FI95439B

FI95439B - Menetelmä biologisesti aktiivisten multivesikulaaristen lipidivesikkeleiden tai liposomien valmistamiseksi

Info

Publication number: FI95439B
Application number: FI880841A
Authority: FI
Inventors: Stephen Barnard Howell; Sinil Kim
Original assignee: Depotech Corp
Priority date: 1987-02-23
Filing date: 1988-02-23
Publication date: 1995-10-31
Also published as: NO880768L; AU1205588A; NO174087B; EP0280503B9; DK93988D0; CA1323568C; PT86805A; ES2053722T4; JP2843566B2; AU602190B2; EP0280503A3; IL85509A0; DK172057B1; FI880841A0; PT86805B; GB8704171D0; NZ223599A; KR890012638A; GR3007581T3; IE62221B1

Description

95439

Menetelmä biologisesti aktiivisten multivesikulaaristen lipidivesikkeleiden tai liposomien valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää keinotekoisten multive-5 sikulaaristen lipidivesikkeleiden tai liposomien valmistamiseksi, joihin on kapseloitu biologisesti aktiivisia aineita .

Multivesikulaariset liposomit ovat yksi kolmesta liposomien päätyypistä. Niitä valmistivat ensimmäisenä Kim 10 et ai. (1983, Biochim. Biophys, Acta 782, 339 - 348), ja ne eroavat erikoisesti unilamellaarisista (Huang, 1969, Biochemistry 8, 334 - 352; Kim et ai., 1981, Biochim. Biophys. Acta 646, 1 - 10) ja multilamellaarisista (Bangham et ai., 1965, J. Mol. Biol. 13, 238 - 252) liposomeista 15 siinä, että ne sisältävät useita ei-samakeskisiä vesikam-mioita. Alalla on aiemmin kuvattu monia tekniikoita liposomien tuottamiseksi, mutta kaikki nämä tekniikat koskevat ei-multivesikulaaristen liposomien tuottamista: esimerkiksi Lenkin US-patentti nro 4 522 803, Baldeschwiele-20 rin 4 310 506, Papahadjopoulos'in 4 235 871, Schneiderin 4 224 179, Papahadjopoulos* in 4 078 052, Taylorin 4 394 372, Marchettin 4 308 166, Mezein 4 485 054 ja Redziniakin 4 508 703 kaikki kuvaavat ei-multivesikulaari-sia vesikkeleitä. Liposomien valmistuksen eri menetelmien 25 laajaa katsausta varten katso Szoka et ai., 1980, Ann. Rev. Bioeng. 9 467 - 508.

Kim et ai.'n (1983, Biochim. Biophys. Acta 782, 339 - 348) menetelmä on ainoa raportti, joka kuvaa multi-vesikulaarisia liposomeja, mutta joidenkin pienten mole-30 kyylien, kuten ara-C:n, kapselointitehokkuus oli suhteellisen alhainen ja kapseloitujen molekyylien vuotonopeus biologisessa nesteessä oli korkea.

Monilla lääkkeillä optimaalinen käsittely vaatii lääkkeen tason ylläpitämisen pidennetyn ajanjakson ajan. 35 Esimerkiksi optimaalinen syövänvastainen hoito solusykli- 2 55439 spesifisillä antimetaboliiteilla vaatii sytotoksisen lääkkeen tason ylläpidon pidennetyn ajanjakson ajan. Sytara-biini on suuresti aikataulusta riippuvainen syövänvastai-nen lääke. Koska tämä lääke tappaa soluja vain silloin, 5 kun ne tekevät DNA:ta, optimaaliselle solutapolle tarvitaan pidennetty altistus lääkkeen terapeuttisella konsen-traatiolla. Valitettavasti sytarabiinin puoliintumisaika suonensisäisen (IV) tai ihonalaisen (SC) annostuksen jälkeen on erittäin lyhyt. Jotta saavutettaisiin optimaalinen 10 syöpäsolutappo solusyklivaihespesifisellä lääkkeellä, kuten sytarabiinilla, täytyy ratkaista kaksi vaatimusta: ensiksi syöpä täytyy altistaa korkealle lääkekonsentraa-tiolle aiheuttamatta palautumatonta vahinkoa isännälle ja toiseksi kasvain täytyy altistaa pidennetyn ajanjakson 15 ajan niin, että kaikki tai suurin osa syöpäsoluista on yrittänyt valmistaa DNA:n sytarabiinin läsnäollessa.

Esillä olevaa keksintöä aiemmin ainoa tapa saada aikaan jatkuvia plasmasoluja oli jatkuva IV- tai SC-infuu-sio, jotka molemmat ovat epämukavia ja kalliita tapoja.

20 Näin ollen tarvitaan näiden lääkkeiden hyväksyttävä, hi-dasvapautteinen depotvalmiste. Aiemmin tutkijat ovat yrittäneet saavuttaa tämän modifioimalla lääkemolekyyliä kemiallisesti metabolian hidastamiseksi tai sitomalla hydrofobinen osa kovalenttisesti liukenemisen hidastamiseksi. 25 Tällaiset käsittelyt ovat johtaneet uusien myrkyllisten vaikutusten syntyyn, Finkelstein et ai., Cancer Treat. Rep. 63, 1331 - 1333, 1979, tai ei-hyväksyttäviin farma-kokineettisiin tai formulaatio-ongelmiin, Ho et ai., Cancer Res. 37, 1640 - 1643, 1977.

30 Näin ollen tarvitaan hidasvapautteinen depotvalmis te, joka sallii pidennetyn ja jatkuvan altistuksen biologisesti aktiivisen aineen terapeuttisella konsentraatiol-la.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää biologises-35 ti aktiivisten multivesikulaaristen lipidivesikkelien tai li 3 95439 liposomien valmistamiseksi, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että se sisältää seuraavat vaiheet: a) liuotetaan lipidikomponentti yhteen tai useampaan orgaaniseen liuottimeen, jolloin lipidikomponentti 5 sisältää ainakin yhtä neutraalia lipidiä ja ainakin yhtä amfipaattista lipidiä, jolla on vähintään yksi negatiivinen nettovaraus; b) lisätään lipidikomponenttiin sekoittumaton, ensimmäinen, hydrokloridia ja yhtä tai useampaa biologises- 10 ti aktiivista kapseloitavaa ainetta sisältävä vesikompo- nentti; c) muodostetaan vesi-öljy-emulsio kahdesta sekoittamattomasta komponentista; d) siirretään ja upotetaan vesi-öljy-emulsio toi- 15 seen sekoittumattomaan vesikomponenttiin; e) dispergoidaan vesi-öljy-emulsio useita pisaroita ensimmäistä vesikomponenttia sisältävien liuotinpal-losten muodostamiseksi; ja f) haihdutetaan orgaaniset liuottimet liuotinpal- 20 losista multivesikulaaristen liposomien muodostamiseksi.

Näin valmistettu liposomi sallii pidennetyn ja jatkuvan altistuksen biologisesti aktiivisen aineen terapeuttisella konsentraatiolla optimaalisten tulosten aikaansaamiseksi .

’ 25 Multivesikulaarisilla liposomeilla on korkea kapse lointi tehokkuus, alhainen kapseloidun aineen vuotonopeus, hyvin määritelty, toistettava koon hajonta, pallomainen muoto, säädeltävä keskikoko, jota voi helposti suurentaa tai pienentää, säädeltävä sisäkammion koko ja määrä.

30 Hydrokloridien, kuten suolahapon, käyttö on välttä mätöntä korkealle kapselointitehokkuudelle ja hitaalle kapseloitujen molekyylien vuotonopeudelle biologisissa nesteissä ja in vivo. Kun hydrokloridi on hapanta, on myös välttämätöntä käyttää alhaisen ionivahvuuden omaavaa neut-35 raloivaa ainetta estämään liuotinpallosien tarttuminen toisiinsa.

95439 4

Niin ollen esillä olevan keksinnön päämääränä on saada aikaan hidasvapautteinen depotvalmiste, joka sallii pidennetyn ja jatkuvan altistuksen biologisesti aktiivisen aineen terapeuttisella konsentraatiolla ja on multive-5 sikulaarinen liposomi, johon on kapseloitu biologisesti aktiivinen aine ja jolla on pidennetty ja jatkuva altistus terapeuttisella konsentraatiolla.

Keksinnön muut ja lisäpäämäärät, ominaisuudet ja edut kuuluvat siihen luonnostaan ja käyvät ilmi koko seli-10 tysosasta ja patenttivaatimuksista.

Määritelmä "multivesikulaariset liposomit" käytettynä kaikkialla selitysosassa ja patenttivaatimuksissa tarkoittaa ihmisen tekemiä, mikroskooppisia, kaksikerroksisista lipidikalvoista muodostuneita lipidivesikkeleitä, 15 jotka sulkevat sisäänsä useita ei-samakeskisiä vesikam- mioita. Sitävastoin unilamellaarisissa liposomeissa on yksi vesikammio ja multilamellaarisissa liposomeissa on useita "sipulinkuori"-tyyppisiä samakeskisiä kalvoja, joiden välissä on simpukankuorimaisia samakeskisiä vesiosas- 20 toja.

Määritelmä "liuotinpallonen" käytettynä kaikkialla selitysosassa ja patenttivaatimuksissa tarkoittaa mikroskooppisia, orgaanisen liuottimen pallonmuotoisia pisaroita, joiden sisällä on useita pienempiä vesiliuoksen 25 muodostamia pisaroita. Liuotinpalloset lietetään ja upo tetaan kokonaan toiseen vesiliuokseen.

Määritelmä "neutraali lipidi" tarkoittaa öljyä tai rasvoja, joilla ei ole itsessään kykyä muodostaa kalvoja ja joilta puuttuu hydrofiilinen "pää"-ryhmä.

30 Määritelmä "amfipaattiset lipidit" tarkoittaa nii tä molekyylejä, joilla on hydrofiilinen "pää"-ryhmä ja hydrofobinen "häntä"-ryhmä ja joillä on kyky muodostaa kalvoj a.

Määritelmä "ioninvahvuus" määritellään seuraavasti: 35 Ioninvahvuus = 1/2 (M1Z12+ ...), jossa MXM2M3 ... edusta-

II

95439 5 vat liuoksen eri ionien molaarisia konsentraatioita ja Z1Z2Z3 ... ovat niiden vastaavat varaukset.

Määritelmä "matala ionivahvuus" on ionivahvuus, joka on vähemmän kuin noin 0,05 ja edullisesti vähemmän 5 kuin 0,01.

Lyhyesti kuvattuna "vesi-lipidi"-emulsio valmistetaan ensiksi liuottamalla amfipaattiset lipidit haihtuvassa orgaanisessa liuottimessa lipidikomponentiksi, lisäämällä lipidikomponenttiin sekoittumaton ensimmäinen vesi-10 komponentti, kapseloitava aine ja hydrokloridi ja sitten emulgoimalla tämä seos mekaanisesti. Orgaaniseen liuotti-meen lietetyt vesipisarat muodostavat emulsiossa sisäisiä vesikammioita ja vesikammioita rajaava amfipaattisten lipidien muodostama yksittäiskerros tulee lopputuotteen kak-15 sikerroksisen kalvon yhdeksi lehdykäksi. Koko emulsio upo tetaan sitten yhtä tai useampaa ionitonta osmoottista ainetta ja matalan ionivahvuuden omaavaa happoa neutraloivaa ainetta sisältävään toiseen vesikomponenttiin, ja sitten sekoitetaan joko mekaanisesti, ultrasonikaatio-energialla, 20 suuttimen avulla tai niiden yhdistelmillä, jolloin muodostuu toiseen vesikomponenttiin lietettyjä liuotinpallosia. Liuotinpalloset sisältävät useita vesipisaroita, joihin kapseloitava aine on liuennut. Haihtuva orgaaninen liuotin haihdutetaan pallosista johtamalla kaasuvirta suspension 25 yli. Kun liuotin on kokonaan haihtunut, palloset muuttuvat multivesikulaarisiksi liposomeiksi. Käytettäväksi sopivia, edustavia kaasuja ovat typpi, helium, argon, happi, vety ja hiilidioksidi.

Hydrokloridin käyttö on välttämätöntä korkealle 30 kapselointitehokkuudelle ja hitaalle kapseloitujen mole kyylien vuotonopeudelle biologisissa nesteissä ja in vivo. Kun hydrokloridi on hapan, on myös välttämätöntä käyttää matalan ionivahvuuden omaavaa neutraloivaa ainetta estämään liuotinpallosten tarttuminen toisiinsa. Suolahappoa 35 suositellaan, mutta muita tyydyttäviä hydroklorideja • 95*39 δ ovat lysiinihydrokloridi, histidiinihydrokloridi ja niiden yhdistelmät. Sekä käytetyn hydrokloridin että neutraloivan aineen määrät voivat vaihdella pitoisuuksissa välillä noin 0,1 mM - 0,5 M ja mieluummin pitoisuuksissa 5 välillä noin 10 - 200 mM.

Monia erilaisia haihtuvia hydrofobisia liuotin-tyyppejä, kuten eettereitä, hiilivetyjä, halogenoituja hiilivetyjä tai freoneja voidaan käyttää lipidivaiheen liuottimena. Esimerkiksi dietyylieetteri, isopropyyli ja 10 muut eetterit, kloroformi, tetrahydrofuraani, halogenoi-dut eetterit, esterit ja niiden yhdistelmät ovat tyydyttäviä.

Jotta estettäisiin liuotinpallosten tarttuminen toisiinsa ja astian seinään, ainakin 1 % molaarinen mää-15 rä negatiivisen nettovarauksen omaavaa amfipaattista lipidiä täytyy sisältyä pallosiin, liettävällä vesiliuoksella tulee olla hyvin matala ionivahvuus ja kun hydro-kloridi on hapan, matalan ionivahvuuden omaavaa neutraloivaa ainetta tarvitaan absorboimaan hydrokloridi; muu-20 toin liuotinpalloset sulautuvat yhteen muodostaen sotkuisen kuonan. Yhtä tai useampaa ionitonta osmoottista ainetta tarvitaan Imetettävässä vesiliuoksessa pitämään osmoottinen paine tasapainossa liposomien sisä- ja ulkopuolella. Multivesikulaaristen liposomien valmistuksessa 25 voidaan käyttää erityyppisiä lipidejä, ja ainoat kaksi vaatimusta ovat, että mukana on yksi neutraali lipidi ja yksi amfipaattinen lipidi, jolla on negatiivinen nettova-raus. Esimerkkejä neutraaleista lipideistä ovat trioleii-ni, trioktanioni, kasvisöljy, kuten soijapapuöljy, ihra, 30 naudanrasva, tokoferoli ja niiden yhdistelmät. Esimerkkejä negatiivisen nettovarauksen omaavista amfipaattisista lipideistä ovat kardiolipiini, fosfatidyyliseriinit, fosfa-tidyyliglyserolit ja fosfatidihapot.

Toinen vesikomponentti on vesiliuos, joka sisältää 35 liuenneita aineita, kuten hiilihydraatteja, mukaan lukien tl 7 95“39 glukoosi, sakkaroosi ja laktoosi, ja aminohappoja, kuten lysiini, vapaan emäksen omaava histidiini ja niiden yhdistelmät .

Multivesikulaarisiin liposomeihin voidaan sisällyt-5 tää kapseloimalla monia ja vaihtelevia biologisia aineita. Nämä sisältävät lääkkeitä ja muunlaisia materiaaleja, kuten DNA:ta, RNA:ta, erityyppisiä proteiineja, yhdistel-mä-DNA-teknologialla tuotettuja, ihmisille tehokkaita pro-teiinihormoneja, hematopoieettisia kasvutekijöitä, mono-10 kiinejä, lymfokiinejä, kasvaimen nekroositekijää, inhi-biiniä, kasvaimen kasvutekijää alfa ja beeta, Mullerian'in inhibiittoriainetta, hermojen kasvutekijää, fibroblastien kasvutekijää, verihiutaleista peräisin olevaa kasvutekijää, aivolisäkkeen ja hypofyysin hormoneja, mukaan lukien 15 LH ja muut vapauttajahormonit, kaisitoniiniä, rokotuksessa immunogeeneinä palvelevia proteiineja ja DNA- sekä RNA-sekvenssejä.

Seuraava taulukko 1 sisältää listan edustavista, biologisesti aktiivisista aineista, jotka voidaan kapse-20 loida multivesikulaarisiin liposomeihin hydrokloridin läsnäollessa ja jotka ovat tehokkaita ihmisille.

r 8 95^39 4-> cu cu

X

X Ή

:<Ö G

:tQ Ή -h -p

<H C *H *H -P "P

•P Dj 4-> G -P -P -P -P G -P -P

4-> -P CU -P -P 4-> G -H G O G G -P

<ö tn tn g -p -p -p G o tn o o G

t> -P*POWn3*H*H*H -P i—I *P U) tn O

(ö (0(0C-P(C3inC-H 4-1 G O ·<-> <0 O Ή

4-1 £-HCU-He4->-H4-> -H O G P 4-> 4-1 O

4-> onomtniottJ-PG ό tn -p o <u cu tn

-H POO-*-QP!l<Ö -H -P Ai AC P g -P

0 fttnpoo-pptn o ceoBioc

Λ p-p>iPPO<UAi p Ό H ^ ID U 'Q

G oc-P-ödiCeno <u cu -p no Ai cu cu

ItJrPCUGiPtUCUtU-P 4J P P ΪΡ CU CU p 01 ^χιλ^ε^-ιρ-ρ m &i4->£Ojaai 4-1

CU

u> Ή (Ö 4-> tn <0 > c

i—i :θ *P

•H "P TO

OP G -P

Ai -P 4-10 0 x rt -h e x

G A no P -P -P

tp P Ή -H O G 4-1 G g 4J O -H X -H ·γ4 ·γ4 p

(O+J-H-H-h 4-i P G tnc G-HO

EH >t <H Ή i—I -H CU CU O Ή 1C o o a ϋ

ΡΟΉ-Ρ-ΗΌ CU 4-> P G -G £ PO-H

i—(i—I ·Ρ P P 4J p tn <D CU G p CUP f-) GOOEPXI -H GO-PCUIÖO 4-> 4-1 td <u g p g a p G p ac tn tn p .c tn o td

ΕΦΟ&,ΟΟ o O-r-lOO-PG CU Ό P

O* G G 4-) tn g P4-i4->pOj>Ktn<dCU

το o cu p α o p 4->ptn-pHtnE-iOGC

>,s-i4J(U(tjtn o g O cu tn p «d u P o-p tm α, φ > a: p κ rdAi4-><u-*Ai<atng 4-1 CU P 4-1

Cfi ιΗ P Ή -rl -H o -p -h G no

cd G G P O P P -KU

4-1 CU -P -H G G -p -P tn G

tnp-PGP cu G P o -p-p-p

(O cu ip -P -p -P p p -P p x tn -P· G

> 4-> p p p p G cu p cu >1 p tn p p

0>iPtdOP4->PG P P x Ui -P

G p M-l P 4-1 4-1 P O tö-p tn (tJOOtn (d &iO>iG<UPPGC1j G 4-1 4-1 4-1 Λ

g (dGP,QpnOOj<UCU :td -P -P (ti O

4-i 4-iPOPtnCUOPP 'O tn toi G Cn tn cugtutucupcnTOO ip p p te p < £nJ4->4->4->CUPidG m O O H o 9 95^39 Φ 4-) -μ 3 τ3 -Ρ -Ρ

β (1) CD

β to <υ

0< ·Η C

4-1 -Η "Η Ή Φ Ή -H β β β °β -Ρ <0 ·Η β -Η -Η -Η Ή Ή 4-> -Η -Η ·Η Ή .μ .μ Φ 4-) Φ Ή •η εεε<ο<ΐ) ω ·η φ 4-> g φ φ φ > φ φ c 4-> m 4J φ en μ μ φ ,ν -η β -η ο ή φ -Η 4-> +1 -Η ·0 4.) Λ -Η'σ-Η-Η-Ρ-Ηΐμ,βμ τ) φ β β >ι 4J :Φ β-Ηββ-Ρ'-ιμμβ -H -H φ φ .β -Η :Φ -ΗΌ-Η-ΗΟΟΟΦ-Ρ O ,β ΛΜ-ΙβΟΉ -Ηβ-Η-μαίμΕΛ-Η β -η -η μ φ ,β Μ-4 to <d α> -t-J cl> -·-! ο φ 4-) μ o )μ β -μ 4.) β >, μ μ β n) O-HOO>i<l),ya>r0 CO < &ι Τ3 (¾ > ετΙΛίΛί .Φ'ΟΟ'μΛ (0 ο λ; +j Φ •η 4-) — φ tn γΗ ·η φ ο -μ ,¾ w 4-) Μ (0 Φ β t> tn Ή Ή -Η γ-4 -Η -Η Ό C -μ β -Η β φ β -Η -Η -Η ·Η 4-) φ β -H -Ρ -Η -H g β Ή β Φ tn ·ΗΤ3 tn -μβφ-πω-ΗΦ -Ηβ φ -Η Φ μ -Η Μ-4 -H -H -H tn 4-) βφ φ β > a ·η tn tn Λ-μ^: •Η Ο 4-) Φ-Η ΟΦΟΪηΡΦΦ β 4->·Η β·Η β -Η >ι M-t g μ -η μ ο -Η μ φιΗ :Φ -μεΟΦ Ο μ 4-)

g EC Φ φ Λ β > ΦΟΉ-τΗ β Ai O U CM

μ «κήλ: φφ :ο φ φ α; μ β β -μ h s O E K CO Φ Ο -Ηβ >1 +J Η >1 fl Φ-ΗΦΙΙ κ μι μι Em a: ω α-Η ω φλφφ ό > ε 'ο ^ • « β φ φ β -μ •Η Φ 4-) Φ Φ -Η (¾ -Η -Η Ό β Φ -Η γΗ •Η Φ 4J Η Ο Ή φ μ -Η Φ φ Φ β Ο Φ β φ 4-) 4-) Ή Α >4-> -Η Ή > βφ-Η >ι Φ -Η Η Φ Ό Φ ι—Η β Φ ι—I Ο β >-Η-Η ct> φ -η ο 11 ο) α β ε β φ φ φ ο -μ -η ο φ :φ α -Ρ φ β φ φμ-μ ό μφμφ -η φ -μ β >1 ο Φ α 4-) Ο μφφ col « > n φ μι α ε a %

— I

ίο 95^39 tn d H ** •H 0) . T to

L * *H

5 ^ S

P (ö e d -H ro «

'd -PN rS

d >1 C -P S

d U Q) O) o Λ Cdtn.pl, >1 m -h »a tn u-t to m >h c +J m p -p >i -h tn Γ-

ϊϋ O) P (ti ,_j r-t -H

> cd otn >ijLnc (ö λ; -p td -p d .h i -h p ^ <d tn to <-i C.hDj-h 4J:d tl) tn p -h <d ·> O p

-H J(0 4-> <D -H x: <D +j o P -H

oh 4-> d Dj Dj 4-> tn^J^> Λ o rH tn o o d +J id d 4-> Ai Ή tl) g * PsLCX!

<Ö rt OCPQJO -H P1 -H -H

os > os-h=kp >^sp (Ö 0

Ai 4-> (ti •n

1 -I

•H

O -Ρ T3

Ai 4-> -P tl) -H

Ai tl) -H N +J H tl) ffl +J

d tn +j i d) C -h Dj

Ή -H 3 -H tn ·Η (Ö -H <U

d <0 -H 0) e -H -P -H 4-> C Dj

Ιΰ 4-> C Ή Dj -H*Hj—I 0) »H tn Ή Ή -H

E-< tn -H G rtJC-HfflO^lO-HnHra

to -H -H p OAi(ÖG.D>tnO-H

> -P -H tl)PdC-HO -HtOrH

tn -P 4-1 Q) tl) O <0 Ή G p 4-> >i c e m o mj—it-ii tr> ο <u to >i :d i—l vd vo i—I G PPAi((5(Ö4-)4-iGg > Λ ή Hl Dj d Q)Q)O4->gGOO(0

=o G ι i tn g 4->4->Gtngti)i44AiP

>1 -hojS-hd g cco(0ra-Hg>id W > > > Ai h H -H-Hg>t7'C/l(0gg 4-1 Q) tn -h

•H G

Π3 -H -r-l -H

4-1 -H G G -H -H -H -H -H

tn 4JC-H-H-P g .-t c e c

(0 *H *H Ή ·Η G *H *P «—I ·Ρ v-Γ *H

^ 4-* Ή i—I tn *r-t g 4-Γ -H Ή Ή *P

o γηλ;>ι ·ρ φ m tn tn tn tn c o-Hipg 4J φ a: -p >, >, >i tl) -H -H tn O O G Φ G g g g 4-) xitndP M0)tp<i)0(o3

(n ·Η -H p 4-1 (0 Dj O -Q Ai 4-1 P

•H 4->C-P>i4-I-PM-iPGG,Q

O G φ Φ P tl) g φ (0 φ Φ O

id C Qj 41 J) H Λ ϋ > O' D

n ^39

•H

<o g p

PC P

G (O P tJ1

r| Ό -H O

•H ,G ί-Ι I Ή fO

TS O O -H (Ö -r->

ro -n -H P G G

ρ p ΌΡΟ (0 P

<D G °3 Ρ Ρ P P P

03tÖ M 11 -H d o0 P

h g -h o tn λ tl) «J

(O (0 G G -H -H tn P 5

p v\ Ή «H lii .G (1) O G

t/1 -H -H £) d G Sh Ot O

(0 G Ό (0 >i P to P

> -h -H H >. i CP X tn H g (0 Ρ P (0(0 P o

G Ό >i Ρ P tn G ti G Ρ P

Q)(0P G G (0 G (0 P PP

ρ P O P P (0 P(0 P nHCn

tn g Ό p p a) d ,* d> >iO

G (OP G Ό Ρ P G ,* Ρ >iP

H g tn Ρ ΦΡΟ G P O X <«<p(0

P P P <U Ό g H G OP G S § Φ G

> H (0 tn G G di S tn £1 £ Q«g(0 (0

O

X

P

(0

•n G

'r- φ a) p

PPG G

<D P P

O W G P

X P Λ g X (0 P G (0

G P P 0) P

p tn o G tl) G to tn o p ro > P > P P g EH (0 0) G (0

G g G tn P O

tl) P G P P 1h p p p ns g p G G <0 P (0 tn ω o p tn d x P 1—I G G O tl)

ω X 2 > TS TS

30 -n

•H

X :<0 Ρ I tl) -n

•HO Ρ P

TS X P X

•h >1 tn a)

tn p OP

O S' I O G

-HP X P VD U > G P G P >1 (0 P x U) •H g -H Ρ P i—I Ρ P HP G (0 tl) (0 ppnjPGG PGtJi Ρ Ρ t~i G .*

•H P G Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ O p p Ρ -H P

+J P P P P P to P G -H P G a; LH P G -H G

OP.* -Hi—IP MPP G G p G * G tl) G 0) o tn to tn p o OPg ρ ρ p ti) ρ p g ρ g

h (op ρ p tn h tn to ρ ρ ,* p ·. ρ tn ppP

Λ hio tntnp ό .* a)a)OHP,*c/iPnCn(ö.Q(0 •H Q)tn A! P (0 (OOP PPP<D-OUCflW>P> P d* o d p PPG oogPtNPiuUtn^ltn G PO g g Φ a)Q)G HH>iG'>h2:iI(OG(0 OS dg Λ (ϋ X ,* * g OidPPPtnogO^lP^ 12 95-39

Taulukko 1 (jatkoa)

Antibiootit

Mullerian'in inhibiittoriaine hermon kasvutekijä 5 fibroblastin kasvutekijä verihiutaleista peräisin oleva kasvutekijä veren hyytymistekijät (esim. VIII, IX, VII) insuliini kudoksen plasminogeeniaktivaattori 10 histokompatibiliteettiantigeeni onkogeenituotteet myeliinin emäksinen proteiini kollageeni fibronektiini 15 laminiini muut yhdistelmä-DNA-teknologialla valmistetut proteiinit

Ihmisille käytettäväksi sopiva annosmäärä sisältää välin 1 - 6000 mg/m2 kehon pinta-alaa. Syy, että vaihteluväli on niin laaja, on se, että joissakin sovellutuksissa, 20 kuten ihonalaisessa annostelussa, tarvittava annosmäärä saattaa olla melko pieni, mutta muissa sovellutuksissa, kuten vatsaonteloon annosteltaessa, käytettäväksi haluttu annosmäärä voi olla kerrassaan valtava. Koska edellä mainittujen annosrajojen ulkopuolella olevia määriä voidaan 25 antaa, tämä vaihteluväli ympäröi käytännöllisesti kaik kien biologisesti aktiivisten aineiden käyttöaluetta.

Multivesikulaarisia liposomeja voidaan antaa millä tahansa toivotulla tavalla; esimerkiksi selkäydinkanavaan, vatsaonteloon, ihonsisäisesti, laskimonsisäisesti, 30 imunesteeseen, suun kautta ja limakalvon sisäisesti monien erilaisten epiteelien alle sisältäen keuhkoputkien epiteelit, ruuansulatuskanavan epiteelit, virtsaputken epiteelit ja monet kehon limakalvot, sekä lihaksensisäisesti.

Seuraavat esimerkit kuvaavat tällä hetkellä suosi- 35 teltavat menetelmät näiden biologisesti aktiivisia ainei- cS-3° 13 ' J °' ta sisältävien multivesikulaaristen liposomien valmistamiseksi .

Esimerkki 1

Vaihe 1 5 Puhtaaseen yhden dramman lasipulloon (ulkoiset mi tat halkaisija 1,4 cm x korkeus 4,5 cm) laitettiin 9,3 μπιοί dioleoyylilesitiiniä, 2,1 pmol dipalmitoyylifos-fatidyyliglyserolia, 15 pmol kolesterolia, 1,8 pmol trio-leiinia ja yksi ml kloroformia (lipidifaasi).

10 Vaihe 2

Yksi ml vesifaasia, sytosiiniarabinosidia (20 mg/ml) liuotettuna 0,136 N suolahappoon, lisättiin yllä mainittuun, lipidifaasia sisältävään yhden dramman pulloon.

15 Vaihe 3

Vesi-öljy-emulsion valmistamiseksi pullo suljettiin ja kiinnitettiin vortex-sekoittajan päähän ja sekoitettiin suurimmalla nopeudella 6 minuuttia.

Vaihe 4 20 Veteen lietettyjen kloroformipallosien valmistami seksi puolet emulsiosta ruiskutettiin sitten jokainen nopeasti ohuen Pasteur-pipetin kärjen läpi yhden dramman pulloihin, joista jokainen sisälsi 4-prosenttista dekst-roosia vedessä ja 40 mM lysiiniä, vapaata emästä, ja ra-25 visteltiin sitten vortex-sekoittajalla puolella nopeudella 3 sekuntia kloroformipallosten muodostamiseksi.

Vaihe 5

Kahden pullon kloroformipallosten suspensiot kaadettiin 5 ml vettä, glukoosia (3,5 g/100 ml) ja vapaan 30 emäksen omaavaa lysiiniä (40 mM) sisältävän 250 ml:n

Erlenmeyer-pullon pohjalle, ja typpikaasuvirran annettiin virrata pullon läpi nopeudella 7 1/min 10 - 15 minuutin ajan 37 °C:ssa kloroformin haihduttamiseksi hitaasti. Liposomit eristettiin sitten sentrifugoimalla 600 x g 5 35 minuuttia.

95^39 14

Tuloksena syntyneiden liposomien keskimääräinen tilavuuden mukaan tarkistettu koko (± jakautumisen stan-dardihajonta) oli 19,4 ±6,5 pm. Saalispitoisuus oli 59 ± 7 prosenttia ja saalistilavuus oli 36 ± 4 μΐ/mg käytettyä 5 kokonaislipidiä. Hydrokloridin lisäyksellä oli merkittävä vaikutus sytosiiniarabinosidin vuotonopeuteen ihmisen plasmassa inkuboiduista multivesikulaarisista liposomeis-ta. Puolet lääkkeestä vuoti ulos 12 vuorokaudessa, kun suolahappoa lisättiin yllä esitetyssä esimerkissä, kun 10 taas puolet lääkkeestä vuoti ulos vain 12 tunnissa, kun suolahappo jätettiin pois yllä esitetyssä vaiheessa 2. Kun testattiin eläimillä, hydrokloridin lisäyksellä oli taas merkittävä vaikutus sytosiiniarabinosidin vapautumisno-peuteen; lääke pysyi hiiren vatsaontelossa paljon kauem-15 min, kun suolahappoa lisättiin valmistuksen aikana.

Seuraava esimerkki kuvaa laajennetun menetelmämit-takaavan suurien multivesikulaaristen liposomimäärien valmistamiseksi .

Esimerkki 2 20 Vaihe 1

Ruostumattomasta teräksestä valmistettuun homogeni-saattoriin (Omni-Mixer 17150, Sorval Co., Newton, CT) laitettiin 186 pmol dioleoyylilesitiiniä, 42 pmol dipalmito-yylifosfatidyyliglyserolia, 300 pmol kolesterolia, 36 pmol 25 trioleiinia ja 20 ml kloroformia (lipidifaasi).

Vaihe 2 20 ml vesifaasia, sytosiiniarabinosidia (20 mg/ml) liuotettuna 0,136 N suolahappoon, lisättiin yllä olevaan, lipidifaasia sisältävään, ruostumattomasta teräksestä val-30 mistettuun sekoittajaan sen pyöriessä.

Vaihe 3

Vesi-öl jy-emulsion valmistamiseksi homogenisaattori suljettiin ja ajettiin asetuksella "7" 3 minuuttia.

Vaihe 4 35 Veteen lietettyjen kloroformipallosten valmistami seksi emulsio kaadettiin sitten (pyörityksen ollessa käyn- 15 95-39 nissä) puoliksi kahteen muuhun, ruostumattomasta teräksestä valmistettuun homogenointlastiaan, joista kumpikin sisälsi 200 ml 4-prosenttista dekstroosia vedessä ja 40 mM lysiiniä vapaana emäksenä, ja sitten homogenisoitiin Omni-5 Mixer'llä 3 sekuntia asetuksella "1".

Vaihe 5

Kummankin homogenointiastian kloroformipallosten suspensiot kaadettiin tasapohjaiseen, suorakulmaiseen teräsastiaan, jonka pohjan mitat olivat 20,32 x 30,48 cm 10 (8 x 12 tuumaa), ja typpikaasu- tai ilmavirran annettiin virrata astian läpi nopeudella 14 £/minuutti 10 - 15 minuutin ajan kloroformin hitaaksi haihduttamiseksi. Liposo-mit eristettiin sitten sentrifugaatiolla 600 x g 5 minuuttia.

15 Seuraava esimerkki kuvaa pienempien ja suurempien liposomien valmistusmenetelmiä.

Esimerkki 3

Esimerkeissä 1 tai 2 esitettyjä liposomeja pienempien liposomien valmistamiseksi kohotettiin esimerkkien 1 20 tai 2 vaiheen 4 ravistelun tai homogenoinnin mekaanista voimakkuutta tai kestoaikaa. Suurempien liposomien valmistamiseksi alennettiin esimerkkien 1 tai 2 vaiheen 4 ravistelun tai homogenoinnin mekaanista voimakkuutta tai kestoaikaa.

25 Seuraava esimerkki 4 kuvaa edustavia menetelmiä erilaisia lipidikoostumusten omaavien liposomien valmistamiseksi ja erilaisten materiaalien sisällyttämistä lipo-someihin.

Esimerkki 4 30 Esimerkkien 1 tai 2 vaiheessa 1 voidaan käyttää muita amfipaattisia lipidejä, kuten fosfatidyylikoliineja (PC), karbiolipiiniä (CL), dimyristoyylifosfatidyyliglyse-rolia (DMPG), fosfatidyylietanolamiineja (PE), fosfatidyy-liseriinejä (PS) ja dimyristoyylifosfatidihappoa (DMPA), 35 eri yhdistelminä samanlaisilla tuloksilla. Esimerkiksi yhdistelmiä PC/C/CL/T0 molaarisella suhteella 4,5/4,5/1/1; 16 9S»'39 DOPC/C/PS/TO molaarisella suhteella 4,5/4,5/1/1; PC/C/DPPG/TC molaarisella suhteella 5/4/1/1; PC/C/PG/TC molaarisella suhteella 5/4/1/1; PE/C/CL/TO molaarisella suhteella 4,5/4,5/1/1; ja PC/C/DMPA/TO molaa-5 risella suhteella 4,5/4,5/1/1 voidaan kaikkia käyttää.

Muiden biogeneettisesti aktiivisten materiaalien sisällyttämiseksi sytosilniarabinosidi yksinkertaisesti korvataan halutulla materiaalilla tai taulukon 1 materiaalien yhdistelmällä esimerkkien 1 tai 2 vaiheessa 2. Kaikki nämä muo-10 dostavat multivesikulaarisia liposomeja, jotka ovat tehokkaita ihmisillä ja sallivat pidennetyn altistuksen biologisesti aktiivisen aineen terapeuttisella konsentraatiol-la.

Näin ollen esillä oleva keksintö esittää laajaso-15 vellutuksiset ja -käyttöiset depotvalmisteet, joihin biologisesti aktiiviset aineet on kapseloitu suhteellisen suurina määrinä ja jotka sallivat pidennetyn altistuksen näiden aineiden terapeuttisilla konsentraatioilla optimaalisten tulosten aikaansaamiseksi välttäen korkeita annos-20 huippuja, jotka voivat olla myrkyllisiä.

Esillä oleva keksintö sopii näin ollen hyvin ja on adaptoitu saavuttamaan tarkoitusperät ja päämäärät ja mainitut edut ja ominaisuudet kuin myös muut seikat kuuluvat siihen luonnostaan.

25 Samalla kun keksinnön nykyään suositeltavat suori tustavat on annettu julkistamisen vuoksi, niihin voidaan tehdä keksinnön henkeen kuuluvia muutoksia, kuten patenttivaatimusten puitteissa on määritelty.

Claims

1. Menetelmä biologisesti aktiivisten multivesiku-laaristen lipidivesikkelien tai liposomien valmistamisek-5 si, tunnettu siitä, että se sisältää seuraavat vaiheet: a) liuotetaan lipidikomponentti yhteen tai useampaan orgaaniseen liuottimeen, jolloin lipidikomponentti sisältää ainakin yhtä neutraalia lipidiä ja ainakin yhtä 10 amfipaattista lipidiä, jolla on vähintään yksi negatiivi nen nettovaraus; b) lisätään lipidikomponenttiin sekoittumaton, ensimmäinen, hydrokloridia ja yhtä tai useampaa biologisesti aktiivista kapseloitavaa ainetta sisältävä vesikompo- 15 nentti; c) muodostetaan vesi-öljy-emulsio kahdesta sekoit-tumattomasta komponentista; d) siirretään ja upotetaan vesi-öljy-emulsio toiseen sekoittumattomaan vesikomponenttiin; 20 e) dispergoidaan vesi-öljy-emulsio useita pisaroi ta ensimmäistä vesikomponenttia sisältävien liuotinpal-losten muodostamiseksi; ja f) haihdutetaan orgaaniset liuottimet liuotinpal-losista multivesikulaaristen liposomien muodostamiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lipidikomponentti on fosfo-lipidi tai fosfolipidiseos.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fosfolipidi on fosfatidyyli- 30 koliini, kardiolipiini, fosfatidyylietanoliamiini, sfin-gomyeliini, lysofosfatidyylikoliini, fosfatidyyliseriini, fosfatidyyli-inositoli, fosfatidyyliglyseroli tai fosfa-tidihappo.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että ainakin yksi fosfolipideistä 18 55-:39 on ryhmä, jolla on vähintään yksi negatiivinen nettova-raus.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fosfolipidiä käytetään seok- 5 sena kolesterolin kanssa.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fosfolipidiä käytetään seoksena stearyyliamiinin kanssa.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että lipofiilistä, biologisesti aktiivista materiaalia käytetään seoksena lipidikomponentin kanssa.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että neutraali lipidi on tri- 15 oleiini, trioktanoiini, kasvisöljy, ihra, naudan rasva, tokoferoli tai niiden yhdistelmä.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että orgaaninen liuotin on die-tyylieetteri, isopropyylieetteri, kloroformi, tetrahydro- 20 furaani, eetteri, hiilivety, halogenoitu hiilivety, esteri tai niiden yhdistelmä.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydrokloridi on suolahappo, lysiinihydrokloridi, histidiinihydrokloridi tai niiden 25 yhdistelmä.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kapseloitava aine on hydro-fiilistä biologisesti aktiivista materiaalia.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että kahden komponentin emulgoin-ti suoritetaan käyttäen menetelmää, joka on mekaaninen ravistelu, ultrasonikaatioenergia tai suuttimen avulla hajottaminen.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että hydrokloridi on hapan ja toi- il 95-39 nen vesikomponentti sisältää ainakin yhden neutraloivan aineen.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että neutraloiva aine on vapaan 5 emäksen muodossa oleva lysiini, vapaan emäksen muodossa oleva histidiini tai niiden yhdistelmä.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toisella vesikomponentilla on matala ionivahvuus.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen vesikomponentti on vesiliuos, joka sisältää liuenneita aineita, joita ovat hiilihydraatit tai aminohapot.

17. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että toinen vesikomponentti on vesiliuos, joka sisältää liuenneita aineita, joita ovat glukoosi, sakkaroosi, laktoosi, vapaan emäksen muodossa oleva lysiini, vapaan emäksen muodossa oleva histidiini tai niiden yhdistelmä.

17. S 3 9

18. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuotinpallosten muodostaminen suoritetaan käyttäen menetelmää, joka on mekaaninen ravistelu, ultrasonikaatioenergia, suuttimen avulla hajottaminen tai niiden yhdistelmä.

19. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että orgaanisen liuottimen haihdutus tapahtuu kaasuvirtauksella toisten vesikomponenttien yli. 9ν·3 9