FI95600B - Menetelmä fuusioproteiinien valmistamiseksi Streptomyces-lajeissa - Google Patents

Description

1 95600

Menetelmä fuusioproteiinien valmistamiseksi Streptomyces-lajeissa

Keksintö koskee menetelmää fuusioproteiinien val-5 mistamiseksi, jossa halutun proteiinin rakennegeeni kytketään mahdollisesti typistetyn tendamistaattigeenin C-päät-teeseen, tämä geenlrakenne ilmennetään Streptomyces-isän-täsolussa ja erittynyt fuusioproteiini eristetään viljel-mäsupernatantista.

10 Aiemmin on esitetty menetelmä fuusioproteiinien valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että halutun proteiinin rakennegeeni kytketään C-päätteen välityksellä mahdollisesti modifioituun tendamistaattigeeniin, ilmaistaan tämä geenirakenne Streptomyces-isäntäsolussa ja 15 eristetään erittynyt fuusioproteiini viljelmäsupernatan-tista (DE 37 14 866 AI tai EP 0 289 936 A2). Aikaisempi patenttijulkaisu koskee edelleen geenirakenteita, jotka sisältävät mainitun mahdollisesti modifioidun tendamistaattigeenin, joka on C-päätteestään kytketty jonkin toi-20 sen proteiinin rakennegeeniin, tällaisen geenirakenteen sisältäviä vektoreita, tällaisen vektorin sisältäviä Streptomyces-soluja sekä fuusioproteiineja, joille on tunnusomaista N-pääteosuus mahdollisesti modifioidusta tenda-mistaattigeenistä. Aikaisempi patenttijulkaisu käsittää : 25 esimerkkejä fuusioproteiineista, joissa tendamistaatin aminohapposekvenssi on siltasekvenssin välityksellä kytketty apinaproinsuliinin aminohapposekvenssiin.

Kyseisen keksinnön johtoajatusta edelleenkehitet-täessä todettiin, että menetelmän mukaan voidaan erityisen . 30 soveliaasti valmistaa fuusioproteiini, jossa tendamistaat- tiosuutta seuraa typistetty proinsuliini, jonka C-ketju koostuu pelkästään yhdestä tai kahdesta lysiinijäännöksestä. Nämä esituotteet voidaan muuttaa humaani-insuliiniksi erityisen helposti ja edullisin kustannuksin.

2 95600

Keksinnön mukaiselle menetelmälle fuusioproteiinien valmistamiseksi on siten tunnusomaista, että halutun proteiinin rakennegeeni koodaa proinsuliinijohdannaista, jossa B-ketju on sidottu A-ketjuun siltasekvenssin (C-ketjun) 5 välityksellä, joka koodaa aminohapporyhmää Lys tai Lys-Lys.

Keksinnön erityiset suoritusmuodot koskevat edullisia geenirakenteita tällaista fuusioproteiinia koodaavan geenin monistamiseksi ja ilmaisemiseksi. Keksinnön muita 10 edullisia suoritusmuotoja kuvataan seuraavassa tai esitetään oheisessa patenttivaatimuksessa.

Keksinnön mukaisen geenirakenteen perustana on edullisesti synteettinen geeni, joka koodaa typistettyä proinsuliinijohdannaista. Tätä geeniä rakennettaessa on 15 tarkoituksenmukaista ottaa huomioon Streptomyces-lajeille ominainen kodonikäytäntö. On ilmennyt, että näin menette-lemällä saadaan fuusioproteiinisaantoa nostetuksi.

Edullisesti niinikään synteettiseen geenirakentee-seen liitetään rakentamisvaiheessa päätössekvenssi, koska 20 myös täten nostetaan synteesinopeutta.

Keksinnön mukaisen menetelmän suuri etu on, että fuusioproteiinit voidaan osoittaa maljakokeella, jota kuvataan patenttijulkaisun EP-A1 0 161 629 esimerkissä 3 sekä DE-hakemusjulkaisun 3 536 182 esimerkissä 2. Näin ei 25 ainoastaan oleellisesti helpoteta kiinnostavien kloonien seulontaa, vaan niinikään työskentelyä yleensä pystyttäessä helposti määrittämään eri parametrien vaikutukset saantoon.

Tekniikan tasona esitetyssä julkaisussa EP 30 AI 195 691 kuvataan erilaisia insuliiniprekursoreita; keksinnön mukaista tendamistaattiosaa ei kuvata eikä mainita. Julkaisu EP A2 281 090 koskee menetelmää, jossa haluttu proteiini insertoidaan tendamistaatin aminohapposekvenssiin. Kytkentää C-päätteen kautta ei siis julkaisussa ku-35 vata. Julkaisu EP AI 161 629 koskee määrättyä menetelmää, 3 95600 jossa käytetään tiettyä signaalipeptidiä. Julkaisussa W088/02005 esitetään kuten julkaisussa EP AI 195 691 erilaisia insuliiniprekursoreita; keksinnön mukaista tendami-staattiosaa ei kuvata eikä mainita. FI-patenttihakemukses-5 sa 882059 ei kuvata tämän hakemuksen patenttivaatimuksessa 1 esitettyjä proinsuliinijohdannaisia (vrt. tämän hakemuksen taulukko 1 ja edellä esitetyn Fl-hakemuksen taulukko 2 C-ketjun osalta.) Todettakoon lisäksi, että kun vieraita proteiineja ilmennetään isäntäsoluissa, ei alan ammatti-10 mies yleensä pysty ennakoimaan, muodostuuko haluttua tuotetta riittävässä määrin. On aina olemassa se vaara, että isäntäsolun omat proteaasit hajottavat vieraat proteiinit.

Näin ollen oli hyvin yllättävää, eikä lainkaan ilmeistä, että keksinnön mukaisesti valmistettavat vieraat prote-15 iinit eivät oleellisesti hajoa pidemmänkään fermentoinnin aikaina ja että niitä siten voidaan ottaa talteen hyvin saannoin. Lisäksi vieraat proteiinit ilmeisesti muodostuvat konformaatiossa, joka täysin vastaa kypsää insuliinia tai ainakin muistuttaa sitä hyvin paljon, mikä ei ollut 20 mitenkään ilmeistä monimutkaiset ilmentämis- ja fermen-tointiolosuhteet huomioon ottaen.

Keksinnön mukaan saatujen fuusioproteiinien konfor-maatio on siten ilmeisesti kypsän insuliinin konformaatio-ta vastaava, tai ainakin sitä likeisesti muistuttava. Täi- • 25 löin ei ainoastaan jatkotyöstäminen insuliiniksi merkittä västi helpotu, vaan niinikään yllättävästi ilmenee, että fermentoinneissa, jotka kestonsa puitteissa jo tuottavat hyvän saannon, ei esiinny merkittävämpää hyökkäystä fer-mentointiliemeen erittyneiden proteaasien taholta.

. 30 Proinsuliinimolekyylin modifiointi keksinnön mukai sesti typistetyn C-ketjun omaavaksi mahdollistaa helpon jatkotyöstämisen humaani-insuliiniksi, nimittäin kemiallisesti hydroksyyliamiinilla lohkaisemalla ja/tai lohkaisemalla entsymaattisesti trypsiinillä tai edullisesti ly-35 syyliendoproteinaaseilla. Edullinen on entsymaattinen . · 4 95600 pilkkominen. Lysyyliendoproteinaasit pilkkovat spesifisesti karboksyylipäätteestä aminohapon lysiini jälkeen. A- ja B-ketjujen edullisen järjestäytymisen keksinnön mukaisissa fuusioproteiineissa ansiosta mainittujen entsyymien vaiku-5 tuksesta muodostuu insuliini-esituote, jossa yllättävästi disulfidisillat on kytketty oikein.

Tarkoituksenmukaista on sijoittaa geenirakenteeseen tendamistaattiosuuden ja proinsuliinimolekyylin alkukohdan väliin siltasekvenssi, joka sallii proinsuliinijohdannai-10 sen irtileikkaamisen tendamistaattiosuudesta samalla entsyymillä, jolla proinsuliinijohdannainen pilkotaan kyseisiksi kahdeksi insuliiniketjuksi.

Pilkottaessa keksinnön mukaisia fuusioproteiineja lysyyliendopeptidaasilla saadaan - kulloinkin riippuen 15 modifioidun C-ketjun rakenteesta - Des-B30-insuliinia, joka voidaan transpeptidoinnilla muuttaa humaani-insuliiniksi, tai B31-Lys-insuliinia tai B31-Lys-B32-Lys-insuliinia, jotka voidaan muuttaa humaani-insuliiniksi esimerkiksi käyttämällä karboksipeptidaasi-B:tä.

20 Erityisen korkeita halutun proteiinin saantoja saa daan käyttämällä typistetyn tendamistaattigeenin käsittäviä geenirakenteita. Tähän keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuotoon liittyy se merkittävä hyvä puoli, että modifioidun insuliinin osuus muodostaa fuusioproteiinista 25 noin puolet, eli tuo mukanaan oleellisesti vähemmän "painoa". Tendamistaattiosuuden lyhentämisellä ei ole vaikutusta fuusioproteiinin oikeanlaiseen laskostumiseen, jolloin siis myös keksinnön mukaista pienempää fuusioproteii-nia käytettäessä edullinen jatkotyöstö, johon edellä vii-30 tattiin, on mahdollinen. Tätä etua ei myöskään tarvitse ostaa isännälle ominaisten proteaasien korkeampana hajo-tusnopeutena - yllättävästi ilmeni itse asiassa, että stabiilisuus näiden proteaasien suhteen parani.

Keksintö mahdollistaa täten suorastaan valikoiman 35 edullisia geenirakenteita, joista voidaan saada insuliini- 5 95600 esituotteita, jotka ovat helposti erotettavissa fuusiopro-teiinin "paino-osasta”. Kyseisen yksinkertaisen jatkotyös-tön ansiosta humaani-insuliinisaanto kasvaa edelleen.

Fuusioproteiinin erotus kasvualustasta, sen edel-5 leen työstäminen insuliini-esiasteiksi ja näiden muuttaminen humaani-insuliiniksi voidaan suorittaa sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Täten fuusioproteiini voidaan edullisesti eristää adsorptio- tai ioninvaihtokromatografises-ti ja/tai geelisuodatusta käyttäen sekä proinsuliiniosuus 10 lohkaista kemiallisesti tai edullisesti entsymaattisesti. Vastaavien siltasekvenssien rakentaminen on yleisesti tunnettu menettely, jota kuvataan esimerkiksi patenttijulkaisussa ΕΡ-Ά2 0 229 998.

Patenttijulkaisusta EP-B 0 089 007 tunnetaan pre-15 pro- ja proinsuliinianalogeja, jotka käsittävät preketjun C-päätteessä (tai proinsuliinin N-päätteessä) aminohappo-jäännöksen Lys tai Arg (mikä on edullista myös keksinnön mukaisissa rakenteissa), joiden B-ketju päättyy B29-Lys ja joissa C-peptidi voi olla typistynyt pelkkään aminohappo-20 jäännökseen Lys tai Arg, jolloin siis proinsuliiniraken-teessa aminohappojäännöstä B29-Lys yksinkertaisimmillaan seuraa ainoastaan Lys tai Arg, johon liittyy A-ketju. Nämä yhdisteet toimivat esituotteina insuliinien valmistamiseksi trypsiiniä tai trypsiinin kaltaisia endopeptidaaseja • 25 sekä jonkin luontaisen, valinnaisesti suojaryhmän käsittä vän aminohapon esteriä käyttäen.

Insuliinin esiasteet, joissa B- ja A-ketjuja yhdistää siltasekvenssi -X-Y-, jossa X ja Y ovat identtiset tai poikkeavat toisistaan ja edustavat jäännöksiä Lys ja Arg, 30 tunnetaan patenttijulkaisusta EP-A 0 195 691. Nämä insu-liini-esiasteet ilmennetään hiivassa ja muutetaan sitten entsymaattisesti konvertoimalla humaani-insuliiniksi. Typistetyn C-ketjun käsittävät insuliini-esiasteet tunnetaan patenttijulkaisusta EP-A 0 163 529. Patenttijulkaisuissa 35 EP-B 0 132 769 ja 0 132 770 kuvataan insuliini johdannaisia . sekä niitä sisältäviä farmaseuttisia valmisteita.

6 95600

Seuraavissa esimerkeissä kuvataan keksintöä tarkemmin. Prosenttiosuudet on laskettu painosta, ellei toisin mainittu.

Oheinen kuvio havainnollistaa esimerkissä 1 esitet-5 tyä keksinnön mukaista geenirakennetta. Kuvio ei ole mittakaavaan piirretty.

Esimerkki 1

Taulukon 1 mukainen synteettinen geeni (1) syntetisoidaan kemiallisesti fosfoamidiittimenetelmän mukaan si-10 nänsä tunnetulla tavalla. Kodonivalinnassa otettiin huomioon Streptomyces-lajien suosima G:n ja C:n asettaminen etusijalle. Kuten aikaisemman patenttihakemuksen mukaisessa (siinä taulukko 2) apinaproinsuliinia koodaavassa geenissä esiintyy myös taulukon 1 mukaisessa geenissä (1) 5' -15 päätteessä restriktioentsyymille EcoRI ominainen ylijää-mäsekvenssi. Rakennegeenin jälkeen sijaitsevat kaksi lope-tuskodonia sekä Sali-entsyymin tunnistuskeskuksen käsittävä liitossekvenssi. 3'-päätteessä sijaitsee restriktioent-syymiä HindiII vastaava ylijäämäsekvenssi.

20 Kaupallisesti saatavana olevaa plasmidia pUC19 pil kotaan entsyymeillä EcoRI ja HindiII ja taulukon 1 mukainen synteettinen geeni (1) ligatoidaan pilkkomistulokseen, jolloin saadaan plasmidi pH (2). Synteettistä geeniä monistetaan, minkä jälkeen se lohkaistaan irti entsyymejä : 25 EcoRI ja Sali käyttäen fragmenttina (3), jota käytetään jäljempänä kuvatun rakenteen muodostamiseksi.

Plasmidi pUC19 pilkotaan täysin Smal:llä ja pilkko-mistuote ligatoidaan taulukon 2 mukaiseen päätössekvenssiin (4). Plasmidit, jotka sisältävät tämän sekvenssin 30 oikein suuntautuneena, nimetään pTl:ksi (5). Tämä plasmidi : (5) leikataan auki EcoRI:llä ja leikkauskohta täytetään DNA-polymeraasia (Klenow-fragmentti) käyttäen. Uudelleen-ligatoimalla saadaan plasmidi pT2 (6). Tämä plasmidi leikataan auki entsyymeillä Sali ja Sphl ja eristetään saatu 35 suuri fragmentti (7).

• >· =* «Ui HU lU-i-SB : - 7 95600

Plasmidia pKK400 (8) [vrt. aikaisempi patenttihakemus, kuvio 4 (20)] pilkotaan Sphl:llä ja EcoRI:llä ja eristetään saatu pieni, tendamistaattigeenin käsittävä fragmentti (9).

5 Ligatoimalla keskenään fragmentit (3), (7) ja (9) saadaan plasmidi pKK500 (10), jossa tendamistaattisekvens-siä seuraavat ensin 12 aminohappojäännöstä koodaava sil-tasekvenssi

Phe Asn Ala Met Ala Thr Gly Asn Ser Asn Gly Lys 10 TTC AAT GCG ATG GCC ACC GGG ATT TCG AAC GGC AAG AAG TTA CGC TAC CGG TGG CCC TAA AGC TTG CCG TTC

EcoRI

ja sen jälkeen keksinnön mukaisesti modifioidun proinsu-liinin geeni. Oikeanlainen järjestäytyminen varmistetaan 15 pilkkomalla Sphl:llä ja Sstl:llä, jolloin noin 3,5 kb:n plasmidista saadaan 833 bp:n fragmentti. Sekvenssin oikeellisuudesta varmistutaan DNA-sekvensoimalla dideoksi-menetelmän mukaan.

Keksinnön mukaisia geenirakenteita, joissa C-pep-20 tidinä toimivaa Lys-jäännöstä täydentää toinen Lys-jäännös, valmistetaan vastaavalla tavalla. Tässä tarkoituksessa Lys-jäännöstä koodaava tripletti AAG kahdennetaan. E-deltävään nähden analogisesti saadaan plasmidi p!2 ja siitä vektori pKK600.

i 25 Esimerkki 2

Aikaisemmassa patenttihakemuksessa esitettyyn vektoriin pGFl nähden analogisesti vektoreista pKK500 ja pKK600 valmistetaan ekspressioplasmidit pGF2 ja pGF3. Tässä tarkoituksessa vektoreista pKK500 ja pKK600 eristetään # 30 Sphl:llä ja Sstl:llä samanaikaisesti pilkkomalla 823 bp:n ja vastaavasti 826 bp:n insertti, jotka DNA-fragmentit li-gatoidaan samoilla entsyymeillä pilkottuun ekspressioplas-midiin pIJ702. Ligatointiseoksella transformoidaan S. li-vidans -kanta TK 24, minkä jälkeen tiostreptoniresisten-35 teistä transformanteista, jotka osoittavat tendamistaat- f « 1 4 8 95600 tiaktiivisuutta (maljakoe), eristetään plasmidi-DNA. Kaikki positiiviset kloonit sisältävät kyseisen insertin pKK500:stä tai pKK600:sta.

Koodattu fuusioproteiini voidaan ilmentää sinänsä 5 tunnetulla tavalla. Jos transformoitua S. lividans -kantaa TK 24 inkuboidaan neljän päivän ajan 28°C:ssa ravistelukol-veissa ja eristetään myseeli kasvatusliemestä sentrifugoi-mallla, voidaan kirkkaasta liuoksesta osoittaa fuusioproteiini seuraavasti: 10 10 - 100 pl:aan liuosta lisätään 20 - 200 μΐ 15- %:ista trikloorietikkahappoa, saostunut proteiini rikastetaan sentrifugoimalla, pestään ja lietetään SDS-pitoi-seen määrityspuskuriin [U. Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685]. Näytettä inkuboidaan 2 minuutin ajan 90°C:ssa, minkä 15 jälkeen inkubointituotteet erotetaan elektroforeettisesti 10 - 17 -%:isessa SDS-polyakryyliamidigeelissä. Saadun proteiinin molekyylipaino on 15 kD:tä, joka siis edustaa odotusten mukaista molekyylipainoaluetta tendamistaatista ja proinsuliinista koostuvalle fuusioproteiinille. Fuusio-20 proteiini reagoi niinikään tendamistaattivastaisten vasta-aineiden kuten myös insuliinivastaisten vasta-aineiden kanssa.

Esimerkki 3

Ekspressiovektoria pTF2 (DE 37 14 866 AI, esimerkki • 25 4) pilkotaan restriktioentsyymeillä EcoRI ja Sstl ja eris tetään apinaproinsuliinia koodaava fragmentti. Saatua 5,65 kbp:n fragmenttia käytetään alla kuvatussa ligatointireak-tiossa.

Plasmidista pKK500 (esimerkki 1) leikataan samoja 30 restriktioentsyymejä käyttäen 285 bp:n DNA-fragmentti, joka sisältää sekä typistetyn proinsuliinigeenin että pää-tössekvenssin.

Ligatoimalla pTF2:sta peräisin oleva 5,65 kbp:n fragmentti pKK500:sta peräisin olevaan 285 bp:n fragment-35 tiin saadaan ekspressioplasmidi pTF3.

t 9 95600

Jos Streptomyces lividans -kannan TK 24 protoplas-teja transformoidaan ligatointiseoksella, saadaan klooneja, jotka ovat tiostreptoniresistenttejä sekä erittävät fuusioproteiinia, joka reagoi proinsuliinivastaisten vas-5 ta-aineiden kanssa. Tämä fuusioproteiini koostuu tendamis-taatin 41 ensimmäisestä aminohappojäännöksestä, siltasek-venssistä

Pro-Ser-Leu-Asn-Ser-Asn-Gly-Lys sekä typistetystä proinsuliinista.

956GC

Taulukko 1 B1 10

ASN SER ASN OLY LYS PHE VAL ASN GLN HIS LEU CYS GLY SER HIS

5 AAT TCG AAC GGC AAG TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC

GC TTG CCG TTC AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AOC GTG (EcoRI)

20 30 LEU VAL GLU ALA LEU TYR LEU VAL CYS GLY GLU ARG GLY PHE PHE

10 CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC

GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG

C A1 HO

15 TYR THR PRO LYS THR LYS GLY ILE VAL GLU GLN CYS CYS THR SER

TAC ACC CCC AAG ACC AAG GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGT ACG TCC

ATG TGG GGG TTC TGG TTC CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACA TGC AGG

50

2o ILE CYS SER LEU TYR GLN LEU GLU ASN TYR CYS ASN STP STP

ATC TGC TCC CTC TAC CAG CTC GAG AAC TAC TGC AAC TAG TAA

TAG ACG AGG GAG ATG GTC GAG CTC TTG ATG ACG TTG ATC ATT

: 25 GTC GAC CTG CAG CCA

CAG CTG GAC GTC GGT TCG A

Sali (Hindlll)

Taulukko 2 GCTATTTGGCTATGmAmCCGAGGAAAACCT0GGAAAAAAAAACCrcrAAAAGTTGCACCrAG-5'

Il : *l;t iin In t m <

Claims (2)

11 95600 Patenttivaatimus r Menetelmä fuusioproteiinien valmistamiseksi, jossa halutun proteiinin rakennegeeni kytketään mahdollisesti 5 typistetyn tendamistaattigeenin C-päätteeseen, tämä gee-nirakenne ilmennetään Streptomyces-isäntäsolussa ja erittynyt fuusioproteiini eristetään viljelmäsupernatantista, tunnettu siitä, että halutun proteiinin rakenne-geeni koodaa proinsuliinijohdannaista, jossa B-ketju on 10 sidottu A-ketjuun siltasekvenssin (C-ketjun) välityksellä, joka koodaa aminohapporyhmää Lys tai Lys-Lys. hmää Lys tai Lys-Lys.

15 Patentkrav Förfarande för framställning av fusionsproteiner, i vilket det önskade proteinets strukturgen kopplas till C-terminalen av den eventuellt förkortade tendamistatgenen, 20 denna genstruktur uttrycks i en Streptomyces-värdcell och det utsöndrade fusionsproteinet isoleras frän odlingssu-pernatanten, kännetecknat därav, att det önskade proteinets strukturgen kodar ett proinsulinderivat, i . vilket B-kedjan bundits vid A-kedjan medelst en brosekvens : 25 (C-kedja), som kodar aminosyragruppen Lys eller Lys-Lys. « « «