FI96039B - Menetelmä ihmiskudostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi - Google Patents

Menetelmä ihmiskudostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI96039B
FI96039B FI894657A FI894657A FI96039B FI 96039 B FI96039 B FI 96039B FI 894657 A FI894657 A FI 894657A FI 894657 A FI894657 A FI 894657A FI 96039 B FI96039 B FI 96039B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
tpa
medium
cells
osmotic pressure
chain
Prior art date
Application number
FI894657A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI96039C (fi
FI894657A0 (fi
FI894657L (fi
Inventor
Maki Suzuki
Atsunori Shindo
Nobumi Kusuhara
Nobuyoshi Makiguchi
Shoichiro Miyahara
Original Assignee
Mitsui Toatsu Chemicals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP63249081A external-priority patent/JP2648624B2/ja
Priority claimed from JP63316118A external-priority patent/JP2718726B2/ja
Application filed by Mitsui Toatsu Chemicals filed Critical Mitsui Toatsu Chemicals
Publication of FI894657A0 publication Critical patent/FI894657A0/fi
Publication of FI894657L publication Critical patent/FI894657L/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI96039B publication Critical patent/FI96039B/fi
Publication of FI96039C publication Critical patent/FI96039C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

96039
Menetelmä ihmiskudostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi 5 Tämä keksintö koskee menetelmää kudostyyppi sen pals-minogeeniaktivaattorin (johon tästä lähtien viitataan tPA:na) tuottamiseksi, jota tPA:ta tuottaa ja erittää verisuonten endoteelisolut ja erilaiset kudossolut ja joka liuottaa fibriinihyytymiä, nimittäin verisuonitukoksia.
10 Täten tPA on tehokas trombolyytt-isenä aineena.
On jo ehdotettu erilaisia menetelmiä tPA:n tuottamiseksi. Esimerkki tätä edustavista menetelmistä on tPA:n DNA-sek-venssin liittäminen sopivaan promoottoriin, sekvenssin 15 yhdistäminen ekspressiovektoriin, isäntäsolun transformoiminen yhdistelmä-DNA-sekvenssillä, tuottavan yhdistel-mäsolun, joka on näin transformoitu, viljely sopivassa väliaineessa tPA:n tuottamiseksi ja sitten tPA:n puhdistaminen käyttäen affiniteettipylvästä ja geel isuodatuspylväs-20 tä.
Sellaisessa menetelmässä sisältävät esimerkit väliaineesta tPArn tuottamiseksi yleisesti sellaiset, jotka sisältävät epäorgaanisia happoja, aminohappoja, vitamiineja jne., 25 kuten Eagle Basal Medium (EBM), Eagle Minimum Essential Medium (EMEM), Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) ja RPMI 1640-väliaine, peruskomponentteina täydennettynä L-glutaamihapol1 a, 10 *:11a vasikan sikiöseerumi1 la (FCS) ja natriumbikarbonaatilla 1-2 g/1 pitoisuudella pH:n säätä-30 miseksi alueelle 6,5 - 7,5.
Esimerkiksi tunnetut menetelmät sisältävät sen, jossa käytetään Modified Eagle Mediumia täydennettynä 10 *:lla vasikan sikiöseerumi11 a, natriumbikarbonaatilla (1,2 g/1) 35 ja sopivalla määrällä L-glutaamihappoa viljelyyn (Journal of Biological Chemistry Voi. 25, s. 7035) ja sen, jossa viljely suoritetaan perusvällaineessa, kuten DMEMrssä, EMEM:ssä tai PRMI-1640:ssa, täydennettynä bikarbonaati11 a 2 96039 alle 2,0 g/1 pitoisuudessa pH:n säätämiseksi 6,5 - 7,5 alueelle (Japanilainen hakemusjulkai su No. 4233/1987).
Yllä kuvattujen tavanomaisten menetelmien mukaan tPA:n 5 tuotanto yksikkösolua kohti on kuitenkin äärimmäisen pieni ja tuottavuus on huono niin, että ongelmat, kuten korkeat tuotantokustannukset, tekevät ne vaikeiksi käyttää vakaaksi tPA:n tuottamiseksi kaupallisessa mittakaavassa.
10 Toisaalta on äskettäin huomattu,- että solujen proteiinien tuottavuutta voidaan stimuloida lisäämällä väliaineen osmoottista painetta, vaikka solujen kasvu hiukan pienenee-k i n.
15 Yleisesti menetelmässä hyödyllisen aineen tuottamiseksi käyttäen eläinsoluvi1jelyä, väliaineen olosuhteita, kuten osmoottista painetta, pH:ta ja lämpötilaa säädetään äärimmäisen tarkoilla alueilla. Erityisesti mitä tulee osmoottiseen paineeseen, sitä säädetään muuntamalla väliaineen 20 koostumusta 280 - 300 mi 11iosmoolia/1itra alueella, mikä on se alue, joka vastaa ihmisveren ja kammionesteen tai muiden ruumiin nesteiden aluetta.
Tässä mielessä on tehty yrityksiä parantaa halutun proteii-25 nin tuottavuutta lisäämällä osmoottista painetta. Esimerkiksi on raportoitu, että vasta-aineen tuotannossa on vasta-ainetta tuottavien solujen tuottavuutta stimuloitu useita kertoja lisäämällä aminohappopitoisuutta väliaineessa olennaisesti väliaineen tekemiseksi ylipaineiseksi jopa 30 340 mi 11iosmooliin/1 (Japani 1 ainen. hakemusjulkai su No.
188062/1985).
Aminohappojen lisääminen väliaineen tekemiseksi ylipaineiseksi voi kuitenkin vaikuttaa suuresti soiuaineenvaihdun-35 taan ja joissakin tapauksissa haluttujen proteiinien tuottavuus voi haitallisesti pienentyä.
3 96039 Tämän keksinnön ensimmäinen tarkoitus on aikaansaada menetelmä, jossa halutun proteiinin, tPA:n, tuotanto yksik-kösolulukua kohti on parantunut. tPA:lla on kaksi molekyy-limuotoa, yksi ketjuinen tPA ja kaksiketjuinen tPA. Kaksi-5 ketjuisen tPA:n trombolyyttinen aktiiviisuus on korkeampi kuin yksiketjuisen tPA:n. tPA:ta on tavanomaisesti kehitetty joko puhtaana kaksiketjuisena muotona tai kaksi ketjuisen ja yksiketjuisen muodon seosmuotona.
10 Kaksiketjuisei la tPArlla on korkea fibrinolyyttinen aktiivisuus ja on hyvin mahdollista, että kaksiketjuinen tPA aktivoi plasminogeeniä ei verisuonten tukkeumissa, missä fibrinolyyttistä vaikutusta odotetaan, vaan verivimassa, mikä usein aiheuttaa kliinisen vuotamisen (Japanilainen 15 · hakemusjulkai su No. 118717/1984).
Yksiketjuisei 1 a tPArlla, jota pidetään kaksi ketjuisen tPA:n prekursorina, on kuitenkin korkea affiniteetti fibriiniin ja se muuttuu nopeasti kaksiketjuiseksi tPA:ksi kun se 20 kerran on sitoutunut fibriiniin.
Niinpä yksi ketjuisei la tPA:lla on maksimaalinen plas-minogeeniakti ivisuus hyytymäpaikoi 1 la.
25 Täten yksiketjuisen tPA:n trombolyyttinen aktiivisuus on suhteellisen alhainen ja sitä ei esiinny verivimassa. Sen seurauksena kliinistä käyttöä varten tarvitaan yksiketjuis-ta tPA:ta enemmän kuin kaksiketjuista tPA:ta ja täten halutaan tehokas menetelmä yksiketjuisen tPA:n tuottamiseksi.
30
Tunnetut menetelmät vain yksiketjuisen tPA:n tuottamiseksi sisältävät menetelmän, jossa viljely ja sitä seuraavat käsittelyvaiheet suoritetaan aprotiniinin läsnäollessa (EP-patenttijuikai su No. 41 766), menetelmän, jossa trypsiini-35 inhibiittoria tai aprotiniiniä lisätään tPA:ta tuottavien solujen vi1jelyväliaineeseen (Japanilainen hakemusjulkai su No. 118717/1984), menetelmän, jossa viljely tai induk-tiotuottaminen suoritetaan väliaineessa, jota on täydennet- 4 96039 ty aprotiniini 1lä tai bentsamidiini 1 la (Japanilainen hake-musjulkaisu No. 19486/1986) ja menetelmän, jossa aprotinii-niä tai 6-aminokapronihappoa lisätään puhdistusmenetelmässä (Biochem. Biophys. Acta 719(2). 318-328, 1982). Koska käy-5 tettävä aprotiniini on kuitenkin melko kallista, käytännöllinen käyttö teol1isuusmittakaavassa on vaikeaa. Niinpä on ehdotettu menetelmää, jossa molekyylipainoltaan alhaisia kemikaaleja lisätään kalliin seerumista peräisin olevan aprotiniinin tilalle, nimittäin menetelmiä, joissa anti-10 plasmiiniaineita, kuten epsilonaminokapronihappoa ja tra-neksaamihappoa lisätään väliaineeseen (Japanilainen hake-musjulkaisu No. 4233/1987).
Yksiketjuisen tPA:n tuottavuudessa ei kuitenkaan ole voitu 15 · suorittaa merkittävää edistymistä korvaamalla aprotiniini alhaisen molekyylipainon antiplasmiiniainei11 a tai p-amino-metyy1ibentsoehappojohdannaisi11a.
Tämän keksinnön toinen tarkoitus on aikaansaada menetelmä 20 yksiketjuisen tPA:n tuottavuuden parantamisessa suuressa määrin.
Intensiivisen tutkimuksen kuluessa tämän keksinnön tarkoitusten suorittamiseksi tämän keksijät huomasivat, että 25 tPA:n tuottavuutta voidaan parantaa paljon lisäämällä väliaineen osmoottista painetta jopa 350 mij 1 iosmool i in/1 tai ylikin käyttäjällä bikarbonaatti-ionia.
Edelleen tämän keksijät huomasivat, että tPA:n tuotannossa 30 voidaan yksiketjuisen tPA:n tuottavuutta parantaa paljon lisäämällä molekyylipainoltaan alhaisia antiplasmiiniainei-ta väliaineeseen, jossa osmoottinen paine on nostettu bikarbonaatti-ioni1 la 450 mi 11iosmooliin/1 ja yli ja täten tämä keksintö on saatettu loppuun.
35
Nimittäin tämä keksintö koskee menetelmää ihmiskudostyyppi-sen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi, jossa väliai 5 96039 neen osmoottinen paine nostetaan käyttäen bikarbonaatti -ionia 350 mi 11iosmooliin/1 ja yli.
Edelleen tämä keksintö koskee menetelmää ihmiskudostyyppi-5 sen p1asminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi, jossa menetelmässä yksiketjuisen tPA:n tuottavuutta voidaan parantaa huomattavasti lisäämällä molekyy1ipainoltaan alhaisia anti-plasmiiniaineita väliaineeseen, jossa osmoottinen paine nostetaan käyttäen bikarbonaatti-ionia 350 mi 11iosmooliin/1 ja yli.
tPA:n tuottaminen voidaan suorittaa tämän keksinnön mukaisesti joko rinnakkaisvaiheessa samanaikaisesti solunkasvun 5 kanssa tai erillisessä vaiheessa soiunkasvusta riippumattomasti .
Tämän keksinnön mukaan voidaan tPA:n tuottavuutta parantaa paljon lisäämällä solunvi1jelyväliaineen tai tPArta tuotta-10 van väliaineen osmoottista painetta, käyttäen bikarbonaat-ti-ionia, 350 mi 11iosmooliin/1 tai yli. Edelleen yksiket-juisen tPA:n tuottavuutta voidaan suuresti parantaa johtuen bikarbonaatti-ionin ja väliaineeseen lisätyn antiplasmiini-aineen synergistisestä vaikutuksesta.
15
Edelleen osmoottisen paineen vaikutuksen suhteen tPA:ta tuottavaan väliaineeseen ovat tämän keksinnön tekijät esittäneet tekniikan p-aminometyy1ibentsoehappojohdannais-ten läsnäollessa aikaisemmassa patenttihakemuksessaan US 20 sarjanumero 07/347.649 (EP-hakemus 89 304944.5).
Bikarbonaatti-ioni, jota käytetään tässä keskinnössä osmoottisen paineen nostamiseksi, voidaan varustaa väliaineeseen bikarbonaatteina, esimerkiksi natriumbikarbonaattina 25 (NaHC03), kaiiumbikarbonaattina ja kaisiumbikarbonaattina, jotka kehittävät bikarbonaatti-ionin, kun ne yhdistetään väliaineeseen tai hiilidioksidikaasuna sellaisessa pitoisuudessa, että bikarbonaatti-ioni dissosioituu, kun kaasu liukenee veteen väliaineessa. Mieluummin käytetään bikar-30 bonaatteja halutun bikarbonaatti-ionin pitoisuuden saarni- 6 96039 seksi ja tarvittaessa hiilidioksidikaasua syötetään sen jälkeistä säätöä varten, koska bikarbonaatti-ionin kehittymisen saanto on korkeampi lisättäessä bikarbonaatteja kuin syötettäessä hi i1idioksidi kaasua.
O
tPAm tuottaminen voidaan suori'ttaa soi uv i 1 je 1 y väl i ai neessa samanaikaisesti solun kasvun kanssa (yksivaiheprosessi) tai erillisessä tPA:ta tuottavassa väliaineessa riippumattomasti viIjelyvällaineesta (kaksi vaiheprosessi). Tässä keksin-10 nössä väliaineen osmoottisen paineen lisäämisen menettelytapa käyttämällä bikarbonaatti-ioni a suoritetaan tehokkaasti asiaankuuluvassa tPA:n tuottamiseksi tarkoitetussa väliaineessa. Nimittäin bikarbonaattia käyttävä menettely suoritetaan solunviIjelyvällaineessa yksi vaiheprosessin 15 tapauksessa ja tPA:ta tuottavassa väliaineessa kaksivaihe-prosessin tapauksessa. tPA:n tuottavuutta parannetaan suuresti näillä menetelmillä. Edelleen termi "väliaine" käytettynä sinänsä tässä selityksessä merkitsee väliainetta, joka liittyy tPA:n tuottamiseen.
20
Esimerkki soluviIjelyvällaineesta tässä keksinnössä on perusväliai ne, jota on täydennetty vasikan sikiöseerumi1 la sopivassa määrin (0 - 10 %) ja lisäaineilla, jotka ovat välttämättömiä solun kasvulle, kuten pinta-aktiiviainei11 a, 25 aminohapoilla, sokereilla ja suoloilla, jos niitä halutaan.
«
Edelleen tPA:ta tuottava väliaine on tässä keksinnössä esimerkiksi perusväliaine, jota on täydennetty vasikan s^kiöseerumi11 a sopivassa määrin (0 - 10 %) ja tPArta 30 indusoivilla aineilla, kuten sinki.llä, kadmiumilla ja niiden suoloilla 1 - 10 μΜ:η pitoisuudessa.
Perusväliai ne on tässä keksinnössä väliaine, joka käsittää esimerkiksi aminohappoja, vitamiineja ja epäorgaanisia 35 suoloja. Esimerkit perusväliaineista sisältävät väliaineet Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 199-väliaine (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) ja Eagle’s Minimal Essential Medium.
7 96039 Tämän keksinnön mukaisesti käytetään bikarbonaatti-ionia yleisesti sellaisessa määrin, että se tekee osmoottisen paineen summan, joka johtuu lisätyistä epäorgaanisista suoloista, aminohapoista, vitamiineista ja sen kaltaisita, 5 joita on lisätty väliaineeseen ja joka johtuu bikarbcnaat-ti-ionista, 350 mi 11iosmooliksi/1 tai suuremmaksi. Esimerkiksi, kun osmoottinen paine, joka johtuu orgaanisista suoloista, aminohapoista tai vitamiineista, on 280 millios-moolia/1, lisätään bikarbonaatti-ionia osmoottisen paineen 10 lisäämiseksi 70 mi 11 i osmool i 11 a/-l tai enemmällä kokonaismäärään 350 mi 11iosmoolia/1 tai yli. Kuitenkin siinä tapauksessa, että osmoottinen paine on kokonaismäärältään 350 mi 11iosmoolia/1 tai enemmän, bikarbonaatti-ionista johtuva osmoottinen paine on mieluummin 70 mi 11iosmoolia/1 tai 15 enemmän ja enemmän kuin 20 % kokonaismäärästä. Nimittäin osmoottisen paineen tekemiseksi 350 mi 11iosmooliksi/1 väliaineen osmoottisen paineen tulisi olla vähemmän kuin 350 mi 11iosmoolia/1 ilman bikarbonaatti-ionin lisäämistä. Merkittävää parannusta tPA:n tuottavuudessa ei voida odot-20 taa, kun 1isäbikarbonaatti-ionia syötetään väliaineeseen, jossa osmoottinen paine on jo 350 mi 11iosmoolia/1 tai enemmän johtuen aminohappojen jne. lisäyksestä, koska soiuaineenvaihduntaan vaikuttaa ylipaineinen tila, joka on tuloksena aminohapoista jne.
25
Keksinnön mukaan nimittäin tPAita tuottavan väliaineen * · osmoottista painetta säädetään käyttäen bikarbonaatti-ionia 350 mi 111osmooliin/1 tai yli, mieluummin alueelle 35C -1000 mi 11iosmoolia/1, vielä mieluummin 350 - 500 millios-30 moolia/Ί alueelle.
Ylenmääräisen korkea osmoottinen paine häiritsee solujen kasvua. Häiritseminen on kuitenkin pientä verrattuna siihen, mikä johtuu muiden liuenneitten aineiden nostamasta 35 osmoottisesta paineesta.
Solunkasvun vähenemisen estämiseksi osmoottisen paineen noususta johtuen voi kaksivaiheinen menetelmä, jossa solun- 8 96039 kasvu ja tPA:n tuottaminen etenevät erillään, olla suotavampi kuin yksivaiheinen menetelmä.
Väliaineen osmoottisen paineen säätämiseksi, kuten on 5 mainittu yllä, väliaineeseen lisätään esimerkiksi natriumbikarbonaattia (NaHC03) yli noin 3 g/1 pitoisuudessa, mieluummin 3-12 g/1 pitoisuudessa. Natriumbikarbonaatti on tehokkaampi kuin muut bikarbonaatit.
10 Lisäysvälineet ja bikarbonaatti-ionin muodot valitaan riippuen käytetyistä viljelymenetelmistä. Esimerkiksi kun käytetään T-pulloa, pyöritettävää pulloa tai sen kaltaista, natriumbikarbonaatti lisätään mieluummin väliaineeseen tekemään väliaineen osmoottinen paine 350 - 500 milliosmoo-15 liin/1 (noin 3-12 g/1 natriumbikarbonaattia).
Solujen viljely ja tPA:n tuottaminen suoritetaan mieluummin hii1idioksidikaasuinkubaattorissa joko suljetussa tai avoimessa järjestelmässä. Edelleen väliaineeseen liuenneen h i i — 20 1idioksi di kaasun määrä on enimmillään noin 0,001 M, mikä vastaa noin 1 mi 11iosmoolia/1. Täten ilmakehän hiilidioksidikaasun kokonaisvaikutus on merkityksetön väliaineessa pHrssa 6,5 - 7,5, mitä pH-aluetta käytetään käytännössä viljelyyn. Solujen tuottaman hiilidioksidikaasun määrä on 25 vähäinen ja merkityksetön. Toisaalta, kun viljely suoritetaan pyörivässä astiassa tai purkissa, bikarbonaatti-ioni voidaan varustaa syöttämällä natriumbikarbonaattia väliaineeseen ennen viljelyä ja myös puhaltamalla säädetty määrä hiilidioksidikaasua määrätyssä pitoisuudessa järjestelmään 30 tPA:n tuottamiseksi ja osmoottisen.paineen kokonaismäärän pitämiseksi järjestelmässä 350 - 500 mi 11iosmoolissa/1.
Kuten kuvattiin yllä, tPA:n tuottavuutta voidaan parantaa suuresti nostamalla väliaineen osmoottista painetta käyttä-35 en bikarbonaatti-ionia. Edelleen tämän keksinnön mukaan on mahdollista tuottaa selektiivisesti pääasiassa yksiketjuis-ta tPA:ta, joka on äärimmäisen hyödyllistä kliiniseen käyt-
II
9 96039 töön, lisäämällä molekyylipainoltaan alhaisia antiplas-miiniaineita väliaineeseen.
Esimerkit tämän keksinnön mukaan käytettävistä antiplas-5 miiniaineista sisältävät 4-aminovoihapon, 5-aminovaleri- aanahapon, 6-aminoheksaanihapon ja trans-4-(aminometyy-li)sykloheksaanikarboksyylihapon (traneksaamihapon). Muita aineita, joilla on antiplasmiiniaktiivisuutta ja joilla on molekyylipaino alueella 50 - 1000, voidaan myös käyttää.
10 Näitä yhdisteitä voidaan käyttää myös estereiden, metal lien, kuten alkalimetallien, suolojen muodossa tai hap-posuolojen, kuten kloridien muodossa. Tämän keksinnön mukaisesti lisätään molekyylipainoltaan alhaisia antiplas-miiniaineita 10-4 - 10_1 M, mieluummin 10-3 - 10“2 M pitoi-15 suudessa.
Edelleen antiplasmiiniaineita lisätään soluviljelyväliai-neeseen yksivaiheisessa prosessissa ja tPA:ta tuottavaan väliaineeseen kaksivaiheisessa prosessissa. Niitä voidaan 20 lisätä joko väliaineen valmistuksen aikana tai sen jälkeen, kun väliaine on tehty ylipaineiseksi käyttäen bikarbonaat-ti-ionia.
Esimerkki tPA:ta tuottavasta kannasta käytettäväksi tässä 25 keksinnössä on hT-382-solulinja (Japanilainen hakemusjul-kaisu No. 126978/1987), joka saadaan transformoimalla hiiren C-127-soluja plasmidilla, joka on rakennettu lisäkkeillä sekä osasta BPV:stä peräisin olevaa plasmidia ja osasta pBR322-plasmidia, joihin liittyy DNA-sekvenssi, 30 jossa DNA-sekvenssi, joka koodaa ihmisen kudoksen tyyppistä plasminogeeniaktivaattoria, joka on peräisin normaaleista ihmissoluista, on liitetty ihmisperäiseen metallotione-iinipromoottoriin ja DNA-sekvenssistä, joka on välttämätön transkription lopettamiseksi.
35
Toinen esimerkki tPArta tuottavasta kannasta on SV-21-M2.5 K7-solulinja (Japanilainen hakemusjulkaisu No.
126978/1987), joka saadaan transformoimalla kiinalaisen 10 96039 hamsterin munasoluja plasmidilla, joka käsittää DNA-sek-vensssin, jossa DNA-sekvenssi, joka koodaa ihmisen plas-minogeeniaktivaattoria, joka on peräisin normaaleista ihmissoluista, on liitetty SV-40 ai kaispromoottoriin ja 5 DNA-sekvenssiin, joka koodaa dihydrofolaattireduktaasia ja edelleen valitsemalla solut, jo'issa on monistetut geenit väliaineessa, jota on täydennetty metotreksaati11 a. Luonnollisesti minkä tahansa kaltaisia tPA:ta tuottavia soluja; esimerkiksi niitä, jotka on tuotettu yhdistelmänä muiden 10 välineiden kanssa, kuten mutaation tai sopeuttamisen kautta, tai niitä jotka on transformoitu viruksilla, voidaan käyttää.
Solujen viljelemiseksi ja tPA:n tuottamiseksi voidaan käyt-15 tää mitä tahansa tunnettuja menetelmiä. Esimerkiksi tätä keksintöä voidaan soveltaa tPA:n, erityisesti yksiketjuisen tPA:n, tehokkaaksi tuottamiseksi käyttäen yhtä seuraavista tunnetuista menetelmistä yhdistelmänä sen menetelmän kanssa, jossa tehdään väliaine ylipaineiseksi käyttäen bikar-20 bonaatti-ionia tai lisätään antiplasmiiniainetta, kuten on kuvattu yllä.
Edellisen kuvauksena istutetaan sopiva määrä soluja solun-vi1jelyaineeseen, jota on mahdollisesti täydennetty tPA:n 25 indusoijalla, T-pulloon ja sitten sitä inkuboidaan sopivassa lämpötilassa sopivan aikaa hii1idioksidikaasuinkubaatto-* rissa tPA:n tuottamiseksi rinnan solunkasvun kanssa.
Vaihtoehtoisesti soluja istutetaan soluvi1jelyaineeseen T-30 pullossa ja sitten niiden annetaan.kasvaa sopivassa lämpötilassa sopiva aika hii1idi oksi di-inkubaattorissa. Kun solut ovat kasvaneet yhteen asti, väliaine vaihdetaan tPA:ta tuottavaan väliaineeseen ja sitten inkubointia jatketaan hii1idioksidikaasuinkubaattorissa sopivassa 35 lämpötilassa sopiva aika tPA:n tuottamiseksi.
Esimerkiksi, kun käytetään 75 cm2 T-pulloa, solut istutetaan pitoisuudessa 0,5 - 2,0 x 105/ml ja niitä inkuboidaan 11 96039 37°C:ssa 3-4 päivää kasvaakseen rinnan tPA:n tuotannon kanssa.
Vaihtoehtoisesti, kun esimerkiksi käytetään 75 cm2 T-pulloa, 5 solut istutetaan 1 - 2 x 105/ml:n pitoisuudessa ja niitä inkuboidaan 37°C:ssa 3-4 päivää solujen kasvamiseksi. Sitten väliaine vaihdetaan tPArta tuottvaan väliaineeseen ja inkubointia jatketaan 37°C:ssa 1-3 päivää tPA:n tuottamiseksi.
10
Edelleen tätä keksintöä voidaan soveltaa käyttämällä pyöritettävää pulloa samalla tavalla.
Näillä tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä saadun tPA:n 15 analyysi paljasti, että tuotanto oli hyvinkin yli 10 - 30 mg/1 (yksiketjuisena tPA:na) siinä tapauksessa, että osmoottinen paine oli 350 milliosmoolia/1 tai yli ja siinä tapauksessa että antiplasmiiniainetta lisätään, yksiketjui-sen tPA:n tuotanto oli vallitseva. Tuotanto oli 20 - 40 20 mg/1 yksiketjuiselle tPA:lle ja vastaavasti 0-2 mg/1 kak-siketjuiselle tPA:lle ja yksiketjuisen tPA:n määrä oli yli 95 % kokonaismäärästä.
ESIMERKIT
25 Tätä keksintöä kuvataan erityisemmin seuraavissa esimerkeissä:
Menetelmä yksiketjuisen tPA:n ja kaksiketjuisen tPA:n 30 analysoimiseksi viljelmässä on seuraava.
(1) Monoklonaalisiä vasta-aineita yksiketjuiselle tPA:lle (PAM—1, American Diagonotica Co.) ja monoklonaalisia vasta-aineita yksiketjuiselle tPA:lle plus kaksiketjuiselle 35 tPA:lle (PAM-2, American Diagonotica Co.) laimennettiin päällystysliuoksella 10 Mg/l:ksi ja 50 μΐ kutakin laimennettua liuosta jaeltiin ELISA-levyn kuoppiin (96 kuoppaa, Corning Glass Works). Levyn annettiin seisoa kaksi tuntia 12 96039 huoneen lämpötilassa ja sitten kuopissa oleva neste pois-tettii n.
(2) Kukin kuopista pestiin pesuliuoksel1 a ja sitten täytet-5 ti in kiinnitysliuoksel1 a. Levyn annettiin seisoa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. 50 μΐ kutakin 1000 - 2000-ker-taisesti laimennettua näyteliuosta ja standardi 1iuoksia (0, 1. 2, 4 ja 8 ng/1) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyn annettiin seisoa kaksi tuntia.
10 (3) Kukin kuopista pestiin taas pesu 1iuoksel1 a ja sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin kanin anti-tPA-vasta-ainetta.
(4) Kukin kuopista pestiin taas pesuliuoksella ja sitten 50 15 pl 500-kertaisesti laimennettua liuosta, jossa oli vuohen anti-kani-IgG:tä ja alkaalista fosfataasikonjugaattia (Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyn annettiin seisoa 1 tunti.
20 (5) Kukin kuopista pestiin taas pesu 1iuoksel1 a ja sitten 50 pl substraatti 1iuosta (p-nitrofenyylifosfaatti, Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyn annettiin seisoa 30 minuutti a.
25 (6) 50 ui 3N NaOH-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan entsyymi reaktion pysäyttämiseksi.
(7) Absorptio 405 nm:n aallonpituudella luettiin kaupallisesti saatavalla ELISA-laitteella.
30 (8) Piirrettiin mittalinja käyttäen standardien lukemia ja tPA:n pitoisuudet näytteissä määritettiin.
(9) Suoritettiin laskelmat seuraavasti.
35 Yksiketjuisen tPA:n pitoisuus (mg/1) = PAM-1:n mittaus
Kaksiketjuisen tPA:n pitoisuus (mg/1) = PAM-2:n mittaus - PAM-1:n mi ttaus 13 96039
Edelleen osmoottinen paine mitattiin käyttäen Shimadzu Osmometer OSM-1 -1 aitetta nesteiden näytteiksi tekemisten jäi keen.
5 Esimerkki 1: tPA:n tuottamiseen käytetyt solut olivat yllä mainittua hT-382-kantaa.
10 Asetettiin 75 cm2:n T-pulloihin kuhunkin 20 ml Dulbecco’s Mooified Eagle Medium (DMEM)-elatusainetta, jota oli täydennetty 10 sk: 11a vasikan si kiöseerumi 11 a, joka oli lämpö! nakti voi tu, ja 10 pMrlla sinkkik 1 oridi 11 a. Kuhunkin aineeseen lisättiin aprotiniiniä (40 KIU) tai traneksaami-15 happoa (10‘2 M) ja Tisäksi natriumbikarbonaattia taulukossa 1 esitetyssä pitoisuudessa. Kukin näin valmistettu viljely-väliaine istutettiin yllämainittuihin soluihin, joiden pitoisuus oli 1,0 x 105 solua/ml.
20 Soluja inkuboitiin väliaineessa 37° C:ssa 4 päivää 5 %:ssa hii1idioksidikaasuinkubaattorissa. Kun solut olivat kasvaneet yhteen (noin 10 x 105 solua/ml), määritettiin yksiket-juisen tPA:n ja kaksiketjuisen tPA:n pitoisuudet yllä kuvatun analyysin mukaisesti. Tulokset on esitetty taulu-25 kossa 1.
Edelleen osmoottiselle paineelle annetut arvot olivat niitä, jotka oli mitattu, kun r.atriumbikarbonaatti oli lähes täysin ionisoitu.
30
Kuten on esitetty taulukossa 1, tPA:n tuottavuus viljelmässä, jossa osmoottinen paine nostettiin NaHC03:lla, oli parantunut riippumatta joko aprotiniinin tai traneksaamihapon lisäyksestä.
35
Edelleen tPA:n tuottavuuden parantuminen oli huomattava, kun traneksaamihappoa lisättiin; erityisesti yksiketjuisen tPA:n tuotanto parantui suuresti.
Taulukko 1 14 96039
NaHCOg Osmoottinen Lisäaine yk-tPA* yk-tPA HUOM
(g/1) paine (mg/1) nop.(%) 5 (m osm) 1.0 300 AP»* 6,4 90 norm.
TKA*** ' 7,4 94 väliaine 10 3,0 380 AP 10,2 92 TKA 22,1 96 7,5 450 AP 14,3 92 TKA .24,3 97 15 10.0 520 AP 7,4 90 *4 TKA 12,6 95
20 * yksiketjuinen tPA
‘** aprotiniini *** traneksaamihappo *4 väliaineen pH oli yli 8 ja solunkasvu oli hiukan alentunut .
25
Esimerkki 2 Käytettiin samaa soluiinjaa kuin esimerkissä 1. Solut istutettiin 1,0 x 105 solua/ml pitoisuudessa kukin Dulbec-30 co’s Modified Eagle Medium (DMEM)-väliaineessa, jota oli täydennetty 10 %:lla 1ämpöinaktivoidul1 a vasikan sikiösee-rumilla, 7 5 cm2: n T-pui loi hi n.
Soluja inkuboitiin 37' C:ssa 4 päivää hiilidioksidikaasuin-35 kubaattorissa. Kun solut olivat kasvaneet yhteen (noin 10 x 105 solua/ml), väliaine poistettiin ja korvattiin 20 mlrlla tPArta tuottavaa väliainetta, jolla oli sama koostumus, kuten kuvattiin yllä paitsi, että lisättiin sinkkikloridia 10 μΜ pitoisuutena ja aprotiniiniä (40 KIU) tai traneksaa-40 mihappoa (10'2 M) ja muita lisäaineita, kuten on määritelty taulukossa 2. Inkubointia jatkettiin hii1idioksidikaasuin-kubaattorissa 37’ C:ssa 2 päivää. Yksi ketjuisen tPA:n ja kaksi ketjuisen tPA:n pitoisuudet viljelmässä määritettiin, • · li 15 96039 kuten on kuvattu esimerkissä 1. Tulokset on esitetty taulukossa 2.
Kuten on esitetty taulukossa 2, tulokset käyttäen erilaisia 5 tPA:ta tuottavia väliaineita olivat saman laisia, kuin on saatu taulukossa 1. Edelleen itse tPA:n tuotanto parantui, kun Käytettiin tPA:ta tuottavaa väliainetta.
Taulukko 2 10 -----------------------------------------------------------
NaHC03 Osmoottinen Lisäaine yk-tPA* yk-tPA HUOM
(g/1) paine (mg/1) nop.(fc) (m osm) 15 1,0 300 AP** 8,6 90 norm.
TKA*** 9,2 95 väliaine 5.0 380 AP 24,3 88 TKA 32,0 93 20 7,5 450 AP 32,0 92 TKA 41,3 94 10.0 520 AP 21,0 94 25 TKA 28,5 94 * yksiketjuinen tPA ** aprotiniini 30 *** traneksaamihappo
Esimerkki 3 tPA:n tuotantoon käytetyt solut olivat SV-21-M2.5 K7-solu-35 1i nj aa.
tPA:n tuottaminen suoritettiin samalla tavalla kuin on kuvattu esimerkissä 1 paitsi, että sinkkik 1 oridi a ei lisätty väliaineeseen. Tulokset on esitetty taulukossa 3.
Kuten on ilmeistä taulukosta 3, havaittiin sama vaikutus kuin esimerkissä 1 myös tällä erityisellä sol uiinjal1 a.
40
Taulukko 3 16 96039
NaHC03 Osmoottinen Lisäaine yk-tPA* yk-tPA HUOM
(g/'l ) paine (mg/1 ) nop. (¾) 5 im osm) 1.0 300 AP*» 3,4 93 norm.
väliaine TKA*** 3,6 32 10 5.0 380 AP 8,2 88 TKA 16,2 92 7,5 450 AP .10,4 92 15 TKA 20,0 94 10.0 520 AP 7,5 90 - TKA 15,4 90 20 -----------------------------------------------------------
* yksiketjuinen tPA
** aprotini ini *** traneksaamihappo 25 Esimerkki 4 tPA:n tuotantoon käytetyt solut olivat samaa kantaa, kuin ne joita käytettiin esimerkissä 1. Solut (10® solua) istutettiin 1,0 x 105 solua/ml pitoisuudessa yhteen litraan 30 DMEMriä, jota oli täydennetty 10 *:lla vasikan lämpöinakti-voidulla sikiöseerumi11 a yhden litran pyöritettäviin pulloihin (kokonaiskapasiteetti noin 1,5 1), joista kukin oli varustettu sekoitusteri11ä, pH-elektrodei11 a, DO-elektro-deilla ja putkella kaasun tuomiseksi. Siemensolut, joita 35 käytettiin, oli etukäteen viljelty yllämainitussa väliaineessa pyörityspu11ossa. Inkubointia suoritettiin 37' C:ssa 4 päivää. Kun soiupitoisuus saavutti 106 solua/ml, yllämainittu väliaine poistettiin ja se korvattiin tPA:n tuotantoa varten yhdellä litralla DMEM:iä, jota oli täydennet-40 ty 5 %:lla lämpöinaktivoidulla vasikan sikiöseerumi11 a, aprotiniini11 a (40 KIU) tai traneksaamihapol1 a (10'z M) ja sinkki kloridi 1 la (10 μΜ) ja edelleen natriumbikarbonaati11 a (5,0 g/1).
17 96039
Osmoottisen paineen pitämiseksi väliaineessa, kuten on esitetty taulukossa 4, 5 % hiilidioksidikaasua puhallettiin silloin tällöin pulloon. pH säädettiin NaOH:lla. Edelleen ylläpidettiin DO 1 ppm:ssä ja lämpötila 37° C:ssa. Väliaine 5 vaihdettiin kerran päivässä viiden päivän ajan, täten tPA-fraktiot otettiin talteen kaikkiaan viisi kertaa.
Kuten taulukossa 4 on esitetty, havaittiin samanlaisia vaikutuksia kuin taulukossa 1, kun osmoottista painetta 10 säädettiin puhaltamalla hiilidioksidikaasua väliaineeseen.
Taulukko 4
Osmoottinen Lisäaine Yksiketjuinen tPA (mg/ml) 15 paine (m osm) 1 2 3 4 5 Yht AP1 4,3 6,2 7,7 4,8 4,0 27,0 (87) (88) (91) (90) (88) 300 20 TKA2 5,0 6,0 7,6 5,4 4,2 28,2 (92) (94) (91) (93) (95) 380 AP 5,3 10,4 12,8 14,2 11,3 54,0 25 AP 10,1 13,4 17,2 16,8 12,2 69,7 (90) (89) (93) (92) (91) 450 TKA 8,2 18,0 24,2 28,3 34,0 112,7 (93) (93) (96) (94) (92) 30 ------------------------------------------------------------— 520 AP 6,4 9,8 12,2 15,3 14,2 58,7 aprotiniini 2 35 2 traneksaamihappo

Claims (5)

96039
1. Menetelmä ihmiskudostyyppisen plasminogeeniaktivaat-torin (tPA) tuottamiseksi käyttäen soluja, tunnettu siitä, että 5 1) tuotetaan rinnan solujen solunviljelyväliaineessa ta pahtuvan kasvun kanssa, jossa väliaineessa osmoottinen paine nostetaan käyttäen bikarbonaatti-ionia ainakin 350 mil-liosmooliin/1, ja enintään 520 milliosmooliin/1 tai 2. solut kasvatetaan etukäteen väliaineessa ja sitten 10 niitä inkuboidaan väliaineessa tPA:n tuottamiseksi, väliaineen osmoottisen paineen ollessa nostettu käyttäen bikarbonaatti-ionia ainakin 350 milliosmooliin/1 ja enintään 520 milliosmooliin/1.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että bikarbonaatti-ioni on natriumbikarbonaatti ja sen pitoisuus väliaineessa on ainakin 3 g/1.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että väliaineeseen lisätään myös molekyylipai-noltaan alhaista antiplasmiiniäinetta.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antiplasmiiniaine on 4-aminovoihappo, 5-amino-valeriaanahappo, 6-aminoheksaanihappo, trans-4-(aminometyy-li)sykloheksaanikarboksyylihappo tai trans-4-(aminoetyy-li)sykloheksaanikarboksyylihappo.
5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että antiplasmiiniaineen pitoisuus väliaineessa on alueella 10-4 - 10_1 M. 96039
FI894657A 1988-10-04 1989-10-02 Menetelmä ihmiskudostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi FI96039C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP24908188 1988-10-04
JP63249081A JP2648624B2 (ja) 1988-10-04 1988-10-04 ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造方法
JP31611888 1988-12-16
JP63316118A JP2718726B2 (ja) 1988-12-16 1988-12-16 ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI894657A0 FI894657A0 (fi) 1989-10-02
FI894657L FI894657L (fi) 1990-04-05
FI96039B true FI96039B (fi) 1996-01-15
FI96039C FI96039C (fi) 1996-04-25

Family

ID=26539082

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI894657A FI96039C (fi) 1988-10-04 1989-10-02 Menetelmä ihmiskudostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5183754A (fi)
EP (1) EP0366285B1 (fi)
KR (1) KR920007398B1 (fi)
AT (1) ATE116363T1 (fi)
AU (1) AU614429B2 (fi)
CA (1) CA1335188C (fi)
DE (1) DE68920269T2 (fi)
DK (1) DK488489A (fi)
FI (1) FI96039C (fi)
NO (1) NO175787C (fi)
NZ (1) NZ230856A (fi)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5151359A (en) * 1988-05-19 1992-09-29 Mitsui Toatsu Chemicals Incorporated Method for producing of human tissue type plasminogen activator
CA2829774C (en) 2011-03-14 2019-09-24 National Research Council Of Canada Method of viral production in cells

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3732146A (en) * 1970-12-22 1973-05-08 Behringwerke Ag Process for the isolation of native, highly purified plasminogen
US4766075A (en) * 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
GB8334499D0 (en) * 1983-12-24 1984-02-01 Beecham Group Plc Derivatives
US4740461A (en) * 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4724206A (en) * 1984-02-13 1988-02-09 Damon Biotech, Inc. Protein production using hypertonic media
US4661453A (en) * 1984-06-19 1987-04-28 American Biogenetic Sciences, Inc. Production of tissue plasminogen activator factor
JPS624233A (ja) * 1985-07-01 1987-01-10 Toyobo Co Ltd 組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製造法
US4960702A (en) * 1985-09-06 1990-10-02 Codon Methods for recovery of tissue plasminogen activator
CA1312030C (en) * 1987-11-18 1992-12-29 Brian Maiorella Method to increase antibody titer
US5151359A (en) * 1988-05-19 1992-09-29 Mitsui Toatsu Chemicals Incorporated Method for producing of human tissue type plasminogen activator

Also Published As

Publication number Publication date
KR920007398B1 (ko) 1992-08-31
FI96039C (fi) 1996-04-25
FI894657A0 (fi) 1989-10-02
NO893929L (no) 1990-04-05
EP0366285A1 (en) 1990-05-02
DE68920269T2 (de) 1995-05-18
NZ230856A (en) 1991-10-25
DK488489A (da) 1990-04-05
EP0366285B1 (en) 1994-12-28
AU4254189A (en) 1990-04-12
DE68920269D1 (de) 1995-02-09
NO175787C (no) 1994-12-07
DK488489D0 (da) 1989-10-04
NO175787B (no) 1994-08-29
AU614429B2 (en) 1991-08-29
US5183754A (en) 1993-02-02
ATE116363T1 (de) 1995-01-15
KR900006509A (ko) 1990-05-08
FI894657L (fi) 1990-04-05
NO893929D0 (no) 1989-10-03
CA1335188C (en) 1995-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Suttie et al. Mechanism of action of vitamin K: Synthesis of y-carboxyglutamic aci
ES2644089T3 (es) Procedimientos de cultivo celular
Esmon et al. Protein C activation
Yoch et al. Effect of light intensity and inhibitors of nitrogen assimilation on NH4+ inhibition of nitrogenase activity in Rhodospirillum rubrum and Anabaena sp
Kuwae et al. Development of a fed-batch culture process for enhanced production of recombinant human antithrombin by Chinese hamster ovary cells
Morita et al. Calcium binding to a human factor IXa derivative lacking γ-carboxyglutamic acid: evidence for two high-affinity sites that do not involve β-hydroxyaspartic acid
FI96039B (fi) Menetelmä ihmiskudostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin tuottamiseksi
Levene et al. The effect of hypoxia on collagen synthesis in cultured 3T6 fibroblasts and its relationship to the mode of action of ascorbate
FI98123C (fi) Menetelmä ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorin valmistamiseksi
CN102471794B (zh) 提高维生素k依赖性蛋白质的表达产量的方法
ES2803773T3 (es) Medios mejorados para la expresión de proteínas recombinantes dependientes de vitamina k
Wu et al. The binding of plasminogen fragments to cultured human umbilical vein endothelial cells
AU614999B2 (en) Method for preparing proteins
Kunamneni et al. Urokinase-A strong plasminogen activator
JP2718726B2 (ja) ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法
EP0603215B1 (en) Purification of factor xiii
JP2825541B2 (ja) ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法
JPS62285784A (ja) プラスミノ−ゲン活性化因子および血栓ほう壊組成物
Eisenstadt et al. Sulfur incorporation into the α-amylase of Pseudomonas saccharophila
JP2648624B2 (ja) ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造方法
Murray et al. Influence of cyclic AMP on the growth response and anaerobic metabolism of carbon monoxide in Rhodocyclus gelatinosus
KR100249135B1 (ko) 글리신 베타인이 첨가된 고삼투압의 배지를 사용하여 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 방법
Kyung et al. Enhanced productivity of protein C by recombinant human cells in automated fed-batch cultures
Khaparde et al. Session: Biological Engineering ChemCon’04 Mumbai
JPS6336782A (ja) ヒト組織プラスミノゲン活性化因子の産生法

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: MITSUI CHEMICALS, INC.

MM Patent lapsed

Owner name: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT