FI91282C - Immunokemiallinen reagenssi - Google Patents

Description

i 91282

Immunokemiallinen reagenssi

Tama keksinto koskee immunokemiallista reagenssia ja polypeptideja, jotka jaljittelevat AIDS:iin liittyvien 5 virusten proteiinien aminohapposekvensseja.

AIDS (immuunikato) on vasta viime aikoina havaittu nopeasti leviava vitsaus, jolla on usein dramaattiset ja tuhoisat seuraukset uhreilleen. On myos todettu, etta AIDS leviaa virusinfektioiden kautta, ja taman taudin 10 aiheuttajavirus on nimetty HTLV-III-virukseksi [Science 224 (1984) 497-508). Eri tutkijat ovat kayttaneet myos vaihtoehtoisia nimia, kuten LAV ja ARV-2, eristamistaan AIDSiia aiheuttavista viruksista. Tåsså hakemuksessa kay-tetaån nimitysta HTLV-III kattamaan myos LAV, ARV-2 ja 15 kaikki muut AIDS:ia aiheuttavat variantit. Naiden va- rianttien on osoitettu olevan hyvin låheisia sukulaisia genomiorganisaationsa suhteen.

HTLV-III:n kloonauksella ja molekyylikarakte-risoinnilla on kuitenkin osoitettu myos, etta DNA-sek-20 venssisså vallitsee huomattavia eroja yksittaisten eris-tettyjen virusten kesken, mita heijastavat erot niiden restriktioentsyymipilkkoutumismalleissa. Nama havainnot yhdistettyina DNA-sekvenssianalyysiin ovat johtaneet sii-hen yleiseen otaksumaan, etta pistemutantit, jotka aihe-25 uttavat geneettisiå eroja ja siirtymista HTLV-III:ssa, saattavat edistaå taman viruksen patogeenisuutta. Tallai-sen geneettisen muuttumisen on osoitettu olevan syyna eristettyjen Visnavirusten kasvaneeseen patogeenisuuteen [Clements et al., PNAS 77 (1980) 4454-4458). Hevosen en-30 kefaliittiviruksen aiheuttaman kuumeisen enkefaliitin toistuva esiintyminen voi samoin olla infektoituneessa populaatiossa syntyvien mutaatioiden aiheuttamaa [Monte-laro et al., Journal of Biological Chemistry 259 (1980) 10539-10544). Vaikka HTLV-III-viruksen on osoitettu nuk- 2 leiinihappomåårityksin olevan eri laji kuin muut RNA-vi-rukset, on se selvasti retrovirusryhmån jåsen.

HTLV-III-viruksen nukleiinihapon yleinen genomi-organisaatio esitetåån kuviossa 1. Tasså kuviossa nåkyvåt 5 viruksen kolme påågeeniå. Gag on kapsidiantigeenien esi-astetta koodaava geeni; pol on kåånteiskopiointientsyymi-geeni; ja env on vaipan glykoproteiinien esiastetta vas-taava geeni. Kuviossa nakyy kaksi muuta avointa lukuke-hystå (ORF) 1 ja 2. HTLV-III:n transaktivointitekijan 10 geeni vastaa 0RFl:å. 0RF2:n mahdollisen geenituotteen tehtåvaa ei tunneta. Kuvion 1 påissa olevat laatikolla merkityt alueet edustavat viruksen toistuvia pitkia påå-tejaksoja (LTR).

Nåiden kolmen viruspaageenin tuotteita voidaan 15 luonnehtia lyhyesti seuraavasti: I. gag-geenituotteet

Genomin 5'-pååsså sijaitseva avoimessa lukukehyk-sessa oleva gag-sekvenssi koodaa esiasteproteiinia, jonka molekyylimassa Mr on 55K. Tama esiaste kasitellaån kol-20 meksi valmiiksi proteiiniksi. Aminohapot 1-132 vastaavat 17 K:n virioniproteiinia, joka todennåkoisesti osallistuu morfogeneesiin. Seuraava valmis proteiini on kapsidin paårakenneproteiini, p24. Loppuosa gag-polyproteiinista (pl5), hyvin emaksinen proteiini, osallistuu todennåkoi-25 sesti nukleiinihappojen sitomiseen.

II. pol-geenituotteet HTLV-III:n toisen pitkån avoimen lukukehyksen en-nustetussa aminohapposekvenssissa esiintyy homologiaa ja samankaltaisuutta muiden retrovirusten muiden pol-geenien 30 kanssa. Tallå 3044 nukleotidin pituisella avoimella luku-kehyksellå on kyky koodata HTLV-III-virionissa esiintyvån kåånteiskopioijaentsyymin 1015 aminohapon pituista esiasteproteiinia. 5'-paan kåånteiskopioijaentsyymi-infor- 3 91282 maation lisaksi geenisså on 3'-påån geneettista informaa-tiota, joka todennåkoisesti liittyy viruksen replikoitu-miselle valttamattomiin endonukleaasi- ja integraasitoi-mintoihin.

5 III. env-geenituotteet HTLV-III:n env-lor-alue koodaa noin 863 aminohapon pituista esiasteproteiinia. Tama primaarinen geenituote, jonka Mr on 160 K, on todettavissa infektoituneissa so-luissa. TSma esiaste pilkkoutuu kahdeksi tuotteeksi, hyd-10 rofiiliseksi ulkopuoliseksi proteiiniksi (gpl20), joka on glykosyloitunut, ja hydrofiiliseksi transmembraaniprote-iiniksi. Virioni gp41 vastaa transmembraaniproteiinia. Transmembraaniproteiinin kasittelykohdassa vallitsee kor-kea-asteinen aminohapposekvenssin sailyminen muuttumat-15 tomana. Taman alueen ulkopuoliset alueet ovat vahemman hyvin sailyneitå, ja niissa esiintyy huomattavia eroja nukleotidi- ja aminohapposekvenssitasolla verrattaessa eri eristettyja viruksia.

Kun eri tutkijat olivat kloonanneet erilaisia 20 eristettyja HTLV-III-viruskantoja, otettiin geneettisen kasittelyn kohteeksi DNA-sekvenssianalyysilla maaritelty-ja genomisekvenssejS. Julkaistuissa toisså on kasitelty geneettisesti ja saatettu ilmentymåan E. colissa erilaisia HTLV-IlI:n env-geenin segmentteja. Eristetty virus 25 BH-10 on saatettu ilmentymaan vektoreissa, joissa on avoin lukukehys [Chang et al., Science 228 (1985) 93-95;

Chang et al., Biotechnology 3 (1985) 905-909]. Vastaavas-ti on kloonattu ja saatettu ilmentymaan E. colissa eris-tetyn viruksen HXB-3 env-geeni [Crowl et al., Cell 41 30 (1985) 979-986].

Jotta saataisiin pysaytetyksi nykyaån havaittu AIDS:in voimakas leviaminen, on tehty mm. suurimittaisia rutiinitestauksia viruksen tai sen vasta-aineiden loyta-miseksi veresta. Nykyisin kaytossa olevat HTLV-III-vasta- 4 ainetestit perustuvat yhteen tai useampaan immunoreagens-siin, jotka sisSltSvSt luontaisesta viruksesta peråisin olevaa antigeenimateriaalia.

Immunodiagnostisiin tarkoituksiin on olemassa tun-5 nustettu tarve saada aikaan tehokas antigeenimateriaali, joka on perSisin turvallisesta lShteesta, ei siis suoraan luonnossa esiintyvåstå viruksesta.

Tåmån antigeenisen (polypeptidi)materiaalin val-mistukseen valittava menetelmå on siten synteettinen val-10 mistus, erityisesti orgaaninen keraiallinen synteesi tai yhdistelma-DNA-tekniikalla toteutettava valmistus.

TåmSn keksinnon tarkoituksena on tarjota kåytettå-våksi immunokemiallinen reagenssi, jota voidaan kåyttåS immunodiagnostisiin tarkoituksiin.

15 Keksinndn mukaiselle immunokemialliselle reagens- sille on tunnusomaista, ettå se sisåltåa kahden tai use-amman synteettisen polypeptidisekvenssin yhdistelmå, jol-loin sekvenssit on valittu seuraavista: polypeptidisekvenssi, joka sisåltåS våhintåån yhtå 20 HTLV-III-isolaatin, HAT-3:n gag-antigeenin antigeenide-terminanttia; polypeptidisekvenssi, joka sisSltSS våhintå&n yhta HTLV-III-isolaatin, HAT-3:n glykoproteiini gpl20:n anti-geenideterminanttia; ja 25 polypeptidisekvenssi, joka sisåltåå våhintåån yhtå HTLV-III-isolaatin, HAT-3;n glykoproteiini gp41:n anti-geenideterminanttia, ja jolloin isolaatti sisåltSS HTLV-III-isolaatin, HAT-3-viruksen, ATCC 40213, genomi-DNA:ta. Polypeptidisekvenssien yhdistelmSllå tarkoitetaan tåsså 5 91282 yhteydesså mitå tahansa mainittuja polypeptidejå sisåltå-våå fysikaalista tai kemiallista koostumusta, kuten yhtå synteettistå polypeptidiå, joka sisåltåå våhintåån kaksi mainittua polypeptidisekvenssiå, tai synteettisten poly-5 peptidien, joista kukin sisåltaa våhintaan yhden mainitun polypeptidisekvenssin, seosta.

Kuten edellå mainittiin, synteettisellå tarkoite-taan tåsså yhteydesså mistå tahansa muusta kuin luonnon låhteestå peråisin olevaa. Siten sillå tarkoitetaan mm.,: 10 orgaanisella kemiallisella synteesillå valmistettua (tå-mån keksinnon mukaisten polypeptidien yhteydesså erityi-sesti jollakin tunnetulla polypeptidisynteesimenetelmål-lå, kuten Merrifieldin kiinteåfaasimenetelmållå, valmistettua) tai sellaista, joka on valmistettu saattamalla 15 ilmentymåån isåntåorganismissa yhdistelmåpolynukleotidi, joka sisåltåå yhtå tai useampaa keksinnon mukaista polypeptidia koodaavan polynukleotidisekvenssin.

Mainittuja antigeenideterminantteja sisåltåvåt polypeptidisekvenssit voivat esiintyå sellaisinaan tåmån 20 keksinnon mukaisessa immunokemiallisessa ragenssissa, ne voivat olla sidottuja toisiinsa ja/tai muihin polypepti-disekvensseihin ja/tai soveltuvaan kantajaan, jne. Tåmå riippuu paljolti immunokemiallisen reagenssin aiotusta kåytostå.

25 Immunokemiallisessa mååritysmenetelmåsså kåytettå- vå immunokemiallinen reagenssi voi olla joko vapaana liu-oksessa tai sisåltåå kiinteån yksikon tai leimausyksikon. Mainittu kiinteå yksikko voi olla esimerkiksi mikrotit-rauslevy, putki, tikku, sauva, suodatin, helmi, kiinteå 30 hiukkanen, kuten lateksihiukkanen, erytrosyytti tai våri-ainesoolihiukkanen, metalli tai metalliyhdiste. Leimaus-yksikkonå voidaan kåyttåå esimerkiksi radioaktiivista atomia tai yhdistettå, fluoresoivaa yhdistettå, fosfo- 6 resoivaa yhdistettå, entsyymiå, pientå kiinteåå hiukkas-ta, kuten våriainesoolihiukkasta, metallia tai metalliyh-distettå. Tåmån keksinnon tarkoituksiin antigeenideter-minanttina pidetåån antigeenin pienintå rakenne-element-5 tiå, joka mahdollistaa vuorovaikutuksen vasta-aineiden kanssa, jotka tunnistavat myos luonnon antigeenin. Eris-tettynå yksikkonå esiintyvån antigeenideterminantin suh-teen tåmå tarkoittaa sitå, etta sen tulisi pysyvåsti tai tilapaisesti olla samalla tavalla kolmiulotteisesti jår-10 jestynyt kuin sama elementti luonnon antigeenissa.

Tallainen antigeenideterminanttipolypeptidi sisål-tåå yleenså våhintåan noin 4 tai 5 aminohappoa. Lineaari-sessa antigeenideterminantissa namå vahintaån 4 tai 5 aminohappoa ovat jårjestyneinå suhteellisen lyhyeksi po-15 lypeptidiketjuksi, kun taas konformationaalisessa anti geenideterminantissa namå våhintaan 4 tai 5 determinantin muodostavaa aminohappoa ovat jakautuneina eri kohtiin huomattavan pitkaa polypeptidiketjua, joka laskostuu ja taipuu silla tavalla, etta merkitykselliset aminohapot 20 sijoittuvat toistensa laheisyyteen. Nama molemmat anti-geenideterminanttityypit kuuluvat keksinnon piiriin.

Polypeptidisekvenssien, jotka sisaltavat gag-anti-geenin, glykoproteiini gpl20:n ja glykoproteiini gp41:n antigeenideterminantteja, tulisi olla suurin piirtein 25 vapaita luonnossa esiintyvista gag-, gpl20- ja gp41-pro-teiineista. Keksinnon mukainen immunokeraiallinen reagenssi voi tåsta huolimatta mahdollisesti sisåltaa myos yhtå tai useampaa luonnossa esiintyvaa HTLV-III-proteiinia.

Yksi tai useampi polypeptideista voi edullisesti 30 sisaltaa ainoastaan relevantin osan vastaavista proteii-neista. Erityisesti glykoproteiinien gpl20 ja gp41 antigeenideterminantteja voidaan tamån keksinnon mukaisesti sopivasti jåljitellå nåiden proteiinien osalla, joka si-såltåå våhintåan noin 4-160 aminohappoa.

91282 7 Nåmå osat voidaan valita millå tahansa alalla tun-netulla menetelmållå antigeenideterminanttipolypeptidi-sekvenssien valikoimiseksi tai kåyttåmållå menetelmåå, jota kuvataan jåljempånå esimerkeisså.

5 Kun polypeptidien relevantit osat on valittu, edul- lisesti jåljempånå kuvattavalla menetelmållå, voidaan nåmå valitut polypeptidit, kuten jo mainittiin, valmistaa synteettisesti liittåmållå yhteen aminohapot orgaanisen kemian menetelmin tai kåyttåmållå tunnettua yhdistelmå-10 DNA-tekniikkaa. Kummassakin tapauksessa keksinnon mukaiset våhintåån kaksi polypeptidiå voidaan valmistaa erillisinå polypeptideinå tai yhteenliitettyinå polypeptideinå.

Nåmå fuusioidut polypeptidit voivat joko sisåltåå våhintåån kaksi kahdesta tai useammasta synteettisestå poly-15 peptidistå yhdesså sekvenssisså tai ne voivat sisåltåå muun polypeptidisekvenssin tai tållaisten sekvenssien yhdistelmån. Soveltuva muu polypeptidisekvenssi voi olla esimerkiksi entsyymi, joka voi toimia merkkiaineena entsyy-mi-immuunimåårityksesså.

20 Tåhån keksintoon johtaneessa tutkimustyosså kåytet- tiin menetelmåå virusgeenien antigeenisuuden tutkimiseksi systemaattisesti saattamalla nåiden geenien osat ilmenty-måån fuusioproteiineina transformoiduissa soluissa. Eri-laisista fuusioproteiineista tutkittiin erilaisin menetel-25 min (Western-tåplåmenetelmå, ELISA) reaktiivisuus erilais-ten antiseerumien (anti-p24, anti-p41 ja anti-p120) kanssa. Vaikka seuraavissa esimerkeisså on kåytetty transformoitua E. colia keksinnon valaisemiseen, voitaisiin mitå tahansa elinkykyistå transformoitua solulinjaa, joka ilmentåå 30 tehokkaasti kyseesså olevaa fuusioproteiinia, kåyttåå alan ammattimiesten tuntemin menetelmin. Vaikka menetelmållå on joitakin yhtålåisyyksiå edellå mainituissa HTLV-III:n kloonaustutkimuksissa julkistettujen menetelmien kanssa, ei mikåån mainituista julkaisuista mahdollista systemaat-35 tisen kuvan muodostamista antigeenideterminanteista.

Aiemmin julkaistut tulokset, joita on saatu kåyttåmållå 8 E. colissa valmistettuja yhdistelmåantigeeneja, osoittavat inunuunireaktiivisuuden AIDS-potilaiden seerumien kanssa. Toisin kuin tahan keksintoon johtaneessa tutkimuksessa, ei kuitenkaan ole voitu tehdå mitåån paåtelmiå env-geenin 5 alueista, joita ei ole esiintynyt julkaisuissa kuvatuissa klooneissa.

Taman tutkimuksen låhtokohtana oli uusi eristetty HTLV-III, joka nimettiin HAT-3:ksi. Taman viruksen DNA kloonattiin faagiperaiseen vektoriin jaljempana olevissa 10 erityisesimerkeissa kuvattavalla tavalla.

Kuviossa 1 esitetaan taman XHAT-3-esifaagin restriktiokohdat. Vaakasuorat pylvaat A, B ja C viittaavat naissa esimerkeissa kloonattuihin gag- ja env-geenien segmentteihin. Numerot viittaavat naiden DNA-fragmenttien 15 kokoihin kiloemaksina ilmoitettuina. Naiden XHAT-3:n osien sekvenssitiedot annetaan kuvioissa 2 ja 3.

Kuviossa 2 esitetaan gag-geenin fragmentin A (katso kuvio 1) DNA-sekvenssi ja siitå saatu polypeptidisekvenssi.

Kuviossa esitetaan koko P24-rakennegeenin DNA-20 sekvenssi. Fragmenttiin A kuuluva DNA on kahden Pstl- restriktioentsyymikohdan (CTGCAG) valinen alue. Kuviossa 3 esitetaan env-geenin fragmenttien B ja C (katso kuvio 1) DNA-sekvenssi ja siita johdettu polypeptidisekvenssi. Kuviossa annetaan koko env-geenin sekvenssi. Fragmentti B 25 on kahden osoitetun Pstl-kohdan valissa oleva DNA.

Fragmentti C alkaa esitetysta (toisesta) KpnI-kohdasta ja paattyy samaan Pstl-kohtaan kuin fragmentti B. Allevii-vauksin on merkitty kohdat PstI = CTGCAG, Kpnl = GGTACC ja Bglll = AGATCT.

30 Vaikka tama geeni on saman kokoinen ja pituinen kuin muut sekventoidut env-geenit, tehtiin systemaattinen tutkimus kayttåmalla tata geenia.

Tassa kuvattavan tutkimuksen tuloksena pystyttiin identifioimaan muutamia env-geenin koodaaman proteiinin 35 immunologisesti dominoivia osia. Havaittiin, ettå taman keksinnon mukaiset immunokernialliset reagenssit voisivat 91282 9 edullisesti sisåltåå mainittuja immunologisesti dominoivia alueita vastaavia tai jaljitteleviå peptidejå.

Eras soveltuva inununologisesti dominoiva alue iden-tifioitiin aminohapposekvenssistå, joka on HAT-3:n avoimen 5 env-lukukehyksen aminohappojen 30 ja 181 vålisså nåmå aminohapot mukaan luettuina (pylvas A kuviossa 7), ja se vastaa esimerkiksi HTLV-III:n /Ratner et al., Nature 314 (1985) 277-284^7 aminohappo jen 38 ja 188 (nåmå mukaan luettuina) valista aluetta; ARV-2:n /Sanchez-Pescador et al., 10 Science 227 (1985) 484-492_7 aminohappo jen 38 ja 187 (nama mukaan luettuina) valista aluetta; ja LAV:n /Wain-Hobson et al., Cell 40 (1985) 9-177 aminohappojen 38 ja 193 (nama mukaan luettuina) valista aluetta. Nama aminohappo-sekvenssit esitetåån kuviossa 8.

15 Eras toinen soveltuva immunologisesti dominoiva alue havaittiin aminohappojen 463 ja 520 (nama mukaan luettuina) valisessa aminohapposekvenssissa ja tarkemmin ilmaistuna HAT-3:n aminohappojen 483 ja 520 (nama mukaan luettuina) valisella alueella (pylvååt B ja vastaavasti 20 B kuvion 7 alareunassa), jotka alueet vastaavat esimerkiksi HTLV-III:n aminohappoja 463-519 (tarkemmin ilmaistuna 482-519), ARV-2:n aminohappoja 461-518 (tarkemmin ilmaistuna 481-518) ja LAV:n aminohappoja 468-524 (tarkemmin ilmaistuna 487-524) (kuviot 9A ja vastaavasti 9B).

25 Eras immunologisesti dominoiva alue havaittiin lisaksi HAT-3:n avoimen env-lukukehyksen aminohappojen 473 ja 642 valisessa aminohapposekvenssissa (pylvas C kuvion 7 alareunassa), joka sekvenssi vastaa esimerkiksi HTLV-III:n avoimen env-lukukehyksen aminohappoja 571-640 30 ja LAV:n avoimen env-lukukehyksen aminohappoja 576-645.

Nama neljå sekvenssia esitetaan kuviossa 10.

Viela eras immunologisesti dominoiva alue loydet-tiin HAT-3:n avoimen env-lukukehyksen aminohappojen 643 ja 692 ja tarkemmin ilmaistuna aminohappojen 643 ja 683 35 vålisså olevasta aminohapposekvenssista (pylvåat D ja vastaavasti D"*· kuvion 7 alareunassa) , joka vastaa esimerkiksi 1 o HTLV-III:n avoimen env-lukukehyksen aminohappoja 641-690 (tarkemmin ilmaistuna 641-681) ja LAV:n avoimen env-lukukehyksen aminohappoja 646-695 (tarkemmin ilmaistuna 641-681). Nåmå neljå sekvenssiå esitetåån kuvioissa 11A 5 ja vastaavasti 11B.

Vielå eras immunologisesti dominoiva alue havait-tiin HAT-3:n aminohappojen 693-739 ja tarkemmin ilmaistuna aminohappojen avoimen env-lukukehyksen 716-739 vålisesså aminohapposekvenssisså (pylvååt E ja vastaavasti E"*- ku-10 vion 7 alareunassa), joka vastaa esimerkiksi HTLV-III:n avoimen env-lukukehyksen aminohappoja 691-737 (tarkemmin ilmaistuna 714-737), ARV-2:n avoimen env-lukukehyksen aminohappoja 691-737 (tarkemmin ilmaistuna 714-737) ja LAV:n avoimen env-lukukehyksen aminohappoja 696-742 15 (tarkemmin ilmaistuna 719-742). Nåmå neljå sekvenssiå esitetåån kuvioissa 12A ja vastaavasti 12B.

Plasmidit p24-10SB.3, pENVKPN45 ja pGAG8, ja eris-tetty HTLV-III-viruskanta HAT-3 on talletettu the American Type Culture Collectioniin, 12301 Parklawn Drive, Rock-20 ville, Maryland 20852, 17. joulukuuta 1985 ennen tåmån patenttihakemuksen jåttåmistå, ja niille on annettu ATCC-numerot 53375, 53374, 53373 ja vastaavasti 40213.

Plasmidit p2-10SB, p28-23EB.4, p28-EB.l ja P45ESI.3 on talletettu the American Type Culture Collectioniin 25 18. heinåkuuta 1986 ennen tåmån patenttihakemuksen jåttå mistå, ja niille on annettu ATCC-numerot 67159, 67157, 67158 ja vastaavasti 67160.

Esimerkki 1

Isåntåkanta 30 DH5 A(lac)Ul69. Tamå E. coli -kanta on DHl:n (ATCC, Rockville, Maryland), joka on lac+ /Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166 (1983) 5577, johdos.

Tavanomaista E. coli -geenitekniikkaa kåytettiin (lac)Ul69-deleetion aikaansaamiseen. Tåmå deleetio pois-35 taa tåydellisesti lac-operonigeenit ja mahdollisen homo-logian plasmidien kanssa. Låhtokanta DH5 on eristetty 91282 1 1 spontaani DHl-johdos, jonka transformoitumistiheys on 10-kertainen DHlreen verrattuna. Tåman kannan taydellinen genotyyppi on DH5, A(argP - lac)Ul69 endAl hsdRl'7 (rk · mk+) supE44 thi-lA - reCAl gyrA96 relAl.

5 Esimerkki 2

Kloonausvektori Nåissa kokeissa kaytetyt kloonausvektorit ovat pBR322:n (ATCC, Rockville, Maryland) johdoksia. Kaikki HTLV-III-kloonit on johdettu plasmidista pMLB1113.Igl.

10 Tama plasmidi sisaltaa osan E. colin lac-operonista kloo-nattuna pBR322:n EcoRI-kohdan (nukleotidi 4361) ja Aval-kohdan (nukleotidi 1425) valiin. lac-geenit ovat orientoi-tuneina myotapaivaan tavanomaisessa pBR322:n esitystavassa. lacZ-geenifragmentti on peraisin plasmidista pMLB1034 15 (Berman et al., US-patenttijulkaisu 4 503 142, mainitaan tassa viitteena). lacl-geenifragmentti on peraisin plasmidista pMC9 /Calos, Nature 274 (1978) Ί62-Ί65]. Nåmå geenit ovat kloonattuina luonnossa esiintyvasta, lacl-geeniå edeltavasta HincII-kohdasta luonnossa esiintyvaan Aval-20 kohtaan, joka on kodonin 70 kohdalla lacY:ssa. Tama vastaa pMLBH13.IGl-sekvenssin nukleotideja 13-4667. (lac-opero-nin mainittua sekvenssia on kuvattu Silhavyn et al., supra, julkaisun liitteessa M sivuilla 273-281).

Tassa vektorissa on tehty muutamia muutoksia lac-25 geeneihin tavanomaisin geeniteknisin menetelmin. laclrn promoottorissa on pistemutaatio (W.T. C ->T; pMLB1113.IG1:n nukleotidi (n.t.) 28), joka johtaa respressorisynteesi-tason kymmenkertaistumiseen (LacI^^). lacZ-geenin kodoniin 5 on tuotu useita kloonauskohtia plasmidia PUC8 vårten 30 /vieira ja Messing, Gene 19 (1982) 259-268J7 (pMLBlll3. IG1: n nukleotidit 1310-1345). lacZ:n kodonin 1006 kohdalla luonnossa esiintyva EcoRI-kohta poistetaan pistemutaatiolla (W.T. C -> A; pMLBll3.IG1:n n.t. 4352).

lac-geeneihin tehtyjen muutosten lisaksi on pBR322-35 sekvenssiin lisatty yksinkertaisen saikeen 1 faagialoitus-kohta. 514 emasparin fragmentti bakteriofagi M13:sta (ATCC, 12

Rockville, Maryland) on kloonattu kahden vierekkaisen Ahalll-kohdan valiin kauemmaksi bla-geenista (pBR322:n nukleotidit 3232-3251 korvataan M13:n nukleotideilla 5488-6001 ; pMLBH13 . IGl: n nukleotidit 6472-6985). Tama 5 Ml3-alue saa aikaan yksisaikeisen DNA:n muodostumisen pBR322-johdoksesta avustaja-M13-faagin lasnaollessa /*Zagursky ja Berman, Gene 27 (1984) 18 3—191J7 - Nailla toi- minnoilla ei ole vaikutusta pBR322:n normaaliin replikoi-tumiseen eika sailymiseen, ja ne ovat aktiivisia vain M13-10 infektion aikana.

Lahtoaineena toimiva kloonausvektori pMLB113.IGl antaa isåntåsolu DH5 A(lac):lle ampisilliiniresistenssin ja kyvyn tuottaa hyvin saådellysti luontaista y^-galakto-sidaasia. Taman vektorin lac -johdosta kaytettiin moniin 15 kaytannon kloonauskokeista. Tata johdosta muutettiin

BamHI-kohdasta (nukleotidi 1320) pilkkomalla ja taydenta-malla DNA-polymeraasilla. Tasta plasmidista kaytetåan mer-kintaa pMLBH20.IGl. Kaikki naiden kloonausvektoreiden muutokset on vahvistettu yhdistelmaalueiden DNA-sekvenssi-20 analyysilla.

Tassa tutkimuksessa kaytettyjen kahden kloonaus-vektorin (pMLBH3.IGl ja pI4LBll 20 . IGl) kaaviokuvat esite-taan kuviossa 4. Yhtenaisen viivan ymparoimat laatikot edustavat E. colin lac-geeneja. M13:n geenien valinen alue 25 osoitetaan varjostetulla laatikolla. Kuviossa nakyvat myos ampisilliiniresistenssia koodaava geeni (bla) ja pBR322:sta tullut replikoitumisen aloituskohta (ori). Kehyksensiirtomutaatio (+1) tuotiin osoitettuun moninker-taiseen kloonauskohtaan. Tama mutaatio varmistettiin maa-30 rittamalla kloonauskohdan DNA-sekvenssi.

Esimerkki 3

HTLV-III:n DNA

Kaytettiin bakteriofagissa olevan HTLV-III:n pro-faagin genomikloonia ( λ HAT-3) . Tama nimenomainen klooni 35 sisaltåa noin 9 kiloemasparin (ke) HTLV-III-DNA-fragmentin, joka on peraisin virus-LTR:ien kahdesta luonnossa esiin- 91282 13 tyvasta Sstl-kohdasta, Taman kloonin yksinkertaistettu entsyymikohtakartta esitetaan kuviossa 1. Tahan sisåltyy julkaisemattomia DNA-sekvenssitietoja gag- ja env-geeni-alueista (kuviot 2 ja 3). Tama antoi meille mahdollisuuden 5 saada tiettyjå restriktioentsyymifragmentteja alkuperai-sesta kloonista ja laboratoriossa konstruoiduista erilai-sista aliklooneista (kuvio 5). Osittainen kartta esitetaan kuvion 5 ylåreunassa. Kloonin talla alueella olevien EcoRI-fragmenttien koot osoitetaan kuviossa. Nåma fragmen-10 tit alikloonattiin plasmidivektoriin pMLBH13.IG1. Klooni 29 sisaltaå faagista tulevan 8,3 ke:n EcoRI-fragmentin.

Klooni 29 sisaltaa 3,0 ke:n ja 1,1 ke:n EcoRI-fragmentit. Naiden alikloonien pilkkominen asianmukaisilla entsyy-meillå (kuviossa esitetyllå tavalla) johti laatikoilla 15 merkittyihin kolmeen låhtoaineplasmidiin.

Esimerkki 4

Plasmidi pGAG8 (katso kuvio 5)

Tama klooni johdetaan plasmidista pMLB1120.IGl insertoimalla HTLV-III:n p24-koodausalueelta peraisin ole-20 va 506 emasparin Pstl-fragmentti (katso kuvio 2). Tama DNA koodaa 169 aminohapon polypeptidia, joka on gag:n p24-osan sisalla ja edustaa noin 70 % p24-geenituotteesta.

Kun operoni oli indusoitu 10 ^ M isopropyylitio-galaktosidilla (IPTG), syntyi hybridiproteiinia, jonka 25 molekyylipaino oli 134 kD ja jonka osuus solun kokonais-proteiinista on noin 10-15 %. Samalla syntetisoitui vas-taava måara luonnollista kokoa olevaa ^-galaktosidaasi-monomeeria. Hybridi-Gag-LacZ-proteiini oli eristettavissa liukenemattomassa muodossa pelletista, joka saatiin sentri-30 fugoimalla aanikasiteltyja soluja pienella nopeudella (noin 10 000 x g). Proteiini liuotettiin takaisin 7 M guanidiinihydrokloridiin ja sailytettiin 0,05 M guani-diinihydrokloridiliuoksessa.

Esimerkki 5 35 Plasmidi pENVPSTl

Tama klooni johdetaan plasmidista pMLB1120.IGl 14 insertoimalla HTLV-III:n env-geenistå peråisin oleva 2339 emasparin Pstl-fragmentti (katso kuvio 3). Tåmå plasmidi edustaa 94 % viruksen koodausalueesta. (Tåma fragmentti sisåltåå myos gp41:a koodaavat sekvenssit, katso edellå.) 5 Tåma klooni on HTLV-III-hybridiproteiinien heikoin tuottaja. Se tuottaa induktion jålkeen noin 1 % Env-LacZ-hybridejå. Tåyskokoista fuusioproteiinia (molekyylipaino 206 K) esiintyy våhiten, mutta se reagoi voimakkaasti posi-tiivisen potilaan seerumin kanssa. Pååhybridiproteiini 10 esiintyy immuunireaktiivisessa vyohykkeesså, joka vastaa molekyylipainoa 149 K. Kaksi muuta -galaktosidaasihybri-diå, joita syntetisoituu vaihtelevia mååriå, esiintyvåt kohdilla 133 K ja 124 K. Merkittåvå vybhyke esiintyy myos /%-galaktosidaasin kohdalla. Kaikki neljå hybridiproteiinien 15 kokoryhmåå reagoivat anti- -galaktosidaasiantiseerumin kanssa, samalla kun kaksi suurimolekyylisintå spesiestå reagoivat HTLV-III-positiivisen potilaan seerumin kanssa.

Esimerkki 6

Plasmidi pENVKPN24 ja sen sukulaisplasmidit 20 Tåmå klooni johdetaan sisåisesta Kpnl - PstI -frag- mentista, joka kloonataan faagiin M13mpl8 /Gene 33 (1985) 10 3—109^7 ja alikloonataan sitten (kåyttåmållå EcoRI-Hindlllra) plasmidiin pMLB113.IGl. Tuloksena oleva klooni (pENVKPN) on LacZ , koska env:n ja lacZ:n lukukehvkset 25 eivåt ole samat. Erilaisia spontaaneja mutantteja, joista kåytetåån nimitystå "pop-ups", eristettiin kåyttåmållå julkaistua ohjelmaa /Berman ja Jackson, J. Bacteriol. 159 (1984) 750-756/. Erås nåistå, pENVKPN24, syntetisoi Env-LacZ-hybridiå noin 5 %:n osuutena. Tåmå klooni erosi 30 pENVPSTl-kloonista siinå suhteessa, ettå 5'-påån PstI- ja KpnI-kohtien vålistå on poistettu 152 kodonia (457 nukleo-tidin deleetio). Tåmå kloonin DNA-sekvenssianalyysi osoit-ti pENVKPN24:n nukleotidin 3225 kohdalla olevan A-ryhmån deleetion, joka yhdiståå uudelleen env-koodausalueen lacZ-35 koodaussegmenttiin. Toisin kuin pENVPSTl-klooni, pENVKPN24 tuottaa pååasiassa tåyskokoisia hybridejå (molekyylipaino 91282 15 noin 200 K) ja erastå toista våhemmån runsaasti esiinty-våa proteiinia, jonka molekyylipaino on noin 146 K. Tama plasmidi muutettiin LacZ :ksi tuomalla entsymaattisesti kehyksensiirtomutaatio lacZrn viereiseen Hindlll-kohtaan.

5 Tallåkin kertaa valikoitiin erilaisia LacZ+-johdoksia (katso kuvio 6).

Eras toinen samalla tavalla valikoitu plasmidin pENVKPN Lac+-johdos on plasmidi pENVKPN45. Tamå plasmidi syntetisoi Env-LacZ-hybridiå noin 10-15 %:n osuutena. Tå-10 man kloonin DNA-sekvenssianalyysi osoitti 1024 nukleotidin deleetion.

Kolmas talla valikoinnilla saatu Lac+-johdos on plasmidi pENVKPN28. Tamå plasmidi syntetisoi yhtå suurina pitoisuuksina kuin pENVKPN24 hybridiå, jonka molekyyli- 15 paino on 200 K. Samaa menetelmåå kuin pENVKPN24:n yhtey- desså kåytettiin pENVKPN28:n lacZ -johdoksen muodostami-+ seen. En Lac -mutanteissa on tapahtunut env-geenimateriaa-lin deleetioita. Nåiden johdosten DNA-sekvenssianalyysi osoitti, ettå kaikissa Lac+-mutanteissa oli tapahtunut 20 env-geenimateriaalin deleetioita. Nåiden deleetioiden laa-juudesta on yhteenveto kuvioissa 6 ja 7.

Neljås Lac+-johdos p45ESI.3 konstruoitiin korvaa-malla pENVKPN45:n 118 emåsparin EcoRI-StuI-fragmentti kloonista pENVPSTl saadulla 587 emåsparin EcoRI-StuI-25 fragmentilla.

Esimerkki 7

Virusgeenituotteita (g)p!20, (g)p41 ja p24 vastaa- vien yhdistelmåantigeenien tuottaminen suurina pitoisuuksina 30 LacZ+-klooneihin tehtiin entsymaattisesti muutamia deleetioita in vitro, jotta saataisiin aikaan suuria yhdis-telmåhybridipitoisuuksia (1-15 % solun kaikista proteii-neista). Plasmidin pGAG8 proteiinituotanto oli riittåvå sellaisenaan. Tåmå plasmidi tuottaa vastaavaa yhdistelmå-35 p24:åå kuin eriståmåmme viruskanta.

16

Plasmidi pENVKPN45 tuottaa (g)p120:å vastaavaa tuo-tetta {*>-galaktosidaasihybridinå pitoisuutena 10-15 %. Plasmidit pENVKPNH3 28-45 ja p45ESI.3 ovat yhdistelma-g (p120)-hybridiproteiinien lisalahteita. pENVKPNH3 28-45 5 ja p45ESI.3 tuottavat -galaktosidaasihybridiproteiineja 5-10 %:n osuutena solun kokonaisproteiinista.

Plasmideille pENVPSTH3 2-10 ja pENVKPNH3 24-10 tehtiin restriktionukleaasipilkkominen ja uudelleenliga-tointi (katso kuvio 6).

10 Kuvion 7 ylaosassa on HTLV-III:n env-geenin kartta.

Kolme varjostettua aluetta ovat hydrofobisia alueita, jot-ka vastaavat signaalisekvenssia (kauimpana vasemmalla), p41-esiasteen N-paassa olevaa aluetta ja transmembraani-ankkurisegmenttiå (kauimpana oikealla). Pystyviivat kodo-15 nien 30, 144 ja 810 kohdilla vastaavat kloonauskohtia PstI, Kpnl ja PstI, joita kuviossa 3 edustavat nukleo-tidit 112, 544 ja vastaavasti 2454. Proteolyyttinen pilk-koutumiskohta, joka johtaa p120:een (vasemmanpuoleinen) ja p41:een, osoitetaan merkilla V.

20 Kauimpana oikealla olevassa sarakkeessa on kloonin numero (viittaus kuvioon 6). Avoimet pylvåat osoittavat env-geenista peraisin olevan DNA:n pituuden kussakin kloo-nissa. Naiden pylvaiden sisalla olevat numerot viittaavat ensimmaiseen env-kodoniin ja viimeiseen env-kodoniin 25 (kaytettaessa referenssina pENVPSTl-sekvenssia). Nama yksityiskohdat maåritettiin DNA-sekvenssi-informaation avulla.

Nel ja pylvasta p28EBl.l, p28-23EB4.1, p2-10SB.5 ja p24-10SB.3 edustavat "DNA":ta joka koodaa pENVPSTl:n 30 (n:o 1) neljaS muuta geenituotetta. Proteiinisynteesin sisainen aloitus tapahtuu luonnossa esiintyvasta metionii-nikodonista 483 låhtien, jota edustavat pystysuorat katko-viivat. Tamån kohdan merkintanå kuviossa on (M). Kaikki muut pylvaat edustavat DNA-sekvenssin tarkasti måariteltyja 35 muutoksia, jotka johtavat hybridiproteiinien, joilla on kuviossa esitetty molekyylipaino, tuotantoon. Kaikki hybri- 91282 17 diproteiinit antavat positiivisen reaktion anti-y4 -galakto-sidaasiantiseerumin kanssa. env:n kartan ylapuolella ole-vat c:t edustavat kysteiiniryhmia. Varjostetut pystyviivat osoittavat geneettiseen kasittelyyn kaytettyjen kahden 5 Bglll-kohdan sijaintia. (Katso kuvio 6.)

Esimerkki 8 HAT-3;n env-geenitaustaisten polypeptidien immuno- kemiallinen tutkiminen

Esimerkin 7 mukaisesti tuotettujen env-johdospoly-10 peptidien immunokemialliset ominaisuudet tutkittiin seka ELISA:11a etta Western-tåplamenetelmållå. Nåihin testeihin kaytettiin keratyista soluista saatua, liuotettua mate-riaalia.

A. env-peraisten yhdistelmapolypeptidien liuosmuo-15 toon saattaminen

Keratyt solut suspendoidaan puskuriin, joka sisaltaa 50 mmol/1 Tris:ia ja 0,1 mmol/1 PMSFraa (pH 7,8) suhteessa 1 g soluja/4 ml puskuria. Solut hajotetaan French-paine-kammiossa, jossa sisainen tyoskentelypaine on 138 MPa.

20 Hajotetut solut sisaltava suspensio poistetaan painekam-miosta virtausnopeudella 15 pisaraa/min jaahdytettyyn astiaan ja sentrifugoidaan kiihtyvyydella 48 000 x g 30 min lampotilassa 4°C. Saatu pelletti (P^) pestaan liuoksella, joka sisaltaa 50 mmol/1 Trisiia ja 0,1 25 mmol/1 PMSF:aa, ja sentrifugoidaan edella kuvatulla taval-la. Jaljelle jaanyt P^-pellettiaines suspendoidaan sitten spaatelin tai kumipaisen sekoitussauvan avulla homogeeni-sesti liuokseen, joka sisaltaa 8 mol/1 ureaa, 50 mmol/1 Trisiia, 10 mmol/1 EDTA:a, 1 mmol/1 DH:ta ja 0,1 mmol/1 30 PMSF:aa (pH 8,1); P^n valmistukseen alunperin kaytettyjen solujen grammamaaran suhde 1iuotuspuskurin millilitra-maaraan on 1:4. Tata suspensiota aanikasitellaan 45 min huoneen lampotilassa kåyttamalla aanikasittelyvesihaudet-ta. Liuosta sentrifugoidaan kiihtyvyydella 200 000 x g 35 45 min lampotilassa 4°C. Tuloksena oleva supernatantti, S2> voidaan dialysoida PBS:aa vastaan tai liuosta vastaan, 18 joka sisåltåå 50 mmol/1 Tris:iå, 10 mmol/1 EDTA:a, 1 mmol/1 DH:ta ja 0,1 mmol/1 PMSFraa (pH 8,1), urean poistamiseksi, tai se voidaan jåttåå ureapuskuriin. Siten saatua fraktio-ta S2 kåytettiin ELISA:ssa ja Western-tåplåanalyysisså.

5 B. ELISA

ELISA toteutettiin seuraavasti: 1. Mikrotitrauslevyn syvennykset påållystetåån 100 ^ul:lla antigeenia, joka saadaan dialysoimalla kohdan A mukaisesti saatu S2-fraktio 0,05 M natriumkarbonaatti/- 10 bikarbonaattipuskuria (pH 9,6) vastaan. Paallystys tehdåån låmpotilassa 4°C liuoksella, jossa pitoisuus on 0,5-10 ^,ug/ml, ja se kestaa 1-3 vrk antigeenipreparaatista riip-puen.

2. Antigeeni imetaan pois, ja syvennykset suojataan 15 Blottolla (5 % rasvatonta kuivamaitoa tislatussa H20:ssa).

Tama paallystys kestaa 45 min huoneen låmpotilassa.

3. Levyjen suojauksen aikana inkuboidaan antiseeru-meja, jotka sisåltåvåt HTLV-III-antigeeneille spesifisiå vasta-aineita ja jotka on laimennettu suhteessa 1:100 20 Blottolla, joka sisåltåå 10 % vuohen seerumia/PBS:åå ja 1 % Triton X-100:a, 30 min låmpotilassa 37°C HTLV-III-antigeeneja koodaavaa vektoria sisåltåmåttomån E. colin S2~preparaatin kanssa.

4. Blotto imetaan pois syvennyksistå, lisåtåån 25 100^,ul absorboitua laimennettua antiseerumia, ja inkuboi daan mikrotitrauslevyå 90 min låmmittimesså låmpotilassa 37°C.

5. Seerumi imetåån pois syvennyksistå, ja ne pes-tåån kolmesti 1-%:isella glyseroliliuoksella, joka sisål- 30 tåå 0,05 % Tween 20:å.

6. Sen jålkeen lisåtåån kuhunkin syvennykseen 100 ^ul konjugaattiliuosta, joka sisåltåå 0,143^,ug vuohen anti-ihmis-IgG(H+L)/HRP:tå (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) 1 ml:ssa 10-%:ista vuohen see- 35 rumia/PBS:åå, joka sisåltåå 10 % triton X-100:a, ja inkuboidaan 60 min låmpotilassa 37°C.

91282 19 7. Konjugaatti imetåån pois, ja syvennykset peståån kuudesti.

8. Kuhunkin mikrotitrauslevyn syvennykseen lisåtåån 100^,ul TMB: ta, ja annetaan reagoida 30 min huoneen låmpo- 5 tilassa. Sen jalkeen reaktio pysåytetåån lisååmållå 100 ^.ul 4 N H2SO^:a, ja mitataan absorbanssi aallonpituudella 450 nm.

C. Western-taplaanalyysi

Tata analyysia vårten S2:n HTLV-III-antigeenit 10 erotetaan ensin SDS-PAGE:lla kåyttåmållå Laemmlin menetel-måå /Nature 227 (1970) 680-6857, ja siten erotetut anti-geenit siirretåån sitten nitroselluloosalevyille Towbinin et al. /Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 4350-4_7 kuvaamalla menetelmalla.

15 D. Hybridiproteiinien reaktiivisuus

Taulukon I ensimmåisessa sarakkeessa lueteltujen plasmidien tuottamilla hybridiproteiineilla påallystettiin mikrotitrauslevyt, ja ne reagoivat taulukossa I esite-tylla tavalla seerumin 1 ja seerumin 2 kanssa, jotka sisal-20 sivat gp41-vasta-aineita ja vastaavasti seka gp41- etta gpl20-vasta-aineita, kohdassa B kuvattua koejarjestelya kaytettaessa. Nåmå tulokset vahvistavat kuviossa 7 pyl-våillå A, B, B"*· ja C esitettyjen peptidisekvenssien reak-tiivisuuden. Suurempimolekyyliset hybridiproteiinit valai-25 sevat proteiinisynteesiå, joka alkaa lac-operonin vaiku-tuksesta (esimerkiksi hybridi, jonka molekyylipaino on 206 K), ja pienempimolekyyliset hybridit ovat proteiineja, joiden synteesin aloittajana on luonnossa esiintyvå metio-niinikodoni 483.

20

Taulukko I

Seerumi 2 iMaridin Seerumi 1 (gp4i + ja 5 Plasmidi molekyyli- (gp41+) gpl20+) paino pENVPST 1 206-149K + + pENVPSTH3 1-2 200-149K + + PENVPSTH3 2-10 200-140K + + p45ESl.3 185K - + 10 pENVKPN 24 200-1 SOK + + pENVKPN 28 200-149K + + pENVKPNH3 28-23 190-145K + + pENVKPNH3 24-10 180-133K + + pENVKPNH3 28-24 155-118K - + 15 pENVKPNH3 28-45 152-117K - +

pENVKPN 45 150K

E. Yhdistelmåproteiinien yhdistelman kaytto HTLV-20 III:n vastaisten vasta-aineiden testaamisessa a. Joukko seerumeita, jotka olivat peraisin yksi-loistå, joilla on vaara joutua HTLV-III:n infektoimaksi, tutkittiin ELISA:11a kayttåmalla kohdassa B kuvattua menettelya. Levyt paallystettiin HTLV-III-yhdistelmå-25 proteiineilla (kohdassa A kuvatulla tavalla valmistetuilla S2~fraktioilla). Levyt a. paallystettiin kloonista 24-10SB.3 saaduilla proteiineilla (2,5^ug/ml), levyt b. kloonista gag-8 saaduilla proteiineilla (1,5yUg/ml) ja levyt c. naiden kahden proteiinin seoksella (2,5^ug/ml 30 24-10SB.3 + 1,5^,ug/ml gag-8). Tuloksia verrattiin koh dassa C. kuvatuilla Western-tåplåmenetelmilla (WB) ja kaupallisella ELISA: 11a (Vironostika) , joissa kunimassakin kaytetaan luonnon viruslysaattia antigeenilåhteena, saa-tuihin tuloksiin (taulukko II).

91282 21

Taulukko II

Levyt: a b c VIRONOS- antiqeeni: 24-10SB3 gag-8 yhdistelmåt WB jika 5 nåvte 1 0,24 + 0,27 - 0,61 + 41 1,04 + 2 0,19 - 1,26 + 1,32 + 24,41 0,30 + 3 0,46 + 0,31 - 0,88 + 41 2,65 + 4 1,79 + 0,41 + 2,51 + 41,24 >3,00 + 1 0 5 1,41 + 0,74 + 2,50 + 41,24 >3,00 + 6 0,33 + 0,53 + 0,80 + 24 0,12 - 7 0,22 - 0,36 - 0,55 - neg. 0,20

Lievåsti positiivinen vertailunåvte 0,39 + 0,62 + 1,52 + 41,24 1,31 + 15 NHS 0,14 - 0,29 - 0,40 - neg. 0,12 -

Katkaisu- arvo 0,24 - 0,39 — 0,60 — — 0,68 20 Edellå esitetyt tulokset osoittavat, etta testi- jarjestelma, jossa kaytetaån kahden taman keksinnon mukai-sen antigeenisen polypeptidin yhdistelmåa, toimii luotet-tavairanin kuin jårjestelmå, jossa kaytetaån yhtå antigeenisen polypeptidin tyyppiå.

25 b. Levyt d. påållystettiin kolmen yhdistelmåproteii- nin /kloonit gag-8 (1,5^,ug/ml) , 24-10SB.3 (2,5yUg/ml) ja p45 ESL3 (2,5^ug/ml)_7 yhdistelmållå edella kuvatulla tavalla. Joukko seerumeita, jotka oli aiemmin analysoitu anti-HTLV-III-vasta-aineiden suhteen Western-tåplåmenetel-30 mållå ja ELISA:lla (Vironostika), joissa kaytetaån luon-non viruslysaattia antigeenilåhteenå, tutkittiin nåillå levyillå samoin kuin levyillå, jotka sisålsivåt gag-8- ja 24-10SB.3-antigeenia (kuvattu levy c.).

22

Taulukko III

Levyt: d c VIRONOSTIKA

paallystetty: 3 antigeenilla 2 antigeenilla virus- , % lysaatilla

Naytteet (n) 5 Western-tåplamene- telmassS positiivisia 100 99 pos. 89 pos. 95 pos.

Tuloksista kay ilmi, etta testijarjestelma, jossa kaytettiin kolmen antigeenisen polypeptidin yhdistelmaå, 10 tunnistaa positiivisiksi merkittavåsti useampia naytteita kuin Western-tåplaanalyysi.

F. p41-yhdistelmaproteiinin polypeptidiketjun pituuden vaikutus

Levyt paallystettiin seuraavien kloonien S2-prepa-15 raateilla: levyt e. 2-10SB.3:11a (2,5^ug/ml), levyt f.

28 EB1.1:11a (2,5^ug/ml) ja levyt £. 28.23 EB4.1:llå (2,5yug/ml). Seerumit testattiin kayttåmalla nåitå levyja edella kuvatuilla menetelmilla. Tuloksia (taulukko IV) verrataan levyilla a. (paallystettyjå kloonilla 24-10SB.3) 20 ja Western-taplamenetelmalla saatuihin tuloksiin.

Taulukko IV

Levy; ® * i S Western- antigeeni: 24-10 SB.3 2-10 SB.5 28 EB1.1 28-23 EB4.1 tåpla virus- oc lysaatilla ^ -3 Naytteet 11 0,23 - 2,30 + 2,83 + >3,00 + 41,24 12 0,7 - 0,27 - 0,34 - 0,48 - 41 heikko 13 0,19 - 1,05 + 0,78 + 0 ,94 + 41,24 14 0,15 - 0,85 - 1,47 + 1,95 + 41,24 30 15 0j24 + 1,20 + 1,44 + 1,93 + 41 16 0,46 + >3 + >3 + >3 +41 17 0,24 + 1,42 + 1,68 + 2,00 + 41 NHS 0,14 0,82 0,68 0,63 35 Katkaisu- arvo 0,24 0,92 0,78 0,73 91282 23

Nama tulokset osoittavat, etta jotkut seerumit, jotka eivåt reagoi levyn a. kanssa, antavat positiivisen reaktion levyjen e. , f. ja £. kanssa. Tasta tuloksesta paåtellaan, etta kloonissa 2-10 SB.5. (pylvås D kuvassa 7) 5 oleva ylimåaråinen polypeptidifragmentti saa aikaan yli-maaraisen vasta-aineryhman sitoutumisen ja on siten eras antigeenideterminantti.

Eras ero havaitaan naytteessa 14, joka oli negatii-vinen seka levyn a. etta e. kanssa ja merkittavasti posi-10 tiivinen seka levyn f. etta kanssa. Tåma tulos viittaa siihen, etta kloonin 28 EBl.1 klooniin 2-10 (pylvas E kuviossa 7) nahden ylimåaraisessa polypeptidifragmentissa esiintyy eras antigeenideterminantti.

Lisaksi on houkuttelevaa otaksua, etta gp41:n trans-15 membraanisegmentti (varjostettu alue kuvion 7 ylimmassa pylvaassa aminohappojen 684 ja 715 valissa) ei osallistu vasta-aineiden sitomiseen in vivo. Tastå otaksumasta seu-raa, etta D:n ja E:n antigeenideterminantit sijaitsevat pylvailla D^" ja vastaavasti esitetyissa segmenteissa.

Claims (29)

1. Immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siita, etta se sisaitaa kahden tai useanunan synteettisen 5 polypeptidisekvenssin yhdistelmaa, jolloin sekvenssit on valittu seuraavista: polypeptidisekvenssi, joka sisaitaa vahintaan yhta HTLV-III-isolaatin, HAT-3:n gag-antigeenin antigeenide-terminanttia; 10 polypeptidisekvenssi, joka sisåltaa våhintaån yhta HTLV-III-isolaatin, HAT-3:n glykoproteiini gpl20:n anti-geenideterminanttia; ja polypeptidisekvenssi, joka sisaitåa vahintåån yhtå HTLV-III-isolaatin, HAT-3:n glykoproteiini gp41:n anti- 15 geenideterminanttia, ja jolloin isolaatti sisaltåå HTLV- III-isolaatin, HAT-3-viruksen, ATCC 40213, genomi-DNA:ta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitå, etta se sisaltaa poly-peptidiå, joka vastaa gpl20-proteiinin karboksiterminaa- 20 lista, noin 58 aminohapon pituista polypeptidia.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siita, etta se sisåltaa polypeptidia, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet kuin polypeptidilia, jolla on kuviossa 9A esitetty sek- 25 venssi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siita, ettå se sisåltaa polypeptidia, joka vastaa gpl20-proteiinin karboksiterminaa-lista, noin 38 aminohapon pituista polypeptidia.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siita, etta se sisaitaa polypeptidia, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet kuin millå tahansa polypeptidilia, jolla on kuviossa 9B esitetty sekvenssi. 91282

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå polypeptidiå, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet kuin aminohappo-osasekvenssillå, joka ulottuu 5 gp41-proteiinin aminohaposta 53 aminohappoon 122.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siita, ettå se sisåltaa polypeptidia, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet kuin polypeptidillå, jolla on kuviossa 10 esitetty sek- 10 venssi, joka vastaa λHAT-3-sekvenssin aminohappoja 571 -640.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siita, ettå se sisåltåå polypeptidiå, jolla on samat immunokemialliset 15 ominaisuudet kuin aminohappo-osasekvenssilla, joka ulottuu gp41-proteiinin aminohaposta 123 aminohappoon 172.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå polypeptidiå, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet 20 kuin polypeptidillå, jolla on kuviossa 11A esitetty sekvenssi, joka vastaa λHAT-3-sekvenssin aminohappoja 641 -690.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitå, ettå 25 se sisåltåå polypeptidiå, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet kuin aminohappo-osasekvenssillå, joka ulottuu gp4l-proteiinin aminohaposta 123 aminohappoon 163.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå 30 polypeptidiå, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet kuin polypeptidillå, jolla on kuviossa 11B esitetty sekvenssi, joka vastaa λΗΑΤ-3-sekvenssin aminohappoja 641-681.

12. Jonkin patenttivaatimuksista 1-11 mukainen 35 immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå polypeptidiå, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet kuin aminohappo-osasekvenssillå, joka ulottuu gp41-proteiinin aminohaposta 173 aminohappoon 217.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen immunokemialli-5 nen reagenssi, tunnettu siitå, ettå se sisaltaa polypeptidiå, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet kuin polypeptidillå, jolla on kuviossa 12A esitetty sekvenssi, joka vastaa λΗΑΤ-3-sekvenssin aminohappoja 691-737 .

14. Jonkin patenttivaatimuksista 1-11 mukainen immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå polypeptidiå, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet kuin aminohappo-osasekvenssillå, joka ulottuu gp41-proteiinin aminohaposta 196 aminohappoon 217.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen immunokemialli nen reagenssi, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå polypeptidiå, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet kuin polypeptidillå, jolla on kuviossa 12B esitetty sekvenssi, joka vastaa λΗΑΤ-3-sekvenssin aminohappoja 714- 20 737.

16. Jonkin patenttivaatimuksista 1-15 mukainen immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå polypeptidiå, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet kuin aminohappo-osasekvenssillå, joka ulottuu 25 gpl20-proteiinin aminohaposta 30 aminohappoon 181.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå polypeptidiå, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet kuin polypeptidillå, jolla on kuviossa 8 esitetty sek- 30 venssi.

18. Synteettinen polypeptidi, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå våhintåån yhden aminohapposekvens-sin, jolla on samat immunokemialliset ominaisuudet kuin HTLV-III-isolaatin λΗΑΤ-3-:η aminohapposekvenssillå, joka 35 isolaatti sisåltåå HTLV-III-isolaatin, HAT-3-viruksen ATCC 91282 40213, genomi-DNA:ta ja joka polypeptidi on valittu seu-raavista: gpl20-proteiinin karboksiterminaalinen, 38 aminoha-pon pituinen polypeptidi; 5 aminohappo-osasekvenssi, joka ulottuu gp41-proteii- nin aminohaposta 53 aminohappoon 122; aminohappo-osasekvenssi, joka ulottuu gp41-proteii-nin aminohaposta 123 aminohappoon 163; aminohappo-osasekvenssi, joka ulottuu gp41-proteii- 10 nin aminohaposta 196 aminohappoon 217; ja aminohappo-osasekvenssi, joka ulottuu gpl20-pro-teiinin aminohaposta 30 aminohappoon 181.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen synteettinen polypeptidi, tunnettu siitå, ettå se sisaltaå va- 15 hintaan yhden kuvioissa 8, 9A, 9B, 10, 11A, 11B, 12A ja 12B esitetyn aminohapposekvenssin, joka vastaa λΗΑΤ-3-sek-venssin osaa.

20. Yhdistelma-DNA, tunnettu siita, ettå se sisaltåa DNA-sekvenssin, joka koodaa patenttivaatimuk- 20 sen 18 tai 19 mukaisen polypeptidin tuotantoa.

21. Plasmidi, tunnettu siita, etta se si-saltaa patenttivaatimuksen 20 mukaisen yhdistelmå-DNA:n.

22. Bakteeri-isåntåsolu, tunnettu siita, ettå se on transformoitu patenttivaatimuksen 21 mukaisella 25 plasmidilla.

23. HTLV-III-isolaatti λΗΑΤ-3, joka sisaltaå HTLV-Ill-isolaatin, HAT-3-viruksen ATCC 40213, genomi-DNA:ta.

24. Patenttivaatimuksen 21 mukainen plasmidi, tunnettu siitå, ettå se on johdettu patenttivaati- 30 muksen 23 mukaisesta HTLV-Ill-isolaatista.

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen plasmidi, tunnettu siitå, ettå se on p24-10SB.3, ATCC 53375, pENVKPN45, ATCC 53374, pGAG8, ATCC 53373, p2-10SB.5, ATCC 67159, p28-23EB.4, ATCC 67157 tai p28-EB.l, ATCC 67158.

26. Patenttivaatimuksen 24 mukainen plasmidi, tunnettu siita, ettå se on pENVPSTl, pENVPSTH3, pENVPSTH3 1-2, pENVPSTH3 2 - 10, p2 - 10 EB.3, pENVKPN, PENVKPN24, pENVKPNH3 24, pENVKPNH3 24 - 10, pENVKPN 28, 5 pENVKPNH3 28, pENVKPNH3 28 - 23, pENVKPNH3 28 - 24 tai pENVKPNH3 28 - 45, jotka plasmidit on kuvattu kuvioissa 6 ja 7 seka selitysosan esimerkeissa 6 ja 7 ja taulukossa I.

27. Menetelma patenttivaatimuksen 21 mukaisen plas-midin valmistamiseksi, tunnettu siita, ettå 10 (a) insertoidaan HTLV-III:sta saatu cDNA-sekvenssi plasmidiin soluisannan transformoimiseksi; (b) deletoidaan vaiheessa (a) saadusta plasmidista identifioitavissa ja ilmennettåvisså olevan sekvenssin osa, jolloin saadaan aikaan kehyksen siirtyminen pois sa- 15 masta vaiheesta tåmån sekvenssin suhteen; (c) transformoidaan soluisanta vaiheessa (b) saa-dulla plasmidilla; (d) viljellaan transformoitua isåntåå; (e) valikoidaan ne soluisannåt, joissa esiintyy 20 spontaaneja mutaatioita, jotka saavat aikaan kehyksen siirtymisen samaan vaiheeseen identifioitavissa olevan, vaiheen (b) mukaisen sekvenssin suhteen; (f) viljellaan vaiheessa (e) valikoitua isantaso- lua; 25 (g) valikoidaan isantasolu, joka tuottaa kaytto- kelpoisia mååria polypeptideja, jotka ovat tehokkaasti immunoreaktiivisia HTLV-III-vasta-aineiden kanssa; ja (h) eristetåan ja identifioidaan plasmidit, jotka koodaavat vaiheen (g) mukaisia polypeptideja.

28. Polypeptidi, tunnettu siita, ettå sitå tuottaa isantasolu, joka on transformoitu patenttivaatimuksen 25 tai 26 mukaisella plasmidilla.

29. Immuunimåårityksesså kåytettåvåksi tarkoitettu testivalineistd, tunnettu siita, ettå se sisåltåa 35 jonkin patenttivaatimuksista 1-17 mukaista immunokemial-lista reagenssia. 91282