NO174087B

NO174087B - Fremgangsmaate for fremstilling av multivesikulaere lipidvesikler eller liposomer

Info

Publication number: NO174087B
Application number: NO88880768A
Authority: NO
Inventors: Stephen Barnard Howell; Sinil Kim
Original assignee: Res Dev Foundation
Priority date: 1987-02-23
Filing date: 1988-02-22
Publication date: 1993-12-06
Also published as: IL85509A0; DK172057B1; AU1205588A; DK93988D0; ES2053722T4; KR970004907B1; FI95439C; CA1323568C; PT86805B; IE62221B1; EP0280503A2; EP0280503B9; EP0280503A3; NO174087C; GR3007581T3; EP0280503B1; FI880841A0; FI880841A; JPH01125318A; IL85509A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av syntetiske multivesikulære lipidvesikler eller liposomer som innkapsler biologisk aktive stoffer.

Multivesikulære liposomer er en av de tre hovedtypene av liposomer, først fremstilt av Kim et al.(1983, Biochim. Biophys. Acta 782, 339-348), og er på en enestående måte forskjellig fra de unilamellære (Huang, 1969, Biochemistry 8, 334-352; Kim, et al. 1981, Biochim. biophys. Acta 646, 1-10) og multilamellære (Bangham, et al. 1965, J. Mol. bio. 13, 238-252), liposomene i at det deri befinner seg multiple, ikke-konsentriske vandige kammere. Den tidligere teknikk beskriver flere teknikker for fremstilling av liposomer, men alle disse teknikkene angår fremstillingen av ikke-multivesikulære liposomer; f.eks. beskriver US patentene 4.522.803; 4.310.506; 4.235.871; 4.224.179; 4.078.052; 4.394.372; 4.308.166; 4.485.054; og 4.508.703, alle ikke-multivesikulære vesikler. For en detaljert oversikt over forskjellige metoder for liposomfremstilling vises det til Szoka et al., 1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467-508.

Metoden ifølge Kim et al. (1983) er den eneste rapport som beskriver multivesikulære liposomer, men innkapslings-effektiviteten til noen av de små molekylene slik som ara-C var relativt lav, og lekkasjegraden av innkapslede molekyler i biologisk fluid var høy.

Optimal behandling med mange legemidler krever opprettholdelse av et legemiddelnivå over en lengre tidsperiode. F.eks. krever optimal anti-kreftbehandling med cellecykel-spesifikke antimetabolitter opprettholdelse av et cytotoksisk legemiddelnivå over en lengre tidsperiode. Cytarabin er et høyt plan-avhengig anti-kreftlegemiddel. Fordi dette legemiddelet dreper celler bare når de danner DNA, er en lengre eksponering ved terapeutisk konsentrasjon av legemiddelet nødvendig for optimal celledreping. Uheldigvis er halveringstiden for cytarabin etter en intravenøs (i.v.) eller subkutan (s.c.) dose meget kort. For å oppnå optimal kreftcelledreping med et cellecykelfase-spesifikt legemiddel slik som cytarabin, må to hovedkrav tilfredsstilles: For det første må kreften eksponeres for en høy konsentrasjon av legemiddelet uten å gjøre irreversibel skade på verten; og for det annet må tumoren eksponeres over et lengre tidsrom slik at alle eller flesteparten av kreftcellene har forsøkt å syntetisere DNA i nærvær av cytarabin.

Forut for foreliggende oppfinnelse er den eneste måte å oppnå en forlenget plasmacelle gjennom kontinuerlig IV- eller SC-infusjon, som begge deler er uhensiktsmessig og kostbart. Det er derfor behov for et akseptabelt depotpreparat med langsom frigjøring av disse legemidlene. Tidligere har forskere forsøkt å oppnå dette ved kjemisk modifikasjon av legemiddel-molekylet for å retardere metabolisme eller kovalent tilfesting av en hydrofob gruppe for å retardere oppløselig-gjøring. Slike manipulasjoner har resultert i nye, toksiske effekter, Finkelstein et al., Cancer Treat Rep. 63:1331-1333, 1979, eller uakseptable farmakokinetiske eller formuleringsproblemer, Eo et al., Cancer Res. 37:1640-1643, 1977.

Følgelig er det behov for et depotpreparat med langsom fri-gjøring som gir en langvarig og vedvarende eksponering ved terapeutisk konsentrasjon av et biologisk aktivt stoff.

Foreliggende oppfinnelse er derfor rettet mot en fremgangsmåte for fremstilling av et multivesikulært liposom inneholdende et biologisk aktivt stoff innkapslet i nærvær av et hydroklorid som gir en langvarig og vedvarende eksponering ved terapeutisk konsentrasjon av det biologisk aktive stoffet for optimale resultater.

De multivesikulære liposomene har høy innkapslingseffektivitet, lav lekkasjegrad av det innkapslede stoff, veldefinert, reproduserbar størrelsesfordeling, sfærisk form, justerbar gjennomsnittsstørrelse som lett kan økes eller minskes, justerbar indre kammerstørrelse og antall.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av multivesikulære lipid-vesikler eller liposomer omfattende trinnene

a) oppløsning av en lipidkomponent i ett eller flere organiske oppløsningsmidler hvor nevnte lipidkomponent

inneholder minst ett nøytralt lipid og minst ett amfipatisk lipid med minst en netto negativ ladning;

b) tilsetning til lipidkomponenten av en ublandbar første vandig komponent inneholdende ett eller flere stoffer som

skal innkapsles,

c) dannelse av en vann-i-olje-emulsjon fra de to ublandbare komponentene ved anvendelse av en metode valgt fra

mekanisk agitasjon, ultralydenergi og dyseforstøvning hvorved den gjennomsnittlige størrelse og antallet av de vandige kammrene i liposomene bestemmes av typen, intensi-teten og varigheten av den valgte metode; d) overføring og neddykking av vann-i-olje-emulsjonen i en annen ublandbar vandig komponent; e) dispegering av vann-i-olje-emulsjonen for dannelse av oppløsningsmiddelsfæruler inneholdende flere dråper av den

første vandige komponenten deri under anvendelse av metoder valgt fra mekanisk agitasjon, ultralydenergi, dyseforstøvning og kombinasjoner derav, idet liposomenes gjennomsnittlige størrelse bestemmes av typen, intensi-teten og varigheten av den benyttede energi; og

f) fordampning av de organiske oppløsningsmidlene fra opp-løsningsmiddelsfærulene for dannelse av de multivesikulære

liposomene, idet nevnte fordampning tilveiebringes ved

føring av gass over de andre vandige komponentene, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at innkapslingen utføres i nærvær av et hydroklorid som tilsettes til den ublandbare første vandige komponenten i trinn (b), idet det anvendes et nøytral iseringsmiddel av lav ionisk styrke når hydrokloridet er surt for å hindre at oppløsnings-middelsfæruler kleber seg til hverandre, og idet det anvendes et eller flere ikke-ioniske osmotiske midler i den suspenderende vandige oppløsning for å holde det osmotiske trykket inne i og utenfor liposomene balansert.

Anvendelsen av hydroklorider, slik som saltsyre, er vesentlig for høy innkapslingseffektivitet og for langsom lekkasjegrad eller —hastighet av innkapslede molekyler i biologiske fluider og in vivo.

Beskrivelse av foretrukne utførelser

Med den heri benyttede betegnelse "multivesikulære liposomer" menes mikroskopiske lipid-vesikler frembragt av mennesker og bestående av tolags lipidmembraner som omslutter flere ikke-konsentriske vandige kammere. I motsetning har unilamellære liposomer et enkelt vandig kammer; og multilamellære liposomer har konsentriske membraner av multippel-"løkskinn"-typen imellom hvilke det befinner seg skjell-lignende konsentriske, vandige rom.

Med den benyttede betegnelse "oppløsningsmiddelsfærul" menes en mikroskopisk sfæroid dråpe av organisk oppløsningsmiddel i hvilken det befinner seg flere mindre dråper av vandig opp-løsning. Oppløsningsmiddelsfærulene er suspendert og totalt neddykket i en annen vandig oppløsning.

Med betegnelsen "nøytralt lipid" menes olje eller fett-materialer som ikke har noen membrandannende evne i seg selv og mangler hydrofil "hode"-gruppe.

Med betegnelsen "amflpatiske lipider" menes de molekyler som har en hydrofil "hode"-gruppe og hydrofob "hale"-gruppe og har membrandannende evne.

Betegnelsen "ionisk styrke" er definert som:

hvor Mi, M2, M3 ... representerer de molare konsentrasjoner av forskjellige ioner i oppløsningen, og , Zg, Z3 ... er deres respektive ladninger.

Betegnelsen "lav ionisk styrke" er ionisk styrke mindre enn 0,05, og fortrinnsvis mindre enn 0,01.

I korthet, "vann-i-lipid"-emulsjon dannes først ved oppløs-ning av amfipatiske lipider i et flyktig, organisk opp-løsningsmiddel for lipidkomponenten, tilsetning til lipidkomponenten av en ublandbar første vandig komponent, stoffet som skal innkapsles og et hydroklorid, og deretter emulgering av blandingen på mekanisk måte. I emulsjonen vil vanndråpene som er suspendert i det organiske oppløsningsmiddelet, danne de indre vandige kamrene, og monolaget av amfipatiske lipider som danner et belegg i de vandige kamrene, vil utgjøre et bladelement av tolagsmembranen i sluttproduktet. Hele emulsjonen neddykkes deretter i den andre vandige komponenten inneholdende ett eller flere ikke-ioniske osmotiske midler og et syrenøytraliserende middel av lav ionisk styrke og om-røres deretter enten mekanisk, ved ultralydenergi, dyse-forstøvninger eller kombinasjoner derav, til dannelse av oppløsningsmiddelsfæruler suspendert i den andre vandige komponenten. Oppløsningsmiddelsfærulene inneholder multiple vandige dråper med stoffet som skal innkapsles oppløst i disse. Det flyktige, organiske oppløsningsmiddelet fordampes fra sfærulene ved føring av en gasstrøm over suspensjonen. Når oppløsningsmiddelet er fullstendig fordampet, omdannes sfærulene til multivesikulære liposomer. Representative gasser som kan benyttes på tilfredsstillende måte, innbefatter nitrogen, helium, argon, oksygen, hydrogen og karbondioksyd.

Anvendelsen av et hydroklorid er vesentlig for høy innkapslingseffektivitet og for en langsom lekkasjehastighet av innkapslede molekyler i biologiske fluider og in vivo. Når hydrokloridet er surt, er det også vesentlig å benytte et nøytraliseringsmiddel av lav ionisk styrke for å hindre opp-løsningsmiddelsfærulene i å klebe til hverandre. Saltsyre er foretrukket, men andre hydroklorider som er tilfredsstillende, innbefatter lysinhydroklorid, histidinhydroklorid og kombinasjoner derav. Mengdene av både hydrokloridet og nøy-traliseringsmiddelet som benyttes, kan variere fra 0,1 mM til 0,5 m konsentrasjoner, og fortrinnsvis fra 10 mM til 200 mM konsentrasjon.

Mange forskjellige typer av flyktige hydrofobe oppløsnings-midler slik som etere, hydrokarboner, halogenerte hydrokarboner eller freoner kan benyttes som lipidfase-oppløsningsmiddelet. F.eks. er dietyletere, isopropyl- og andre etere, kloroform, tetrahydrofuran, halogenerte etere, estere og kombinasjoner derav, tilfredsstillende.

For å hindre oppløsningsmiddelsfærulene i å klebe til hverandre og til karveggen er det nødvendig at minst 1 % molarforhold av et amfipatisk lipid med en netto negativ ladning innbefattes i sfærulene, den suspenderende vandige oppløsning må ha en meget lav ionisk styrke, og når hydrokloridet er en syre, er det nødvendig at et nøytraliseringsmiddel av lav ionisk styrke absorberer hydrokloridet; ellers koalescerer oppløsningsmiddelsfærulene til dannelse av et skittent skum. Ett eller flere ikke-ioniske, osmotiske midler er nødvendig i den suspenderende, vandige oppløsning for å holde det osmotiske trykket inne i og utenfor liposomene i balanse. Forskjellige typer av lipider kan benyttes for fremstilling av de multivesikulære liposomene, og de eneste to krav er at et nøytralt lipid og et amfipatisk lipid med en netto negativ ladning inkluderes. Eksempler på nøytrale lipider er triolein, trioktanion, vegetabilsk olje slik som soyabønneolje, spekk, storfefett, tokoferol, og kombinasjoner derav. Eksempler på amfipatiske lipider med netto negativ ladning er kardiolipin, fosfatidylserinene, fosfatidylglycerolene, og fosfatidinsyrer.

De andre vandige komponentene er en vandig oppløsning inneholdende oppløste stoffer slik som karbohydrater inkludert glukose, sukrose, laktose, og aminosyrer slik som lysin, fri-basehistidin og kombinasjoner derav.

Mange og varierte biologiske stoffer kan inkorporeres ved innkapsling i de multivesikulære liposomene. Disse inkluderer legemidler og andre typer av materialer, slik som DNA, RNA, proteiner av forskjellige typer, proteinhormoner produsert ved rekombinant DNA-teknologi som er effektiv i mennesker, hematopoietiske vektfaktorer, monokiner, lymfo-kiner, tumornekrosefaktor, inhibin, tumor vekstfaktor alfa og beta, Mullerian, inhiberende substans, nervevekstfaktor, fibroblastvekstfaktor, blodplateavledet vekstfaktor, hypo-fyse- og hypofysiale hormoner inkludert LH og andre fri-gjørende hormoner, kalsitonin, proteiner som tjener som immunogener for vaksinasjon, og DNA- og RNA-sekvenser.

Følgende tabell 1 gir en oversikt over representative, biologisk aktive stoffer som kan innkapsles i multivesikulære liposomer i nærvær av et hydroklorid og som er effektive i mennesker. Det doseområdet som er passende for bruk hos mennesker, inkluderer området 1-6000 mg/m til kroppsoverflatearealet. Grunnen for at dette området er så stort er at for noen anvendelser, slik som subkutan administrasjon, kan den nødven-dige dosen være temmelig liten, men for andre anvendelser, slik som intraperitoneal administrasjon, kan den dose som er ønsket benyttet, være absolutt enorm. Mens doser utenfor det ovenfor angitte doseområdet kan gis, omfatter dette området bredden for bruk for praktisk talt alle de biologisk aktive stoffene.

De multivesikulære liposomene kan administreres ved en hvilken som helst ønsket vei: f.eks. intratekal, intraperitoneal, subkutan, intravenøs, intralymfatisk, oral og submukosal, under mange forskjellige typer av epitel inkludert bronkialepitelet, mave-tarmepitelet, urogenitalepitelet, og forskjellige slimhinner i kroppen, og intramuskulært.

Følgende eksempler representerer for tiden foretrukne frem-gangsmåter for fremstilling av disse multivesikulære liposomene som innkapsler biologisk aktive stoffer.

Eksempel 1

Trinn 1) I en ren 3,5 g glassampulle (1,4 cm diameter x 4,5 cm høyde utvendige mål), ble det anbragt 9,3 pinol dioleyllecitin, 2,1 jjmol dipalmitoylfosfatidylglycerol, 15 jjmol kolesterol, 1,8 jjmol triolein og 1 ml kloroform (lipid-fasen).

Trinn 2) 1 ml vandig fase, cytosinarabinosid (20 mg/ml) oppløst i 0,1336 N saltsyreoppløsning, tilsettes til oven-nevnte 3,5 g ampulle inneholdende lipidfase.

Trinn 3) For fremstilling av vann-i-oljemulsjonen for-segles ampullen og festes til holderen i en hvirvelryster og rystes ved maksimum hastighet i 6 minutter.

Trinn 4) For fremstilling av kloroformsfærulene suspendert i vann blir halvparten av emulsjonen deretter hver sprøytet hurtig gjennom en Pasteur-pipette med smal spiss inn i 3,5 g glassampuller hver inneholdende 4 % dekstrose i vann og 40 mM lysin, fri base, og rystes deretter på hvirvel-rysteren i 3 sekunder ved høy hastighet for dannelse av kloroformsfaerulene.

Trinn 5) Kloroformsfaerulsuspensjonene i de to ampullene helles i bunnen av en 250 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende 5 ml vann, glukose (3,5 g/100 ml), og fri base-lysin (40 mM), og en strøm av nitrogengass ved 7 l/min. spyles gjennom kolben for langsomt å fordampe kloroform i løpet av 10-15 min. ved 37°C. Liposomene isoleres deretter ved sentrifugering ved 600 x g i 5 min.

Den gjennomsnittlige volumjusterte størrelsen på de resul-terende liposomer (± standard avvik av fordelingen) var 19,4 ± 6,5 pm. Prosentvis oppfanging var 59 ± 7 %, og oppfangings-volumet var 36 ± 4 pl/mg av totale benyttede lipider. Til-setningen av saltsyre hadde markert innvirkning på hastigheten for cytosinarabinosidlekkasje fra de multivesikulære liposomene inkubert i humanplasma. Halvparten av legemiddelet lekket ut i løpet av 12 dager da saltsyre ble tilsatt i eksempelet ovenfor, mens halvparten av legemiddelet lekket ut i løpet av bare 2 timer, da saltsyren ble sløyfet i trinn 2) ovenfor. Ved testing i dyr hadde tilset-ningen av saltsyre igjen markert innvirkning på hastigheten for cytosinarabinosidlekkasje; legemiddelet holdt seg i det peritoneale hulrom hos mus mye lenger når saltsyre tilsettes under fremstilling.

Følgende eksempel illustrerer en forstørring av fremgangsmåten for fremstilling av store satser av multivesikulære liposomer.

Eksempel 2

Trinn 1) I en homogenisator av rustfritt stål (Omni-mikser 17150, Sorval Co., Newtton, CT) tilsettes 186 pmol dioleyllecitin, 42 jjmol dipalmitoylfosfatidylglycerol, 300 pmol kolesterol, 36 jjmol triolein og 20 ml kloroform (lipid-fasen).

Trinn 2) 20 ml vandig fase, cytosinarabinosid (20 mg/ml) oppløst i 0,136 N saltsyreoppløsning tilsettes til oven-nevnte blander av rustfritt stål inneholdende lipidfase under hvirvling.

Trinn 3) For fremstilling av vann-i-oljemulsjonen for-segles homogenisatoren og kjøres ved "7"-innstillingen i 3 min.

Trinn 4) For fremstilling av kloroformsfærulene suspendert i vann helles halvparten av emulsjonen deretter hver (under hvirvling) i to andre homogenisatorbeholdere av rustfritt stål, hver inneholdende 200 ml 4 % dekstrose i vann og 40 m mM lysin, fri base, og homogeniseres deretter på Omni-mikser-anordningen i 3 sek. ved "1"-innstillingen.

Trinn 5) Kloroformsfærulsuspensjonene i hver av homogeni-satorbeholderne helles i en flatbunnet, rektangulær stål-beholder, 20,3 cm x 30,5 cm bunndimensjon, og en strøm av nitrogengass eller luft ved 14 l/min. spyles gjennom kolben for langsomt å fordampe kloroform i løpet av 10-15 min. Liposomene isoleres deretter ved sentrifugering ved 6 x g i 5 min.

Følgende eksempel illustrerer metoder for å fremstille mindre eller større liposomer.

Eksempel 3

For å gjøre llposomer mindre enn det i eksempel 1 eller 2 ble den mekaniske styrken eller varigheten av rystingen eller homogeniseringen i trinn 4) i eksempel 1 eller 2 øket. For å gjøre liposomer større ble den mekaniske styrken eller varigheten av rystingen eller homogeniseringen i trinn 4) i eksempel 1 eller 2 minsket.

Følgende eksempel 4 illustrerer representative metoder for fremstilling av liposomer av varierende lipidsammensetninger og inkorporering av forskjellige materialer i liposomer.

Eksempel 4

I trinn 1) i eksempel 1 eller 2 kan andre amfipatiske lipider slik som fosfatidylkoliner (PC), kardiolipin (CL), dimyristoylfosfatidylglycerol (DMPG), fosfatidyletanolaminer (PE), fosfatidylseriner (PS), dimyristoylfosfatidinsyre (DMPA) i forskjellige kombinasjoner benyttes med lignende resultater. F.eks., PC/C/CL/TO i 44,5/4,5/1/1 molarforhold; DOPC/C/PC/TO i 4,5/4,5/1/1 molarforhold; PC/C/DPPG/TC i 4/4/1/1 molarforhold; 1 PC/C/PG/TC i 5/4/1/1 molarforhold; PE/C/CL/TO i 4,5/4,5/1/1 molarforhold; PC/D/DMPA/TO i 4,5/4,5/1/1 molarforhold kan alle bli benyttet. For å in-korporere andre biogenetisk aktive materialer kan man på enkel måte erstatte cytosinarabinosidet med et ønsket mate-riale eller kombinasjon av materialer i tabell 1 i trinn 2) i eksempel 1 eller 2. Alle disse gir multivesikulære liposomer som er effektive i mennesker og gir forlenget eksponering av den biologisk aktive substans ved terapeutisk konsentrasjon.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således "depot"-preparater med bred anvendelse, hvor biologisk aktive stoffer er innkapslet i relativt store mengder og gir forlenget eksponering ved terapeutiske konsentrasjoner av disse substan-sene for optimale resultater som unngår høy topping av dosering, hvilket kunne være toksisk.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av multivesikulære lipid-vesikler eller liposomer omfattende trinnene a) oppløsning av en lipidkomponent i ett eller flere organiske oppløsningsmidler hvor nevnte lipidkomponent inneholder minst ett nøytralt lipid og minst ett amfipatisk lipid med minst en netto negativ ladning; b) tilsetning til lipidkomponenten av en ublandbar første vandig komponent inneholdende ett eller flere stoffer som skal innkapsles, c) dannelse av en vann-i-olje-emulsjon fra de to ublandbare komponentene ved anvendelse av en metode valgt fra mekanisk agitasjon, ultralydenergi og dyseforstøvning hvorved den gjennomsnittlige størrelse og antallet av de vandige kammrene i liposomene bestemmes av typen, intensi-teten og varigheten av den valgte metode; d) overføring og neddykking av vann-i-olje-emulsjonen i en annen ublandbar vandig komponent; e) dispegering av vann-i-olje-emulsjonen for dannelse av oppløsningsmiddelsfæruler inneholdende flere dråper av den første vandige komponenten deri under anvendelse av metoder valgt fra mekanisk agitasjon, ultralydenergi, dyseforstøvning og kombinasjoner derav, idet liposomenes gjennomsnittlige størrelse bestemmes av typen, intensi-teten og varigheten av den benyttede energi; og f) fordampning av de organiske oppløsningsmidlene fra opp-løsningsmiddelsfærulene for dannelse av de multivesikulære liposomene, idet nevnte fordampning tilveiebringes ved føring av gass over de andre vandige komponentene, karakterisert ved at innkapslingen utføres i nærvær av et hydroklorid som tilsettes til den ublandbare første vandige komponenten i trinn (b), idet det anvendes et nøytraliseringsmiddel av lav ionisk styrke når hydrokloridet er surt for å hindre at oppløsnings-middelsfæruler kleber seg til hverandre, og idet det anvendes et eller flere ikke-ioniske osmotiske midler i den suspenderende vandige oppløsning for å holde det osmotiske trykket inne i og utenfor liposomene balansert.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hydrokloridet velges fra gruppen bestående av saltsyre, lysinhydroklorid, histidinhydroklorid og kombinasjoner derav.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hydrokloridet er surt, og at den andre vandige komponenten inneholder minst ett nøytraliseringsmiddel.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 3, karakterisert ved at nøytraliseringsmiddelet velges fra gruppen bestående av fribase-lysin og fribase-histidin og kombinasjoner derav.