CZ285939B6

CZ285939B6 - Způsob ošetření semen pro klíčení

Info

Publication number: CZ285939B6
Application number: CZ951793A
Authority: CZ
Inventors: Auli Haikara; Tiina Mattila-Sandholm
Original assignee: Quest International Nederland Bv
Priority date: 1993-01-15
Filing date: 1993-09-27
Publication date: 1999-12-15
Also published as: JPH08505056A; UA27008C2; SK89995A3; CZ179395A3; SK281407B6; WO1994016053A1; FI94875C; BR9307847A; EP0678120A1; HUT72484A; FI94875B; EE03161B1; AU4821493A; RU2126443C1; CA2153339A1; JP3518549B2; HU9502142D0; AU680426B2; HU220583B1; FI930182A

Abstract

Způsob ošetření semen, která mají být podrobena klíčení, přídavkem přípravku z bakterií mléčného kvašení nebo přípravku produkovaného bakteriemi mléčného kvašení, majícího inhibiční účinek na růst mikrobů, v souvislosti s procesem klíčení.ŕ

Description

(57) Anotace:

Způsob potlačeni nežádoucího mikrobiálního růstu při ošetření semen pro klíčeni, spočívá v tom, že k zrnům ječmene v procesu výroby sladu nebo k semenům, která mají být přeměněna na výhonky pro účely výživy, se přidá před a/nebo během klíčení přípravek z bakterií mléčného kvašení nebo přípravek produkovaný kultivací bakterii mléčného kvašení.

CZ 285 939 B6

Způsob potlačení nežádoucího mikrobiálního růstu u semen pro klíčení

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu potlačení nežádoucího mikrobiálního růstu u semen, která mají být podrobena klíčení.

Dosavadní stav techniky

Procesem klíčení se v kontextu toho vynálezu rozumí obecně technologický stupeň, nutný k produkci naklíčeného produktu ze skladovaných suchých semen. V pivovarnickém a lihovamickém průmyslu se například proces klíčení, tj. tvorba sladu, používá při výrobě důležité suroviny piva nebo jiných alkoholických nápojů, totiž obilného sladu, jako je ječný slad, žitný slad nebo jakýkoli jiný slad. Proces klíčení se dále používá při výrobě různých komerčních kličkových produktů, například fazolových nebo jiných klíčků pro použití v lidské výživě.

Procesy klíčení se obvykle provádějí v neaseptických podmínkách. Na ošetřovaných semenech se vyskytují mikroby, pocházející z místa pěstování nebo skladování. Podmínky během procesu klíčení jsou mikrobům přítomným na semenech většinou příznivé, takže se mikroby obvykle během klíčení rozmnoží. Mikroby mohou působit nepříznivě na naklíčený produkt nebo na konečný produkt, který z něho může být vyráběn, a přitom mohou mít současně příznivý vliv na klíčící produkt.

Hlavními stupni procesu vaření piva jsou: výroba sladu, výroba mladiny, primární a sekundární fermentace a následující zpracování. Účelem výroby sladu je získat jaderné enzymy, které ve stupni vystírání rozkládají látky jaderného endospermu na formu rozpustnou v mladině. Například je známo, že proces výroby sladu z ječmene zahrnuje tři stupně: máčení, klíčení a hvozdění. Vyčištěná a prosátá ječná zrna se máčejí ve vodě do dosažení požadované vlhkosti, například řádu 43 až 44 %. Část máčení může být prováděna v tzv. vzduchovém klidu. Ječmen se nechá klíčit za kontrolovaných podmínek a naklíčený ječmen se hvozdí v proudu horkého vzduchu do dokončení klíčení. Po skončení hvozdění se ze sladu odstraní kořínky. Regulace stupňů výroby sladuje založena na teplotě, průtoku vzduchu a kontrole vlhkosti.

Kvalita sladuje ze strany techniky a podmínek jeho výroby ovlivňována také mikrobiální flórou sladové obilniny, která se významně mění například v závislosti na druhu obilniny, povětrnostních podmínkách, pěstební lokalitě, délce vegetačního období a podmínkách skladování.

Nejčastěji používanou obilninou při výrobě sladu je ječmen. Jeho vlastní mikrobiální flóru je možno klasifikovat jako polní a skladištní plísně, bakterie a kvasinky. Nejběžnějšími polními plísněmi ječmene jsou Fusarium, Altemaria, Cladosporium, Cephalosporium, Epicoccum a Helminthosporium. Výskyt plísní je různý v různých krajích a různých letech. Vlhké povětrnostní podmínky během vegetačního období obilniny a zejména v době sklizně podporují růst plísně Fusarium. Kontaminace Fusariem může být v deštivých vegetačních obdobích skutečně značná. Jedním z nej obvyklejších bakteriálních druhů na obilninách je Enterobacter agglomerans. Jako další bakterie je možno uvést Escherichia coli a bakterie rodů Pseudomonas, Micrococcus a Bacillus a bakterie mléčného kvašení. Počet bakterií na ječmeni je asi 10⁵ až 10⁸CFU/g (jednotek tvořících kolonie na gram).

Počet plísní a bakterií v ječmeni během výroby sladu vzrůstá a vrcholných koncentrací obvykle dosahuje ve stupni klíčení. Nejsilnější proliferaci podléhají zejména plísně Fusarium a bakterie mléčného kvašení. Během výroby sladu rovněž vzrůstá počet kvasinek. Při hvozdění koncentrace plísní, kvasinek i bakterií zpravidla klesá. Část mikrobů, přítomných na ječmeni, má příznivý

- 1 CZ 285939 B6 účinek z hlediska vzniku sladu a produktu vyráběného ze sladu, například piva. Odhaduje se, že až 40 až 50 % určitých enzymů ve sladu je mikrobiálního původu. Na druhé straně má část mikrobů na ječmen a/nebo slady škodlivý vliv.

Mezi škodlivými mikroby si zaslouží zmínku plísně Fusarium, o nichž bylo zjištěno, že způsobují zvlášť nežádoucí pěnění piva častěji než jiné plísně, přičemž peptidy produkované těmito plísněmi vytvářejí jádra pro hromadění a prudký únik bublin plynu z pivní láhve. Je-li plísněmi Fusarium kontaminováno více než 50 % sladových zrn, je riziko úniku zřetelně vyšší.

Kromě toho se ukázalo, že gramnegativní bakterie, přítomné v ječmeni, jako jsou druhy náležející k rodům Pseudomonas a Flavobacterium, a grampositivní bakterie rodu Leuconostoc zpomalují filtraci zápary v souvislosti s produkcí mladiny. Různé mikroby, přítomné v ječmeni, mohou rovněž vyvolávat další nevýhodné účinky, například inhibovat klíčení, způsobovat nežádoucí příchuť nebo nepříznivé změny analytických hodnot mladiny a piva.

Kvalitativní požadavky na sladovnický ječmen je možno specifikovat v ročně sjednávaných pěstebních kontraktech a dodacích lhůtách. Plísně jsou často zmiňovanou skupinou mikrobů v kvalitativních specifikacích. Mnoho sladovnických podniků navíc stanovilo na určité plísně homí hranici. Překročí-li množství zrn kontaminovaných Fusarium 65 % nebo jestliže odpovídající poměr plísní Aspergillus a Penicillium 50 %, může být ječmen klasifikován jako nízkokvalitní nebo dokonce jako nevhodný pro použití k výrobě sladu.

Byly činěny pokusy k omezení plísněmi vyvolaného pěnění použitím ječmene dobré kvality nebo míšením šarží ječmene, sladu nebo piva. V deštivých letech může mít špatnou kvalitu téměř celá úroda ječmene a získat dobrý ječmen může být v takovém případě nemožné. Ke snížení množství plísní byly zkoušeny i mikrobicidní chemikálie, ale nebylo možno nalézt bezpečnou a obecně přijatelnou látku.

Proces klíčení za účelem produkce výhonků pro nutriční účely poskytuje podobně příznivé podmínky pro proliferaci například plísní a bakterií. Takovéto kličkové produkty se rychle kazí. V souvislosti s klíčením může dále docházet ke zvýšení patogenů v potravinách, vyvolávajících otravy, jako jsou bakterie Salmonella, Yersinia a/nebo Listeria.

Použití bakterií mléčného kvašení v potravinářském a krmivářském průmyslu je známo. Za podmínek kvašení tyto bakterie produkují sloučeniny, které ovlivňují složení a chuť produktu, ale které také inhibují růst patogenních mikrobů, vedoucích ke kažení těchto produktů. Bakterie mléčného kvašení se běžně používají v mléčných výrobcích, masných produktech, produktech rostlinného kvašení a pekařských výrobcích a při konzervaci krmiv.

Přídavek bakterií mléčného kvašení nebo mléčné kyseliny se praktikuje při výrobě určitého typu sladu, takzvaného Sauermalz. Tento přídavek ke sladu se provádí ve stupni hvozdění, před vystíráním nebo během vystírání. Jeho účelem je pouze snížení pH mladiny a v důsledku toho působení na průběh vystíracího procesu a na kvalitu hotového piva. Bakterie mléčného kvašení však dosud nebyly použity k inhibici růstu nežádoucích mikrobů v souvislosti s procesem klíčení.

Podstata vynálezu

Účelem vynálezu je odstranit právě uvedené nevýhody.

Konkrétně je účelem vynálezu nalézt postup, jímž by bylo možno pečlivě regulovat kvantitu a kvalitu mikrobiální flóry během klíčení, avšak bez nepříznivého ovlivnění kvality naklíčeného produktu nebo případného konečného produktu.

-2CZ 285939 B6

Předmětem vynálezu je způsob potlačení nežádoucího mikrobiálního růstu při ošetření semen pro klíčení, jehož podstata spočívá v tom, že k zrnům ječmene v procesu výroby sladu nebo k semenům, která mají být přeměněna na výhonky pro účely výživy, se přidá před a/nebo během klíčení přípravek z bakterií mléčného kvašení nebo přípravek produkovaný kultivací bakterií mléčného kvašení.

Vynález je založen na studiích, v souvislosti s nimiž bylo neočekávaně zjištěno, že za účelem zlepšení kvality produktu podrobovaného klíčení je možno použít bakterií mléčného kvašení. Látky, obsažené a/nebo produkované přípravkem podle vynálezu, tj. mikrobicidní prostředky, inhibují růst škodlivých mikroorganismů, k němuž dochází v souvislosti s procesem klíčení.

Přípravek podle vynálezu je možno k produktu přidávat v kterémkoli stupni procesu klíčení.

Ve zvlášť výhodném provedení se přípravek z bakterií mléčného kvašení nebo přípravek produkovaný bakteriemi mléčného kvašení přidává k obilninovému materiálu, jako jsou ječná zrna, v průběhu procesu výroby sladu. Přídavek přípravku inhibuje růst plísní, zejména škodlivých plísní Fusarium, a bakterií, v důsledku čehož je například sníženo nebezpečí pěnění piva vlivem plísně Fusarium. Přípravek však nemá podstatný vliv na působení užitečné mikrobiální flóry, pokud jde o kvalitu získávaného sladu nebo z něho vyráběného piva. Nebyly pozorovány žádné škodlivé účinky přidávaného přípravku na kvalitu sladu ani nebylo zjištěno, že by obsahoval nebo produkoval sloučeniny, škodlivé z hlediska sladu nebo vyráběného piva.

V procesu výroby sladu může být přípravek z bakterií mléčného kvašení nebo přípravek produkovaný bakteriemi mléčného kvašení přidáván kječným zrnům před máčením, během máčení nebo během klíčení. Výhodně se přídavek provádí ve stupni máčení nebo klíčení.

V ostatních částech může proces výroby sladu probíhat jakýmkoli o sobě známým způsobem. Je-li to žádoucí, je možno například k ječmeni zpracovávanému na slad přidávat živné přísady nebo je možno regulovat podmínky, například přidávanou mléčnou kyselinu, za účelem optimalizace podmínek pro růst bakterií mléčného kvašení.

Podle vynálezu je možno používat jakoukoli běžně dostupnou bakterii mléčného kvašení, která je schopná inhibice mikrobiálního růstu. Jako použitelné druhy bakterií mléčného kvašení je možno uvést Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus a Lactobacillus. Jako výhodné druhy je možno jmenovat Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus curvatus a Lactobacillus plantarum nebo jakékoliv jejich směsi, přičemž zvlášť výhodné jsou Lactobacillus plantarum a Pediococcus pentosaceus nebo jejich směsi. Použití geneticky modifikovaných bakterií mléčného kvašení je rovněž možné.

Přípravek z bakterií mléčného kvašení může být tvořen kultivačním médiem, s buňkami nebo bez nich, nebo koncentrovaným kultivačním médiem (včetně buněk). Přípravek produkovaný bakteriemi mléčného kvašení může být tvořen filtrátem kultuiy bez buněk nebo frakcionovaným filtrátem kultury nebo čistým nebo částečně přečištěným mikrobicidním produktem.

Podle zvlášť výhodného provedení se ošetření provádí koncentrovaným nebo frakcionovaným kultivačním médiem, které může být prosté buněk nebo obsahovat buňky. Koncentraci je možno provést například lyofilizací nebo odpařením. Kultivační médium se koncentruje například faktorem 2-20-40.

Frakcionaci, tj. čištění mikrobicidních produktů, je možno provádět o sobě známým způsobem, například pomocí chromatografických metod nebo ultrafiltrací.

Při postupu podle vynálezu odpovídá účinnost při inhibici růstu mikrobů u přípravku obsahujícího bakterie mléčného kvašení nebo u přípravku produkovaného bakteriemi mléčného

-3 CZ 285939 B6 kvašení, přidávaného k semenům, například množství kultivačního média asi 10 až 10000, výhodně 30 až 7000, například 40 až 5000 ml/kg ošetřovaných semen. Příprava kultivačního média je popsána v příkladech provedení. Je třeba poznamenat, že v této přihlášce se účinnost přípravku definuje pomocí použitých kultivačních médií. Odborníku je však zřejmé, že přípravky podle vynálezu s ekvivalentní inhibiční účinností na mikrobiální růst je stejně možno připravit s použitím jiných kultivačních médií a/nebo postupů.

Podle vynálezu přípravek obsahuje mikrobicidní sloučeniny a/nebo je produkuje v průběhu procesu klíčení. Použije-li se buněčný preparát, je možno růst buněk podpořit, je-li to nutné, například regulací podmínek během procesu klíčení nebo přídavkem živných látek. Přípravek může rovněž urychlovat růst jiných bakterií mléčného kvašení přítomných v klíčícím materiálu.

Jelikož použití bakterií mléčného kvašení v potravinách je povoleno a všeobecně schvalováno, je použití přípravku odvozeného z růstu bakterií mléčného kvašení rovněž bezpečné. Bakterie mléčného kvašení obvykle náležejí k přirozené mikrobiální flóře semen, podrobovaných klíčení, jako jsou ječná zrna. Proto je postup podle vynálezu maximálně přírodní. Je rovněž možno jako kmen bakterií mléčného kvašení použít kmen, původně se vyskytující na semenech.

Díky vynálezu je možno při výrobě sladu snížit poškození vlivem kontaminace Fusariem, jako je pěnění piva.

Navíc se neočekávaně ukázalo, že postup zlepšuje charakteristiky filtrovatelnosti v procesu vaření piva. Bylo zjištěno, že je to způsobeno skutečností, že přípravek podle vynálezu také omezuje počet škodlivých druhů, vyskytujících se při výrobě sladu a zpomalujících filtraci zápary, například náležejících k rodům Leuconostoc, Pseudomonas a Flavobacterium.

Podle dalšího výhodného provedení se přípravek z bakterií mléčného kvašení nebo přípravek produkovaný bakteriemi mléčného kvašení přidává k semenům při výrobě naklíčených výhonků pro potravinářské využití.

Díky vynálezu je možno omezit růst škodlivých mikrobů v souvislosti s procesem klíčení. Vynález především umožňuje použít biologických prostředků k zabránění růstu škodlivých bakterií na semenech během průmyslového procesu klíčení.

Postup podle vynálezu zlepšuje obecný hygienický standard procesu klíčení i celkově.

Přehled obrázků na výkresech

Dále je vynález blíže popsán na příkladech provedení, které jsou však určeny pouze k osvětlení vynálezu, aniž by se na ně omezoval. Ošetření podle vynálezu je aplikovatelné i v jiných procesech klíčení.

Na obr. 1 je uveden graf, znázorňující mikrobicidní aktivitu ve filtrátu kultury bakterií mléčného kvašení, stanovenou turbidometrickou metodou. Představuje normální růstovou křivku testovaného organismu, E. agglomerans E-396, a inhibiční účinek na růst testovaného organismu, vyvolávaný filtráty kultur produkčních kmenů L. plantarum E-76 a P. pentosaceus E-390.

Na obr. 2 je znázorněn účinek na celkové počty bakterií při výrobě sladu při přídavku kultivačního média P. pentosaceus E-390, přidávaného v různých stupních výroby sladu.

Na obr. 3 je znázorněn účinek na celkové počty bakterií při výrobě sladu při přídavku buněk P. pentosaceus E-390, přidávaných v různých stupních výroby sladu.

-4CZ 285939 B6

Na obr. 4 jsou znázorněny celkové počty bakterií v různých stupních laboratorní výroby sladu při přídavku kultivačních médií nebo koncentrovaných kultivačních médií P. pentosaceus E-390 a

L. plantarum E-76 k vodě k máčení ječmene.

Na obr. 5 jsou znázorněny celkové počty bakterií v různých stupních laboratorní výroby sladu při přídavku kultivačních médií nebo koncentrovaných a frakcionovaných kultivačních médií P. pentosaceus E-390 a L. plantarum E-76 k vodě k máčení ječmene.

Obr. 6 znázorňuje účinek kultur bakterií mléčného kvašení, přidávaných při výrobě sladu, na filtraci zápary (filtrace Terpal).

Obr. 7 znázorňuje účinek přídavku bakterií mléčného kvašení na obsah deoxynivalenolu při výrobě sladu z ječmene kontaminovaného kmeny F. culmorum D 148.

Obr. 8 a 9 uvádějí koncentrace deoxynivalenolu při výrobě sladu za šarží finského a cizího ječmene a rovněž vliv bakterií mléčného kvašení na tvorbu deoxynivalenolu (DON) při výrobě sladu z ječmene přirozeně kontaminovaného deoxynivalenolem a plísní Fusarium.

Obr. 10 znázorňuje průměrné hodnoty koncentrací deoxynivalenolu tří domácích a tří cizích vzorků ječmene, tzn. účinek kultur bakterií mléčného kvašení, přidávaných k vodě pro první a druhé máčení, na koncentraci deoxynivalenolu při výrobě sladu z finského a cizího ječmene, stanovenou testem ELISA (Ridascreen). Výsledky jsou udány jako průměrné hodnoty.

Obr. 11 znázorňuje účinek přídavků bakterií mléčného kvašení na obsah zearalenonu při výrobě sladu z ječmene kontaminovaného kmenem F. culmorum D-148.

Obr. 12 znázorňuje účinek přídavků bakterií mléčného kvašení na obsah zearalenonu při výrobě sladu z ječmene kontaminovaného F. graminearum VTT D-95470 (D-148).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Mikrobicidní účinek různých kmenů bakterií mléčného kvašení na mikroby vyskytující se při výrobě sladu

V experimentu byl studován mikrobicidní účinek na mikroby vyskytující se při výrobě sladu, vyvolávaný přípravky, produkovanými různými kmeny bakterií mléčného kvašení. Na přípravky bylo použito sterilně filtrované kultivační médium.

1. Produkční kmeny:

Jako produkční kmeny byly použity tyto kmeny bakterií mléčného kvašení:

Lactobacillus lactis ssp. lactis ssp. diacitilactis

Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides ssp. mesenteroides ssp. mesenteroides Pediococcus damnosus

VTT-E-90414 (E-414)

VTT-E-90423 (E-423)

VTT-E-90389 (E-389)

VTT-E-90415 (E-415)

VTT-E-90466 (E-466)

VTT-E-76065 (E-65)

-5CZ 285939 B6

Pediococcus parvulus

Pediococcus pentosaceus Pediococcus pentosaceus Pediococcus pentosaceus Pediococcus pentosaceus Lactobacillus curvatus

VTT-E-88315 (E-315)

VTT-E-76067 (E-67)

VTT-E-76068 (E-68)

VTT-E-88317 (E-317)

Lactobacillus plantarum

VTT-E-90390 (E-390) (DSM 7389)

VTT-E-90391 (E-391)

VTT-E-78076 (E-76) (DSM 7388)

VTT-E-79098 (E-98)

Kmeny byly získány ze sbírky průmyslových mikroorganismů VTT (Biotechnical Laboratory, Finsko). Lactobacillus plantarum (E-76) byl uložen u DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) pod číslem 7388. Kmen E-76 (DSM 7388) byl izolován z piva známými metodami používanými pro kapalné produkty a analyzován/identifikován známými analytickými metodami. Pediococcus pentosaceus (E-390) byl uložen u DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) pod číslem 7389. Kmen E-390 (DSM 7389) byl izolován z homogenizo váných vzorků štěpených ječných zrn a identifikován/analyzován známými metodami [viz článek Haikara, A. a Home, S., Mash Filtration difficulties caused by split barley kemels: A Microbiological problém, v publikaci kongresu EBC 1991 (Quality Control)]. Uložení odpovídá předpisům budapešťské smlouvy.

2. Testovací kmeny:

Jako testovaní kmeny byly použity mimo jiné různé škodlivé druhy mikrobů, vyskytující se při výrobě sladu, stejně jako kmeny bakterií mléčného kvašení, použité jako produkční kmeny.

Škodlivé plísně byly v testech reprezentovány plísněmi Fusarium [Gibberella avenacea (dříve Fusarium avenaceum) VTT-D-80141 (D—141) a VTT-D-80147 (D-147) a Fusarium culmorum VTT-D-80148 (D-148) a VTT-D-80149 (D-149), Collection of Industrial Microorganisms, Biotechnical Laboratory of VTT] a jedním druhem Aspergillus.

Škodlivé gramnegativní bakterie byly reprezentovány dvěma kmeny rodu Enterobacter a po jednom druhu z rodů Flavobacterium a Pseudomonas. Bakterie mléčného kvašení byly tvořeny těmi kmeny, které byly použity jako produkční kmeny, a navíc kmenem Lactococcus sp. E-416.

3. Kultivace produkčních kmenů a příprava sterilního filtrátu kultury z kultivačního média:

Bakterie mléčného kvašení byly kultivovány v živném médiu MRS (MRS BROTH, Oxoid). Kmeny Pediococcus byly kultivovány aerobně při 25 °C a všechny ostatní produkční kmeny anaerobně při 30 °C; doba kultivace se pohybovala od 2 do 5 dní. Buňky pak byly odstředěny a supematant byl sterilně přefiltrován.

4. Kultivace testovaných kmenů:

Z plísní Fusarium byly vyrobeny suspenze spor kultivací kmene v roztoku CMC (karboxymethylcelulóza) při 25 °C třepáním po dobu 5 až 6 dní, dispergováním vytvořených spor v roztoku TWEEN, přefiltrováním suspenze a odebráním filtrátu.

Suspenze spor plísně Aspergillus byla získána přímo na agaru PD (25 °C, 3 dny; bramborová dextróza, Difco).

Gramnegativní bakterie byly kultivovány aerobně v médiu NB (Nutrient broth, Difco) po dobu 1 dne, kmen Enterobacter při 30 °C a kmeny Flavobacterium a Pseudomonas při 25 °C.

Bakterie mléčného kvašení byly kultivovány způsobem uvedeným v odstavci 3.

-6CZ 285939 B6

5. Zkoumání mikrobicidního efektu bakterií mléčného kvašení:

Mikrobicidní aktivita kultivačního média byla hodnocena diskovou metodou nebo turbidometricky.

5.1. Disková metoda hodnocení mikrobicidní aktivity:

Sterilně přefiltrované kultivační médium nebo jeho zředěný roztok se v množství 100 μΐ napipetuje na kotouč filtračního papíru (průměr 12,7 mm). Kotouče se umístí na agarové misky Plate Count, do nichž bylo rozlito 0,3ml roztoku testovaného organismu ve zředění 10~². Vzorky byly kultivovány 24 h při 30 °C, načež byl změřen průměr vytvořené inhibiční zóny v mm.

5.2. Turbidometrická metoda hodnocení mikrobicidní aktivity:

Při postupu byl použit automatický turbidometr (Bioscreen, Labsystems).

Vzorek obsahoval 10 % objemových testovaného organismu a 10 % objemových sterilně přefiltrovaného kultivačního média produkčního kmene, počítáno na objem vzorku, a růstové médium. U kontrol byl preparát sterilního filtrátu nahrazen destilovanou vodou, jejíž pH bylo nastaveno mléčnou kyselinou na stejnou hodnotu jako u sterilně přefiltrovaného preparátu.

Použité růstové médium bylo v případě každého testovaného kmene stejné jako při kultivaci testovaného kmene.

Podmínky růstu pro plísně Fusarium a Aspergillus·. 5 dní, 25 °C, silné třepání; pro gramnegativní bakterie - kmen Enterobacter 30 °C, všechny ostatní 25 °C a třepání; pro bakterie mléčného kvašení 3 dny, 30 °C a třepání.

Zařízení zjišťovalo ze vzorků absorbanci při vlnových délkách viditelného světla 420 až 580 nm. Po kultivaci bylo možno sestavit růstovou křivku každého vzorku a vypočíst plochu ležící pod touto křivkou.

Mikrobicidní účinek produkčního kmene na testovaný kmen byl vyjádřen procentem inhibice, získaným ze srovnání velikostí růstových ploch, zjištěných u kontrolního, resp. sterilně filtrovaného preparátu produkčního kmene.

6. Zkoumání fungicidního účinku určitých bakterií mléčného kvašení:

Byl studován fúngicidní účinek šesti kmenů bakterií mléčného kvašení E-76, E-98, E-315, E317, E-414 a E—415 zvlášť na všechny plísně Fusarium, použité jako testovací kmeny. Při testu bylo prováděno vizuelní hodnocení tvorby zákalu v plísňových kulturách, k nimž byl přidán sterilně filtrovaný preparát z kultivace každé bakterie mléčného kvašení v různém zředění, uvedeném v tabulce 3.

V kontrolních pokusech byla místo kultivačního média použita sterilizovaná voda Milli—Q a voda Milli—Q, upravená mléčnou kyselinou na pH 3,6.

Kultivace probíhala ve zkumavkách v médiu CMC po dobu 5 dní při 25 °C. Výsledky bylo možno odečítat vizuelně.

-7CZ 285939 B6

7. Výsledky:

V tabulkách 1 a 2 a na obr. 1 je znázorněna mikrobicidní aktivita, stanovená pro různé bakterie mléčného kvašení diskovou, resp. turbidometrickou metodou.

Tabulka 3 shrnuje visuelně stanovenou fungicidní aktivitu.

Tabulka 1. Mikrobicidní aktivita kultivačních médií bakterií mléčného kvašení diskovou metodou

bakterie mléčného kvašení	počet buněk CFU/ml	kultivační médium PH	průměr zóny inhibice mm
E-76	3,2.10⁸	3,70	19
E-98	1,2.10⁸	3,72	17
E-315	1,6.10⁸	3,90	16
E-317	1,0.10⁸	3,86	16
E-390	1,9.10⁸	3,92	15

Počet buněk testovaného organismu E-396: 4,0.10⁷ CFU/ml; na misce: 1,2.10⁵ CFU/ml

-8CZ 285939 B6 tJ- r*·. rf rri CM

O O O O O ’χ 7 7 7 x © O o o rf rf rf

&

i ω s© rI ω

		r-	O
7	Γ- 1	s© 1	cr 1	7
Os	Os	O	<n	Os
C*S 1	r- 1	r- 1	7	7
	n	r*		©
7	T	tn 1	n 1	l

m r- rOs Os Os m s© oo Os Os Os

I I I m Os rOs Os Os

S©	<N	00	00
tn 1	7	tn 1	tn 1
so		r-	r-
tn 1	7	tn 1	tn 1
			00
7	7	7	ΓΊ 1

n	tn	©	r4
7		1	7	7
n	00	r-	n	oo
7		1	7	1
r* 1	r-	1	O	7

Tabulka 2. Mikrobicidní účinek bakterií mléčného kvašení na růst různých mikrobů

oo	r-	cn		cr	m	oo	r-
7	7	tn 1	7	n 1	Os 1	Os 1	Os 1
	n	O	o	o		00	r*
7	tn 1	trs 1	7	7	Os 1	os 1	7
O		cn	\o		s©	00	00
n	7	7	7	1	7	7	7
	ri	r*	©	00	C*S	00	00
n	7	7	7	7	7	7	7
	Os	m	ir»	©	n	r*
cr	i/S 1	S© 1	7	7	7	7	7
s©	cn	00	©	O	\©	σ>	r-
7	cn 1	1	1	7	7	7	7

os rr ώ

Q.

ND: nestanoveno; záporné číslo: inhibuje růst, kladné číslo: stimuluje růst > 55 % silná inhibice, 35-55 % dosti silná inhibice, 15-34 % dosti slabá inhibice, 15 % slabá nebo žádná inhibice ^IJ vyvolává pěnění piva, ²⁾ zpomaluje filtraci zápary

GZ 285939 B6

Tabulka 3.

Účinek kultivačního média bakterií mléčného kvašení na plísně Fusarium vyvolávající pěnění piva

+ zřetelný růst;

- žádný růst

D-141	kmen bakterie mléčného kvašení	zředění kultivačního média
1:6	2:6	3:6 4:6 5:6	6:6
	E-76	+	+	— — _	__
	E-98	+	+	— — —	—
	E-315	+	+	+ - -	—
	E-317	+	+	+ - -	—
	E-414	+	+	4- 4- —	—
	E-415	+	+	+ - -
	kontrola	+
	kontrola pH	+
D-147	kmen bakterie mléčného		zředění kultivačního média
	kvašení	1:6	2:6	3:6 4:6 5:6	6:6
	E-76	4	+	___ ___ ___
	E-98	+	+	— — —	—
	E-315	+	+	+ - -	—
	E-317	+	+	+ - -	—
	E-414	+	+	+ + -	—
	E-415	+	+	+ - -	—
	kontrola	+
	kontrola pH	+
D-148	kmen bakterie mléčného		zředění kultivačního média
	kvašení	1:6	2:6	3:6 4:6 5:6	6:6
	E-76	+	_	— — _
	E-98	+	+	— — —	—
	E-315	+	4-	— — —	—
	E-317	+	+	— — —	—
	E-414	+	+	+ - -	—
	E-415	+	+	— — —	—
	kontrola	+
	kontrola pH	+
D-149	kmen bakterie mléčného		zředění kultivačního média
	kvašení	1:6	2:6	3:6 4:6 5:6	6:6
	E-76	+	+	— _ _
	E-98	+	+	— — —	—
	E-315	+	+	+ - -	—
	E-317	+	+	+ - -	—
	E-414	+	+	+ - -	—
	E-415	+	+	+ - -	—
	kontrola	+
	kontrola pH	+

Výsledky testů ukazují, že uvedené kmeny bakterií mléčného kvašení inhibují růst škodlivých plísní Fusarium a dalších nežádoucích mikrobů, vyskytujících se v procesu výroby sladu, a 10 přitom v podstatě nepůsobí na užitečné mikroby. Získané výsledky demonstrují použitelnost bakterií mléčného kvašení při postupu pole vynálezu.

- 10CZ 285939 B6

Příklad 2

Mikrobicidní účinek určitých kmenů bakterií mléčného kvašení na potravinové patogeny a na mikroby škodící potravinám

V pokusu bylo prováděno studium mikrobicidního účinku přípravků, získaných pomocí kmenů Pediococcus pentosaceus VTT-E-90390 (E-390) a Lactobacillus plantarum VTT-E-78076 (E-76), na potravinové patogeny a na mikroby škodící potravinám. Jako testované organismy byly vybrány kmeny náležející k rodům Bacillus, Yersinia, Listeria, Pseudomonas, Salmonella a Staphylococcus.

Jako preparát bylo použito sterilní kultivační médium bakterií mléčného kvašení, připravené podle příkladu 1. Všechny ostatní testované kmeny byly kultivovány po dobu 16 až 18 v médiu Iso-Sensitest (Oxoid) kromě kmene Listeria, který byl pěstován v médiu tryptóza/fosfát. Teplota kultivace byla 30 °C kromě případů kmenů Salmonella, Listeria a Staphylococcus, kde činila 37 °C.

Mikrobicidní aktivita byla stanovena turbidometrickou metodou, popsanou v příkladu 1. Experimentální podmínky, pokud jde živný substrát a teplotu, byly stejné, jak výše popsáno. Doba inkubace byla 24 h kromě případů kmenů Bacillus a Yersinia, kdy činila 48 h.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4, z níž vyplývá, že přídavek přípravku z bakterií mléčného kvašení podle vynálezu způsobuje inhibici růstu potravinových patogenů a mikrobů škodlivých potravinám.

Tabulka 4. Inhibice růstu vyvolaná P. pentosaceus E-390 a L. plantarum E-76

produkční kmen	E-390	E-76
testovaný organismus	snížení růstové plochy %
Bacillus cereus ATCC91339*⁾	93	80
Yersinia enterolitica ELI351	85	54
Listeria monocytogenes KTL4126*¹	41	49
Pseudomonas fluorescensELYYl	59	97
Pseudomonas fragi ATCC4973	84	93
Salmonella infantis ELI5*⁾	90	98
Staphylococcus aureus ELI200 >	73	86

** patogeny vyskytující se na potravinách

ATCC: Američan Type Culture Collection ELI: VTT, Food Research Laboratory

KTL: National Public Health Institute

Příklad 3

Účinek přípravků z bakterií mléčného kvašení a přípravků produkovaných bakteriemi mléčného kvašení na mikroflóru při výrobě sladu a na kvalitu sladu

1. Použitý kmen:

V experimentu byl použit kmen bakterií mléčného kvašení Pediococcus pentosaceus VTT-E-90390 (E-390).

- 11 CZ 285939 B6

Jako růstové médium inokula bylo použito živné médium MRS. Bakterie byly kultivovány anaerobně 2 dny v 10 ml média MRS při teplotě 30 °C. Inokulační objem činil 1 % objemu kultivačního roztoku.

2. Ječmen:

Byl použit ječmen Kymppi ze sklizně roku 1990, v němž byl podíl zrn napadených plísní Fusarium 55 %.

3. Proces výroby sladu:

Šarže ječmene po 1000 g byly 1 h promývány vodní lázní o teplotě 12 °C. Promývací voda byla nahrazena první vodou k máčení a ta byla po 5 h nahrazena druhou vodou k máčení. Poté po 16 h bylo zahájeno klidové období na vzduchu. Účelem tohoto období bylo odstranit vodu z povrchu zrn. Trvalo 8 h. Během máčení dosáhl ječmen vlhkosti 44 %. Během procesu máčení byl ječmen provzdušňován.

Po máčení následovalo klíčení. Klíčení ječmene se provádělo po dobu 6 dní při 14 °C. K udržení vlhkosti na hodnotě 44 % byly šarže ječmene každý den zvlhčovány a obraceny. Takto získaný zelený slad byl sušen podle 21 h teplotního programu. Teplota činidla 4,5 h 50 °C. Během dalších 4,5 byla zvýšena na 60 °C, kde byla udržována 4 h. Pak byla teplota po dobu 5 h rovnoměrně zvyšována až na 85 °C a udržována na této hodnotě zbývající 3 h. Konečný obsah vlhkosti ve sladu byl asi 4 %. Nakonec byly mechanicky odstraněny kořínky.

Jako kontrola sloužil proces výroby sladu bez jakýchkoli přísad.

4. Přípravek z bakterií mléčného kvašení a přípravek produkovaný bakteriemi mléčného kvašení

Na přípravky byly použity buňky bakterií mléčného kvašení, izolované z kultivačního média a kultivačních médií obsahujících mikrobicidní sloučeniny, v kombinaci i odděleně. Na kg ječmene bylo přidáno 120 ml kultivačního média včetně buněk nebo byly buňky ze 120 ml kultivačního média odděleny. Toto oddělení se provedlo odstředěním kultivačního média a buňky byly suspendovány ve vodě. V případech, kdy bylo přidáváno kultivační médium, bylo kultivační médium používáno jako takové. Počet buněk v přidávaných přípravcích byl řádu asi 10⁸ až 10⁹ CFU/ml.

5. Přídavek přípravku z bakterií mléčného kvašení:

Přídavek přípravku z bakterií mléčného kvašení byl prováděn buď k ječmeni, na začátku máčení I, na začátku máčení I a II nebo na začátku klíčení.

6. Prováděné analýzy:

Z každého stupně výroby sladu byly odebírány vzorky.

6.1 Plísně byly hodnoceny tímto způsobem: Procento zrn kontaminovaných plísněmi Fusarium bylo stanoveno pomocí agaru CZAPEKIPRODION DICLORAL (agar CZID), který je selektivní vůči plísním Fusarium, a vlhkého filtračního papíru (EBC-Analytica Microbiologica, část Π, 1987). Plísně Fusarium byly identifikovány podle své typické morfologie kolonií a spor a podle červené barvy.

- 12CZ 285939 B6

Plísně Aspergillus a Penicillium byly hodnoceny s použitím selektivního sladového solného agaru (EBC-Analytica Microbiologica, část II, 1987). Další běžné plísně byly hodnoceny na zvlhčeném filtračním papíru.

6.2 Bakterie mléčného kvašení byly v případě přidávaných kultur i u vzorků z výroby sladu hodnoceny na agaru MRS.

6.3 Celkové počty bakterií byly zjišťovány na agaru Plata Count (Difco).

6.4. Chemické charakteristiky sladu byly stanovovány analytickými metodami, známými v oblasti výroby sladu (EBC-Analytica, 1987, 4. vyd.).

7. Výsledky:

V tabulce 5 jsou uvedeny počty plísní Fusarium a bakterií mléčného kvašení v různých stupních výroby sladu při přídavku kultivačního média E-390.

Na obr. 2 a 3 jsou uvedeny celkové počty baktérií v různých stupních výroby sladu pro kultivační médium E-390 a pro E-390 buňky. Tabulka 6 uvádí výsledky analýz sladu při přídavku kultivačního media E-390 nebo E-390 buněk.

Tabulka 5. Účinek kultivačního média P. pentosaceus E-390 přidávaného v různých stupních výroby sladu, na počty plísní Fusarium a bakterií mléčného kvašení během výroby sladu

Stupeň	plísně Fusarium (počet kontaminovaných zrn)
ječmen	máčení	klíčení	slad
Kontrola	55	72	96	25
120 ml k ječmeni	3	6	77	3
120 ml k vodě k 1. Máčení	55	62	98	14
120 ml k vodě k 1. a 2. Máčení	55	42	90	9
120 ml ke klíčení	55	78	91	3

	bakterie mléčného kvašení (hustota buněk, CFU/g)
Kontrola	6,0.10*	3,4.10²	2,2.10⁴	3,0.10³
120 ml k ječmeni	1,2.10⁸	1,1.10⁸	2,2.10⁸	1,8.10⁸
120 ml k vodě k 1. Máčení	6,0.10*	3,1.10⁷	2,8.10⁷	1,4.10⁷
120 k vodě k 1. a 2. Máčení	6,0.10*	7,4.10⁷	8,3.10⁷	5,3.10⁷
120 ml ke klíčení	6,0.10*	1,5.10⁸	2,7.10⁸	2,6.10⁸

Tabulka 6. Účinek kultivačního média nebo buněk P. pentosaceus E-390 přidávaného v různých stupních výroby sladu, na kvalitu sladu

-13CZ 285939 B6

analýza vzorek	β-glukany mg/ml	vlhkost %	extrakt % suš.	hr. mletí % suš.
Kontrola	604	4,1	80,1	77,8
120 ml CB*) k ječmeni	496	4,3	80,3	77,3
120 ml CB*) k vodě k 1. máčení	482	4,2	80,5	77,5
120 ml CB*) k vodě k 1. a 2. máčení	482	4,3	80,0	76,9
120 ml CB*) ke klíčení	955	4,2	79,0	74,9
buňky (10⁸ CFU/g) k ječmeni	606	4,3	80,3	77,4
buňky (10⁸ CFU/g) k vodě k 1. máčení	-	-	-	-
buňky (10⁸ CFU/g) k vodě k 1. a 2. máčení	-	-	-	-
buňky (10⁸ CFU/g) ke klíčení	804	4,3	79,5	76,6

analýza vzorek	rozdíl extr. % suš.	čirost	filtrační mletí ml/h	doba cukemat. min
kontrola	2,3	čirý	300	< 10
120 ml CB*' k ječmeni	3,0	čilý	305	< 10
120 ml CB*) k vodě k 1. máčení	2,9	čirý	310/56 min	< 10
120 ml CB*) k vodě k 1. a 2. máčení	3,1	čirý	305	< 10
120 ml CB*) ke klíčení	4,1	opal.	310	< 10
buňky (10⁸ CFU/g) k ječmeni	2,9	čirý	315/61 min	< 10
buňky (10⁸ CFU/g) k vodě k 1. Máčení	-	-	-	-
buňky (10⁸ CFU/g) k vodě k 1. a 2. máčení	-	-	-	-
buňky (10⁸ CFU/g)ke klíčení	2,9	opal.	290	< 10

analýza	viskozita	FAN	modifikace	homoge-
vzorek	cP	mg/1	%	nita °/o
kontrola	1,59	163	82	69
120 ml CB*) k ječmeni	1,51	164	80	57
120 ml CB*) k vodě k 1. máčení	1,50	171	76	51
120 ml CB*) k vodě k 1. a 2. máčení	1,49	168	80	64
120 ml CB*) ke klíčení	1,68	129	69	59
buňky (10⁸ CFU/g) k ječmeni	1,54	167	79	59
buňky (10⁸ CFU/g) k vodě k 1. máčení	-	-	79	59
buňky (10⁸ CFU/g) k vodě k 1. a 2. máčení	-	-	81	67
buňky (10⁸ CFU/g) ke klíčení	1,63	148	81	69

analýza	aktivita a-	aktivita β-	kořínky
vzorek	amylasy U/g	glukanasy U/g	g/kg
kontrola	202	365	35
120 ml CB*) k ječmeni	207	355	37
120 ml CB*) k vodě k 1. máčení	194	316	30
120 ml CB*) k vodě k 1. a 2. máčení	186	360	31
120 ml CB*) ke klíčení	159	386	21
buňky (10⁸ CFU/g) k ječmeni	223	359	38
buňky (10⁸ CFU/g) k vodě k 1. máčení	187	376	39
buňky (10⁸ CFU/g) k vodě k 1. a 2. máčení	178	353	36
buňky (10⁸ CFU/g) ke klíčení	179	392	35

- neanalyzováno

’) CB - kultivační médium

- 14CZ 285939 B6

Získané výsledky ukazují, že ošetření podle vynálezu snižuje v různých stupních výroby sladu zejména množství plísní Fusarium a celkový počet bakterií.

Přídavek přípravku nemá nežádoucí vliv na kvalitu sladu. Pravý opak je pravdou: ošetření podle vynálezu zlepšovalo filtraci zápary získané z mladiny a snižovalo obsah β-glukanu ve sladu.

Příklad 4

Výroba přípravků produkovaných bakteriemi mléčného kvašení

1. Příprava koncentrovaných kultivačních médií:

Produkční kmeny Pediococcus pentosaceus VTT-E-90390 (E-390) a Lactohacillus plantarum VTT-E-78076 (E-76) byly kultivovány ve fermentoru o objemu 15 1. Objem inokula byl 6 až 7 %, kultivace probíhala po dobu 2 dní při 30 °C v médiu MRS v mikroaerofílních podmínkách. Kultivační média byla zahuštěna desetkrát a dvacetkrát pomocí lyofilizace a odpařování. Mikrobicidní aktivita koncentrátů byla zjišťována diskovou metodou.

2. Příprava čištěného roztoku obsahujícího mikrobicidní sloučeniny:

Kultivační médium bakterií mléčného kvašení bylo čištěno gelově chromatografickou frakcionací fSodle velikosti molekul. Frakce, detekované diskovou metodou a turbidometrií jako aktivní, byly jímány a vraceny na sloupec gelu.

Příklad 5

1. Použité kmeny a přípravky vyrobené z těchto kmenů:

Byly použity tyto bakteriální kmeny:

Lactobacillus plantarum VTT-E-78076 (E-76) Pediococcuspentosaceus VTT-E-90390 (E-390).

Kmeny byly získány od sbírky průmyslových mikroorganismů VTT (Biotechnical Laboratory, Finsko).

Přípravky byly vyrobeny způsobem uvedeným v příkladu 1, bod 3, příkladu 3, bod 1, a příkladu 4, body 1 a 2.

2. Ječmen:

Byl použit ječmen Kymppi ze sklizně roku 1991.

3. Proces výroby sladu:

Výroba sladu byla prováděna způsobem, uvedeným v příkladu 3, avšak s dobou trvání stupně klíčení 8 dní. Konečný obsah vlhkosti ve sladu se snížil pod 5 %.

- 15CZ 285939 B6

4. Výroba sladu:

Byly provedeny dvě laboratorní výroby sladu. Postup bez jakýchkoli přísad sloužil jako kontrola.

4.1. První výroba:

Pro přípravky při laboratorní výrobě sladu byla použita kultivační média bez buněk, desetkrát zahuštěná, a neošetřená kultivační média včetně buněk. Přípravek byl přidáván k ječmeni nebo na začátku máčení I a II. Bylo provedeno následujících 8 pokusů:

Test č. 1: kontrola, ječmen Kymppi, 1991.

Test č. 2: na začátku máčení I a II se přidá 120 ml kultivačního média E-76 s buňkami.

Test č. 3: na začátku máčení I se přidá 120 ml desetkrát zahuštěného filtrátu kultury E-76.

Test č. 4: na začátku máčení I a II se přidá 120 ml desetkrát zahuštěného filtrátu kultury E-76.

Test č. 5: na začátku máčení I a I se přidá 120 ml kultivačního média E-390.

Test č. 6: na začátku máčení I se přidá 120 ml desetkrát zahuštěného filtrátu kultury E-390.

Test č. 7: na začátku máčení I a II se přidá 120 ml desetkrát zahuštěného filtrátu kultury E-390.

4.2. Druhá výroba:

Na přípravky při laboratorní výrobě sladu byly použity dvacetkrát zahuštěné filtráty kultur bez buněk a neošetřená kultivační média s buňkami. Byla kontrolována hodnota pH vody k máčení. Přípravky byly přidávány na začátku máčení I a II. Byly provedeny pokusy 9 až 16:

Test č. 9: kontrola, ječmen Kymppi 1991.

Test č. 10: na začátku máčení I a II se přidá 120 ml vody o pH 3,8.

Test č. 11: na začátku máčení I a II se přidá 120 ml kultivačního média E-76 s buňkami.

Test č. 12: na začátku máčení I a II se přidá 120 ml frakcionovaného koncentrátu E-76, pH 3,8.

Testč. 13: na začátku máčení I a II se přidá 120 ml dvacetkrát zahuštěného filtrátu kultury

E-76.

Test č. 14: na začátku máčení I a II se přidá 120 ml kultivačního média E-390 s buňkami.

Testč. 15: na začátku máčení I a II se přidá 120 ml frakcionovaného koncentrátu E-390, pH3,8.

Testč. 16: na začátku máčení I a II se přidá 120 ml dvacetkrát zahuštěného filtrátu kultuiy E-390.

5. Provedení analýzy:

Z každého stupně výroby sladu byly odebírány vzorky.

Počty plísní, bakterií mléčného kvašení a celkových bakterií a fyzikálně chemické kvalitativní charakteristiky sladu byly stanoveny způsobem, uvedeným v příkladu 3.

6. Výsledky:

Obr. 4 a 5 ukazují celkové počty bakterií v jednotlivých stupních výroby sladu při použití kultivačních médií bakterií mléčného kvašení s buňkami nebo koncentrovaných nebo frakcionovaných filtrátů kultur ve vodě k máčení.

V tabulkách 7, 8, 9 a 10 jsou uvedeny koncentrace plísní Fusarium a jiných plísní a bakterií mléčného kvašení v jednotlivých stupních výroby sladu v obou provedených postupech.

V tabulkách 11 a 12 jsou uvedeny výsledky analýzy sladu z obou postupů výroby sladu.

- 16CZ 285939 B6

w>

G <D >O

Z3

Γ^© ΜΝ

Ν’ γν (Ν

Γx>

Ν' cn

CN

N~

Ν'

X©

CN

o

O

CN

t

CN

o

O

o

O

CM

Γ-

CM

Γ'

00

Ό

, ,

X©

o

, ,

OO

o

₁

O

o

un

CN

·—·

O

CN

x©

O

CN

o

*“*

CN

00

CN

un

Ν’

oo

r-

CN

oo

O

CN

o

CN

X©

cn

CN

UN

Ν’

00

oo

O

CN

o

Ν’

oo

(N

O

r-

UN

Ν’

O

00

O

Ν’

o

O

o

r-

<N

00

cn

o

x©

Os

o

X©

o

CN

r-*

r-

CN

•o

so

00

CM

CN

O

UN

o

00

o

_L -

o

(N

CN

¹

X©

CN

Ν'

Ό

o

N“

N

o

Ν’

o

CN

00

o

Os

CN

VN

O

o

CN

x©

X©

o

Ν'

o

O

00

o

CN

CTs

00

cn

CN

O

00

CN

o

Ν’

o

Ν'

o

CN

O

00

Γ-

CN

Ν'

<N

Ό

Ν’

O

CN

Ν’

o

N

o

O

o

CN

o

00

Ν’

'

CN

N

CN

o

CN

o

Ν’

CN

o

Os

00

oo

vn

X©

Ν'

00

o

OO

(N

O

o

00

O

o

CN

o

00

oo

Ν’

CN

x©

00

<N

o

O

x©

o

O

o

Ν’

o

CN

o

00

CN

X©

(N

Ν’

00

CN

O

o

O

o

00

o

Ν’

o

Γ-

00

r-

N·

o

Γ-

48

CN CN

CM

00 CN

Ν’ Ν’

o

N

o

CN

o

\o

X©

Ν’

(N

CN

O

o

Ν’

o

x©

o

O

o

r-

CN

ΜΊ

SO

Ν’

00

CN

N

o

00

o

v©

o

O

o

G

Γ-

00

»-*

Ν’

CN

<υ

>Q

c

Ν’

CN

00

o

X©

o

CN

o

O

o

CN

o

c

CN

CM

CN

ίΝ

CN

O

X©

<N

N

SO

CN

O

o

CN

o

SO

N“

CN

·—

CN

Ν’

(N

OO

o

O

Ν’

o

x©

o

CN

o

X©

r-

CN

Ν’

O

Ν’

xo

CN

Ν’

o

CN

o

X©

o

00

r*

CN

1 >Q

G

V©

r*

o

O

o

(N

O

o

CN

<U

O

CN

*—i

ε

FP - filtrační papír

Tabulka 8. Počty bakterií mléčného kvašení (CFU/ml) při výrobě sladu při přídavku přípravků P. pentosaceus E-390 a L. plcmtarum E-76 k vodě k máčení ječmene. Číslování vzorků v příkladu 5.

Příklad	máčení	klíčení	slad
1	5,5.10³	3,3.10⁶	2,5.10²
2	7,3.10⁶	1,2.10⁷	5,5.10⁵
3	1,4.10³	4,4.10³	1,1.10³
4	3,2.10²	1,4.10⁴	9,5.10²
5	1,3.10⁷	7,5.10⁶	2,6.10⁶
6	4,8.10³	5,0.10⁵	4,0.10⁴
7	7,3.10²	2,4.10⁴	2,6.10³
8	1,2.10⁷	1,4.10⁷	2,3.10⁶

Obsah bakterií mléčného kvašení na ječmeni: 7,5.10² CFU/g.

- 18CZ 285939 B6

Ό ^G3

«Λ >

C <υ

Ε κ> .2.

Έ ω Κ) ^03 Ε >ο Ό

Ο >

s© Γ**

I ω

s©

m

-

cn

O CN

o

o Os

O

o

r-

O

o

O

</Ί

ΜΊ

Γ--

m

o

_

Tt

CN

o

tr>

O

o

O

s©

CN

F—

oo

un

^ι·

ν©

N

Os

Tf

,

o

m

ΓΊ

o

s©

o

CN

Os

r-

ΠΊ

,

I

CN

,

r-

o

00

O

o

r-

o

<—»1

Os

Ό

C3

ΐΛ

(Ν

’χΓ

Γ-

ΓΊ

o

—

<—

o

(N

o

’”^M

Ch

un

,

Γ-

©>

s©

o

00

-rt

o

<o

o

cn

m

CN

Γ--

tT

Ο

οο

, ,

s©

o

oo

Ν’

, ,

00

o

_l ,

CN

m

·

CN

r-

un

α\

cn

00

r-

1/Ί

m

o

MO

o

CN

co

T—*

00

Tf

\ο

(Ν

\b

00

<±>

o

s©

<±>

·£>

oo

<±>

e>

o

ώ

o

*—·

γ-*-

m

CN

S©

un

Ν-

(N

^r

s©

o

S©

CN

s©

o

θ'

Os

^,—·

m

s©

\ο

CN

o

v©

CN

o

CN

o

00

o

Os

ΟΊ

CN

r-

Γ*Ί

Os

CN

o

N“

o

©

CN

o

v©

o

«—

vn

r-

cn

c

ο

>ο

(Ν

00

s©

^t

(N

s©

o

CN

o

(N

o

S©

o

3

σ>

V©

CN

*r>

Tt

OO

τΤ

(N

s©

CN

o

(N

O

o

s©

o

Os

O>

ur>

1ΖΊ

Ο

Ό

oo

CN

oo

©>

o

N“

O

o

ď

00

Os

F—·

ι/Ί

ο>

00

CN

Tř

o

K©

o

©

ο\

Os

ι/ϊ

ΠΊ

s©

Tf

SO

00

ΓΝ

•^r

CN

o

CN

o

ώ

s©

o

CN

Tf

rt

CN

s©

00

o

Ν’

N

o

O

o

O

00

o

CN

o

m

CN

Ν’

CN

^r

S©

'ď

s©

OO

o

CN

o

v©

o

O

o

ττ

cm

CM

m

CM

m

ο

O

o

ď

CN

o

O

o

» —

F-H

Γ-

1—^

C

<υ

>Q *•03

CN

ο

O

S©

o

CN

O

o

oo

o

CN

o

Ε

«—4

m

F—1

CN

♦—

CN

O

'ď

o

CN

o

CN

^3

o

O

o

m

ΓΛ

cn

rř

Ο

00

CN

oo

00

o

CN

o

O

00

o

CN

o

00

r-

»—1

CN

ο

00

s©

OO

*©

o

O

o

CN

o

CN

o

Γ--

r-

,-¹

CH

ječmen	msosor-r-ooocNOOOOcn^m m CN cn
Vzorek rod plísně	Ξ Έ E E o-— = «§.·=<» E E 8.2 8 §1« \| uSU = s e m .5 I ε .8 ε i ·§ S .2 “ £u<ůósSŽui<ř<£^

Tabulka 10. Počty bakterií mléčného kvašení (CFU/ml) při výrobě sladu při přídavku přípravků P. pentosaceus E-390 a L. plantanim E-76 k vodě k máčení ječmene. Číslování vzorků v příkladu 5.

příklad	máčení	klíčení	slad
9	8,0.10²	4,2.10⁶	8,0.10³
10	8,0.10²	5,0.10⁶	5,6.10⁴
11	2,7.10⁷	2,1.10⁷	8,5.10⁵
12	2,2.10³	3,4.10⁵	2,5.10³
13	1,2.10³	1,4.10⁷	2,3.10³
14	4,1.10⁷	3,5.10⁷	1,1.10⁴
15	4,8.10³	4,8.10⁶	3,9.10⁵
16	3,5.10²	2,1.10⁵	1,7.10⁴

Obsah bakterií mléčného kvašení na ječmeni: 7,5.10² CFU/g.

Tabulka 11. Účinek přídavku přípravků P. pentosaceus E-390 a L. plantarum E-76 kvodě k máčení ječmene na kvalitu sladu. Číslování vzorků v příkladu 5.

analýza	vzorek
1	2	3	4
vlhkost %	3,6	3,6	3,5	3,7
jemný extrakt % sušiny	81	80,8	80,6	80
hrubý extrakt % sušiny	76,8	77	76,1	75,2
rozdíl extraktů %	4,2	3,8	4,5	4,9
cukematění min	< 10	< 10	< 10	< 10
čirost mladiny	čirá	čirá	čirá	čirá
filtrace jemného podílu ml/min	320/45	320/44	315/48	315/40
filtrace hrubého podílu ml/min	260/86	265/64	270/59	255/73
pH mladiny	5,93	5,88	5,86	5,86
viskozita (,10³Pa.s)	1,69	1,57	1,59	1,57
β-glukany mg/1	784	659	705	736
volný amino dusík mg/1	154	156	155	139
modifikace	74	72	73	73
homogenita %	61	65	63	58
α-amylasa U/g	178	182	148	128
β-glukanasa U/kg	434	420	360	360

-20CZ 285939 B6

analýza	vzorek
5	6	7	8
vlhkost %	3,7	3,6	3,9	3,9
jemný extrakt % sušiny	81,2	81	80,7	81,2
hrubý extrakt % sušiny	77	76,4	74,8	77,1
rozdíl extraktů %	4,3	4,7	5,9	4,1
cukematění min	< 10	< 10	< 10	< 10
čirost mladiny	čirá	čirá	čirá	čirá
filtrace jemného podílu ml/min	320/47	315/66	320/49	315/52
filtrace hrubého podílu ml/min	260/68	270/76	255/90	275/120
pH mladiny	5,86	5,86	5,97	5,99
viskozita (,10³Pa.s)	1,55	1,58	1,59	1,58
β-glukany mg/1	610	696	822	657
volný amino dusík mg/1	158	150	130	154
modifikace %	72	75	77	76
homogenita %	67	66	62	68
α-amylasa U/g	179	156	144	174
β-glukanasa U/kg	442	412	361	425

Tabulka 12. Účinek přídavku přípravků P. pentosaceus E-390 a L. plantarum E-76 kvodě 5 k máčení ječmene na kvalitu sladu. Číslování vzorků v příkladu 5.

analýza	vzorek
9	10	11	12
vlhkost %	3,5	3,6	3,6	3,5
jemný extrakt % sušiny	80,5	80,5	81,2	80,5
hrubý extrakt % sušiny	78,4	77,9	77,4	73,3
rozdíl extraktů %	2,1	2,6	3,7	7,2
cukematění min	< 10	< 10	< 10	< 10
čirost mladiny	čirá	čirá	čirá	čirá
filtrace jemného podílu ml/min	320/40	315/47	320/44	315/42
filtrace hrubého podílu ml/min	290/120	270/76	260/51	265/120
pH mladiny	6,04	6,05	5,99	5,97
viskozita (.10'³Pa.s)	1,54	1,65	1,51	1,53
β-glukany mg/1	442	522	397	553
volný amino dusík mg/1	149	145	149	128
Modifikace %	85	85	86	82
Homogenita %	63	66	76	57
α-amylasa U/g	161	172	161	123
β-glukanasa U/kg	365	375	365	282

-21 CZ 285939 B6

analýza	vzorek
13	14	15	16
vlhkost %	3,8	3,5	3,5	3,6
jemný extrakt % sušiny	80,3	81	81,1	80,4
hrubý extrakt % sušiny	73,5	77,6	76,6	75,1
rozdíl extraktů %	6,8	3,4	4,5	5,4
Cukematění min	< 10	< 10	< 10	< 10
čirost mladiny	čirá	čirá	čirá	čirá
filtrace jemného podílu ml/min	320/55	315/49	330/40	320/40
filtrace hrubého podílu ml/min	245/120	285/68	305/120	265/12
pH mladiny	5,94	5,95	5,98	5,99
viskozita (.10³Pa.s)	1,5	1,49	1,49	1,52
β-glukany mg/1	612	381	463	576
volný amino dusík mg/1	117	149	139	120
Modifikace %	74	81	75	71
Homogenita %	57	68	51	47
α-amylasa U/g	72	148	125	101
β-glukanasa U/kg	282	371	342	308

Nyní získané výsledky ukazují, že ošetření podle vynálezu snižuje zejména množství plísně Fusarium a celkový počet bakterií v různých stupních výroby sladu. Dále je zřejmé, že kromě kultivačních médií mají zejména koncentrované a frakcionované filtráty kultur příznivý účinek například s ohledem na plísně Fusarium.

Z analýz sladu je možno odvodit závěr, že přídavek kultivačního média kmenů E-76 a E-390 měl za následek zlepšení filtrovatelnosti mladiny, získané ze sladu; obsah β-glukanu je rovněž v jednotlivých sladech nižší než v kontrolním sladu.

Příklad 6

Účinek přípravků produkovaných bakteriemi mléčného kvašení, přidávaných při výrobě sladu, na filtraci zápary

Na obr. 6 je znázorněn diagram ukazující vliv ošetření podle vynálezu přípravky odvozenými od kmenů bakterií mléčného kvašení (120 ml kultivačního média na kg ječmene) na filtraci zápary, získané s použitím takto ošetřeného sladu.

V tomto experimentu byly použity kmeny uvedené v příkladu 1: E-390, E-416, E-98, E-317, E-390, E-76 a E-315. Test byl prováděn s použitím filtrační metody Tepral (BIOS 19, 1988, Grandclerc, J. a d., „Simplification de la méthode de filtration du brassin tepral description de la méthode“, str. 88-92).

Z výsledků je zřejmé, že ošetření podle vynálezu zlepšuje filtraci zápary.

V následujících příkladech je studován účinek bakterií mléčného kvašení na koncentraci mykotoxinů, deoxynivalenolu a zearalenonu, produkovaných plísněmi Fusarium v procesu výrobyječného sladu.

-22CZ 285939 B6

Příklad 7

Účinek bakterií mléčného kvašení na koncentraci deoxynivalenolu (DON) při výrobě sladu z ječmene kontaminovaného plísní F. culmorumXO 148

1. Použité kmeny

V testu byly použity kmeny bakterií mléčného kvašení Lactobacillus plantarum (E-76) a Pediococcus pentosaceus (E-390).

Bakterie byly kultivovány anaerobně v živném roztoku MRS po dobu 3 až 4 dní při 30 °C. Mezi testy byly bakteriální kmeny udržovány ve svém živném roztoku za anaerobních podmínek při 4 °C.

2. Ječmen

Byla použita odrůda ječmene „Kymppi“ z roku sklizně 1994, kníž bylo přidáno 2 ml roztoku kultury Fusarium na 100 g ječmene. Pro získání spor byl kmen Fusarium kultivován asi 7 dní v třepaném roztoku CMC. Hustota spor v roztoku kultury F. culmorum VTT D-80148 (D 148) byla asi 10⁶ spor/ml roztoku. Kontaminovaný ječmen byl inkubován 3 dny při 25 °C. Ječmen byl každý den promícháván a pak byl sušen přes noc při 30 °C do své původní vlhkosti.

3. Výroba sladu

Šarže po 1000 g ječmene byly máčeny podle tohoto programu: praní (1 h), 1. máčení (7 h), 1. aerační přestávka (16 h), 2. máčení (8 h), 2. aerační přestávka (15 h) a namáčení. Teplota máčení byla 12 °C a cílová vlhkost ječmene na konci máčení byla 46%. K zajištění dýchání a metabolismu ječmene byly mezi stupně máčení zařazeny aerační přestávky a vzorky ječmene byly během přestávek přeneseny do provzdušňovaného prostoru. Nádoby pro máčení byly rovněž opatřeny aerací. Po druhé aerační přestávce byly vzorky ječmene zváženy pro zjištění obsahu vlhkosti. Jestliže byla vlhkost pod 46 %, byly vzorky ječmene na krátkou dobu namočeny do vody. Poměr ječmene kvodě během stupňů máčení byl 1 : 1,5. Poté byly vzorky ječmene přeneseny do boxu pro klíčení.

Klíčení vzorků ječmene probíhalo v provzdušňovaném boxu po dobu 6 dní při 14 °C. Pro úpravu vlhkosti na cílovou úroveň 46 % byly vzorky ječmene denně zvlhčovány a provětrávány. Takto získaný zelený slad byl sušen s použitím 2 lh programu jako v bodu 3 v příkladu 3. Nakonec byly ze sladu mechanicky odstraněny kořínky.

Výroba sladu bez přídavku bakterií mléčného kvašení byla použita jako kontrolní test.

4. Příprava bakterií mléčného kvašení

V tabulce 13 jsou uvedeny hodnoty pH, počty buněk a mikrobicidní účinnost (disková metoda, příklad 1, bod 5) kultur bakterií mléčného kvašení, přidávaných do procesu výroby sladu.

Tabulka 13

kmen bakterií	pH roztoku	počet buněk	zóna inhibice
mléčného kvašení	kultury	(PMY/ml)	(mm)
E-76	3,72	5,1E+O8	17
E-390	3,77	l,7E+09	15

-23 CZ 285939 B6

5. Přidávání preparátů bakterií mléčného kvašení

Preparát bakterií mléčného kvašení byl přidáván na začátku prvního a druhého stupně máčení. Poměr kultury bakterií mléčného kvašení kvodě byl během procesu výroby sladu udržován na 8 %.

6. Provádění analýzy

V každém vzorku ječmene byla pomocí plynové chromatografie stanovena koncentrace deoxynivalenolu. Pro identifikaci a kvantifikaci deoxynivalenolu byl použit hmotový spektrometr.

7. Výsledky

Ze získaných výsledků je zřejmé, že účinkem kmene L. plantarum E-76 měl slad o 50 % nižší obsah deoxynivalenolu než referenční slad a účinkem kmene P. pentosaceus E-390 měl slad o 25 % nižší obsah deoxynivalenolu než referenční slad.

Příklad 8

Účinek bakterií mléčného kvašení na tvorbu deoxynivalenolu (DON) při výrobě sladu z ječmene přirozeně kontaminovaného deoxynivalenolem a plísněmi Fusarium

A. Finské odrůdy ječmene

1. Použité kmeny

V testu byly použity kmeny bakterií mléčného kvašení Lactobacillus plantarum (E-76) a Lactobacillus acidophilus VTT E-87276 (E-276).

Kmen Lactobacillus plantarum byl kultivován jako v příkladu 7; teplota kultivace pro Lactobacillus acidophilus byla 37 °C.

2. Ječmen

Byly použity nízkokvalitní odrůdy ječmene Kustaa, Loviisa a Jo 1599 z roku sklizně 1993.

3. Výroba sladu

Proces výroby sladu byl veden jako v příkladu 7 kromě velikosti šarží ječmene (100 g) a poměru ječmenu k vodě během stupňů máčení (1 : 4,0).

Proces výroby sladu bez přídavku bakterií mléčného kvašení byl použit jako kontrolní test.

4. Příprava bakterií mléčného kvašení

V tabulce 14 jsou uvedeny hodnoty pH, počty buněk a mikrobicidní účinnost (disková metoda, příklad 1, bod 5.1) kultur bakterií mléčného kvašení, přidávaných do procesu výroby sladu.

-24CZ 285939 B6

Tabulka 14

odrůda ječmene	kmen bakterií mléčného kvašení	pH kultivačního roztoku	počet buněk (PMY/ml)	zóna inhibice (mm)
Kustaa	E-76	3,68	2,6E+09	23
	E-276	3,96	l,6E+08	21
Loviisa	E-76	3,68	2,6E+09	23
	E-276	3,96	l,6E+08	21
Jo 1599	E-76	3,68	2,6E+09	23
	E-276	3,96	l,6E+08	21

B. Cizí odrůdy ječmene

1. Použité kmeny

Stejně jako v odstavci A.l.

2. Ječmen

Byly použity nízkokvalitní odrůdy cizího ječmene 1 až 3.

Máčení bylo prováděno jako v příkladu 7 kromě velikosti šarží ječmene (20 g) a poměru ječmenu k vodě (1 : 17,0.).

Klíčení ječmene bylo prováděno po dobu 6 dní v plastových pytlích, umístěných v plastovém boxu na kovovém rámu, do cílové vlhkosti 46 %. Pytle byly denně otáčeny. K uchování vlhkosti bylo na dno boxu nalito trochu vody. Zelený slad byl sušen 17 h v inkubátoru při 50 °C, načež byla teplota zvýšena na 85 °C a ječmen byl sušen další 4 h. Kořínky byly odstraněny mechanicky.

4. Příprava bakterií mléčného kvašení

V tabulce 15 jsou uvedeny hodnoty pH, počty buněk a mikrobicidní účinnost (disková metoda, příklad 1, bod 5.1) kultur bakterií mléčného kvašení, přidávaných do procesu výroby sladu.

Tabulka 15

odrůda ječmene	kmen bakterií mléčného kvašení	pH kultivačního roztoku	počet buněk (PMY/ml)	zóna inhibice (mm)
cizí č. 1	E-76	3,82	9,5E+08	23
	E-276	4,00	3,5E+08	20
cizí č. 2	E-76	3,82	9,5E+08	23
	E-276	4,00	3,5E+08	20
cizí č. 3	E-76	3,70	7,5E+09	23
	E-276	4,01	4,4E+08	20

5. Přidávání preparátů bakterií mléčného kvašení

-25CZ 285939 B6

6. Prováděné analýzy

V každém vzorku ječmene byla stanovena koncentrace deoxynivalenolu pomocí testu ELISA (Ridascreen).

7. Výsledky

Tabulka 16 a obr. 8 a 9 uvádějí koncentrace deoxynivalenolu při výrobě sladu ze šarží finského a cizího ječmene a rovněž vliv bakterií mléčného kvašení na tvorbu deoxynivalenolu (DON) při výrobě sladu z ječmene přirozeně kontaminovaného deoxynivalenolem a plísní Fusarium.

Tabulka 16

vzorek ječmen	DON (pg/kg)
Kustaa -93	34
Loviisa -93	115
Jo 1599-93	72
Kymppi -94	56
cizí č. 1	296
cizí č. 2	212
cizí č. 3	673
slad
Kustaa -93 referenční	29
Kustaa -93 + E-76	55
Kustaa -93 + E-276	23
Loviisa -93 referenční	66
Loviisa -93 + E-76	53
Loviisa -93 + E-276	109
Kymppi -94
cizí č. 1 referenční	262
cizí č. 1 + E-76	73
cizí č. 1 + E-276	56
cizí č. 2 referenční	92
cizí č. 2 + E-76	87
cizí č. 2 + E-276	59
cizí č. 3 referenční	263
cizí č. 3 + E-76	40
cizí č. 3 + E-276	38

E-76 = Lactobacillus plantarum

E-276 = Lactobacillus acidophilus

Ze získaných výsledků je zřejmé, že přidá-li se roztok kultury L. plantarum (E-76), zejména při výrobě sladu ze vzorků cizího ječmene, je koncentrace deoxynivalenolu v referenčním sladu vyšší než při přítomnosti bakterií mléčného kvašení. Účinkem kmene L. plantarum E-76 byla koncentrace deoxynivalenolu (průměr ze tří vzorků) o 68 % nižší než u reference a účinkem kmene Lactobacillus acidophilus (E-276) byla koncentrace deoxynivalenolu o 75 % nižší než u

-26CZ 285939 B6 reference. Šarže finského ječmene měly nízkou koncentraci deoxynivalenolu, která mohla být dále snížena během výroby sladu.

Příklad 9

Účinek bakterií mléčného kvašení na obsah zearalenonu (ZEN) ve sladu při výrobě sladu z ječmene kontaminovaného kmeny Fusarium culmorum D-148 a F. graminearum D-470

A. 1. Byl použit kmen bakterií mléčného kvašení Lactobacillus plantarum (E-76).

Použité kmeny, ječmen (doba kontaminace 7 dní), proces výroby sladu, příprava bakterií mléčného kvašení a přidávání preparátu bakterií mléčného kvašení bylo stejné jako v bodech 1 až 5 příkladu 7.

6. Prováděné analýzy

Obsah zearalenonu byl stanoven z každého vzorku ječmene kapalinovou chromatografíí.

7. Výsledky

Z výsledků je zřejmé, že účinkem přídavku kmene L. plantarum E-76 se sníží obsah zearalenonu ve sladu o 46 % oproti referenčnímu sladu.

B. l. Použité kmeny

V testu byly použity kmeny bakterií mléčného kvašení Lactobacillus plantarum (E-76), Lactobacillus acidophilus (E—276) a Pediococcus pentosaceus (E-390).

Kultivace byla prováděna jako v příkladu 7.

2. Ječmen

Byl použit ječmen Kymppi ze sklizně roku 1994, který byl kontaminován kultivačním roztokem F. graminearum VTT D-95470 (D-470) způsobem popsaným v odstavci 2 příkladu 7.

Proces výroby sladu, příprava bakterií mléčného kvašení a přidávání preparátů bakterií mléčného kvašení bylo stejné jako v odstavcích 3 až 5 příkladu 7.

Kultura bakterií mléčného kvašení L. acidophilus E-276, přidávaná do procesu výroby sladu, měla hodnota pH 4,05, počet buněk 5,8E+08 PMY/ml a zónu inhibice 14 m (disková metoda, příklad 1, bod 5.1).

6. Prováděné analýzy

Obsah zearalenonu byla stanoven z každého vzorku ječmene pomocí testu ELISA (Ridascreen).

7. Výsledky

-27CZ 285939 B6

Z výsledků je zřejmé, že účinkem bakterií mléčného kvašení se obsah zearalenonu ve sladu snížil o 37 až 55 % oproti referenčnímu sladu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob potlačení nežádoucího mikrobiálního růstu při ošetření semen pro klíčení, vyznačující se tím, žek zrnům ječmene v procesu výroby sladu nebo k semenům, která mají být přeměněna na výhonky pro účely výživy, se přidá před a/nebo během klíčení přípravek z bakterií mléčného kvašení nebo přípravek produkovaný kultivací bakterií mléčného kvašení.
2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že bakterie mléčného kvašení náleží k rodu Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus nebo Lactobacillus.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že přípravek z bakterií mléčného kvašení nebo přípravek produkovaný kultivací bakterií mléčného kvašení je odvozen od druhu Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus curvatus nebo Lactobacillus plantarum nebo od jejich směsi, výhodně od druhu Lactobacillus plantarum nebo Pediococcus pentosaceus nebo od jejich směsi.
4. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že k zrnům ječmene se přidává přípravek z bakterií mléčného kvašení nebo přípravek produkovaný kultivací bakterií mléčného kvašení.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že přípravek z bakterií mléčného kvašení nebo přípravek produkovaný kultivací bakterií mléčného kvašení se přidává ve stupni máčení nebo klíčení.