation au niveau des points de rencontre ; ni de moyen de chauffage permettant d'atteindre de fortes températures (supérieures à 60 "C).
De façon avantageuse, le dispositif selon l'invention peut comporter des moyens d'établissement et de contrôle des températures de façon à maintenir les sources dans les températures requises. Notamment pour la suspension bactérienne, I'installation peut être agencée de façon que la basse température soit maintenue non seulement dans la source mais également dans la première canalisation jusqu'au point où débute la lyse.
Une installation selon l'invention permet, par exemple, de traiter un volume de suspens ion bactérienne de l'ordre de 1 à 5 litres par heure.
Le mélange obtenu en aval du premier point de rencontre présente une grande homogénéité pendant toute la durée du traitement, de même que le mélange neutralisé en aval du deuxième point de rencontre, de sorte que les moyens de séparation permettant de séparer, d'une part, les plasmides restant en solution, et, d'autre part, les autres éléments cellulaires précipités ou floculés, travaillent dans des conditions constantes et contribuent à l'excellente reproductibilité de la préparation plasmidique purifiée finale.
Par ailleurs on améliore notablement le rendement final qui peut dépasser 50 mg de plasmide pour 100 g de bactéries.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif et se référant au dessin annexé dans lequel la figure unique représente une vue schématique d'un dispositif de mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
La suspension bactérienne à lyser est une suspension provenant d'une culture d'une souche de E. coli dans laquelle a été multiplié un plasmide tel que le plasmide pUC18 en tampon Tris EDTA avec une concentration bactérienne de l'ordre de 200 g (poids humide) par l.itre.
Le mélange soude-SDS est un mélange NaOH 0,2 M /1 % SDS.
La solution d'acétate de potassium utilisée comme agent neutralisant est à 3 M; pH 5,5.
Le dispositif représenté sur la figure comprend un premier récipient 1 contenant la suspension bacteÉlenne. A ce récipient sont associés des moyens de maintien à une température de l'ordre de + 4 "C (non représentés) et des moyens d'agitation 2 permettant de maintenir l'homogénéité de la suspension.
A partir de la source 1 s'étend une canalisation souple en silicone ayant un diamètre interne de 2,06 mm et formant le premier tronçon de canalisation 3.
Le mélange soude-SDS est contenu dans un réservoir 4 à partir duquel s'étend une seconde canalisation, 5 de diamètre interne 3,17 mm et réalisée dans le même matériau souple. A l'emplacement 6 où se trouve le premier point de rencontre la canalisation 3 débouche perpendiculairement dans la canalisation 5 de sorte qu'à cet emplacement se forme un mélange provoquant la lyse rapide des bactéries. A partir du point 6 s'étend un troisième tronçon de canalisation, 7 jusqu'au point 8 formant le second point de rencontre, la longueur de la canalisation 7 étant de 0,8 mètres. Cette canalisation 7 présente un diamètre interne de 7 mm (modulable).
La solution d'acétate de potassium est contenue dans un réservoir 9 à partir duquel s'étend une quatrième canalisation 10 également en matière souple ayant un diamètre interne de 2,79 mm débouchant dans la canalisation 7 au point de rencontre 8, également perpendiculairement à la canalisation 7.
Le récipient 9 est associé également à des moyens de maintien à basse température + 4 "C.
A partir du second point de rencontre 8 s'étend une cinquième canalisation 11, formée par la suite de la canalisation 7, cette canalisation 11 aboutissant à un réservoir de récupération 12.
On comprend que les diamètres des trois canalisations 3,5 et 10 sont dans des rapports tels que les proportions des sections internes des canalisations assurent, pour une même vitesse de circulation des liquides, les proportions de mélange souhaitées.
En conséquence les canalisations souples 3, 5 et 10 peuvent passer à travers une pompe péristaltiqueunique 13 dont la partie rotative 14 assure l'établissement des flux dans les susdites proportions dans les trois canalisations 3, 5 et 10.
L'établissement des débits dans les proportions souhaitées dans les canalisations 3, 5 et 10 détermine bien entendu la valeur des débits en aval dans les canalisations 7, et 11.
Les débits ainsi obtenus sont respectivement de 160 ml/min dans 7 et 244 ml/min dans 11.
Les bactéries sont soumises à l'action du mélange soude + SDS pendant toute la durée du trajet du liquide dans la canalisation 7, entre les points 6 et 8. Cette durée, dans l'exemple choisi, est de 15 sec.
On obtient finalement, dans le récipient de récupération 12, une préparation lysée comprenant deux phases, à savoir une phase soluble claire contenant les plasmides, sensiblement exempte d'élément cellulaire et une phase supérieure insoluble contenant sensiblement les éléments cellulaires.
La séparation de ces deux phases est effectuée ensuite par des techniques classiques de filtration ou de centrifugation et la purification des plasmides peut encore être poursuivie selon les méthodes usuelles.
A titre de vérification on a procédé à une électrophorèse comparative des solutions de plasmide obtenues après lyse alcaline, soit en flux continu (comme décrit dans l'exemple ci-dessus) soit par agitation manuelle pendant 10 min (les quantités de bactéries utilisées dans les deux cas étaient similaires). La révélation du gel d'électrophorèse met en évidence la supériorité du procédé en continu dans la mesure où la teneur en plasmides est accrue et celle des impuretés plus faible.
Claims (16)
1. Procédé de lyse bactérienne dans lequel on réalise, en continu, un mélange liquide de bactéries et d'un agent de lyse, et l'on fait immédiatement écouler ce mélange dans un flux constant à l'intérieur d'une canalisation, le débit de ce flux étant adapté, en fonction du diamètre et de la longueur de la canalisation, de manière à obtenir un lysat bactérien sensiblement homogène à la sortie de ladite canalisation.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la canalisation présente un diamètre réduit facilitant l'homogénéisation très rapide du mélange.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit petit diamètre est de l'ordre de 1 cm ou inférieur, notamment compris entre 2 et 8 mm.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la durée de la lyse, est comprise entre une ou deux secondes et cinq minutes.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le mélange de bactéries et d'agent lysant est réalisé en introduisant, dans la susdite canalisation, un flux de bactéries et un flux d'une solution d'agent lysant, de sorte que l'écoulement du flux de ce mélange produit une homogénéisation rapide.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le mélange homogène lysé arrivant à l'extrémité de la canalisation est immédiatement traité par mélange a*vec un autre agent, notamment un agent neutralisant.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'agent lysant est un mélange soude/SDS.
8. Procédé d'extraction et de purification d'acides nucléiques, notamment de plasmides, à partir d'une suspens ion bactérienne, dans lequel on effectue une lyse des bactéries à l'aide d'un agent lysant, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, suivie d'une neutralisation puis d'une séparation des acides nucléiques recherchés d'avec l'essentiel du reste des constituants bactériens, caractérisé en ce qu'on réalise, en continu1 un mélange d'une suspension bactérienne et d'un agent lysant liquide, en un premier point de rencontre déterminé, à partir duquel on établit un flux constant dudit mélange dans une canalisation, pour homogénéiser le mélange de la suspens ion et de l'agent lysant, en ce que l'on maintient ce mélange dans ce flux constant pendant une durée déterminée, et qu'à la fin de cette durée on ajoute, en un second point de rencontre déterminé, une solution neutralisante assurant la précipitation ou floculation des éléments cellulaires non recherchés, ladite durée étant déterminée par la distance séparant lesdits premier et second points de rencontre et par la vitesse du flux sur cette distance, après quoi l'on procède à la séparation des plasmides restés en solution d'avec les éléments cellulaires précipités ou floculés.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par les étapes suivantes
(i) on établit un flux de la suspension bactérienne dans une
première canalisation;
(ii) on établit un flux d'un agent alcalin de lyse dans une deuxième
canalisation qui se jette dans la première canalisation (ou vice
versa) en un premier point de rencontre pour former une
troisième canalisation
(iii) on établit un flux d'un agent acide dans une quatrième
canalisation qui se jette dans la troisième canalisation (ou vice
versa) en un deuxième point de rencontre situé en aval du
premier point de rencontre, pour former une cinquième
canalisation;
(iv) on établit un flux du mélange bactéries/agent de lyse réalisé
au premier point de rencontre, dans la troisième canalisation
(comprise entre le premier et le deuxième point de rencontre) à
une vitesse adaptée en fonction du diamètre et de la longueur
de la troisième canalisation, de manière à permettre
l'homogénéisation du mélange et l'obtention d'un lysat
bactérien sensiblement homogène au deuxième point de
rencontre; et
(v) dans la cinquième canalisation, on établit un flux de la
préparation obtenue au second point de rencontre, par
mélange du lysat bactérien avec l'agent de neutralisation, et
(vi) on récupère à la sortie de la cinquième canalisation une
préparation comprenant une phase soluble contenant l'ADN et
une phase insoluble contenant les éléments cellulaires
précipités ou floculés et on procède à la séparation de l'ADN
d'avec le reste des éléments cellulaires.
10. Procédé selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que la longueur de la canalisation entre le point de rencontre de la suspension bactérienne et de l'agent lysant alcalin.et le point de rencontre du mélange obtenu et de l'agent acide neutralisant, est de l'ordre de 10 cm à quelques mètres.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la concentration de la suspension bactérienne est de l'ordre de 170 grammes (en poids humide de bactéries) /litre d'un tampon classique.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les flux assurent un mélange dans la proportion volumique:
- suspension bactérienne/agent lysant, notamment mélange soude + SDS: comprise entre 1/4 et 3/4, et notamment de l'ordre de 1/2.
13. Procédé selon l'une des revendications 7 à 12, caractérisé en ce que les flux assurent un mélange neutralisé dans la proportion:
- agent lysant/agent neutralisant, notamment acétate de potassium: comprise entre 1 et 2 et notamment de l'ordre de 1,3.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à i3, caractérisé en ce que la suspension bactérienne est conservée à température basse et adressée à cette température basse dans la canalisation vers le point de rencontre avec l'agent lysant.
15. Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendication 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comporte,
- à partir d'une source de suspens ion bactérienne, telle qu'un réservoir, une canalisation permettant l'établissement d'un flux de suspension bactérienne,
- à partir d'une source de mélange lysant alcalin telle qu'un réservoir, une deuxième canalisation permettant l'établissement d'un flux d'agent lysant, lesdites première et deuxième canalisations aboutissant à un premier point de rencontre dans lequel elles débouchent l'une dans l'autre,
- une troisième canalisation de petit diamètre et de longueur déterminée s'étendant à partir dudit premier point de rencontre,
- et des moyens, tels que des moyens de pompage, pour l'établissement des flux dans lesdites canalisations,
- la longueur, le diamètre et le débit dans ladite troisième canalisation étant adaptés de manière à obtenir un mélange sensiblement homogène aboutissant à un lysat sensiblement homogène.
16. Dispositif selon la revendication 15, notamment pour l'extraction et la purification de plasmides, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre:
- à partir d'une source d'agent neutralisant, telle qu'un réservoir, une quatrième canalisation aboutissant à un second point de rencontre à l'extrémité de ladite troisième canalisation de façon que les canalisations débouchent l'une dans l'autre, ladite troisième canalisation ayant une longueur déterminée par la distance entre ledit premier point de rencontre et ledit second point de rencontre,
- à partir dudit second point de rencontre, une cinquième canalisation de petit diamètre aboutissant à des moyens de récupération et/ou de séparation.
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