FI94875C

FI94875C - Menetelmä elintarvikekäyttöön tarkoitetun teollisesti idätettävän siemenmateriaalin käsittelemiseksi

Info

Publication number: FI94875C
Application number: FI930182A
Authority: FI
Inventors: Tiina Mattila-Sandholm; Auli Haikara
Original assignee: Panimolaboratorio Bryggerilabo
Priority date: 1993-01-15
Filing date: 1993-01-15
Publication date: 1995-11-03
Also published as: UA27008C2; FI930182A0; WO1994016053A1; RU2126443C1; CZ285939B6; HU220583B1; BR9307847A; HUT72484A; SK281407B6; CA2153339A1; JP3518549B2; FI94875B; JPH08505056A; HU9502142D0; AU4821493A; FI930182L; CZ179395A3; SK89995A3; EE03161B1; AU680426B2

Description

94875

MENETELMÄ ELINTARVIKEKÄYTTÖÖN TARKOITETUN TEOLLISESTI IDÄTETTÄVÄN SIEMENMATERIAALIN KÄSITTELEMISEKSI

Keksintö koskee menetelmää elintarvikekäyttöön 5 tarkoitetun teollisesti idätettävän siemenmateriaalin käsittelemiseksi.

Idätysprosessilla tarkoitetaan tässä yhteydessä yleisesti menetelmävaiheita, jotka tarvitaan idätetyn tuotteen valmistamiseksi lähtien varastokuivasta 10 siemenestä. Esimerkiksi panimo- ja tislaamoteollisuu-dessa idätysprosessia, so. mallastusprosessia, käytetään oluen tai muiden alkoholijuomien tärkeän raaka-aineen, viljamaitaan, kuten ohramaitaan, ruismaitaan tai minkä tahansa maltaan tuottamiseksi. Idätysprosessia 15 käytetään lisäksi erilaisten kaupallisten itutuottei-den, esim. pavunitujen tai minkä tahansa ihmisen ravintona käytettävien itujen tuottamiseksi.

Idätysprosessit suoritetaan yleensä ei-asep-tisissa olosuhteissa. Käsiteltävissä siemenissä esiin-20 tyy mikrobeja, jotka ovat peräisin kasvuympäristöstä tai varastoinnista. Idätysprosessin olosuhteet ovat yleensä edullisia siemenessä esiintyville mikrobeille, jotka tavallisesti lisääntyvät prosessin aikana. Mikrobit voivat vaikuttaa haitallisesti idätettyyn tuottee-?5 seen tai tuotteesta mahdollisesti valmistettavaan lop-• putuotteeseen, mutta niillä voi olla myös hyödyllistä vaikutusta idätettävään tuotteeseen.

Oluen valmistuksen päävaiheet ovat mallastus, vierteen valmistus, pää- ja varastokäyminen sekä jäl-30 kikäsittely. Mallastuksen tarkoituksena on tuottaa jyvässä entsyymejä, jotka mäskäyksessä hajottavat vil-.. jän endospermin aineet vierteeseen liukenevaan muotoon. Esimerkiksi ohrajyvien mallastusprosessiin kuuluu tunnetusti kolme vaihetta, liotus, idätys ja kuivaus. Puh-35 distetut ja seulotut ohrajyvät liotetaan vedessä kunnes haluttu kosteus on saavutettu, esim. suuruusluokkaa n.

43 - 44%. Osa liotuksesta voidaan suorittaa ns. kui- 2 94875 valiotuksena. Ohra saa itää hallituissa olosuhteissa ja itänyt ohra kuivataan kuumassa ilmavirrassa, kunnes itäminen on loppunut. Kuivauksen päätteeksi maltaista poistetaan juuri-idut. Mallastuksen vaiheiden säätö 5 perustuu lämpötilan, ilman virtauksen ja kosteuden säätämiseen.

Maltaan laatuun vaikuttaa mallastustekniikan ja -olosuhteiden lisäksi mallasviljan mikrobifloora, joka vaihtelee merkittävästi mm. viljalajikkeen, sää-10 olosuhteiden, kasvupaikan, kasvukauden pituuden ja varastointiolosuhteiden mukaan.

Mallastuksessa yleisimmin käytetty viljalaji on ohra. Ohran luonnollinen mikrobifloora voidaan ryhmitellä pelto- ja varastosieniin, bakteereihin ja hii-15 voihin. Ohran yleisimmät peltosienisuvut ovat Fusarium. Alternaria. Cladosporium. Cephalosporium. Epicoccum ja Helminthosporium. Homesienien esiintyminen on erilaista eri maissa ja eri vuosina. Kosteat sääolosuhteet viljan kasvu- ja etenkin korjuuaikana suosivat Fusarium-homeen 20 kasvua. Sateisina kasvukausina Fusarium-kontaminaatio voi olla hyvin voimakas. Eräs viljan yleisimmistä bak-teerilajeista on Enterobacter aaolomerans. Muista bakteereista mainittakoon Escherichia coli sekä Pseudomonas-. Micrococcus- ja Bacillus-suvun bakteerit sekä 25 maitohappobakteerit. Bakteerien määrä ohrassa on n. 10® ! - 1 O8 pmy/g (pesäkkeitä muodostavia yksiköitä/g).

Ohran sisältämät homeet ja bakteerit lisääntyvät mallastuksen aikana ja huippupitoisuudet saavutetaan yleensä idätysvaiheen aikana. Voimakkaimmin 30 lisääntyvät tällöin etenkin Fusarium-homeet ja maitohappobakteerit. Myös hiivat lisääntyvät mallastuksen .. aikana. Kuivausvaiheessa home-, hiiva- ja bakteeripi-toisuudet taas yleensä laskevat. Osalla ohrassa esiintyvistä mikrobeista on hyödyllinen vaikutus mallastusta 35 ja maltaasta valmistettua tuotetta esim. olutta ajatellen. On arvioitu, että joistakin maltaan entsyymeistä jopa 40 - 50 % on mikrobiperäisiä. Osalla mikrobeista 3 94875 on vastaavasti epäedullinen vaikutus ohraan ja/tai maltaisiin.

Epäedullisista mikrobeista mainittakoon Fusa-rium-homeet, joiden on todettu aiheuttavan muita homei-5 ta useammin erityisen haitallista oluen ylikuohuntaa (gushing-ilmiö), jolloin homeiden tuottamat peptidit ovat alkioina kaasukuplille, jotka purkautuvat olutpullosta voimakkaana kuohuna. Kun mallastetuista jyvistä yli 50 % on Fusarium-homeilla kontaminoituneita, yli-10 kuohumisriski lisääntyy selvästi.

Edelleen, ohran sisältämien gram-negatiivisten bakteerien, kuten Leuconostoc-, Pseudomonas- ja Flavo-bacterium-sukuihin kuuluvien lajien on todettu hidastavan mäskin suodattavuutta vierteen suodatuksen yhtey-15 dessä. Ohrassa esiintyvät erilaiset mikrobit voivat aikaansaada myös muita epäedullisia vaikutuksia, esim. alentaa itävyyttä, aiheuttaa makuvirheitä tai epäedullisia muutoksia vierteen ja oluen analyysiarvoissa.

Mallasohran laatuvaatimukset voidaan määri-20 teliä vuosittain vahvistetuissa viljelysopimus- ja han-kintaehdoissa. Homeet ovat usein laatuvaatimuksissa mainittu mikrobiryhmä. Useat mallastamot ovat lisäksi asettaneet tietyille homeille ylärajan. Jos Fusarium-homeilla kontaminoitujen jyvien osuus on yli 65 % tai 25 Asoeroillus- ja Penicillium-homeiden vastaava osuus on ♦ yli 50 %, voidaan ohra luokitella huonolaatuiseksi tai jopa mallastukseen kelpaamattomaksi.

Homeiden aiheuttamaa ylikuohumista on pyritty ehkäisemään käyttämällä hyvälaatuista ohraa tai sekoit-30 tamalla ohra-, mallas- tai oluteriä. Sateisina vuosina lähes koko ohrasato saattaa olla huonolaatuista, jol-,, loin hyvälaatuisen ohran saaminen voi olla mahdotonta.

Myös mikrobisidisiä kemikaaleja on kokeiltu homeiden määrän vähentämiseksi, mutta mitään turvallista, ylei-35 sesti hyväksyttyä kemikaalia ei ole kyetty löytämään.

Myös idätysprosessi ravinnoksi tarkoitettujen itujen tuottamiseksi tarjoaa edulliset olosuhteet esim.

4 94875 homeiden ja bakteerien lisääntymiselle. Tälläiset itu-tuotteet pilaantuvat nopeasti. Edelleen siementen idätyksen yhteydessä voi lisääntyä esim. ruokamyrkytyksiä aiheuttavia elintarvikepatogeeneja, kuten Salmonella-, 5 Yersinia- ja/tai Listeria-bakteereita.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on poistaa edellä mainitut epäkohdat.

Erityisesti keksinnön tarkoituksena on tuoda esiin menetelmä, jolla mikrobiflooran määrää ja laatua 10 voidaan säädellä hallitusti idätysprosessin aikana vaikuttamatta kuitenkaan epäedullisesti idätetyn tuotteen tai tuotteesta mahdollisesti valmistetun lopputuotteen laatuun.

Keksinnölle tunnusomaisten seikkojen osalta 15 viitataan patenttivaatimuksiin.

Keksintö perustuu tutkimuksiin, joiden yhteydessä on yllättäen havaittu, että maitohappobakteereja voidaan käyttää idätettävän tuotteen laadun parantamiseen. Keksinnön mukaisen valmisteen sisältämät ja/tai 20 tuottamat aineet, so. mikrobisidiset aineet, estävät idätysprosessin yhteydessä esiintyvien haitallisten mikrobien kasvua.

Maitohappobakteerien käyttö elintarvike- ja rehuteollisuudessa on hyvin tunnettua. Ne tuottavat 25 fermentointiolosuhteissa tuotteiden koostumukseen ja : makuun vaikuttavia, mutta myös tuotteita pilaavien pa togeenisten mikrobien kasvua estäviä yhdisteitä. Maitohappobakteereja on käytetty yleisesti maitotuotteissa, lihatuotteissa, vihannesten fermentoinnissa ja 30 leipomotuotteissa sekä rehun säilönnässä.

Maitohappobakteeri- tai maitohappolisäystä on .. käytetty erään mallastyypin, ns. Sauermalz'in, valmistuksessa. Lisäys suoritetaan maltaaseen kuivausvaihees-sa ennen mäskäystä tai mäskäyksen aikana. Lisäyksen 35 tarkoituksena on ainoastaan aikaansaada vierteen pH:n alentuminen ja siten vaikuttaa mäskäysprosessin kulkuun ja valmiin oluen laatuun. Maitohappobakteereja ei ole 5 94875 kuitenkaan aiemmin käytetty keksinnön mukaisesti estämään ei-toivottua mikrobien kasvua idätysprosessin yhteydessä.

Keksinnön mukainen valmiste voidaan lisätä 5 idätettävään tuotteeseen missä tahansa idätysprosessin vaiheessa.

Eräässä erityisen edullisessa sovellutuksessa maitohappobakteerivalmistetta tai maitohappobakteerin tuottamaa valmistetta, jolla on mikrobien kasvua estä-10 vää vaikutusta, lisätään viljamateriaaliin kuten ohran-jyviin mallastusprosessin aikana. Lisätty valmiste rajoittaa homeiden, erityisesti haitallisten Fusarium-homeiden, ja bakteerien kasvua, jonka seurauksena esim. Fusarium-homeesta johtuva oluen ylikuohuntariski piene-15 nee. Valmiste ei kuitenkaan vaikuta oleellisesti hyöty-mikrobiston toimintaan saadun maltaan tai siitä valmistetun oluen laatua ajatellen. Lisätyllä valmisteella ei ole myöskään havaittu haitallisia vaikutuksia maltaan laatuun eikä sen ole havaittu sisältävän tai tuot-20 tavan maltaan tai oluen kannalta haitallisia yhdisteitä .

Mallastusprosessissa maitohappobakteerival miste tai maitohappobakteerin tuottama valmiste voidaan lisätä ohranjyviin ennen liotusta, liotusvaiheessa tai 25 idätysvaiheessa. Lisäys suoritetaan edullisesti liotus- ♦ * - tai idätysvaiheessa. Mallastusprosessi voidaan suorittaa muilta osin sinänsä tunnetulla tavalla. Haluttaessa mallastettavaan ohraan voidaan lisätä esim. ravinteita tai olosuhteita voidaan säätää, esim. lisätä maitohap-20 poa, maitohappobakteerien kasvuolosuhteiden optimoimiseksi .

Keksinnössä voidaan käyttää mitä tahansa yleisesti saatavaa maitohappobakteeria, jolla on mikrobien kasvua estävää vaikutusta. Käyttökelpoisista 35 maitohappobakteerisuvuista mainittakoon Lactococcus-, Leuconostoc-, Pediococcus- ja Lactobacillus-suvut. Edullisina lajeina mainittakoon Lactococcus lactis.

6 94875

Leuconostoc mesenteroides. Pediococcus damnosus, Pe-diococcus parvulus. Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus curvatus ja Lactobacillus plantarum tai näiden seokset, joista erityisen edullisia ovat Lactobacillus 5 plantarum ja Pediococcus pentosaceus tai näiden seokset. Myös geneettisesti muunneltujen maitohappobakteerien käyttö on mahdollista.

Maitohappobakteerivalmiste voi koostua kasvu-liuoksesta soluineen, soluista tai konsentroidusta kas-10 vuliuoksesta soluineen. Maitohappobakteerien tuottama valmiste voi koostua soluvapaasta kasvuliuoksesta, konsentroidusta kasvuliuoksesta, fraktioidusta kasvuliuoksesta tai kokonaan tai osittain puhdistetusta mikro-bisidisestä tuotteesta.

15 Erään erityisen edullisen sovellutuksen mukaan käsittely suoritetaan konsentroidulla tai fraktioidulla kasvuliuoksella, joka voi olla soluvapaa tai sisältää soluja. Konsentrointi voidaan suorittaa esim. lyofili-soimalla tai haihduttamalla. Kasvuliuos konsentroidaan 20 esim. 2-20 - 40-kertaiseksi.

Fraktiointi, so. mikrobisidisten tuotteiden puhdistus, voidaan suorittaa sinänsä tunnettuun tapaan, esim. kromatografisten menetelmien avulla tai ultrasuo-dattamalla.

25 Keksinnön mukaisessa menetelmässä siemenmate- : riaaliin lisättävän, maitohappobakteeria sisältävän valmisteen tai maitohappobakteerin tuottaman valmisteen mikrobien kasvua estävä aktiivisuus vastaa esim. kasvu-liuosmäärää n. 10 - 10 000 ml/kg käsiteltävää siemeninäkö teriaalia, sopivasti 30 - 7000 ml/kg käsiteltävää sie-menmateriaalia, esim. 40 - 5000 ml/kg käsiteltävää sie-menmateriaalia. Kasvuliuoksien valmistusta on kuvattu esimerkkiosassa. On huomioitava, että valmisteen aktiivisuus on määritelty tässä hakemuksessa käytettyjen 35 kasvuliuosten avulla. Alan ammattilaiselle on selvää, että keksinnön mukaisia valmisteita, joilla on vastaavanlainen mikrobien kasvua estävä aktiivisuus, voidaan IU > tf lll I ' * Iti 7 94875 tuottaa myös muita kasvuliuoksia ja/tai -menetelmiä käyttäen.

Keksinnön mukaisesti valmiste sisältää mikro-bisidisiä yhdisteitä tai valmiste tuottaa mikrobisidi-5 siä yhdisteitä idätysprosessin aikana. Käytettäessä soluvalmistetta solujen kasvua voidaan tarvittaessa edistää esim. säätämällä olosuhteita idätysprosessin aikana tai lisäämällä ravinteita. Valmiste voi myös kiihdyttää idätettävässä materiaalissa esiintyvien 10 muiden maitohappobakteerien kasvua.

Koska maitohappobakteereiden käyttö elintarvikkeissa on sallittua ja yleisesti hyväksyttyä, myös maitohappobakteerikasvatuksesta saatu valmiste on turvallista käyttää. Maitohappobakteerit kuuluvat 15 tavallisesti idätettävien siemenien, kuten ohranjyvien, luonnolliseen mikrobiflooraan. Siten keksinnön mukainen menetelmä on mahdollisimman luonnonmukainen. Maitohap-pobakteerikantana voidaan myös käyttää siemenissä luonnostaan esiintyvää kantaa.

20 Keksinnön ansiosta esim. mallastuksessa voi daan vähentää Fusarium-kontaminaatjoista aiheutuvia haittoja kuten oluen ylikuohuntariskiä.

Keksinnön mukaisen menetelmän on lisäksi yllättäen havaittu parantavan suodattuvuutta oluen val-25 mistusprosessissa. Tämän on todettu johtuvan siitä, : että keksinnön mukainen valmiste rajoittaa myös mallas tuksessa esiintyvien haitallisten, mäskin suodattuvuutta hidastavien, esim. Leuconostoe-. Pseudomonas- ja Flavobacterium-sukuihin kuuluvien lajien määrää.

MO Erään toisen edullisen sovellutuksen mukai sesti maitohappobakteerivalmistetta tai maitohappobakteerin tuottamaa valmistetta lisätään siemenmateriaa-liin tuotettaessa ravintona käytettäviä ituja.

Esillä olevan keksinnön ansiosta haitallisten 35 mikrobien kasvua voidaan rajoittaa idätysprosessin yhteydessä. Keksintö mahdollistaa ensimmäistä kertaa biologisten keinojen käytön idätettävässä siemenessä 8 94875 esiintyvien haitallisten mikrobien kasvun estämiseksi teollisen idätysprosessin aikana.

Keksinnön mukainen menetelmä parantaa yleensäkin idätysprosessin yleistä hygieniatasoa.

5 Seuraavassa keksintöä havainnollistetaan so vellutusesimerkein, jotka on tarkoitettu ainoastaan havainnollistamaan keksintöä rajoittamatta sitä näihin.

Keksinnön mukaista käsittelyä voidaan soveltaa myös muunlaisiin idätysprosesseihin.

10 Kuva 1 esittää kuvaajaa maitohappobakteerin kasvuliuoksessa olevasta mikrobisidisestä aktiivisuudesta turbidometrisellä menetelmällä määritettynä. Testiorganismin E.aaalomerans E-396 normaali kasvukäyrä ja tuottokantojen L. plantarum E-76 ja P. pentosaceus 15 E-390 kasvuliuosten estovaikutus testiorganismin kas vuun .

Kuvassa 2 on esitetty mallastusten eri vaiheisiin lisättyjen P. pentosaceus E-390-kasvuliuosten vaikutus mallastuksen kokonaisbakteeripitoisuuksiin.

20 Kuvassa 3 on esitetty mallastusten eri vai heisiin lisättyjen P. pentosaceus E-390-solujen vaikutus mallastuksen kokonaisbakteeripitoisuuksiin.

Kuvassa 4 on esitetty kokonaisbakteeripitoi-suudet koemallastusten eri vaiheissa lisättäessä P^.

25 pentosaceus E-390 ja L. plantarum E-76 kasvuliuoksia i tai konsentroituja kasvuliuoksia ohran likoveteen.

Kuvassa 5 on esitetty kokonaisbakteeripitoi-suudet koemallastusten eri vaiheissa lisättäessä P. pentosaceus E-390 ja L. plantarum E-76 kasvuliuoksia 30 tai konsentroituja ja fraktioituja kasvuliuoksia ohran likoveteen.

Kuvassa 6 on esitetty mallastukseen lisättyjen maitohappobakteeriviljelmien vaikutus mäskin suodattu-vuuteen (Tepral-suodatus).

Esimerkki 1: ERI MAITOHAPPOBAKTEERIKANTOJEN MIKROBISI-DINEN VAIKUTUS MALLASTUKSESSA ESIINTYVIIN MIKROBEIHIN

35 9 94875

Kokeessa tutkittiin eri maitohappobakteeri-kantojen tuottamien valmisteiden mikrobisidistä vaikutusta mallastuksessa esiintyviin mikrobeihin. Valmisteina käytettiin steriilisuodatettua kasvuliuosta.

5 1. Tuottokannat:

Tuottokantoina käytettiin maitohappobakteeri- kantoja :

Lactobacillus lactis ssp. lactis VTT-E-90414 (E-414) 10 ssp. diacitilactis VTT-E-90423 (E-423)

Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides VTT-E-90389 (E-389) ssp. mesenteroides VTT-E-90415 (E-415) ssp. mesenteroides VTT-E-90466 (E-466) 15 Pediococcus damnosus VTT-E-76065 (E-65)

Pediococcus parvulus VTT-E-88315 (E-315)

Pediococcus pentosaceus VTT-E-76067 (E-67)

Pediococcus pentosaceus VTT-E-76068 (E-68)

Pediococcus pentosaceus VTT-E-88317 (E-317) 20 Pediococcus pentosaceus VTT-E-90390 (E-390) (DSM talletus)

Lactobacillus curvatus VTT-E-90391 (E-391)

Lactobacillus plantarum VTT-E-78076 (E-76) (DSM talletus) 25 Lactobacillus plantarum VTT-E-79098 (E-98) i Kannat saatiin VTT:n biotekniikan laboratorion kantakokoelmasta.

2. Testikannat:

Testikantoina käytettiin mallastuksessa 30 esiintyviä erilaisia haitallisia mikrobilajeja sekä mm. tuottokantoina käytettyjä maitohappobakteerikantoja.

Haitallisia homeita kokeessa edustivat oluen ylikuohuntaa aiheuttavat Fusarium-homeet Γ Gibberella avenacea (ent. Fusarium avenaceum) VTT-D-80141 (D-141) 35 ja VTT-D-80147 (D-147) sekä Fusarium culmorum VTT-D-80148 (D-148) ja VTT-D-80149 (D-149), VTT:n biotekniikan laboratorion teollisuusmikrobikokoelma] sekä yksi 10 94875

Asperqillus-laii.

Haitallisia gram-negatiivisia bakteereja edustivat kaksi kantaa Enterobacter-suvusta sekä yksi laji sekä Flavobacterium- että Pseudomonas-suvuista.

5 Maitohappobakteerit koostuivat tuottokantoina käytettyjen kantojen lisäksi kannasta Lactococcus sp.

E-416.

3. luottokantojen kasvatus ja steriilisuoda-tetun kasvuliuoksen valmistus: 10 Maitohappobakteerit kasvatettiin MRS-liemessä (MRS BROTH, Oxoid). Pediococcus-suvun kannat E-65, E-67 ja E-68 kasvatettiin 25 °C:ssa aerobisesti ja muut tuottokannat 30 °C:ssa anaerobisesti kasvatusajan vaihdellessa 2-5 vrk. Sitten solut sentrifugoitiin ja 15 supernatantti steriilisuodatettiin.

4. Testikantojen kasvatus:

Fusarium-homeiden kasvuliemestä tuotettiin itiösuspensiot kasvattamalla homekantaa CMC-liuoksessa (karboksimetyyliselluloosa) 25°C:ssa, 5-6 vrk ravis-20 teluviljelmänä, rikkomalla itiömuodostelmat TWEEN-li-uoksessa, suodattamalla suspensio ja ottamalla saatu suodos talteen.

Asperqillus-homeen itiösuspensio tuotettiin suoraan PD-agarille (25 °C, 3 vrk) (Potato dextrose, 25 Difco).

.· Gram-negatiivisia bakteereita kasvatettiin aerobisesti NB-liemessä (Nutrient broth, Difco) 1 vrk, Enterobacter-kantaa 30 °C:ssa ja Flavobacterium- ja· Pseudomonas-kantoia 25 °C:ssa.

30 Maitohappobakteereita kasvatettiin kohdassa 3.

esitetyn mukaisesti.

, 5. Maitohappobakteerikantojen mikrobisidisen vaikutuksen tutkiminen:

Mikrobisidinen aktiivisuus kasvuliuoksessa 35 määritettiin kiekkomenetelmällä tai turbidometrisesti.

5.1. Kiekkomenetelmä mikrobisidisen aktiivisuuden määrittämiseksi: ·' Steriilisuodatettua kasvuliuosta tai sen lai- i · 11 94875 mennosta pipetoitiin suodatinpaperikiekolle (halkaisija 12,7 mm) 100 μΐ. Kiekot asetettiin Plate Count-agar-maljoille, joihin oli maljattu 0,3 ml testiorganismin laimennusta, 10-2. Näytteitä kasvatettiin 24 h 30°C:ssa, 5 jonka jälkeen muodostuneen estorenkaan halkaisija ilmoitettiin millimetreinä.

5.2. Turbidometrinen sameudenmittausmenetelmä mirobisidisen aktiivisuuden määrittämiseksi:

Menetelmässä käytettiin automaattista turbi-10 dometriä (Bioscreen, Labsystems).

Näyte sisälsi testiorganismia 10 til-% ja tuottokannan kasvatuksesta saatua steriilisuodatettua valmistetta 10 til-% näytteen tilavuudesta laskettuna sekä kasvatusalustaa. Kontrolleissa käytettiin sterii-15 lisuodosvalmisteen tilalla steriiliä vettä, jonka pH oli säädetty maitohapolla samalle tasolle kuin sterii-lisuodatetun valmisteen pH.

Kasvatusalustana käytettin kunkin testikannan tapauksessa samaa alustaa kuin testikannan kasvatuk-20 sessa.

Fusarium-homeilla ja Aspergillus-kannalla kasvatusolosuhteet olivat 5 vrk, 25 °C ja.voimakas ravistelu. Gram-negatiivisilla bakteereilla kasvatusolosuhteet olivat: Enterobacter-kanta 30 °C, muut 25 °C, 2 25 vrk ja ravistelu. Maitohappobakteereilla kasva-j tusolosuhteet olivat 3 vrk, 30 °C ja ravistelu.

Laitteisto määritti näytteistä absorbanssin näkyvän valon aallonpituuksilla 420 - 580 nm. Kasvatuksen jälkeen voitiin muodostaa kunkin näytteen kas-30 vukäyrä ja laskea kasvukäyrän pinta-ala.

Tuottokannan mikrobisidinen vaikutus testi-kannan kasvuun ilmaistiin inhibitioprosenttina, joka saatiin vertaamalla kontrollilla ja tuottokannan ste-riilisuodatetulla valmisteella saatua kasvualan kokoa.

35 6. Eräiden maitohappobakteerien fungisidisen vaikutuksen tutkiminen:

Kuuden maitohappobakteerikannan, E-76, E-98, 12 94875 E— 315, E-317, E-414 ja E-415, fungisidistä vaikutusta tutkittiin erikseen kaikkiin testikantoina käytettyihin Fusarium-homeisiin. Kokeessa tarkasteltiin visuaalisesti sameuden muodostumista homeviljelmissä, joihin 5 oli lisätty kustakin maitohappobakteerikasvatuksesta saatua steriilisuodatettua valmistetta erilaisina, taulukossa 3 määriteltyinä laimennoksina.

Kontrolleissa käytettiin kasvuliuoksen sijasta steriloitua Milli-Q-vettä ja maitohapolla pH 3,6:ksi 10 säädettyä Milli-Q-vettä.

Kasvatus suoritettiin koeputkikasvatuksena CMC-liemessä, 25 °C:ssa, 5 vrk ajan. Tulokset luettiin visuaalisesti.

7. Tulokset: 15 Taulukossa 1 ja 2 sekä kuvassa 1 on esitetty eri maitohappobakteerikannoille kiekkomenetelmällä ja vast, turbidometrisellä menetelmällä määritetty mikro-bisidinen aktiivisuus.

Taulukossa 3 on esitetty visuaalisesti mää-20 ritetty fungisidinen aktiivisuus.

TAULUKKO 1 . Maitohappobakteerikasvuliuosten mikro-bisidinen aktiivisuus kiekkomenetelmällä.

j25 Maitohappo- Solumäärä Kasvuliuos Estorenkaan pobakteeri PMY/ml pH halkaisija, mm E-76 3,2x108 3,70 19 E-98 1,2x108 3,72 17 E-315 1,6x108 3,90 16 *30 E-317 1,0x108 3,86 16 E-390 1,9x108 3,92 15 |

Testiorganismi E-396:n solumäärä 4,0x107 PMY/ml; maljalla 1,2x105 PMY/ml 1 3 i p '00000 £2 2 2 2 £ £22222 Γ) λ O *7 r I f I i i 5 5 0 4 ° 0 <5 <5 0 <£ 0 0 5 0 94875 •5 C. N e N Μ e o’ n‘ — «-Ι -r *· — vo cm cm — irt _ _ ΓΤ TTTT N » 2 “> <? a - g; ^ r-» Ό f> rp cn α ^ v v .

ώ 1“ 2 s s j? 5 k s? = £ ^ s ·? ^ m •C *" C __ -_____- ------ 1 _ _ M r» „ e> ro o r- - 'r - “ f: D "ί Ξ ^ 5: ? ? co cm > cncncn or co co n ' — co ' ' ‘ '

LXJ

o 00 r- co ·«· co co oo £ 2 £ — _ r- tc 2 vc „ *· Ον N i W Γ) H O O O ? *? 2 . · — co * ' ' ' 1 .= ta i| "T" T cm O O O - 00 r~ co r- vc J “ » “? £ 1 f. ' — fsj WO Cf* O' O' ^ t ^

ώ J

"s’ "g”? 52^ £ g! S ? Ϊ s SR*^2^ | . ! ώ ‘ I : g s______ j "o ^ r~ — CM o 00 co oo co £ ;r — >o O o cm £ r v ίο cm u- cm — — o o O' «?«?*? — — ,,

C &_ I I I » « III

£ UJ 2

2 SRSrJS £ o o KKv 2 “ ° ^ T ^ I

co iS

til J

_ ,__ __ ___ __ ----— — —- — o vo vo co eo βν © vo ov r- JS3 & o, r- rr VO o. O. i

p« (η 1 ** Ον PV O' ^Τ,ιΐ U

ta g~ _ Ϊ. s s ________ __ — —. — — .5“ > vO oo vo vo O O e“g 3SS οη-^ιγΓΜίο ._£ S § rv vo vö «M co E O' O' 2 *? *? "? · 3 eg if 2 ta ‘δ r ^ w m .s φ ___ _ ____ ^___ _____ M ( 5 §ov ov cv o ov o 2 gv 5· 2!52 12 T n 7 " = — τά S*® fn^r^<NfN o o» o <? f? - <n cn -* Ξ *j <? 1 1 ' «s ..

.3 UI _: .£ •, tr ·" «-------------------g =

I co vo o o r- vo asg RRS

-r fS Cl f% C4 *“ * Os O' O' I tr ri 5 *·*'· 1 ... Ξ g

> | “ M

3 2 - “.= J ΪΌ OOVOCMVOCO Ov 00 CO O. © © O CM Έ 5 .s q— (s n - 1 poolers ,*7it ?s .

? ^ t 1,1 ’ -g e -s tu .5 « g -S 1 3 ’= ·£ _ r* ζ — T~ ÖO O' vo o> r- ^ JO V° £ 2 OO O Ό 00 ^ „2222 n n n ^QiiSSSSiSS S 5? =^5 £i qqqqq lii ui ti ta ta ta ia ta ai ta ta ui j7· — >« 1 csi “ j - o 2 f a- cl I: S I S -3 3¾ a B llll -i c s | § „ I 11 s s | ||ii 2 5 ·· ® S ^ *r* ί ΐ Ϊ; C "S 3 »CC ^ — S £ Λ ö · ^ C *» 7“ C\.SC**!S — ·“ g c

i .s g * i s- § 8 -3¾ | . g s t l J 'E s| I

" .¾ 1 . 1 . f o i ^ Ϊ .S~ ^ & ε£ a s. ^ 1|-S

M = :2fc-cg-§3|&S^^S 5 s 11 -s o « s * u 'c =5 h ’s v> — vSJiEe^ c *sc“ ί 1 i * I I t I Ί I § «Il .s·*!· ·=^ιι 5 1 i s i I i i | l i 3 J S s pSii - fZ =VC OLUU.t.^ j -1 -J [ ^.“ Λ — U 94875 TAULUKKO 3. Maitohappooaktcenenkasvuliuokscncsiovaikuius oluen ylikuohunua aiheutuviin Fusununi-sicniin. + selva kasvu.

- ei kasvua

D-141 Maitohappo- KASVULIUOS

bakteerikanta laimennus __L6__IA__3j6__4^6__5A__6:6 E-76__+__+__-__;__-__- E-98__+__+__;__-__-__- E-31S__*__+__+__;__-__- E-317__+__+__-__-__-__· E-414__+__+__+__+__-__- E-4IS__+1 + 1 + 1-1-1 kontrolli_____ + jH-jcontroU^^^^^ ^^^ —j^BSSssa=s^ssB=SBSsanB^aas^BSSsssassaBssasssssss

D-147 Maitohappo- KASVULIUOS

bakteenkanu laimennus __L6__2^6__3k6__4*__5t6__6:6 E-76__+__+__;__;__-__- E-98__+__+__;__;__-__- E-315__+__+__+__;__;__- E-317__+__+__+__-__-__- E-414__+__+__+__+__-__- E-415 +__+__+__;__;__- kontrolli + pH4comroHi_^_^_

0-148 Maitohappo- KASVULIUOS

bakteenkanu laimennus __L6__2A__3^6__4^6__5*__6:6 E-76_ +__;__;__;__;__- E-98__+__+__-__-__;__- E-315__i__+__;__;__;__- E-317__+__+__;__;__;__- E-tl4__+__+__+__-__;__-

E-415__+ I + 1 - I - I - I

kontrolli + I jyi-kontroll^^^^^^

D 149 Maitohappo- KASVULIUOS

bakteenkanu laimennus __L6__2A__3^6__4JS__5j6__6:6 E-76__+__+__;__;__;__- E-98__+__+__;__;__;__- E-315__+__+__+__;__;__- E-317__+__+__+__-__-__- E-414__+__+__+__;__;__-

E-415__+ 1 + I + 1 - 1 - I

kontrolli + __nH-kontrolli ^_ 15 94875

Tuloksista nähdään, että mainitut maitohappo-bakteerikannat estävät haitallisten Fusarium-homeiden ja muiden mallastuksessa esiintyvien haitallisten mikrobien kasvua ollen vaikuttamatta oleellisesti hyöty-5 mikrobeihin. Tulokset osoittavat maitohappobakteerien käyttökelpoisuuden esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä.

Esimerkki 2: ERÄIDEN MAITOHAPPOBAKTEERIKANTOJEN MIKRO-10 BISIDINEN VAIKUTUS ELINTARVIKEPATOGEENEIHIN JA ELINTARVIKKEILLE HAITALLISIIN MIKROBEIHIN

Kokeessa tutkittiin Pediococcus pentosaceus VTT-E—90390 (E-390)- ja Lactobacillus plantarum VTT-E— 78076 (E-76)- kannoilla tuotettujen valmisteiden mikro-15 bisidistä vaikutusta elintarvikepatogeeneihin ja elintarvikkeille haitallisiin mikrobeihin. Testiorganis-meina käytettiin Bacillus-. Yersinia-. Listeria-. Pseudomonas-. Salmonella- ja Staphvlococcus-sukuihin kuuluvia kantoja.

20 Valmisteena käytettiin maitohappobakteerien steriloitua kasvuliuosta, joka valmistettiin esimerkissä 1 esitetyn mukaisesti. Kaikkia muita testikantoja kasvatettiin 16 - 18 h Iso-sensitest-liemessä (Oxoid), paitsi Listeria-kantaa. jota kasvatettiin tryptoosifos-?5 faatti-liemessä. Kasvatuslämpötila oli 30 °C, paitsi | Salmonella-. Listeria- ja Staphvlococcus-kannoille 37 °C.

Mikrobisidinen aktiivisuus määritettiin turbi-dometrisellä menetelmällä, joka on kuvattu esimerkissä 30 1 . Koe-olosuhteet turbidometrisessä määrityksessä oli vat kasvualustan ja lämpötilan suhteen edellä esitetyn .. mukaiset. Kasvatusaika oli 24 h, paitsi Bacillus- ja

Yersinia-kannoille 48 h.

Tulokset on esitetty taulukossa 4, josta voi-35 daan havaita, että keksinnön mukainen maitohappobakteerivalmisteen lisäys estää elintarvikepatogeenien ja elintarvikkeille haitallisten mikrobien kasvua.

94875 TAULUKKO 4. P. pentosaceus E-390:n ja L. plantarum E-76:n aiheuttama kasvun esto.

Tuottokannat E-390 E-76

Testiorganismit Kasvun pinta-alan pieneneminen (%)

Bacillus cereus 93 80 ATCC9139_*)___

Yersinia enterolitica 85 54 ELI351_2___

Listeria monocytogenes 41 49 KTL4126 ' *)___

Pseudomonas fluorescens 89 97 ELI97___

Pseudomonas fragi 84 93 ATCC4973___

Salmonella infantis 90 98 ELI5_2___

Staphylococcus aureus 73 86 ELI200 -) *) Elintarvikkeessa esiintyviä patogeenejä ATCC; American Type Culture Collection ELI; VTT, Elintarvikelaboratorio KTL; Kansanterveyslaboratorio : « 94875 1 7

Esimerkki 3; MAITOHAPPOBAKTEERIVALMISTEIDEN JA MAITOHAPPOBAKTEERIEN TUOTTAMIEN VALMISTEIDEN VAIKUTUS MAL-LASTUKSEN MIKROBIFLOORAAN JA MALTAAN LAATUUN

1. Käytetyt kannat: 5 Kokeessa käytettiin Pediococcus pentosaceus VTT-E-90390 (E—390)-maxtohappobakteerikantaa.

Kasvuliuoksena käytettiin MRS-lientä. Viljelmät olivat tuoreita, kahdesti nuorennettuja. Nuoren-nuksissa bakteereita kasvatettiin 10 ml MRS-liemessä 10 anaerobisesti, lämpötila 30 °C. Siirrostilavuus oli 1 % kasvuliuoksen tilavuudesta.

2. Ohra:

Ohrana käytettiin satovuoden 1990 Kymppi-ohraa, jonka Fusarium-homeilla kontaminoitujen jyvien 15 osuus oli 55 %.

3. Mallastusprosessi: 1000 g ohraerät upotettiin huuhtelua varten 12 °C vesihauteeseen 1 h ajaksi. Huuhteluvesi vaihdettiin ensimmäiseksi likovedeksi, joka puolestaan vaihdettiin 20 5 h kuluttua toiseksi likovedeksi. Kuivaliko aloitet tiin tästä 16 h kuluttua. Kuivalion tarkoituksena oli poistaa vesi jyvien pinnalta. Kuivaliko kesti 8 h. Ohra saavutti likojen aikana 44 % kosteuden. Ohria ilmastettiin koko liotuksen ajan.

25 Likoa seurasi idätys. Ohria idätettiin idätys- } kaapissa 6 vrk, 14 °C. Kosteuden pitämiseksi tasolla 44 % ohraeriä kostutettiin ja käännettiin päivittäin.

Saatu vihermallas kuivattiin 21 h lämpötilaohjelmalla. Kuivauksen alussa lämpötila oli 50 °C 4,5 h ajan. Seu-30 raavan 4,5 h aikana lämpötila nostettiin 60 °C:een, jossa sitä pidettiin 4 h. Lämpötilaa nostettiin edelleen tasaisesti 5 h aikana 85 °C:een asti, jossa sitä pidettiin loput 3 h. Maltaan loppukosteudeksi tuli n. 4 %. Lopuksi maltaista poistettiin juuri-idut mekaanises-35 ti.

Kontrollikokeena käytettiin mallastusta ilman mitään lisäystä.

18 94875 4. Maitohappobakteerivalmiste ja maitohappo-bakteerien tuottama valmiste:

Valmisteina käytettiin kasvuliuoksesta erotettuja maitohappobakteerisoluja ja mikrobisidisiä 5 yhdisteitä sisältäviä kasvuliuoksia yhdessä ja erikseen. Kasvuliuosta soluineen lisättiin 120 ml/kg ohra tai solut erotettiin 120 mlista kasvuliuosta. Erotus suoritettiin kasvuliuoksesta sentrifugoimalla ja solut suspendoitiin veteen. Kasvuliuosta lisättäessä liuos 10 käytettiin sellaisenaan. Lisättävien valmisteiden so-lumäärä oli suuruusluokkaa n. 10® -10® pmy/ml.

5. Maitohappobakteerivalmistelisäykset:

Maitohappobakteerivalmistelisäykset suoritettiin joko ohraan, I lion alkuun, I ja II lion alkuun 15 tai idätyksen alkuun.

6. Suoritetut analyysit: Näytteitä otettiin kustakin mallastusvaihees-ta.

6.1. Homeet määritettiin seuraavasti: Fusa- 20 rium-homeilla kontaminoitujen jyvien prosenttiosuus määritettiin Fusarium-homeille selektiivisellä CZAPEK IPRODION DICLORAL-agarilla (CZID-agar) ja kostealla imupaperialustalla (IP, EBC-Analytica Microbiologica, osa II, 1987). Fusarium-homeet tunnistettiin tyypil-25 lisen pesäke- ja itiömorfologian ja punaisen värin • perusteella.

Aspergillus- ja Penicillium-homeet määritettiin selektiivisellä mallassuola-agarilla (EBC-Analytica Microbiologica, osa II, 1987). Muut yleisimmät 30 homesuvut määritettiin kostealla imupaperialustalla.

6.2. Maitohappobakteerit määritettiin MRS-aga-. rilla sekä lisättävien viljelmien että mallastusnäyt- teiden tapauksessa.

6.3. Kokonaisbakteeripitoisuudet määritettiin 35 Plate Count -agarilla (Difco).

6.4. Maltaan kemialliset ominaisuudet määritettiin mallastuksen yhteydestä tunnetuilla menetel- 19 94875 millä (EBC-Analytica, 1987, 4.painos).

7. Tulokset:

Taulukossa 5 on esitetty Fusarium-homeiden sekä maitohappobakteerien pitoisuudet mallastuksen eri 5 vaiheissa lisättäessä E-390-kasvuliuosta.

Kuvissa 2 ja 3 on esitetty kokonaisbakteeri-pitoisuudet mallastuksen eri vaiheissa E-390-kasvuli-uoksille sekä E-390-soluille.

Taulukossa 6 on esitetty mal-10 lasanalyysitulokset, kun mallastukseen on lisätty E-390-kasvuliuosta tai E-390- soluja.

t # i 20 94875 TAULUKKO 5. M alistuksen eri vaiheisiin lisätyn P. peniosaceus E-390 kasvuliuoksen vaikutus mallastuksen Fi/viinuM-sienipitoisuuteen ja maitohappobakteerien määrään.

__Fujarium-homeet (kontaminoituneiden jyvien osuus. %)_

Lisäysvaihe Ohra Liko Idätys Mallas_

Kontrolli 55 72 96 25__ 120 ml kasvuiiuosta ohraan 3 6 77 3 120 ml kasvuiiuosta 1. likoon 55 62 98 14 120 ml kasvuiiuosta 1.+ 2. likoon 55 42 90 9___ 120 ml kasvuiiuosta idätykseen 55 78 91 3 __Maitohappobakteerit (solutiheys, pmy/g)_

Kontrolli__6,0x10*_ 3,4x1ο2 2,2x1ο4 3,0x10*_ 120 ml kasvuiiuosta ohraa__1,2x10*_ l.lxltf 2,2x10* 1,8x10*_ 120 ml kasvuiiuosta 1. likoon 6,0x10' 3,lxl07 2,8xl07 l,4xl07 120 mi kasvuiiuosta 1. + 2. likoon 6,0x10' 7,4xl07 8,3xl07 5,3xl07__ 120 ml kasvuiiuosta idätykseen 6,0x10' 1,5x10* 2,7x10* 2,6xltf 21

= 3 ^ «r, r- O — — κ> Os »O <Λ Q / ö 7 C

r*-i m m n J/ \ \J I

-S * 's* ko o ό » * " S

rStjS^VOVO — \0 00 V*1 ^ 2 i^ic a «D n n n n n ri ri n m y> ►*v»:=3öcrs -rr so os ^ E: S? 2: ,p«t5.*2ioOO-eo»r» γμ oc r- r- Ö#ia>3 n N - - - — — — e .i

lii ts $ Ϊ J « S SKSS

>> 'G « O C e ^ λ rsi O VO © &> ©s O' — — SJii'Sj'^eoeot'-eo^ f- Γ- βο βο Ζ. ^γλ ro — οο © r^ » < *?> \© y) r- νο cm © jr ji Z ο· — ο β» βο ^ «τ> ..·.

]»w ^ vo *o vo vo vo vo .

y 3 , β O © © O © © © »..

I 111¾ V v v v v v . . v :...: « ·♦*.

e .S .5 1 i e :*;*; "s S e o SQ g . ’ • § e a fSS2o2 £ I :·. : a 1/)3 ·&, E n w π w ^ to I i γί » » .2 ,, — 5 M M M M «2 > c « · «I ^ S ί I « S ί ί 8. ί 8.

*5» £«3 Μ Μ Μ Λί O M t * O

’O I — — — — — — —~ 1 11

M

m 'c 8 So ”** ·Ί ®L ®i “ “ ®i. ®i.

o Du SRrJrTrinv isiics .= _________ - ___ "Ξ > a *> ·

jc 3 ,* »o r» «n Ok 'O

o o -, r*-* r-‘ p»‘ «Γ V £- g σ> O' iP t-· r- r- p~ r~ r- > > r~ Ο ____ ώ--- *2 C « ο υ ^ vo O O ci *o 5 j3 »» o o o o £ 2 2 2 3 l£ oo go oo oo r-* go · · r- e - ------- ft.

C o S — fo <n r\ <n r»e ργ

c >c B fcR V V V V V

^ --- — ;« ΐ , = S .-= is £ £ £ S 1 1 :s w> -3 c Φ» ιβο *C .——— —— 1 ‘ "" ““ — ““ ~ ”™ > o g •E ±* c 5 5 2 g “ « ε - u sis 8 < gi?£· £ +·β £- + .-5 = -g - - 2 I · · !g ^ *535 ~ ** ~* -* 3

m S S O S J* ί* Jf Jf O

Σ I .2 .2 .2 P I* E E ^ * 1555 e-te.p.1 O SSSS t t Ϊ* t

^ C.3“3‘C

= » 2 Έ Έ E E .8. -I -a.

d 5* i ?,?.?. ?. -5 ö J C

3 jr “2 — — — — «/5 tn (Λ ΙΛ < _____ + 111,1 22 94875

Saaduista tuloksista voidaan havaita, että keksinnön mukaiset käsittelyt vähentävät erityisesti Fusarium-homemäärää ja kokonaisbakteerimäärää mallas-tuksen eri vaiheissa.

5 Maitohappobakteerivalmisteen lisäys ei vai kuttanut haitallisesti maltaan laatuun. Päin vastoin, keksinnön mukainen käsittely paransi vierteestä saadun mäskin suodattuvuutta ja alensi maltaan B-glukaanipi-toisuutta.

10

Esimerkki 4: MAITOHAPPOBAKTEERIEN TUOTTAMIEN VALMISTEIDEN VALMISTUS

1. Konsentroidun kasvuliuoksen valmistus:

Tuottokannat, Pediococcus pentosaceus VTT-E- 15 90390 (E-390) ja Lactobacillus plantarum VTT-E-78076 (E-76), kasvatettiin fermentorissa 15 1 tilavuudessa.

Siirrostetilavuus oli 6 % - 7 %, kasvatus tehtiin MRS-alustassa, 30 °C:ssa, 2 vrk mikroaerofiilisissä olosuhteissa. Kasvuliuokset konsentroitiin 10- ja 20 kertai- 20 siksi lyofilisointi- ja haihdutusmenetelmällä. Konsent-raattien mikrobisidinen aktiivisuus todettiin kiekko-menetelmällä.

2. Puhdistetun, mikrobisidisiä yhdisteitä sisältävän liuoksen valmistus: 25 Maitohappobakteerin kasvuliuos puhdistettiin • geelikromatografisesti fraktioimalla molekyylikoon mukaan. Kiekkomenetelmällä ja turbidometrisesti mikro-bisidisesti aktiivisiksi todetut fraktiot kerättiin ja ajettiin uudelleen geelipylvään läpi.

30

Esimerkki 5: MAITOHAPPOBAKTEERIVALMISTEIDEN JA MAITO- *; HAPPOBAKTEERIN TUOTTAMIEN VALMISTEIDEN VAIKUTUS MAL-

LASTUKSEN MIKROBIFLOORAAN JA MALTAAN LAATUUN

1. Käytetyt kannat ja kannoista tuotetut val- 35 misteet: Käytettiin bakteerikantoja:

Lactobacillus plantarum VTT-E-78076 (E-76)

Il i II I ll|i I < liri 23 94875

Pediococcus pentosaceus VTT-E-90390 (E-390)

Kannat saatiin VTT:n biotekniikan laboratorion kantakokoelmasta.

Valmisteet tehtiin esimerkissä 1, kohdassa 3., 5 esimerkissä 3, kohdassa 1. ja 4. ja esimerkissä 4, kohdissa 1 ja 2, esitetyn mukaisesti.

2. Ohra: Käytetty ohra oli satovuoden 1991 Kymppi-ohraa .

10 3. Mallastusprosessi:

Mallastus suoritettiin esimerkissä 3 esitetyn mukaisesti, mutta idätysvaihe kesti 8 vrk. Maltaan loppukosteudeksi tuli alle 5 %.

4. Mallastus: 15 Suoritettiin kaksi koemallastusta. Kontrolli- kokeena käytettiin mallastusta ilman lisäyksiä.

4.1. Ensimmäinen mallastus:

Koemallastuksessa valmisteina käytettiin 10-kertaiseksi konsentroituja kasvuliuoksia ilman soluja 20 ja käsittelemätöntä kasvuliuosta soluineen. Valmistetta lisättiin I lion alussa tai I ja II lion alussa. Mal-lastuskokeet 1-8, suoritettiin seuraavasti:

Koe nro 1: Kontrolli Kymppi-ohra 1991;

Koe nro 2: I ja II lion alussa lisätään 120 ml E-76 2b kasvuliuosta soluineen; ‘ Koe nro 3: I lion alussa lisätään 120 ml 10-kertaiseksi konsentroitua E-76 kasvuliuosta;

Koe nro 4: I ja II lion alussa lisätään 120 ml 10-ker-taiseksi konsentroitua E-76 kasvuliuosta; 30 Koe nro 5: I ja II lion alussa lisätään 120 ml E-390 kasvuliuosta soluineen; *, Koe nro 6: I lion alussa lisätään 120 ml 10-kertaiseksi konsentroitua E-390 kasvuliuosta

Koe nro 7: I ja II lion alussa lisätään 120 ml 10-ker-35 täiseksi konsentroitua E-390 kasvuliuosta;

Koe nro 8: I ja II lion alussa lisätään 60 ml E-76 kasvuliuosta soluineen ja 60 ml E—390 kasvuliuosta 24 94875 soluineen.

4.2. Toinen mallastus:

Koemallastuksessa valmisteena käytettiin 20-kertaiseksi konsentroituja kasvuliuoksia ilman soluja, 5 puhdistettuja mikrobisidisiä fraktioita ilman soluja ja käsittelemätöntä kasvuliuosta soluineen. Likoveden pH:ta säädettiin. Valmistetta lisättiin I ja II lion alussa. Mallastuskokeet 9-16 suoritettiin seuraavasti : 10 Koe nro 9: Kontrolli Kymppi-ohra 1991;

Koe nro 10: I ja II lion alussa lisätään 120 ml vettä, pH 3,8;

Koe nro 11: I ja II lion alussa lisätään 120 ml E-76 kasvuliuosta soluineen; 15 Koe nro 12: I ja II lion alussa lisätään 120 ml E-76 fraktioitua konsentraattia, pH 3,8;

Koe nro 13: I ja II lion alussa lisätään 120 ml 20-kertaiseksi konsentroitua E-76 kasvuliuosta;

Koe nro 14: I ja II lion alussa lisätään 120 ml E-390 20 kasvuliuosta soluineen;

Koe nro 15: I ja II lion alussa lisätään 120 ml E-390 fraktioitua konsentraattia, pH 3,8;

Koe nro 16: I ja II lion alussa lisätään 120 ml 20-kertaiseksi konsentroitua E-390 kasvuliuosta.

25 5. Suoritetut analyysit: Näytteitä otettiin kustakin mallastusvaihees-ta.

Homeet, maitohappobakteerit, kokonaisbakteeri-pitoisuudet sekä maltaan fysikaaliset ja kemialliset 30 laatuominaisuudet määritettiin esimerkissä 3 esitetyn mukaisesti.

’ 6. Tulokset:

Kuvissa 4 ja 5 on esitetty kokonaisbakteeripi-toisuudet mallastuksen eri vaiheissa käytettäessä mai-35 tohappobakteerien kasvuliuoksia soluineen tai konsentroituja tai fraktioituja kasvuliuoksia ilman soluja likovesissä.

25 94875

Taulukoissa 7, 8, 9 ja 10 on esitetty Fusa-rium-homeiden ja muiden homeiden sekä maitohappobakteerien pitoisuudet mallastuksen eri vaiheissa molemmissa mallastuksissa.

5 Taulukoissa 11 ja 12 on esitetty mallasanalyy- situlokset molemmista mallastuksista.

26 94875 •'2 οοτΤ^-ΌΙΝΟΟίη — γ·>0©©00©

^ (N N - Γ~ IN

s ---------------- •5 r~ oo — \o — — no © ~ oo © © © — o C — — O' 3 _____________________ __

2 \ot~OOIN — OI^OOI^OOOOO

.p — IN 00 IN J.

w " _

H· ΙΛ ΙΛ ^OOf1^ - f^ooOr^ - OOOOO

'Z (sjr^r^eomOvOOvO — vOOOOOO

g «η Γ4 <M — r- <N

·* 2---------------- — ®—.\OO00(Nr4O</lO — 00OOO — o

= s IM PI — « IN

c ----------------- « ΟΟττνΟΟ'ϊ-'ΤΟ'ΤΟΙΝΟΟΟΟΟΟΟ — on on — in — m υ > — — — — — —-—— ------ J2 Ρ^ΟΟ<ΝΌΌΟ^ΟΟΟΟΟΟΟ(Ν<Ν • — on oo mm m m c ---------------- 2 vooooisraoo^oo^ooorao .c oo r- f***! — ^ »n O __________ _____ __ te "**™ ♦J· »nxO^OfS^O^OOOOOOiN© 2 ^ oo - ^ - N vr> (Λ ____ — τ}·ΤΤΙΝΙΝΟΙΝΟ·νΐΝ<ΝΙΝΟΟΟΟΟ « On 00 OO m NO "f NO — —

^ moOOOOINOOOOOOOOOOINO

t£j 00 00 ΊΤ IN NO

s ---------------- 3 {ΜΟΟΙΝΟΟνΟΟΟΟΟ'ΤΟΟΟΙΝΟ ^ 00 00 — IN — Ό

-S — (vj'rooiNNOOOOOooOOO'NtO

a. ,-j r~ oo - t- ^ £ -j — « -----------------

oOOOOO'nt-nJ-OO'J-OOOOOOINO

g no r- in in im m rn --------------— — ω Ρ'ΟΟΙΝΙΝΟΟ'ΤΟΟΟΟ'ΝΤΟΟΟΙΝΟ fc, -v n — in ·ντ — 3 ________ __

e NOO'flNf^OO'i’OOOOOOOO

ti ---------------- I

U-tNOOÖNONOOINOOOOOOfN© >« in m in tn in — tfj «Λ _________ — - --- — - — 4) ----------- *2 ηΟΌΝ^'ΰίΝΟΟΟΟΟΟΟΝΟ ,13 Ό TT —

Ui ________ — - — . - -

e NtNoooOOO^OO^OOONO

Ei* —^ 00 t— IN IN

«λ 2 E

^ s js

2*5 O

2 « __^_BB— — — — — —__ ee 3 l> t Σ £ ^ Λ = -2

. S ΙΞ £ S - e S

f- E Z o_N ‘C a a a. -S S _

Oc s .= a e .¾ g s s s .* = S S ϊ "a a-a ij ii u S.2 ¢^¢£,1,-5 2.5 5¾¾¾^ 3^ 1 | H U π M n hM! 5 (>N =£ ί_ζ -------- --111- 1 1 ' 1 27 94875 TAULUKKO 8. Mallastuksen maitohappobakteenpitoisuus (PMY/g) lisättäessä P. pentosaceus E-390 ja L. plantarum E-76 valmistelu ohran iikoveteen.

Näytteiden numerointi esimerkissä 5.

Näyte Liotus__Idätvs__Mallas 1 __5.5x10*__3.3x10*__2.5x10* 2 __7.3x10*__1.2xl07__5.5x10* 3 __1,4x10*__4,4x10*__1,1x10* 4 __3,2x10*__1,4x10*__9,5x10* 5 __1.3xl07__7,5x10*__2,6x10« 6 __4,8x10*__5,0x10*__4,0x10« 7 __7,3x10*__2,4x10*__2,6x10* 8 l,2xl07 l,4xl07 2.3x10«

Ohran maitohappobakteenpitoisuus 7,5x10* PMY/g.

94875 28 Ι,Έ_Ι_ r”" — ““ 1 " 2 νβ^ — ,^ο — oooor~ooooo >^ — — — tN O' — —> 3 ---------------

c — ό ^ N — «— oo v> 3 _

S ^xO^-Ch^-OmrnOOOOOOO

.“ — — <N — — On r- E ___- — - ------------—- ? p-, — — (N — [~-Ο00ΟΟ!~ΟΟΟΟΟ o — O' -* __________________ *R pvi af r~. m — — o — — OPJOOOO© g M — — *— ©S VT) v " ” “™" ““ "" ™™

.tS -«f-vO^NOOOOO^OOOOOOO

O — m m (N

3 O00 — NOfnOOoo^ — eoooo — — ’ li — rj m — (N f- *· tA Zl ^ -------— — — — — — — — •3 .SotPioor—vi — mOOOOOOO©© 3 *£ <n m — — oo t s ----------------

Jj ΌΓΝΌΌΟΟΟΟΌΟΟΟΟΟΟΟΟΟ ϋ — r~ νι v rj Ό v) u _____ > ------—--—-------— 3 vi^cj^OOOOrJrJOO^o^ro — — o» O' — po v> ό

^ aJ-O(NOOfSOlNOO00OOOTrO

-C a οι ei n n P» 0 * — .·= p*'0'<sOTj-TrovotsoOOOOoo *> — in — v> r-

Vl _____ _ _ _ _ _ _____ _ ___

— psjoOO^PPJOOOiNOrJOOOOO

— on vO ts v — oo — Ό --—------------ P"· — ^ΡΊ^ΤΌΡΊΟΡΊΟΟΌΟΟΟΟΟ UJ — O' O' — v» VI Ό — a o'coopNoo'oo^tooooooo·^

^ — oo o> — — VI

tS _ ^^^B ^^^B BBB· ^^^B ^^^B

5 >,0' 00 00 00(Μ^·ΟΌΟΟ'02θΟΟΟ o. — O' O' vi— m ό ·*τ aj — « ---- —-——--—~---—— "Τ' 'OOOPJ'r^frJOCJOOOOOOO© o - « N - t t «s n --------------—-— ——

JJ uaOOOO-V-VOOOOOOOOOtSO

V, — n (N N ^ M N

g ----——-—---------

e afaf'O'i'OOOOrJOOOOOOOO

£ — "V (N PJ P1 — ΓΊ o ________________

£ BIOOOOOO'VNOOOOOOO

a. — — r~ — o; ---------------- i

«MOVO^OOf^OOOOOOOfMO

i« —en — — n — —

JA

tA _____-— — - - - - li — — —- — — ‘5 — (so^rT^Ofsofs-^-ooooo ,£ — n ρί ρί pi — ^ tn ___________________

x o-vootsooooOPJOOoooOOfSO

£ — oo r~- — pj J O----------------

TJ r^osoooovoooOOOOOrJOOO(NO

S J r* r- — ** — tn ____ C 5A ____ —- __ __ —Ι,Β. I I II - - — —^ - ' ' "' —^ m VI —B-^— “^2 vnOMDr-p-OOOtNOOOO^ — « t- n m ro <n rt — — ä a s 1-1 o A li ________

Jfl .B ———. — I ' —— — — — - — — '" - — - "eS S D 5 ^ s ·* · «. a ^ C .5* Ö ft ’Ξ -s s t § Il 5 Sä! . . «

s S = t u .5 ! '1 . | I ! i s ! I I

*J «·= 3^ a1- ->2 5* ^^ä-saS-s-S^-ji&gi = £ =l2 ^c!!G£5i5UJ^xt=T^2 HZ I ' ! - ! 1 1 ; j||} dii*3 I i t (tl 29 94875 TAULUKKO 10. Mallas tuksen maitohappobakteeripitoisuus (PMY/g) lisättäessä P. pemosaceus E-390 ja L. plant arum E-76 valmisteita ohran likoveteen. Näytteiden numerointi esimerkissä 5.

Näyte Liotus__Idätvs Mallas 9 __8.0x10*__4.2x10*__8.0x10* 10 __8.0X102__5.0x10*__5,6x10* 11 __2.7xl07__2,lxl07__8.5x10* 12 __2.2x10*__3.4x10*__2,5x10* 13 __1.2x10*__1.4xl07__2.3x10* 14 __4. lxlO7__3.Sxl07__1.1x10* 15 __4,8x10*__4.8x10*__3.9x10* 16 3.5x10* 2.1x10* 1.7x10*

Ohran maitohappobakteeripitoisuus 7,5x10* PMY/g. 1 30 94875 O in «N 2 _ V/-J _ (Μ ,« 00 ®i _- r-* -: « -e £ £ "3 $ - £ 3 - 5 .2 n “ " " Ϊ - S " .* h· 4> E _________________ .-f

CO

V

Ο ιλ On O

2 I- ®j o ^ £ d -S δ £ °1 *Ί g 2 £ S 2 S

g a ·* «*> rs

3 C

C __- ---__ _ — — —-—- -— —- —-— v ΓΞ

'Z

2 er?«^-»ii!2S"*--S2r-«2» *a ·* r> n c s 3 ___________ __ _____ — —— A — ““ —.

A

£ a «* m fM

*> (Λ — 3 >" «3 IA __ - __ __ __ ---_ _ _ _ --- _ — — — 3 jr —- — — ^ *· '5

> © V3 © tO

“ n"gtS’» = ^?"-!2-°-t''0-S

5 e m N

2 « __________ *·· ^^BB ^^^B ^^^B BVB· B^^B ^BBB ^^^B B·^^ s .¾ j - j s p ; ; I 1 I » s. s s s 5 s § A — -3<NVOV> — ^ JT* a ·* m γί © m

____ _____ ^^BB B^^B ^^^B a^B— ^BBaBA ^^^B

m ----- «<) S oo^SS^wjjgaj.rr—._ eoar = - * 5 * 3 · ΐ δ δ *. e. · S ? * ί ?

*» Λ ^ (Π M

5 I

O. ______ O] c .ϋ

: A C C

.2 «· * gg -- m I * * £ EE % E E « 3 => >

iZ

_ ·- . s J C e >r S' I

S3 -Ξ ^ .1 .1 = = - 1 '1 -i .. * S .1 I |·“ε£&Έ’1’Ε-5«1 ^ ·χ «asslsssslj-ga^s 9 — ϋι7ΪΓύωΐ:·2·3"^:-=?>-Ξ= — J c ϊϊΈπΒ-ίί.ϊΕΐ.Ε.ΐΜβ'2^?*® ^ < äZ333cn>MM>>«».>2Se<a i— 1L__^_—±—=±=J^^Ä^^s^==a=Ä=s^^===^=s^^==i 31 I , , , I I I I I I I I I I I I I I 94875 tj- — —. — ed^ — ΟΝΓ^νΟΟ^,ρ^·"·00

" S 5 ο «λ !· » ΐ δ ί ^ ϊ; 2 ? 5 2 S

'J* ;, w " 4) _____... ____ — — --- 1 2 s - 5 e -g S 55 ®;. 3 5g 2 S K 2 5 c ___—— C ——— 1) .*2 5 0^0"» I Ϊ 5 5 Ϊ* 5 i ! fi g 5 :· R ! s s s R : ^ e n w c s 3 ___ __ « ““ _ a C Ο <fl <Λ s 1 = -f 8 p · S J 8 ? «· - s = * w h· 8 C OB *— Π «ο e β> tf! — 2 &_________________ 3 2 “ ^ *

5 O cn <N S

— .-.ΙΛΛλι*· ^•-^^WPOa.ik.WM

S N ^ - - N. u Λ J; ^ Λ ΙΛ IT N S ζ N J

·§ = ^

'5> ® ^ (S

TS

i _________________ *3 > I : : I I i * ? s ! s s S s 3 c _______________ s

i s 5 s 2 S 5 i § I S 2 S 2 8 s £ S

©

On cn ______ ___— ,^- I— MMM IBHI MM *— " U3 --- 3 Q O ° I « n ’ - - I ; : s 5! ? ? « s ; s I *«8£«*:8|8§5-*2 28 j* ce — cn ^ £ ft. ____________ c

R

t2 c c .— λ «e *a *— — — m *™ -* e ^ ^ "Sc "« -5? 5 «ϊ * * &e i 11 % e E « «* => 3 u > .2 c o « 1 j js if ° II s ·“ £ £ l " 2 »" » g jj « » ό t 5 ·— aa .5 ·ϊ c c a- -.s _ S S ·- a S 1 I i 3 i ! 6 S 1 E i ϊ ] i ^ -a » S S 2 ! g Π c || . = S J j

3 s 1 ! e ! ! j 4 ! I ! i f Π I

wj ed (Λ — — — ^4>OOa>tf}QC&tOoaM

= i 3 3 ί i > Σ Ϊ u (_ 1 1 32 94875

Saaduista tuloksista voidaan havaita, että keksinnön mukaiset käsittelyt vähentävät erityisesti Fusarium-homemäärää ja kokonaisbakteerimäärää mallas-tuksen eri vaiheissa. Edelleen voidaan havaita, että 5 kasvuliuosten lisäksi erityisesti konsentroidut ja fraktioidut kasvuliuokset omaavat edullisen vaikutuksen esim. Fusarium-homeisiin nähden.

Mallasanalyyseistä voidaan päätellä, että kantojen E-76 ja E-390 kasvuliuoslisäykset vaikuttivat 10 maltaasta tehdyn vierteen suodattavuutta parantavasti, myös β-glukaanipitoisuudet ovat vastaavissa maltaissa pienempiä kuin kontrollimaltaassa.

ESIMERKKI 6: MALLASTUKSEEN LISÄTTYJEN MAITOHAPPOBAK—

15 TEERIEN TUOTTAMIEN VALMISTEIDEN VAIKUTUS MASKIN SUODAT-TUVUUTEEN

Kuvassa 6 on kuvattu eri maitohappobakteeri-kannoista saaduilla valmisteilla suoritetun keksinnön mukaisen käsittelyn (120 ml kasvatusliuos/kg ohra) 20 vaikutusta käsitellystä maltaasta tuotetun mäskin suo-dattuvuuteen.

Kokeessa käytettiin esimerkissä 1 mainittuja kantoja: E-390, E-416, E-98, E-317, E-390, E-76 ja E-315. Koe suoritettiin Tepral-suodatusmenetelmää käyttä-25 en (BIOS. 19, 1988, Grandclerc, J. et ai., "Simplifica-ί tion de la methode de filtration du brassin tepral description de la methode", s. 88-92).

Tuloksista voidaan havaita, että keksinnön mukainen käsittely parantaa mäskin suodattavuutta.

30

Claims

94875

1. Menetelmä elintarvikekäyttöön tarkoitetun, teollisesti idätettävän siemenmateriaalin käsittelemiä 5 seksi, tunnettu siitä, että siemenmateriaaliin lisätään idätysprosessin yhteydessä maitohappobakteerivalmistetta tai maitohappobakteerien tuottamaa valmistetta, jolla on mikrobien kasvua estävää vaikutusta idätysprosessin aikana.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että maitohappobakteeri kuuluu Lactococcus-, Leuconostoc-, Pediococcus- tai Lactoba-cillus-sukuun.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen mene- 15 telmä, tunnettu siitä, että maitohappobakteerivalmiste tai maitohappobakteerin tuottama valmiste on saatu Lactococcus lactis-, Leuconostoc mesenteroides-, Pediococcus damnosus-, Pediococcus parvulus-, Pediococcus pentosaceus-, Lactobacillus curvatus- tai Lacto- 20 bacillus plantarum-lajista tai näiden seoksesta, edullisesti Lactobacillus plantarum- tai Pediococcus pen-tosaceus-lajista tai näiden seoksesta.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ohranjyviin 25 lisätään mallastusprosessin yhteydessä maitohappobak-teerivalmistetta tai maitohappobakteerien tuottamaa valmistetta, jolla on Fusarium-homeiden kasvua estävää vaikutusta.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että maitohappobakteerivalmiste tai maitohappobakteerin tuottama valmiste lisätään liotus- tai idätysvaiheessa.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että maitohappo- 35 bakteerivalmistetta tai maitohappobakteerin tuottamaa valmistetta lisätään ravinnoksi tarkoitetuiksi iduiksi tuotettavaan siemenmateriaaliin. 94875