MXPA05002183A - Una composicion farmaceutica de liposomas de tamano pequeno y metodo de preparacion. - Google Patents

Abstract

Una composicion farmaceutica de liposomas de tamana pequeno, unilamelares para el suministro de compuestos activos, por via inyectable, con mejorada permanencia en el torrente sanguineo, donde la membrana unilamelar contiene una mezcla de lipidos saturados que comprende al menos un lisofosfolipido en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0,5 moles% y aproximadamente 6,0 moles% respecto de los lipidos totales y metodos de preparacion. Adicionalmente se preparan liposomas con mayor eficiencia de encapsulamiento de un principio activo tal como doxorubicina mediante el agregado de una solucion de iones calcio.

Description

UNA COMPOSICIÓN FARMACEUTICA DE LIPOSOMAS DE TAMAÑO PEQUEÑO Y METODO DE PREPARACIÓN AREA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevas composiciones de liposomas de tamaño pequeño destinadas al suministro de compuestos activos, por vía inyectable, particularmente de aplicación terapéutica, con mejorada permanencia en el torrente sanguíneo. Adicionalmente se provee un método de preparación de liposomas con una mayor eficiencia de incorporación de compuesto activo al interior de los liposomas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La mayoría de las drogas que se administran por perfusión o por vía .inyectable poseen al menos uno de los siguientes inconvenientes : 1) son rápidamente eliminadas de la circulación, ó 2) poseen un bajo índice terapéutico (dado por una elevada toxicidad o incidencia de efectos adversos en relación a su eficacia terapéutica o a una mala distribución) .

En este contexto, los liposomas han sido ampliamente utilizados como sistemas para la liberación controlada y sostenida de principios activos . Los liposomas son esencialmente vesículas lipídicas suspendí-das en un medio acuoso y que contienen también en su interior un medio acuoso.

Los liposomas son estructuras sustancialmente esféricas compuestas por membranas lipídicas bicapa completamente cerradas . Los liposomas pueden ser vesículas unilamelares (que po-seen una única membrana bicapa) o vesículas multilamelares (estructuras de tipo "cebolla" caracterizadas por múltiples membranas bicapa, cada una separada de la siguiente por una capa acuosa) . La bicapa está compuesta por dos monocapas de moléculas de un tipo particular que tienen una región hidró-foba (cola) y una región hidrófila (cabeza) . Este tipo de moléculas se denomina antipática. La estructura de la membrana bicapa es tal que las colas hidrófobas (no polares) de las monocapas lipídicas se orientan hacia el centro de la bicapa mientras que las cabezas hidrófilas (polares) se orientan hacia la fase acuosa. La estructura resultante es una estructura energéticamente estable, cerrada, capaz de transportar moléculas bioactivas . Las moléculas bioactivas atrapadas de-ntro de los liposomas pueden así presentar tanto un índice terapéutico como una biodistribución mejoradas. Las drogas transportadas mediante liposomas son liberadas gradualmente en la circulación, aliviando así los efectos tóxicos latera-les asociados con la administración de la droga libre.

Los liposomas se utilizan extensamente en la preparación de formulaciones farmacéuticas, para el suministro selectivo de una variedad de agentes activos de valor diagnóstico y terapéutico .

Se han descripto liposomas constituidos por diferentes lípi-dos, muchos de ellos en documentos de patente, como por ejemplo las Patentes Nos. 4.737.323 (1988); 4.769.250 (1988); 4.837.028 (1989) 4.863.739 (1989); 4.920.016 (1990); 5.013.556 (1991); 5.463.066 (1995). También se conocen dis-tintos métodos y variantes de los mismos para la preparación de varios tipos de liposomas, tales como los descriptos en las siguientes publicaciones: Preparation of liposomes of de-fined size distribution by extrusión through polycarbonate membranes, por Olson,F; Hunt, C.A.; Szoka, F.C.; Vail, W.J.; Papahadj opoulos , D., Biochem Biophys . Acta, 557 , 9 - 23 (1979); Vesicles of variable size produced by a rapid extrusión procedure por Mayer, L.D.; Hope, M.J. Cullis, P. . Bio-chem. Biop ys. Acta 858, 161-168 (1986) y Effects'of soluble concentrations of the entrapment of solutes in phosphol-ipids vesicles prepared by freeze- thaw extrusión por Chap-man, C.J., Erdahl, E.E. Taylor, R.W., Pfeiffer,D.R. : Chem. Phys. Lipids, 60, 201-208 (1991) . Información bibliográfica adicional puede encontrarse en: N. Berger, A. Sachse; J. Ben-der, R, Schbert and M. Branddl, Int. J Pharmaceutics, 223 55-68 (2001).

Algunas patentes describen composiciones de liposomas conte-niendo lisofosfolípidos , tal como la Patente US 5.043.164, que describe una formulación para liposomas con fosfatidile-tanolamina (particularmente dioleil fosfatidiletanolamina) y un ácido graso como ácido oleico. Con el objeto de estabilizar los liposomas, se reemplaza el colesterol, (estabilizante convencional) , por el agregado, luego de un corto tiempo después de su preparación, de una sustancia anfipática, tal como por ejemplo lisofosfolípidos, gangliósidos , sulfátidos, drogas liofllicas, y proteínas anfipáticas en proporciones de lípidos a sustancia anfipática de 10:1 a 1:1 p/p.

La patente US 5.009.956 describe un método de estabilización de membranas de liposomas mediante la mezcla de un fosfolípi-do y entre 20-30 mol% de un lisofosfolípido, donde al menos uno de ellos es insaturado.

Como se expuso anteriormente, los liposomas han sido ampliamente utilizados como sistemas para la liberación controlada y sostenida de compuestos activos retenidos dentro de los mismos a lo largo de un período de tiempo prolongado, reduciendo asi los posibles efectos tóxicos de la droga al limitar la concentración de droga libre en el torrente sanguíneo. Sin embargo, un problema frecuente de este tipo de estrategia está dado por la rápida eliminación de los liposomas por el sistema reticulo-endotelial (SER) y por la baja retención de los principios activos.

Uno de los factores que contribuyen a minimizar la remoción de los liposomas por el SER es la preparación de liposomas de tamaño pequeño y uniforme.

Otro factor que contribuye a mejorar la terapia de suministro de compuestos activos, lo constituye la posibilidad de obtener liposomas con una mayor eficiencia en la incorporación de compuesto activo, esto es una cantidad aumentada de principio activo atrapado dentro de las vesículas liposomales .

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee una composición farmacéutica de liposomas de tamaño pequeño, unilamelares para suministro de un compuesto activo por vía inyectable.

La obtención de liposomas de tamaño pequeño se logra, de acuerdo a la presente invención, mediante el agregado de cantidades limitadas de un lisofosfollpido a la mezcla de lípi-dos constituyentes de la formulación de membrana.

Es por lo tanto un objeto de la presente invención proveer una composición farmacéutica de liposomas de tamaño pequeño, unilamelares para administración parenteral de un compuesto activo, que comprende: (i) liposomas con un diámetro promedio de entre aproximadamente 75 nm y aproximadamente 300 nm, donde la membrana unilamelar está formada por una mezcla de lx-pidos saturados que contiene una proporción de lisofosfolipi-dos comprendida entre aproximadamen e 0,5 moles% y aproximadamente 6,0 moles% respecto de los lípidos totales, y(ii) un compuesto terapéutico encapsulado dentro de dichos liposomas .

Concentraciones preferidas de lisofosfolípidos son aquellas entre aproximadamente 1,4 moles% y aproximadamente 2,8 moles% respecto de los lípidos totales.

Es otro objeto de la invención proveer un método para la preparación de liposomas de tamaño pequeño y controlado mediante un procedimiento sencillo, por el agregado de pequeñas cantidades de un lisofosfolipido a la mezcla lipidica utilizada en dicha preparación.

Un objeto particular de la invención provee una composición farmacéutica de liposomas de tamaño pequeño, unilamelares para administración parenteral de un agente citotóxico, donde dicho agente citotóxico es preferiblemente un antibiótico an-traciclínico como doxorubicina, epirubicina o daunorubicina, más preferiblemente doxorubicina.

Otro aspecto relevante de esta invención es un método de preparación de una composición de liposomas destinado a incrementar el porcentaje de encapsulamiento de doxorubicina de-ntro de las vesículas liposomales. Este aumento de eficiencia de incorporación de doxorubicina al interior de los liposomas se logra mediante el agregado de iones calcio a la solución de doxorubicina durante la etapa de carga de los liposomas con principio activo.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra las curvas de distribución del tamaño de liposomas para " cantidades crecientes de lisofosfolipido en función del tamaño de poro de extrudado.

Las figuras 2a y 2b muestran la distribución de tamaño de liposomas extrudados a través de membranas con tamaño de poro decreciente (en este caso el poro menor es de 200 nm) con agregado de lisofosfolipido (lotes 06012 y 06013) y sin el agregado de lisofosfolipido (lote 06011) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los liposomas de la presente invención son liposomas unilame-lares que poseen una única membrana bicapa. La bicapa está compuesta por dos monocapas de moléculas antipáticas, un tipo particular de moléculas que tienen una región hidrófoba (cola) y una región hidrófila (cabeza) . La estructura de la membrana bicapa es tal que las colas hidrófobas (no polares) de las monocapas lipídicas se orientan hacia el centro de la bicapa mientras que las cabezas hidrófilas (polares) se orientan hacia las fases acuosas . La estructura resultante es una estructura energéticamente estable, cerrada, capaz de transportar moléculas bioactivas .

La membrana unilamelar de esta invención está formada por una mezcla de lípidos saturados . De acuerdo con la invención, se obtienen liposomas de tamaño pequeño por el agregado de liso-fosfosfolípidos a la mezcla de lipidos utilizada en la preparación de la membrana liposomal .

Preferiblemente los lisofosfolípidos se seleccionan de liso-fosfatidilcolina, lisofosfatidilinositol , lisofosfatidilseri-na y ácido lisofostatidico .

La lisofosfatidil colina (abreviado como "liso PC"), se puede obtener por vía de síntesis química, o por hidrólisis enzim tica con fosfolipasa A2. Naturalmente se produce también como un producto de degradación de fosfatidilcolina .

Los lípidos utilizados en la preparación de la membrana unilamelar son lípidos saturados, preferiblemente seleccionados de entre fosfatidil colina, colesterol y fosfatidil-etanolamina, fosfatidil-inositol ; fosfatidil-glicerol , fosfatidil colina natural (de soja y/o huevo) y fosfatidil colina obtenida de distintas fuentes naturales como soja o huevo, seguida de hidrogenación; diestearoil fosfatidil-etanolamina derivatizada con polietilenglicol 2000 O-metilado; dipalmi-toil-fosfatidiletanolamina derivatizada con polietilenglicol 2000 O-metilado y/o glicolípidos como GMi u otros sialogan-gliósidos o combinaciones de los mismos.

Se ha encontrado evidencia experimental de que el agregado de cantidades crecientes, pero limitadas de un lisofosfolipido, a las mezclas de lipidos utilizadas en la preparación de los liposomas, produce una reducción del tamaño de los mismos cuando se compara con aquellos producidos utilizando la misma mezcla de lipidos sin el agregado de lisofosfolípidos .

Como se utiliza en la presente, liposomas de tamaño pequeño son liposomas que tiene un diámetro medio menor de aproximadamente 500 nm, preferiblemente un diámetro medio de entre aproximadamente 75 nm y aproximadamente 300 nm. Se consideran liposomas de tamaño grande a aquellos que tienen un diámetro medio mayor de aproximadamente 500 nm. El diámetro promedio puede ser determinado mediante métodos convencionales bien conocidos para aquellos expertos en el arte. Entre ellos se puede mencionar la microscopía electrónica y el método de dispersión de luz láser dinámico (Láser Light Scattering) .

De acuerdo con la invención, se obtienen liposomas de tamaño pequeño mediante el agregado de lisofosfolípidos a la mezcla de lipidos que conformarán la membrana liposomal, preferiblemente con un contenido de lisofosfolipido que varía entre aproximadamente 0,5 moles% y aproximadamente 6,0 moles% respecto de los lipidos totales. Más preferiblemente el contenido de lisofosfolípido varía entre aproximadamente 1,4 moles% y aproximadamente 2,8 moles% respecto de los lipidos totales.

Pueden agregarse convenientemente esteróles a la mezcla de lipidos, particularmente colesterol. El agregado de coleste-rol aumenta la estabilidad de las vesículas liposomales, mejorando la retención de principio activo.

Los liposomas son preparados mediante técnicas generalmente conocidas. Particularmente, se prefiere para la preparación de los liposomas de la presente invención un procedimiento que combina ciclos de congelamiento/descongelamiento con ex-trudado a través de membranas de distinto tamaño de poro. Más preferiblemente, puede utilizarse una combinación de un pro-cedimiento de homogeinización, llevado a cabo con un homogei-nizador apropiado, y extrusión a través de membranas de diferente tamaño de poro.

Preferiblemente, la mezcla de lipidos se disuelve en un solvente orgánico que se evapora hasta sequedad. La membrana li-pídica formada se retoma con una solución acuosa, sometiendo la suspensión a entre 3 y 6 ciclos de congelamiento (aproximadamente de -20 °C a -45°C) y descongelamiento (hasta 50 °C-60 °C) . A continuación la suspensión se extruda a través de membranas de policarbonato (Preparation of liposomes of defi-ned size distribution by extrusión through polycarbonate mem-branes, por Olson,F Hunt, C.A.; Szoka, F.C.; Vail, W. J. ; Pa-pahadjopoulos, D., Biochem Biophys. Acta, 557 , 9 - 23 (1979); Vesícles of variable size produced by a rapid extrusión procedure por Mayer, L.D. ,- Hope, M.J. Cullis, P.R. Biochem. Biophys. Acta 858, 161-168 (1986)) . En la presente invención se utilizan una serie de etapas de extrudado comen-zando por la membrana de poro más grande, por ej . 1000 nm, siguiendo por una membrana de 400 nm de poro y continuando con membranas de tamaño de poro más pequeño, hasta obtener liposomas del tamaño buscado.

La incorporación de agente activo al interior de los liposo-mas se realiza, de acuerdo con la presente invención mediante el método de carga activa, realizando previamente una diálisis de la solución de liposomas, siguiendo procedimientos públicamente conocidos por cualquier experto en el arte.

La eficiencia en la carga de un agente activo dentro de un liposoma depende también de las propiedades químicas del compuesto. En general, los compuestos solubles en agua o en 1£~ pidos son más fáciles de incorporar dado que por una parte los compuestos solubles en lxpidos pueden ser fácilmente incorporados dentro de la bicapa lápida durante la formación del liposoma (carga pasiva) . Por otra parte, los compuestos solubles en agua interactúan con la cabeza polar del fosfoli-pido que enfrenta el interior del liposoma y por lo tanto el compuesto es fácilmente secuestrado dentro del liposoma. Los compuestos anfipáticos, tales como los antibióticos antraci-clínicos son los más difíciles de retener en el interior de los liposomas .

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se ha encontrado esencial, para el suministro de dosis terapéuticamente efectivas de una variedad de agentes citotóxicos, cargar los liposomas con una alta concentración de principio activo. Por ejemplo, para agentes citotóxicos tales como antibióticos an-traciclínicos, particularmente antraciclinas como doxorubici-na, epirubicina, daunorubicina, sus sales y lo similar, es deseable lograr una proporción de principio activo encapsula-do de entre aproximadamente 8,5% en peso a aproximadamente 11,5% en peso respecto del peso de los lípidos de liposoma.

Un método para la carga activa de drogas anfipáticas dentro de liposomas se describe en la patente US No. 5.192.542 (Ba-renolz y col.), la cual se incorpora a la presente como refe-rencia. En este método los liposomas se preparan en la presencia de ion amonio, tal como una solución de sulfato de amonio o de cualquier otro compuesto de amonio tal como fosfato, carbonato, bicarbonato, que puedan disociarse dentro del liposoma. Después de la obtención del tamaño adecuado, la suspensión de liposomas es tratada para crear un gradiente de amonio a través de la membrana liposomal .

Sorprendentemente, de acuerdo con una realización de la invención se ha descubierto que la carga de doxorubicina al in-terior de los liposomas, cuando se realiza en la presencia de pequeñas concentraciones de ion calcio, permite incrementar notablemente la eficiencia de encapsulamiento .

Se prefieren soluciones de iones calcio a partir de soluciones tales como de cloruro de calcio en una concentración de entre 50 mM y 200 mM. Pueden utilizarse otras sales solubles de calcio. El medio regulador de pH, cuando se utilice, no deberá comprender sustancias secuestrantes de calcio. Pueden utilizarse soluciones acético/acetato, de otras sales que no produzcan la precipitación de los iones calcio o bien de un aminoácido tal como histidina. La relación en volumen de solución de liposomas a solución de cloruro de calcio puede ser 1,5 : 0, 05-0,5 (v/v) .

Sin adherir a una teoría en particular se entiende que la presencia de iones calcio permitiría eliminar el remanente de sulfato de amonio del exterior de las vesículas lipídicas, ya que en presencia de sulfato de amonio, la doxorubicina geli-fica, y en tal caso no estaría disponible para permear al interior de los liposomas. La eliminación de los iones amonio remanentes en la zona inmediata exterior de los liposomas, dejaría a la doxorubicina libre para incorporarse al interior de los liposomas.

De esta forma, se ha logrado un método que permite alcanzar un aumento de rendimiento de incorporación de principio activo al interior de los liposomas, aumentando el porcentaje de principio activo encapsulado en un porcentaje de entre 20 a 70% respecto de un método que no utiliza iones calcio.

A continuación se proveen ejemplos de realización, los cuales son meramente ilustrativos y no tienen propósitos limitativos de la invención.

EJEMPLOS Preparación de Control Se prepara una solución que contenga 95 mg de fosfatidilcoli-na de soja hidrogenada; 30 mg de fosfatídil etanolamina deri-vatizada con O-metil polietilenglicol-2000 y 30 mg de coles-terol en 15 mi de etanol anhidro.

Se evapora la mezcla en evaporador rotatorio hasta sequedad, cuidando de hacerlo a una temperatura no superior a los 45°C. La película formada se retoma en solución de sulfato de amonio a 45°C (5 mi de solución que contiene 13,20 mg/litro de solución) , con agitación y a temperatura ambiente .

Los liposomas obtenidos en el paso anterior, se someten a ciclos de congelamiento (-45°C) y descongelamiento (50°C) . Por lo menos se practican 6 ciclos .

Luego se extrudan a través de membranas de poro decreciente, comenzando por membrana de 1000 nm, luego de 400 nm y finalmente por membrana de 200 nm.

Se determinó el tamaño promedio de los liposomas en esta preparación mediante el método de Dispersión de Luz Láser Dinámico (Láser Light Scattering) . El resultado se muestra en el gráfico de la figura 1 con circulo lleno (0 mol% de lisofos-folipido/lípidos totales) .

Ejemplo 1 Se prepara una solución que contenga 95 mg de fosfatidilcoli-na de soja hidrogenada; 1,5 mg de palmitoil-lisofosfatidilcolina; 30 mg de fosfatidil etanolamina deriva-tizada con O-metil polietilenglicol-2000 y 30 mg de coleste-rol en 15 mi de etanol anhidro .

Se evapora la mezcla en evaporador rotatorio hasta sequedad, cuidando de hacerlo a una temperatura no superior a los 45°C. La película formada se retoma en solución de sulfato de amonio a 45 °C (5 mi de solución que contiene 13,20 mg/litro de solución) , con agitación y a temperatura ambiente .

Los liposomas obtenidos en el paso anterior, se someten a ciclos de congelamiento (~45°C) y descongelamiento (50°C) . Por lo menos se practican 6 ciclos.

Luego se extrudan a través de membranas de poro decreciente, comenzando por membrana de 1000 nm, siguiendo luego por las membranas de poro más pequeño, luego de 400 nm y finalmente por membrana de 200 nm.

El tamaño promedio de los liposomas en esta preparación se muestra en el gráfico de la figura 1 con círculo vacio (1,43 mol% de lisofosfolípido/lípidos totales) .

Ejemplo 2 Se prepara una solución que contenga 95 mg de fosfatidilcoli-na de soja hidrogenada; 3 mg de palmitoil-lisofosfatidilcolina; 30 mg de fosfatidil etanolamina deriva-tizada con 0-metil polietilenglicol-2000 y 30 mg de coleste-rol en 15 mi de etanol anhidro .

Se evapora la mezcla en evaporador rotatorio hasta sequedad, cuidando de hacerlo a una temperatura no superior a los 45°C. La película formada se retoma en solución de sulfato de amonio a 45 °C (5 mi de solución que contiene 13,20 mg/litro de solución) , con agitación y a temperatura ambiente . Los liposomas obtenidos en el paso anterior, se someten a ciclos de congelamiento (-45°C) y descongelamiento (50°C) . Por lo menos se practican 6 ciclos .

Luego se extrudan a través de membranas de poro decreciente, comenzando por membrana de 1000 nm, siguiendo luego por las membranas de poro más pequeño, luego de 400 nm y finalmente por membrana de 200 nm.

El tamaño promedio de los liposomas en esta preparación se muestra en el gráfico de la figura 1 con triángulo lleno (2,86 mol% de lisofosfolípido/lipidos totales).

Ejemplo 3 Se prepara una solución que contenga 95 mg de fosfatidilcoli-na de soja hidrogenada; 14 mg de palmitoil-lisofosfatidilcolina; 30 mg de fosfatidil etanolamina deriva-tizada con O-metil polietilenglicol-2000 y 30 mg de coleste-rol en 15 mi de etanol anhidro .

Se evapora la mezcla en evaporador rotatorio hasta sequedad, cuidando de hacerlo a una temperatura no superior a los 45 °C. La película formada se retoma en solución de sulfato de amonio a 45°C (5 mi de solución que contiene 13,20 mg/litro de solución) , con agitación y a temperatura ambiente.

Los liposomas obtenidos en el paso anterior, se someten a ciclos de congelamiento (-45°C) y descongelamiento (50°C). Por lo menos se practican 6 ciclos .

Luego se extrudan a través de membranas de poro decreciente, comenzando por membrana de 1000 nm, siguiendo luego por las membranas de poro más pequeño, luego de 400 nm y finalmente por membrana de 200 nm.

El tamaño promedio de los liposomas en esta preparación se muestra en el gráfico de la figura 1 con triángulo vacio (11,5 mol% de lisofosfolípido/lipidos totales) .

Ejemplo 4 Se prepara una solución que contenga 95 mg de fosfatidilcoli-na de soja hidrogenada; 18 mg de palmitoil-lisofosfatidilcolina; 30 mg de fosfatidil etanolamina deriva-tizada con 0-metil polietilenglicol-2.000 y 30 mg de coleste-rol en 15 mi de etanol anhidro .

Se evapora la mezcla en evaporador rotatorio hasta sequedad, cuidando de hacerlo a una temperatura no superior a los 45 °C. La película formada se retoma en solución de sulfato de amonio a 45°C (5 mi de solución que contiene 13,20 mg/litro de solución) , con agitación y a temperatura ambiente .

Los liposomas obtenidos en el paso anterior, se someten a ciclos de congelamiento (-45°C) y descongelamiento (50°C) . Por lo menos se practican 6 ciclos.

Luego se extrudan a través de membranas de poro decreciente, comenzando por membrana de 1000 nm, siguiendo luego por las membranas de poro más pequeño, luego de 400 nm y finalmente por membrana de 200 nm.

El tamaño promedio de los liposomas en esta preparación se muestra en el gráfico de la figura 1 con cuadrado lleno (14,3 mol% de lisofosfolípido/lípidos totales) .

En la Tabla 1 se exponen los tamaños medidos de liposomas conteniendo cantidades crecientes de lisofosfolípido, después de extrudado por membrana de 400 nm, de acuerdo a lo descrip- to en los ejemplos anteriores y lo ilustrado en la Figura 1.

Tabla 1 Ej emplo 5 Se preparan dos lotes de liposomas (06012 y 06013) de acuerdo al procedimiento descripto en el Ejemplo 1. Asimismo se prepara un lote de liposomas de acuerdo al procedimiento descripto en la Preparación de Control (06011) . Las Figuras 2a y 2b muestran la distribución de tamaño de partícula para los lotes 06012 y 06013 en comparación con la distribución de tamaño de partícula para el lote 06011 (sin lisofosfolípido) Se puede observar una consistencia de resultados entre los lotes de liposomas que contienen lisofosfolípido, observándose en ambos (06012 y 06013) un tamaño de partícula menor que el correspondiente al de la preparación control, sin lisofosfolípido (06011) .

Ejemplo 6 Una suspensión de liposomas obtenida según se describió en el ejemplo 1 se dializa contra una solución de sacarosa 10 % (p/v) para eliminar el sulfato de amonio exterior a los lipo-somas.

A continuación, se prepara una solución que contiene la siguiente composición: 1,5 volúmenes de suspensión de liposomas, 1 volumen de solución de doxorubicina que contiene 6 mg/ml en una solución de sacarosa 10% (p/v) e histidina 0,15% (p/v) y 0,5 mi de solución de sacarosa 10% p/v / histidina 0,15% p/v (Buffer sacarosa/histidina) .

Se deja reposar la mezcla durante 15 minutos, entibiando suavemente .

Se determina el grado de encapsulamiento de doxorubicina a través de mediciones de absorbancia mediante espectrometría UV (absorbancia a 590 nm) . A tal fin se realizan mediciones de absorbancia en muestras de diluciones de liposomas con doxorubicina en medio isotónico alcalino (Doxorubicina Libre) y muestras de diluciones de liposomas con doxorubicina en medio alcalino contendiendo detergente (Doxorubicina Total) . Mediante los datos de absorbancia obtenidos a 590 nm se calcula el porcentaje de doxorubicina encapsulada. Se obtiene un porcentaje de encapsulamiento de 78,7%. El porcentaje de doxorubicina libre es de 21,3%.

Ejemplo 7 Se prepara una suspensión de liposomas dializados como se describe en el ejemplo 5 y luego se incuba esa suspensión según la siguiente relación: 1 , 5 volúmenes de suspensión de liposomas ; 0,4 volúmenes de buffer sacarosa/ istidina (según ejemplo 5); 0,1 volúmenes de solución 100 mM de Cl2Ca y 1,0 volumen de solución de doxorubicina 6 mg/.ml en buffer sacarosa / histidina. Se deja reposar la mezcla durante 15 minutos, entibiando suavemente . De determina el porcentaje de doxorubicina incorporado (de igual modo que indicado en el ejemplo 5) , obteniéndose un valor de 87,9%. El porcentaje de doxorubicina libre es de 12,1% Como puede verse, el grado de incorporación es 9,2 puntos mayor que el logrado sin Cl2Ca.

Ejemplo 8 Se procede de igual forma que en el ejemplo 5. Finalizada la etapa de incubamiento, se dializa contra una solución Buffer sacarosa/histidina durante 12 hs.

La determinación del grado de encapsulatniento de doxorubicina da un valor de 91,2%.

Ejemplo 9 Se procede como se describe en el ejemplo 6 y finalmente se dializa contra una solucion de Buffer sacarosa/histidina durante 12 Hs . El porcentaje de encapsulamiento de Doxorubicina es de 95.53%. Es decir, 4,33 puntos mayor que sin el agregado de cloruro de calcio. En otras palabras, el porcentaje de doxorubicina libre es de 50 % menor que sin el agregado de Cloruro de calcio. Mientras que la invención ha sido particularmente descripta con específica referencia a realizaciones de proceso y proce-dimiento particulares, se apreciará que diversas alteraciones, modificaciones y adaptaciones pueden basarse en la pre-senté descripción, y se hallan dentro del espíritu y alcance de la presente invención como se define en las siguientes reivindicaciones

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica de liposomas de tamaño pequeño, unilamelares para administración parenteral de un compuesto activo, que comprende: liposomas con un diámetro pro-medio de entre aproximadamente 75 nm y aproximadamente 300 nm, donde la membrana unilamelar contiene una mezcla de lípi-dos saturados que comprende al menos un lisofosfol pido en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0,5 moles% y aproximadamente 6,0 moles% respecto de los lipidos totales, y un compuesto terapéutico encapsulado dentro de dichos liposomas .

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el lisofosfolxpido está seleccionado entre lisofosfati-dilcolina, lisofosfatidilinositol , lisofosfatidilserina y ácido liso fosfatídico o combinaciones de los mismos.

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los lipidos saturados se seleccionan entre fosfatidil colina, colesterol y fosfatidil-etanolamina, fosfatidil-inositol; fosfatidil-glicerol , fosfatidil colina natural (de soja y/o huevo); diestearoil fosfatidil-etanolamina derivati-zada con polietilenglicol 750-5000 O-metilado; dipalmitoil-fosfatidiletanolamina derivatizada con polietilenglicol 750-5000 0-metilado o combinaciones de los mismos.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3 , en donde la diestearoil fosfatidil-etanolamina está derivatizada preferiblemente con polietilenglicol 2000 O-metilado.

5. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3 , en donde la dipalmitoil-fosfatidiletanolamina está derivatizada preferiblemente con polietilenglicol 2000 O-metilado.

6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto activo es un agente citotóxico.

7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el agente citotóxico se selecciona de entre antibióticos antraciclinicos , taxanos y sales de platino.

8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el antibiótico antraciclínico se selecciona del grupo que consiste de doxorubicina, epirubicina, y daunorubicina y sus sales farmacéuticamente aceptables.

9. Una composición farmacéutica de liposomas unilamelares de tamaño pequeño para administración parenteral de un com-puesto activo de acuerdo con la reivindicación 1, que com-prende: liposomas con un diámetro promedio de entre aproximadamente 75nm y aproximadamente 300 nm, donde la membrana uni-lamelar contiene una mezcla de lipidos saturados que comprende al menos un lisofosfolípido en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0,5 moles% y aproximadamente 6,0 moles% respecto de los lipidos totales, y doxorubicina encapsulada dentro de dichos liposomas en una proporción de entre aproximadamente 8,5% en peso a aproximadamente 11,5% en peso respecto del peso de los lipidos en los liposomas.

10. Un método para preparar una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de: formar liposomas a partir de una solución que contiene lipidos saturados y al menos un lisofosfolipido en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0,5 moles% y aproximadamente 6,0 moles%" de respecto de los lipidos totales; evaporar hasta sequedad; tomar la película en solución acuosa; someter la solución anterior a ciclos de congelamiento y descongelamiento; extrudar a través de membranas de poro decreciente hasta una membrana de 50 nm de poro, obteniendo liposomas con un diámetro prome-dio de entre aproximadamente 75 nm y aproximadamente 300 nm; dializar la suspensión de liposomas; y mezclar la suspensión de liposomas dializada con una solución de compuesto activo. > J 29

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el lisofosfolipido está seleccionado entre lisofosf tidilco- lina, lisofosfatidilinositol , lisofosfatidilserina y ácido liso fosfatídico. 5

12. Un método para preparar una composición de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende las etapas de: formar liposomas a partir de una mezcla que contiene lípidos saturados y al menos un lisofosfolipido en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0,5 moles% y aproximadamente 6,0 moles% 10 de respecto de los lípidos totales; evaporar hasta sequedad; tomar la película en solución de una sal de amonio; someter la solución anterior a ciclos de congelamiento y descongelamiento; extrudar a través de membranas de poro decreciente hasta una membrana de 50 nm de poro, obteniendo liposomas con 15 un diámetro promedio de entre aproximadamente 75 nm y aproximadamente 300 nm,- dializar la suspensión de liposomas contra una solución acuosa sin iones amonio; mezclar la suspensión de liposomas dializada con una solución de entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 200 mM de una sal soluble de 20 calcio y una solución de doxorubicina en una concentración de entre aproximadamente 2 a aproximadamente 30 mg/ml, obtenien-do un porcentaje de más de 80% de encapsulamiento de doxoru-bicina .

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12 , en donde la sal de calcio es cloruro de calcio.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en donde la relación de volúmenes de solución de cloruro de calcio a solución de doxorubicina es de 1:10 (v/v) .

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 12 , en donde el porcentaje de doxorubicina encapsulado aumenta entre 20 a 70% en presencia de cloruro de calcio, respecto de un método que no utiliza cloruro de calcio.