FI87733C - Foerfarande foer modulering av djurcellers reaktioner in vitro med preparat innehaollande 8-substituerade guaninderivat - Google Patents

Description

1 87733

Menetelmä eläinsolujen reaktioiden moduloimiseksi in vitro 8-substituoituja guaniinijohdannaisia sisältävien valmistei den avulla Tämä keksintö kohdistuu eläinten solujen reagoinnin modulointiin in vitro, ja erityisesti immuuni- ja muiden reaktioiden modulointiin molekyylipainoltaan alhaisia guaniinijohdannaisia sisältävien yhdisteiden avulla.

Eläimien immuunijärjestelmä käsittää Lukuisia perusosia, jotka vaikuttavat erillisesti ja/Lai yhdessä, jotta tämän järjestelmän isäntäeläime 1I e vieraaksi, havaitsemia aineita vastaan vaikutettaisiin tai nämä aineet poistettaisiin tai neutraloitaisiin. Tavallisesti, mutta ei välttämättä, Immuuni-järjestelmän vieraaksi tunnistama aine on peräisin isännän ulkopuolelta. Esimerkkejä tämänkaltaisista ulkopuolisista aineista ovat infektoivat bakteerit ja niiden solutoiminnan sivutuotteet, viruspartikkelit ja niiden proteiinit, hyönteisten pistoissa injektoiduiksi tulleet proteiinit, ja muut samankaltaiset aineet. Autoinimunologisissa sairauksissa, kuten reumaattisessa niveltulehduksessa, isännän Immuunijärjestelmä tunnistaa isännän itsensä tuottamat proteiinit eli • : : itsetuotetut proteiinit vieraiksi.

• »

Immuunijärjestelmän pääasiallisimpina vaikuttavina aineina : ovat leukosyytit, joihin kuuluu tymiiniperäiset lymfosyytit (T-solut) , luuytimen tuottamat lymfosyytit (B-solut) , neutro-fiilit, jotka, inter alia tuottavat hapettavia aineita valmistavia entsyymejä, joista hapettavista aineista mainittakoon . . vetyperoksidi, joka vaikuttaa bakteereihin solumyrkyn tavoin, *·_]· sekä makrofayit, jotka johtavat vieraan aineen tai antigee- nin T-soluun, ja jotka tuottavat lnterleukiini-1 :ksi kutsuttua .'· proteiinia, joka myötävaikuttaa T-solujen muuntumiseen T- avustajasoluiksi. Täydentäjäalne, joka on proteiineista muodostuva yhdistelmämateriaali ja joka vaikuttaa järjestäyty-neellä, portaittaisella tavalla vieraaseen aineeseen, näyt-telee myös merkittävää osaa immuunireaktioissa.

2 87733 B-solut voidaan erottaa T-soluista inter alia, siitä syystä, että niiden membraanipinnoilla on immunoglobuliineja. Immu-noglobuliinit toimivat vasta-aineina.

Immunoglobuliineja on viittä tunnettua luokkaa, jotka on merkitty seuraavasti: IgA, IgD, IgE, IgG ja IgM viiden antigeenisestä erilaisen raskaan proteiiniketjun perusteella, jotka ketjut muodostavat osittain immunoglobuliinimolekyylin. B-soluissa on myös ei-immunoglobuliinisia solun merkkiaineita, joihin kuuluu täydentäjäaineen vastaanottaja (TV), immu-noglobuliinin Fc-osan vastaanottaja (FCV). I-alueisiin liittyvät antigeenit (Ia), sekä joukko toiminnoiltaan erilaisia antigeenejä (Lyb 1-7), jotka kaikki antiseerumit identifioivat, ja joiden lukuisat ominaisuudet korreloivat B-solun kehittymisen ja aktivoitumisen kanssa. Nämä merkkiaineet ovat käyttökelpoisia, kun B-solujen fenotyyppiä identifioidaan.

Koska B-solun immunoglobuliinit vaikuttavat vieraaseen aineeseen tai antigeeniin, niin T-solujen ja erityisesti avustaja-T-solujen uskotaan välttämättä stimuloivan B-soluja jakaantumaan ja erikoistumaan humoraalisen immuniteetin vasta-aineita erittäviksi soluiksi.

Ehkäisevät T-solut myötävaikuttavat humoraalisen immuniteetin säätelyyn, kun taas viivästyvän yliherkkyyden solumyrkyn tavoin vaikuttavat T-solut ja T-solun välittäjät ovat soluvälitteisen immuniteetin pääasialliset vaikuttajat.

T-soluihin kuuluu antigeenejä, jotka on merkitty Lyt ljllä, 2:11a ja 3:11a, jotka viittaavat T-solun toimintoihin. Avus-taja-T-solun esiasteet ovat fenotyypiltään Lyt 1+, 2~ ja 3-. Nämä solut osallistuvat tavallisesti B-solujen aktivointiin ja sääntelyyn.

Avustaja-T-solujen tiedetään osallistuvan immunoglobuliineja erittävien B-solujen aktivointiin ja erikoistamiseen sen jälkeen kun B-solut ovat saaneet ensimmäisen viestin aktivoivalta antigeeniaineelta. Kuitenkin siitä tavasta, jolla T-solut 3 87733 lähettävät toisen aktivoivan ja erikoistavan viestin B-so-luille, kiistellään.

Guanosiini-35’-syklisen monofosfaatin (cGMP) on osoitettu olevan luonnossa esiintyvä, tarvittavan toisen viestin aikaansaava aine. 8-bromiguanosiini-3',5'-syklisen monofosfaatin (8-BrcGMP) on todettu olevan heikko synteettinen solunsisäi-nen lymfosyyttimitogeeni.

Immuunireaktiota voidaan muuntaa keinotekoisella ehkäisyllä (immunoehkäisy) tai elvytyksellä (immunovalmius). Immunoeh-käisy, eli keinotekoisesti aikaansaatu alentunut reagointi-kyky voidaan saada aikaan kuudella yleisellä menetelmällä: (1) antigeeniä antamalla, (2) tiettyjä antiseerumeita tai tiettyä vasta-ainetta antamalla, (3) muita biologisia reagoivia aineita, kuten antilymfosyyttisiä antiseerumeita käyttämällä, (4) lääkeaineita tai hormoneja käyttämällä, (5) sä-teilytyksellä ja (6) poistamalla kirurgisesti imurauhaskudosta,

Immunovalmiuden aikaansaaminen saattaa käsittää sellaisen aineen antamisen, joka aine vaikuttaa immuunireaktion kehittymisnopeuden lisääntymiseen, reaktion intensiteetin tai tason lisääntymiseen, reaktion pidentymiseen, tai reaktion kehitty-·..· miseen muuten ei-immunogeeniselle aineelle.

• ·.. Niitä aineita, joiden tiedetään elvyttävän immuunireaktioita, kutsutaan yleisesti apuaineiksi ja ne voidaan luokitella kah-teen ryhmään: (1) aineet, joilla saadaan yleinen valmius aikaan, eli aineet, jotka elvyttävät sekä solun immuunireaktiota että humoraalista immuunireaktiota laajalle antigeeni-. . joukolle, ja (2) aineet, jotka aiheuttavat yleisen valmiuden muodostumisen, eli aineet, jotka elvyttävät ominaisia reak-** tioita ainoastaan tietyille antigeeneille.

·:·: Aineet, jotka voivat toimia apuaineina, voidaan ryhmitellä • ‘ ; seuraaviin luokkiin: (1) vesi- ja öljyemulsiot, so. Freundin apuaineet, (2) synteettiset polynukleotidit, (3) hormonit, 4 87733 lääkeaineet ja sykliset nukleotidit, (4) endotoksiinit, (5) lymfokiinit ja monokiinit, kuten interleukiinit.

Aine, joka kykenee saamaan immuunireaktion ominaisen valmiuden aikaan, on siirtotekijä, dialysoitavissa oleva leukosyytti-uute (DLU), jota on saatu ihmisen etäisleukosyyteistä. Joissakin julkaisuissa on esitetty, että siirtotekijällä olisi jotakin vaikutusta potilaisiin, joiden immuunitoiminta on puutteellista ja mahdollista vaikutusta syöpäpotilaisiin ja potilaisiin, joiden immuunitoiminta on osittain puutteellista. Kuitenkin tästä tietystä aineesta on vielä paljon opittavaa.

Joissakin tautitiloissa ja fysiologisissa tiloissa, kuten X-sidotuissa gammaglobuliinin puutoksissa, vanhuusoireissa ja lääkeaineiden aiheuttamassa immunoehkäisyssä, B-solujen aktivoituminen ja erikoistaminen puuttuu ja/tai sen taso on alentunut, jolloin isännän immuunireaktiot vaimenevat.

Nämä sairaudet ja tilat ovat tyypillisiä immunoehkäistyssä tilassa. Tällöin elvyttävä aktivointi ja erikoistaminen, mikäli nämä voidaan saada aikaan, pyrkivät edullisesti vähentämään taudin ilmenemistä ja/tai parantamaan potilaan tilaa.

Immunovalmiuden tilaa voidaan kuvata kehon kuntona rokottamisen jälkeen. Tällöin immuunireaktiota on jo elvytetty anti-geenireaktion ansiosta, mutta sitä voitaisiin edelleen edullisesti elvyttää, jolloin saavutettaisiin parantunut immuni-teettiaste ja/tai -kesto.

Neoplastinen solujen lisääntyminen, joka käsittää kasvaimet ja metastaattiset sairaudet, voidaan tyypillisesti selittää soluviestien ilmenemisenä, mikä saa aikaan solujen lisääntymisen ilman tavanomaisia sääteleviä rajoitteita ja/tai paljon suuremmalla nopeudella, kuin mikä on tavanomaista vahingoittumattomalle solulle. Eräs tavallinen kemiallisia lääkeaineita käyttävä hoitomuoto neoplastisissa sairauksissa on saattaa neoplastiset solut kosketuksiin sellaisten aineiden alhaisten pitoisuuksien kanssa, jotka aineet yleisesti ottaen ovat 5 37733 solumyrkkyjä, jolloin toiveena on, että yleinen solumyrkyl-lisyys vaikuttaisi nopeasti jakaantuviin neoplastisiin soluihin voimakkaammin kuin tavallisiin soluihin, jolloin aine tappaa selektiivisesti nopeasti jakaantuvat neoplastiset solut. Tämänkaltaisen hoidon haittoihin kuuluu useiden ruumiin-toimintojen yleinen vaimeneminen, käsittäen painon alenemisen ja hiusten lähdön, vatsan ja suoliston häiriöt ja muut senkaltaiset seuraukset.

Interferonit ovat sellainen liukoisten, pienten proteiinien luokka, jotka inhiboivat virusten lisääntymistä. Näitä proteiineja tuottavat sellaiset solut, jotka on infektoitu melkeinpä millä tahansa viruspartikkelilla tai muilla viruksesta peräisin olevilla aineilla, sekä aineilla, kuten bak-teerituotteilla ja monoklonaalisilla vasta-aineilla. Interferonit ovat soluspesifisiä mutta eivät virusspesifisiä. Edistettäessä eläimen yleistä virusinfektioiden vastustuskykyä saattaisi olla edullista, mikäli eläimessä läsnä olevien interferonien tasoa voitaisiin kohottaa ilman luonnossa esiintyvien (patogeenisten) mikrobiologisten interferonia muodostavien aineiden läsnäoloa.

Autoimmunoligisissa sairauksissa isäntä tunnistaa omat proteiininsa antigeeneiksi, ja olennaisinta on, että isäntä puolustautuu itseään vastaan tuottamalla vasta-aineita omiin kudoksiinsa. Koska eläimet tuottavat tavallisesti itseensä joitakin vasta-aineita (itseään vastaan suunnatut vasta-aineet), joiden vaikutukset joko ehkäistään tai niitä siedetään, niin luullaan, että autoimmunologiset sairaudet saattavat aiheutua yliaktiivisesta itseään vastaan kohdistuvien vasta-aineiden tuotannosta, johon tavalliset ruumiin ehkäisyn ja/tai siedon aikaansaavat mekanismit eivät riittävästi reagoi. Tämänka-taisen itseään vastaan suunnattujen vasta-aineiden ylituotannon voidaan katsoa vastaavan vasta-ainetasoltaan neoplas-tisten solujen osoittamaa liiallista solujen lisääntymistä.

Salisylaatit, kuten asetyylisalisylaatti (aspiriini), ovat niitä pääasiallisia kemiallisia lääkeaineita, joita käytetään autoimmunologisia sairauksia, kuten reumaattista niveltuleh dusta vastaan kamppailtaessa.

/ :‘6 87733

Luullaan, että salisylaatit vaikuttavat reumaattisen niveltulehduksen oireita lievittävästi ehkäisemällä prostaglandiinin tuotantoa, ja täten niiden vaikutusta sairaaseen kudokseen.

Kemiallisia lääkeaineita, kuten kultaa, merkaptopuriinia ja D-penisillamiinia on käytetty reumaattisen niveltulehduksen hoitoon, mutta joillakin tämänkaltaisista lääkeaineista on myrkyllisiä tai epämuodostumia aiheuttavia sivuvaikutuksia, ja niiden käyttöön on liittynyt imukudoskasvaimia ja tulehduksia. Tästä syystä olisi edullista saada aikaan kemiallinen lääkeaine, jota voitaisiin menestyksellisesti käyttää autoimmunologisten sairauksien hoitoon ilman edellä mainittuja sivuvaikutuksia .

Lymfokiinit ja monokiinit ovat immunovalmiuden synnyttäviä proteiineja, joita tuottavat lymfosyytit ja monosyytti-makro-fagiperäiset solut, vastaavasti. Makrofagit tuottavat erästä monokiinia, interleukiini-1:ä, kun makrofageja stimuloidaan mitogeenilla tai antigeenillä. Interleukiini-1:ä tarvitaan tavallisesti tuottamaan ensimmäinen antigeenireaktio.

Interleukiini-1 on osallisena T-soluissa interleukiini-2:n tuotannossa. Interleukiini-2 on T-solujen kasvutekijä ja se osallistuu T-avustajasolujen muuntamisessa. Täten interleukiini-1: n tuotannon aikaansaaminen tai proteiineihin reagoivan aktiivisuuden aikaansaaminen T-soluihin, joka aktiivisuus on samankaltainen, kuin minkä interleukiini-1 aiheuttaa, saattaisi olla edullista immuunireaktioiden elvyttämiseksi, erityisesti kun makrofageja ei ole läsnä, tai kun niiden interleukiini-1 :n tuotanto on vajavaista. On todettu, että eläinsolujen reaktiota voidaan moduloida antamalla sellaista valmistetta, joka sisältää aktiivisena aineena vaikuttavan määrän 8-subs-tituoitua guaniinijohdannaista, joka on 9-1'-sitoutunut aldoosiin, jonka johdannaisen aldoosiketjussa on 5 tai 6 hiiliatomia. Antigeenispesifisen humoraalisen immuunireak- 7 87733 tioiden elpyminen, joka aiheuttaa voimakkaan apuaineominaisuu-den, T-solun korvaustekijän kaltainen (TRF-kaltainen) aktiivisuus ja immuunitoiminnot uudelleen aikaansaava aktiivisuus ovat erityisiä esimerkkejä niistä eläinsolun reaktioista, joita voidaan moduloida tämän keksinnön mukaisesti. Guaniinijohdannaisessa ei ole sähköisesti varautunutta toiminnallista ryhmää, kun taas 8-substituoidulla johdannaisella on vetyä voimakkaampi elektroneja poisvetävä induktiivinen vaikutus, ja se käsittää vähemmän kuin 15 atomia. Erityisen edullisia 8-substituoituja guaniinijohdannaisia, joita käytetään eläinso-lujen reaktioita moduloivissa valmisteissa aktiivisina aineina, ovat 8-oksoguanosiini, 8-okso-7-metyyliguanosiini, 8-met-oksiguanosiini, 8-merkaptoguanosiini (8-MGuo) ja 8-merkapto-7-metyyliguanosiini. Käsitteellä "moduloida" sen erilaisissa kieliopillisissa muodoissa, joita tässä käytetään, tarkoitetaan sekä eläinsolun reaktion elvyttämistä että inhibointia, in vitro. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Tämän keksinnön mukaisiin solun reaktioita in vitro moduloiviin valmisteisiin sisältyy myös laimeita määriä fysiologisesti siedettyjä kantaja-aineita. Tämän keksinnön mukaista reak-. . tioita moduloivaa valmistetta voidaan käyttää herättämään eri laisia, vaikkakin toisistaan riippuvia tuloksia, jotka riippuvat mm. antamistavasta, annostuksesta ja siitä solupopulaatiosta, johon valmistetta annetaan. Kantajassa läsnä oleva ak-

Yv tiivinen aine voi olla suspensiona kiinteän 8-substituoidun .· guaniinijohdannaisen muodossa kiinteässä tai nestemäisessä kantajassa tai liuenneena aineena kantajassa.

.·. : Täten kun leukosyytit, kuten T-lymfosyytit, makrofagit, neut- rofiilit tai B-lymfosyytit, saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen valmisteen kanssa, niin niiden leukosyyttien immuunireaktio moduloituu. B-lymfosyyttireaktion (B-solujen reaktion) modulointi voidaan toteuttaa altistamalla B-solut antigeenin vaikutukselle joko ennen B-solujen saattamista kosketuksiin immuunireaktiota moduloivan valmisteen kanssa tai sen kanssa samanaikaisesti.

8 87733 B-soulun immuunireaktiota voidaan myös moduloida altistamalla B-solut antigeenille, jonka jälkeen näin altistetut solut saatetaan kosketuksiin immuunireaktiota moduloivan valmisteen kanssa yhdessä uuden antigeenimäärän kanssa. Nämä vaiheet voidaan toteuttaa ympäristössä, joka joko osoittaa T-lymfosyyttiavustajän aktiivisuutta tai sen lähes täydellistä puuttumista. Immuuni-reaktion modulointi voidaan myös toteuttaa vanhoille B-lymfo-syyteille, jotka osoittavat vaimentunutta immuunireaktiota ennen niiden saattamista kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen valmisteen kanssa.

Neoplastisten solujen kasvu voidaan estää saattamalla tämänkaltaiset solut kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen, eläinsolun reaktiota moduloivan valmisteen kanssa. Eläinsolujen saattaminen kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen valmisteen kanssa saa myös interferonin tuotannon aikaan jopa silloinkin, kun luonnossa esiintyvät mikrobiologiset interferonia indusoivat aineet puuttuvat. Samankaltainen makrofaagien käsittely tämän keksinnön mukaisella valmisteella T-solujen aktiivisuuden puuttuessa saa T-soluihin aikaan interleukiini-1:n kaltaisen aktiivisuuden antigeenien puuttuessa, kun taas T-solujen saattaminen kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen valmisteen kanssa IL-2:n läsnäollessa saa aikaan synergistisesti elvytetyn lisääntymisaktii-visuuden T-soluihin. Kun autoimmunologisesta sairaudesta kärsivän isännän B-lymfosyytit saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen valmisteen kanssa, niin autoimmunologinen sairaus vaimenee.

Tämän keksinnön mukaiset valmisteet ja menetelmät ovat myös käyttökelpoisia elvyttämään vasta-aineiden, kuten monoklonaa-listen vasta-aineiden tuotantoa B-soluista. Tällöin, esimerkiksi, tämän keksinnön mukaista immuunireaktiota elvyttävä valmiste saatetaan kosketuksiin B-solujen kanssa eläimessä, joka on tehty immuuniksi, jotta saavutettaisiin antigeeni-spesifisten B-solujen kasvanut esiintymistiheys, joita B-soluja käytetään solu-fuusioissa hybridisolujen muodostamiseksi. Monoklonaalista vasta-ainetta tuottavat hybridisolut voidaan myös saattaa kosketuksiin in vivo tai in vitro tämän keksinnön mukaisen valmisteen kanssa, jolloin monoklonaalisten vasta-aineiden tuotanto noista soluista elpyy.

9 87733 Tällä keksinnöllä on useita hyviä puolia ja etuja.

Eräs tämän keksinnön huomiotaherättävistä eduista on se, että sen käyttö voi saada aikaan B-lymfosyyttien aktivointiin vaadittavan toisen viestin sekä ensimmäisen viestin (antigeenistä aiheutuneen) aiheuttaman reaktion erikoistumisen.

Toinen tämän keksinnön hyvä puoli on se, että aktivoituminen ja erikoistuminen johtavat proteiinituotannon indusoi-tumiseen, kuten B-soluista tapahtuvan immunoglobuliinien erittymisen tapauksessa. Tämän keksinnön hyvä puoli on edelleen se, että immuunivaimennostilat ja immuunivajavai-set tilat sekä sairauksien ilmenemiset voidaan korjata ja/tai niitä voidaan lievittää, vastaavasti, tätä keksintöä käyttämällä.

Edelleen tämän keksinnön hyvä puoli on se, että sen käytöllä voidaan saada aikaan isännän parantunut immuniteetti, . . kun isännän B-solun aktiivisuudet muuten toimivat normaa- I listi.

*- " Tämän keksinnön erityinen etu on se, että elvytettyjä im muunireaktioita voidaan saada aikaan sekä T-avustajasolujen aktiivisuuden läsnäollessa että ilman sitä. Täten elpynyttä immuunireaktiivisuutta havaitaan sekä T-soluista riippuvis-sa että T-soluista riippumattomissa järjestelmissä.

Tämän keksinnön lisäetuina on se, että sitä voidaan käyttää estämään neoplastisten solujen kasvu, stimuloimaan interfe-ronin tuotantoa luonnossa esiintyvien mikrobiologisten interferonia indusoivien aineiden läsnäollessa tai niiden puuttuessa sekä estämään autoimmunologisia reaktioita.

10 87733

Edelleen tämän keksinnön lisäedut ja hyvät puolet ovat ilmeisiä alan asiantuntijoille seuraavien kuvien, yksityiskohtaisen kuvauksen, esimerkkien ja patenttivaatimusten perusteella.

Antropomorfisiä selityksiä, kuten viestien lähettäminen kemikaaleille ja soluille, sekä kemikaalien ja solujen viestien vastaanottaminen, käytetään tekstissä havainnollisista syistä auttamaan havaittujen ilmiöiden ymmärtämisessä.

Osa alkuperäisistä kuvista on poistettu.

Piirustukset muodostavat osan tämän keksinnön julkaisusta, ja niissä:

Kuva 1 esittää 8-MGuo:n aikaansaaman ensimmäisen vasta-ai-nereaktion elpymisen. 107 elävää CBA/CaJ-pernasolua viljeltiin SRBCrn läsnäollessa tai sen puuttuessa, 8-MGuo:n pitoisuuden kasvaessa. Suora PFC SRBC:hen määritettiin 4 vil-jelyvuorokauden kuluttua. Tulokset on ilmoitettu kolmen viljelyn aritmeettisena keskiarvona ± standardipoikkeama (S.E.).

Kuva 3 esittää 8-MGuo:n aikaansaamaa sekundaarisen IgM-vasta- aineen reaktion elpymistä. 107 elävää SRBC-peräistä CBA/CaJ-pernasolua viljeltiin 0,3 mM 8-MGuo:n läsnäollessa : tai sen puuttuessa, SRBCtn pitoisuuden kasvaessa. Tulokset on esitetty kuten kuvassa 1.

Kuva 4 esittää 8-MGuo:n aikaansaamaa sekundaarisen IgG-vasta-aineen reaktion elpymistä. 107 elävää SRBC-peräistä CBA/CaJ-pernasolua viljeltiin 0,3 mM 8-MGuo:n läsnäollessa tai sen puuttuessa, SRBC:n pitoisuuden kasvaessa. Epäsuora PFC SRBC:hen määritettiin 4 tai 5 viljelyvuorokauden kuluttua. Tulokset on esitetty kuten kuvassa l.

11 87733

Kuva 5 esittää 8-MGuo:n aikaansaamaa TI-1-antigeenin vasta-ainereaktion elpymistä. 107 elävää CBA/CaJ-pernasolua viljeltiin 0,3 mM 8-MGuo:n läsnäollessa tai sen puuttuessa, TNP-LPS:n pitoisuuden kasvaessa. Suora PFC TNP:hen määritettiin 3 viljelyvuorokauden kuluttua. Tulokset on esitetty kuten kuvassa 1.

Kuva 6 esittää 8-MGuo:n aikaansaamaa TI-2-antigeenin vasta-ainereaktion elpymistä, 107 elävää CBA/CaJ-pernasolua viljeltiin 0,3 mM 8-MGuo:n läsnäollessa tai sen puuttuessa, TNP-AECM-ficoll-pitoisuuden kasvaessa. Suora PFC TNP:hen määritettiin 3 viljelyvuorokauden kuluttua. Tulokset on esitetty kuten kuvassa 1.

Kuva 7 esittää vasta-ainereaktion elpymistä vahingoittumattomien T-solujen puuttuessa. 5 x 106 elävää CBA/CaJ B-solua viljeltiin SRBC:n kanssa 5 % MLC:n emäliuoksen läsnäollessa tai sen puuttuessa ja/tai 0,3 mM 8-MGuo:n läsnäollessa tai sen puuttuessa. Suora PFC SRBC:hen määritettiin 4 viljely-vuorokauden kuluttua. Tulokset on esitetty kuten kuvassa 1.

Kuva 8 esittää 8-MGuo:n lisäyksen kineettistä profiilia.

\ ” 107 elävää CBA/CaJ-pernasolua viljeltiin SRBCrn läsnäolles- sa tai sen puuttuessa, jolloin viljelyn perättäisinä päivinä lisättiin joko 0,1 mM tai 0,3 mM 8-MGuo:ta. Suora .: PFCSRBCrhen määritettiin 4 viljelyvuorokauden kuluttua. Tu lokset on esitetty kuten kuvassa 1.

Kuva 10 esittää 8-MGuo:n kykyä indusoida tumallisten punasolujen muuntumista. A. 4 x 105 elävää CBA/CaJ-pernasolua viljeltiin 8-MGuo:n pitoisuuden kasvaessa 2 vuorokautta, ja [3H]TdR:n kulutus tai silmunsynty arvioitiin kuten jäljem-pänä kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" on esitetty. Tulokset ovat 5 (TdR:n kulutuksen) tai 4 (silmunsynnyn) 12 87753 toistetun kasvatuksen keskiarvoja + standardipoikkeama. B. Stimuloimattornien solujen mikrovalokuva. C. Sellaisten solujen mikrovalokuva, joita soluja on 2 vuorokautta inkuboi-tu 1 mM 8-MGuo:ssa.

Kuva 11 esittää 8-MGuo:n kykyä edistää DNA-synteesiä viljelmissä, jotka ovat peräisin hiiristä, joilta kateenkorva puuttuu synnynnäisestä. 4xl05 elävää C57BL/6J nu/nu (----) tai nu/+ (----) pernasolua viljeltiin 2 vuorokautta 8-MGuo:n pitoisuuden lisääntyessä tai 1 mikro-g/g/ml Con A:n pitoisuudessa. Tulokset on esitetty kuten kuvassa 10A.

Kuva 12 esittää 8-MGuo:n kykyä aktivoida B-rikastettujen ja T-rikastettujen lymfosyyttien populaatioita. 4xl05 elävää CBA/CaJ tymosyyttiä (----), pernasta peräisin olevaa B-so- lua (----), pernasta peräisin olevaa T-solua (....) tai pernasta peräisin olevien B- ja T-solujen l:l-seosta (-.-) viljeltiin 8-MGuo:n pitoisuuden kasvaessa 2 vuorokautta. Tulokset on esitetty kuten kuvassa 11. B-solut kykenivät ainoastaan 4 %:iin erottamattomien solujen Con A-reaktios-ta, ja T-solut tuottivat vain 5,9 % erottamattomien solujen ; LPS - reaktiosta.

"· Kuva 13 esittää 8-MGuo:n mitogeenireaktion kehittymisen yk- ·· silöissä. 4xl05 elävää CBA/CaJ-pernasolua, jotka olivat pe räisin joko 4 päivän ikäisistä hiiristä (—) tai aikuisista, 56 päivän ikäisistä hiiristä (----), viljeltiin 2 vuorokautta 8-MGuo:n pitoisuuden kasvaessa. Tulokset on esitetty 8-MGuo:ta sisältävien viljelmien cpm:n ja vertai-luviljelmien cpm:n suhteena.

Kuva 14 esittää 8-MGuo:n kykyä aktivoida Sephadex G-10 -pyl-väästä ulostulleita ja siihen pidättyneitä soluja. A.

4xl05 elävää CBA/CaJ-pernasolua viljeltiin joko ennen 13 87733 (-) G-10-pylvään läpiajoa tai sen jälkeen (...). Kolmas ryhmä käsitti G-10-pylväästä ulostulleita soluja, joita oli täydennetty 5 %:lla pernaan kiinnittyneillä soluilla (—). Näitä kolmea soluryhmää inkuboitiin 2 vuorokautta erilaisissa 8-MGuo-pitoisuuksissa. Tulokset on esitetty kuten kuvassa 11. B. 4 x 105 elävää CBA/CaJ erottamatonta {-), G-10:n läpitullutta (...) tai G-10reen pidättynyttä (-.-) solua viljeltiin 2 vuorokautta 8-MGuo:n pitoisuuden lisääntyessä. Tulokset on esitetty kuten kuvassa 11.

Kuva 16 esittää tuloksia, jotka on saatu, kun 4 CBA/CaJ-hiiren ryhmiin injektoitiin 6 x 106 SRBCrtä i.p. ja 3 vuorokautta myöhemmin liukenemattoman 8-MGuo:n lisääntyviä pitoisuuksia. Suora PFC SRBC.-hen määritettiin 5 vuorokauden kuluttua.

Kuva 18 esittää tuloksia, jotka on saatu, kun 4 CBA/CaJ-hiiren ryhmään injektoitiin lisääntyviä määriä SRBCrtä i.p. ja joko suolaliuosta tai 25 mg 8-MGuo:ta i.p. Suora PFC SRBCrhen määritettiin 5 vuorokautta myöhemmin.

Kuva 20 esittää 8-MGuo:n kykyä korvata T-solut ensimmäisessä vasta-ainereaktiossa in vitro. 4 x 106 elävää CBA/CaJ-pernasolua viljeltiin SRBCm kanssa tai ilman, lisääntyvien 8-MGuo-pitoisuuksien läsnäollessa. Suora PFC SRBCrhen määritettiin 4 vuorokautta myöhemmin. Tulokset on ilmoitettu kolmasti toistettujen kasvatusten aritmeettisena keskiarvona ± standardipoikkeama (o), tai koekasvatuksen ja vertai-lukasvatuksen (eli joka oli ilman 8-MGuo:ta) suhteena (o).

Kuva 21 esittää 8-MGuorn kykyä korvata T-solut sellaisten hiirten ensimmäisessä vasta-ainereaktiossa, jotka hiiret ovat synnynnäisestä ilman kateenkorvaa. 107 elävää C57BL/6J nu/nu tai nu/+ pernasolua viljeltiin SRBCm kanssa tai il- 14 87733 man sitä 8-MGuom läsnäollessa tai ilman sitä, kuten on esitetty. Suora PFC SRBC:hen määrättiin 4 vuorokauden kuluttua. Tulokset on esitettu kolmasti toistettujen kasvatusten aritmeettisena keskiarvona + standardipoikkeama.

Kuva 22 esittää 8-MGuo:n T-solut korvaavan aktiivisuuden IL-2-riippuvuutta. 107 elävää CBA/CaJ-pernasolua viljeltiin SRBC:n kanssa tai ilman sitä 3x10~4 M 8-MGuo:n läsnäollessa tai ilman sitä. Kasvatuksen alussa lisättiin syklosporiini A:n lisääntyviä pitoisuuksia. Suora PFC SRBCihen määritettiin 4 vuorokautta myöhemmin. Tulokset on esitetty kolmasti toistettujen kokeellisten kasvatusten ja vertailukasvatus-ten (vertailu = 220 + 59 PcF) erotusten aritmeettisena keskiarvona + standardipoikkeama (vasen palsta). Oikealla kukin reaktio on normitettu SRBC:n 100 %:n reaktioon syklosporiini A:n puuttuessa.

Kuva 23 esittää MLC:n emäliuoksen ja 8-MGuo:n välistä synergiaa. 5xl06 elävää CBA/CaJ pernasta peräisin olevaa B-solua viljeltiin SRBC:n kanssa tai ilman sitä MLC:n emä-li-uoksen lisääntyvien määrien läsnäollessa. Yksi viljelysarja (-) tehtiin 3xl0'4 Miksi 8-MGuo:lla, toinen (----) ei.

.!*' Suora PFC SRBCihen määritettiin 4 vuorokauden kuluttua.

Tulokset on esitetty kolmeen kertaan toistettujen koe- ja vertailuviljelmien (vertailu = 88±3 PFC) erojen aritmeettisina keskiarvoina + standardipoikkeama.

Kuva 24 esittää immunoglobuliinien erittymisen indusoitu-misen nuorista ja ikääntyneistä hiiristä peräisin olevissa .1. soluissa. 5x10® elävää C57BL/6J-pernasolua viljeltiin 3 vuorokautta 1 ml:n tilavuudessa, jossa oli pelkkää alustaa, 0,1 mg/ml LPS, tai 10'3 M 8-MGuo:n suhteen. Tulokset on esitetty kolmasti toistettujen koe- ja vertailuvil jelmien erojen aritmeettisena keskiarvona (vertailu = 62 PFC/nuor-ten solujen viljely, 3 PFC/vanhojen solujen viljely).

is 8 7 7 6 3

Kuva 25 esittää 8-MGuo:n ja LPS:n apuaineen kaltaisuutta vanhoissa hiirissä. 107 pernasolua, jotka olivat peräisin vanhoista C3H/HeN-hiiristä, viljeltiin 4 vuorokauden ajan 1 ml:n tilavuudessa 10'3 M 8-MGuo:n tai 0,1 mg/ml LPS:n läsnäollessa tai niiden puuttuessa 2 x 106 SRBC:n kanssa tai ilman. Tulokset on esitetty kolmasti toistettujen viljelmien aritmeettisena keskiarvona ± standardipoikkeama.

Kuva 26 esittää 8-MGuo:n ja LPS:n suhteellista TRF:n kaltaista aktiivisuutta vanhoissa hiirissä. 4 x 106 elävää, vanhoista C57BL/6J hiiristä peräisin olevaa pernasolua viljeltiin 4 vuorokauden ajan l ml:n tilavuudessa 2 x 106 SRBC:n läsnäollessa tai niiden puuttuessa, täydennettynä joko 10"3 M 8-MGuo:lla, 0,1 mg/ml LPS:llä, tai pelkällä kasvatusalustalla. Tulokset on ilmoitettu kolmasti toistettujen kasvatusten aritmeettisena keskiarvona ± standardipoikkeama.

Kuva 27: 4 x 104 elävää kasvainsolua tai 5 x 105 tavallista pernasolua viljeltiin 2 vuorokauden ajan lisääntyvien 8-MGuo-pitoisuuksien läsnäollessa. Kasvatukset oli merkitty yhdellä mikro-Cirllä [3H]TdR:ää inkuboinnin 24 viimeisen tunnin aikana. Tulokset on esitetty kuten kuvassa li.

Kuva 30 esittää guaniinijohdannaisten kykyä edistää mitoosin tapahtumista. 4 x 105 elävää CBA/CaJ-pernasolua viljeltiin 2 vuorokauden ajan lisääntyvien guaniinijohdan-* : naisten pitoisuuksien kanssa. Tulokset on esitetty kuten kuvassa 10A.

Kuva 31 esittää B-solun mitoosin tapahtumisen ja poly-klonaalisen B-solun aktivoinnin eroa verrattuna T-solun • korvaustekijän (TRF) aktiivisuuteen hiiren B-soluihin. SJL

tai CBA/CaJ B-soluja viljeltiin 2 vuorokauden ajan (vasen Ιβ 87733 palsta), kolmen vuorokauden ajan (keskimmäinen palsta) tai neljän vuorokauden ajan (oikea palsta) kuvatunlaisessa kokeessa. Käyttämällä edellä olevassa kuvassa 11 viitattuja koemenetelmiä 24 viljelytunnin kuluttua mitoottiset viljelmät merkittiin [3H]TdR:llä toisen 24 tunnin ajaksi, jonka jälkeen tuote otettiin niistä talteen. Suora PFC SRBC:hen määritettiin, kuten kuvassa 24 on esitetty ja arvot on esitetty keskimmäisessä palstassa, kun taas suora PFC SRBCrhen määritettiin kuten kuvassa 20 on esitetty ja nämä tulokset on esitetty oikeassa palstassa.

Kuva 32 esittää 8-MGuo:n indusoimaa ihmisen ensimmäisen immuunireaktion elpymistä, kun SRBC on antigeeninä. 2 x 106 elävää ihmisen veren etäislymfosyyttiä, joissa ei ollut H2-histamiinin vastaanottajia kantavia soluja, mikä oli saatu aikaan kaupallisesti Seragenilta, Inc., Boston, M.A., saatavissa olevilla levyillä huuhtomalla, käyttäen julkaisussa Wysocki ja Sato, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75:2844 (1978) esitettyä tekniikkaa, viljeltiin kuuden vuorokauden ajan 1,0 ml:n tilavuudessa alustalla, joka sisälsi 10 % lämmöllä inaktivoitua tuoretta plasmaa. 5 x 106 SRBC ja/tai 1 x 10'3-molaarinen 8-MGuo:n lopullinen pitoisuus oli läsnä (+) tai puuttui (-), kuten on esitetty. PFC:t määritettiin käyttäen edellä esitettyä täplämenetelmää. Tulokset on esitetty kol- masti toistettujen kasvatusten aritmeettisena keskiarvona ± standardipoikkeama.

17 S 7 7 33

Edellä käytettyjen lyhenteiden luettelo on selitetty seuraavassa taulukossa 1.

Taulukko 1

Lyhenne Tarkoitus AECM N-(2-aminoetyyli)-karbamyylimetyyli cAMP adenosiini-35'-syklinen monofosfaatti ATS jäniksen anti-hiiri tymosyyttiseerumi B-solut luuytimestä peräisin olevat lymfosyytit 8-BrcGMP 8-bromiguanosiini-3',5'-sykiinen monofosfaatti 8-BrGuo 8-bromiguanosiini

Con A conkanavaliini A

CR komplementtireseptori cGMP guanosiini-3',5'-sykiinen monofosfaatti E A erytrosyytti-vasta-aine-kompleksit EAC erytrodyytti-vasta-aine-komplementti- kompleksi

FcR Fc vastaanottaja FCS sikiövasikan seerumi

Guo guanosiini 8-HGuo 8-haloguanosiini j /~^H7TdR tritium-merkitty deoksiribosyylitymidiini

Ia antigeeni immuunireaktion geenien säätelemä antiqeeni

IgA,D,E,G ja M immunoglobu1iinit A,D,E,G ja M

IL interleukiini IL-1 interleukiini-1 IL-2 interleukiini-2 LPS bakteeriperäinen lipopolysakkaridi

Lyb 1-7 hiiren B-solujen lymfosyytti-antigeeni

Lyt hiiren T-solujen lymfosyytti-antigeeni 8-MGuo 8-merkaptoguanosiini MHC pääasiallinen kudosten yhteensopivuuskompleksi MLC leukosyyttien sekaviljelmä 5 1 NT 5 1-nukleotidaasi PFC täplän muodostava solu PHA fytohemagglutiniini RBC punainen verisolu 18 87 733

Taulukko 1 (jatkuu)

Lyhenne Tarkoitus RIA radioimmunologinen koe SRBC lampaan punainen verisolu S.E. standardipoikkeama T-solut kateenkorvasta peräisin olevat lymfosyytit TCA trikloorietikkahappo TI-1,-2 kateenkorvasta riippumattomat 1- ja 2-tyypin reaktiot TNP 2,4,6-trinitrofenyyli TRF T-solun korvaustekijä

Tutkittaessa mitogeenisiksi ilmoitettujen aineiden cGMP ja 8-BrcGMP vaikutuksia totesimme, että uusi, molekyylipainoltaan alhaisten guaniinijohdannaisten luokka saa aikaan huomattavia vaikutuksia moduloitaessa eläinsolujen reaktioita, mikäli näitä johdannaisia on läsnä vaikuttavia määriä aktiivisena aineena valmisteissa, jotka sisältävät fysiologisesti hyväksyttävien kantaja-aineiden laimeita määriä. Antigeenispesifisten humoraa-listen immuunireaktioiden elvyttäminen, joka johtaa voimakkaaseen apuainevaikutukseen, TRF-kaltainen aktiivisuus ja immuniteetin uudistava aktiivisuus ovat erityisiä esimerkkejä niistä eläin-solun reaktioista, joita voidaan moduloida tämän keksinnön mukaisesti .

Uusi solun reaktioita moduloivien aineiden luokka käsittää 8-substituoidut guaniinijohdannaiset, jotka ovat 9-1'-sitoutuneita aldoosiin, jonka ketjussa on 5 tai 6 hiiliatomia. Eräs tämän luokan aktiivisten aineksien edullinen ryhmä käsittää 8-halo-guanosiinit. Toinen tämän luokan aktiivisten aineksien edullinen ryhmä käsittää sulfido- tai tio-(-S-) sidoksen sisältävät 8-merkapto-ja 8-(substituoidut merkapto)guaniinit. Muu tämän luokan edullinen ryhmä käsittää okso- (=o) ja oksi (-o-) sidoksen sisältävät 8-okso-guanosiinit ja 8-(substituoidut oksi)guanosiinit, vastaavasti.

Tulee huomata, että 8-merkapto- ja 8-okso-guanosiinit sisältävät tautomeeriset muotonsa.

19 87733

Guaniinissa oleva 8-substituentti käsittää vähemmän kuin noin 15 atomia, ja mieluummin käsittää vähemmän kuin noin 10 atomia. Mieluiten 8-substituentti käsittää l:stä noin 7 atomiin.

Edullisimmat 8-substituentit käsittävät haloryhmia, kuten kloorin, bromin ja jodin. Bromiryhmä on erityisen edullinen. Muihin edullisiin substituenttiryhmiin kuuluu guaniinijohdannaisen 8-asemassa oleva sulfido- tai tiosidos. Tällaisista ryhmistä esimerkkejä ovat ryhmät, joissa sulfidosidos on merkaptoryhmän osa, C^-C^-asyylimerkaptoryhmä, kuten asetyyli-merkapto, ja C^-C^-alkyyli-sulfidiryhmä, kuten metyylisulfidi tai metyylitioryhmä (CH^-S-). Edelleen edullisiin 8-substituentteihin kuuluu guaniinijohdannaisen 8-asemassa oleva oksosidos. Esimerkkejä tällaisesta substituen-tista ovat 8-okso-guanosiini ja 7-metyyli-8-oksoguanosiini.

Eräs sopiva tapa luonnehtia hyödyllisten guaniinijohdannaisten 8-substituentteja on niiden elektroneja puoleensavetävä induktiivinen vaikutus vetyyn verrattuna. Bentsoehapon meta-substituent-tien ionisoitumiselle lasketut Hammett:in substituenttisigmavakiot (sigmavakiot) ovat käyttökelpoisia ennustettaessa suhteellisia induktiivisia vaikutuksia, ja ne ovat tuttuja henkilöille, jotka ovat perehtyneet orgaaniseen fysikaaliseen kemiaan. Katso esim. seuraavaa julkaisua: Hine, Physical Organic Chemistry, McGraw-Hill Book Company, New York, sivut 85-88 (1962).

Niillä substituenteilla, joiden induktiivinen elektroneja puo-leensavetävä vaikutus on suurempi kuin vedyllä, sigmavakion arvot I'.. ovat positiiviset. Niillä substituenteilla, jotka osoittavat ·.: vetyä heikompaa induktiivista elektroneja puoleensavetävää vaiku- ·;· tusta, eli elektronien luovuttajilla, sigmavakion arvot ovat negatiiviset.

. . Edullisempien 8-substituenttien induktiivinen elektroneja puo-leensavetävä vaikutus on suurempi kuin vedyllä. Esimerkkejä näistä 8-substituenteista ovat merkapto, asyylimerkapto : : kuten asetyylimerkapto, alkyylisulf idit kuten metyylisulf idi *:*·: (-SCH^), nitro, syano, okso, alkoksi, keto kuten asetyyli, 20 8 7 7 3 3 ja metyleenioksi-alkyylieetterit kuten metyleenioksietyyli (-ch2-o-ch2ch3).

Tarkasteltaessa meta-bentsoehapon substituenttien Hammett:in substituentti-sigmavakioita, edullisimpien 8-substituenttien vakioiden arvot ovat positiiviset. Edullisimpien 8-substituenttien sigmavakiot ovat noin 0,l:stä noin 0,4:ään. Huomautettakoon, että kaikille edullisimmille 8-substituenteille ei sigmavakioita olla mitattu. Kuitenkaan tämänkaltaisen mittauksen puuttuminen 8-substituentilta ei ole osoitus siitä, että 8-substituentti ei kuulu edullisimpien substituenttien luokkaan.

Olemme todenneet, että 8-aminoguanosiini ja 8-bentsyylioksigua-nosiini ovat tehottomia moduloitaessa eläinsolujen reaktioita ja ne ovat enemmän B-solun aktivointia inhiboivia kuin Guo, jossa 8-substituentti on vety. Aminoryhmän sigmavakio on negatiivinen (-0,16, Hine, sivu 87, supra). 8-aminoryhmän inhiboiva vaikutus on odotettavissa meta-substituenttina olevan aminoryhmän negatiivisesta sigmavakiosta johtuen. 8-bentsyylioksiryhmän inhiboiva vaikutus on yllättävää, koska 8-metoksiryhmällä on elvyttävä vaikutus, kuten jäljempänä on esitetty, ja koska sigmavakiot ovat positiivisia, kuten Hine, sivulla 87, supra, on esittänyt meta-asemassa oleville metoksi- ja fenoksiryhmille. Kuitenkin on todettu, että kokeiltu 8-bentsyylioksiguanosiininäyte on epäpuhdas, ja luullaan, että inhiboiva vaikutus Guo:hon verrattuna johtuu epäpuhtauksien läsnäolosta.

* 1 Tässä keksinnössä käyttökelpoiset 8-substituidut guaniinijohdan-; naiset on 9-1'-sidottu ja aldoosiin, jonka aldoosiket jussa on 5 ’ / tai 6 hiiliatomia. Termiä "9-1'-sidottu" käytetään tässä tar-*;; koittamaan sitä, että guaniinin 9-asema on sitoutunut aldoosin ’·"·1 l'-asemaan, mikä on tavallinen sitoutuminen nukleosidikemiassa.

Hyödyllisiä aldooseja ovat sakkaridit, jotka ovat aldehydiryhmä-Y ! terminaalisia ja joiden sakkaridirungon muodostavassa hiiliatomien : ketjussa on 5 tai 6 hiiltä.

»· • · • · · 87733

Sopivat aldoosit voidaan esittää rakennekaavalla: r4-o-cii..

/ \ 2 M R1 jossa n on yksi tai nolla; R^ on vety, hydroksi, metoksi, etoksi tai asetoksi; 2 R on hydroksi, metoksi, etoksi, asetoksi, amino, mono tai disubs t i tuo i tn C -C’ -amino, tai asetamido; 3 v f- R on hydroksi, metoksi., etoksi tai asetoksi.; ja 4 R on vety, metyyli, etyyli tai 1-24 hiiliatomisen karboksyylihapon asyyliosa.

Esitetyssä rakenteessa ei pyritä esittämään minkään ylläolevaan rengasrakenteeseen sitoutuneiden ryhmien välistä stereokemiallista suhdetta.

s • : : i ** Edullisimmassa toteutusmuodossa n on nolla, R on vety tai hydroksi, R puuttuu, koska n on nolla, R on hydroksi ja Rq on vety.

: “ Erityisen edullisia aldooseja ovat riboosi, deoksiriboosi sekä :.2i niiden metyyli- ja asetyyl i johdannaiset. Riboosi on erityisen “1 edullinen.

• · · · 1 · 2 • ·

Esimerkkejä muista erityisen edullisista aldooseista ovat riboosi, 2 ' , 3 1 , 5 1-tr i-O-ase tyy l ir iboos i., '?. ’-U-metyy 1 i r i boos i ja deoksi-riboosi. Esimerkkeinä edullisista aldooseista ovat arabi noosi, tyloosi, lyksoosi, glukoosi, galaktoosi, taloosi, alloosi, allroosi, • · *- 1: mannoosi, guloosi ja iduosi. Esimerkkeinä sellaisen karboksyyli- hapon asyyliosasta, jossa liapossa on yhdestä noin 24:ään hiili-: atomia, ovat muurahaishaposta, etikkahaposta, propionihaposta, _··1_ heksaanihaposta , dekaanihaposta, lauriinihaposta , myristiini- 22 87733 haposta, palmitiinihaposta, steariinihaposta, oleiiniha-posta ja arakidonihaposta johdetut asyyliosat.

Tähän tarkoitukseen käyttökelpoiset 8-substituoidut gua-niinijohdannaiset ovat varaukseltaan sähköisesti neutraaleja. Molekyylin guaniini- tai aldoosiosissa kummassakaan ei esiinny sähköisesti varattuja ryhmiä, lukuunottamatta guaniiniyksikön typpiatomeja, joissa voi olla sähköinen varaus vedessä tai vettä sisältävässä ympäristössä johtuen protonin kiinnittymisestä. Täten fosfaattijohdannaiset, kuten 8-BrcGMP tai 8-ΒΓ©φ, joilla on sähköisesti varattu ryhmä fosfaattiryhmässä, eivät kuulu käyttökelpoisten aktiivisten aineksien ryhmään. Positiivisesti varatut 8-BrGuo:n johdannaiset, kuten 7-metyyli-8-bromi-guono-sinium-ioni, joka on valmistettu liittämällä bromia 7-me-tyyli-Guo:hon, mitä seuraa jäljenpänä esitetyt bromin liittämistoimenpiteet, todettiin kuitenkin epästabiileiksi, mistä syystä ne ovat sopimattomia tämän keksinnön tarkoituksiin.

Jäljempänä tarkastellaan tämän keksinnön mukaisten, käyttökelpoisten, solureaktiota moduloivien valmisteiden fysiologisesti siedettyjä kantaja-aineita, annostusta, spesifisiä koostumuksia, annostustapoja, yms.

Guaniinin johdannaiset, kuten 8-oksoguanosiini, 8-metoksi-guanosiini, 7-metyyli-8-oksoguanosiini, 8-Mguo ja 8-tiome-tyyliguanosiini indusoivat pernasoluissa immunoglobuliinin - - erittymistä, kuten taulukossa II on esitetty.

Taulukko II

. . Guaniinijohdannaisten aikaansaamia immunoglobuliinin erit- tymisen indusoituminen pernasoluissa___

Immunoglobuliinia erittävät solut/viljely

Guaniini- iohdannainen Vertailu Käsittely* . 8-okso-Guob 7 320 ; 1 8-metoksi-Guoc 7 85 23 87733 (taulukko II jatkuu) 7- met-8-okso-Guod 7 800 8- MGuo® 7 543 8-metyyli-MGuof 7 462 a Solut on viljelty guaniinijohdannaisen pitoisuuden ollessa 1 mM, 5xl06 solua/ml, ja kokeet on tehty kolmen vuorokauden inkuboinnin jälkeen. b 8-oksoguanosiini c 8-metoksiguanosiini d 7-metyyli-8-oksoguanosiini e 8-merkaptoguanosiini f 8-metyylitioguanosiini

Resistenssi solun aineenvaihdunnalle B-solut eivät metaboloi 8-BrGuo:ta, eikä se myöskään vaikuta Guo:n entsyymitoimintaan. Nämä havainnot osoittavat, että solujen ei voida olettaa käyttävän 8-substituoituja guaniinijohdannaisia, kuten niiden substituoimattomia sukulaisia, tai että solut metaboloisivat ne samalla tavalla. Katso julkaisua Goodman ja Heigle, J. Immunol., 129:2715 (1982), joka täten tällä viittauksella sisältyy hakemukseen.

Näissä tutkimuksissa käytetyt CBA/CaJ-pernasolujen yksittäisten solujen suspensiot oli valmistettu menetelmällä, joka on esitetty julkaisussa Goodman et ai., J. Immunol., ·· 121:1905 (1978). Erytrosyytit lysoitiin ammoniumkloridin . . 0,83-prosenttisessa liuoksessa ja T-lymfosyytit poistet tiin käsittelemällä monoklonaalisella antithy-1.2-vasta-. · aineella ja komplementilla, sen menetelmän mukaisesti, joka on esitetty julkaisussa Goodman ja Weigle, J.Exp.-Med.# 145:473 (1977). Tuloksena olevaa B-solujen populaatiota viljeltiin seerumittomissa olosuhteissa RPMI-1640- ..... perustaisessa alustassa, joka on esitetty yksityiskohta!- . eesti edellä mainitussa Goodman:in et. ai:in julkaisussa.

24 87733

Radioaktiivisesti merkityt yhdisteet valmistettiin ja lym-fosyyttiuutteiden ohutlevykromatografia suoritettiin sen menetelmän mukaisesti, joka on esitetty julkaisussa Goodman ja Weigle, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., supra.

Apuaineen kaltainen ominaisuus in vitro

Kuva 1 esittää apuaineena toimivan 8-MGuo:n vaikutusta ensimmäiseen SRBC:n aikaansaamaan vasta-ainereaktioon, joka on arvioitu in vitro. Optimaalisissa pitoisuuksissa tätä nukleosidijohdannaista sisältävät valmisteet elvyttivät SRBC:n aiheuttamaa reaktiota yhtä kertaluokkaa enemmän. Tämä vaikutus riippuu annoksesta, jolloin suurin vaikutus saavutetaan noin 0,3-millimolaarisella 8-BrGuo:lla tarkasteltavana olevassa viljelyksessä. Vasta-ainereaktion (2725 PFC) elpymistä ei voida selittää SRBC:n (253 PFC) aiheuttaman spesifisen reaktion ja 8-MGuo:n (540 PFC) aikaansaaman polyklonaalisen reaktion yhteisvaikutuksena.

8-MGuo:ta sisältävien valmisteiden apuaineen kaltainen vaikutus sekä antigeenillä käsiteltyihin soluihin että koskemattomiin soluihin on kiinnostavaa. 8-MGuo:ta sisältävien valmisteiden vaikutus SRBCrn aiheuttamiin IgM- ja : IgG-reaktioihin on esitetty kuvissa 3 ja 4.

Molemmat reaktiot elpyivät merkittävästi, kun solut saa-.1. ; tettiin kosketuksiin nukleosidi johdannaista sisältävien - valmisteiden kanssa. IgM- (suora) reaktio elpyi 12,2-ker- : täiseksi ja IgG- (epäsuora) reaktio elpyi 7,2-kertaiseksi.

• ‘ Tämä apuaineen kaltainen vaikutus riippui viljelyyn lisä tyn antigeenin pitoisuudesta. Havaitut huipputason sekundaariset reaktiot synnyttänyt nukleosidipitoisuus oli lähes sama kuin ensimmäisen IgM-reaktion optimaalinen annos (0,3 mlJ1imolaarinen), tutkitussa viljelmässä.

Tämän keksinnön mukaisten valmisteiden tehokkuus ihmisestä peräisin oleviin soluihin voidaan osoittaa 8-MGuo:n apuaineen kaltaisesta vaikutuksesta ihmisen veren etäislym- 25 87733 fosyytteihin spesifisen antigeenin, kuten SRBC:n, läsnäollessa. Nämä tulokset on esitetty kuvassa 32.

Kuten kuvaa 32 tutkittaessa voidaan havaita, ihmisveren etäislymfosyyttien saattaminen kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen, 8-MGuo:ta sisältävän valmisteen kanssa spesifisen antigeenin läsnäollessa tuotti antigeenin aikaansaaman ensimmäisen reaktion noin 6-kertaisen elpymisen, suorana anti-SRBC PFC:nä mitattuna.

Myös T-riippumattomien antigeenien aiheuttamien vasta-ai-nereaktioiden elvyttämiskykyä tutkittiin, jotta saataisiin määritetyksi, kohdistuuko 8-MGuo:n apuaineen kaltainen vaikutus etupäässä T-avustajasoluihin vai vasta-aineita tuottaviin B-soluihin. Kun antigeeniannokset olivat pienempiä kuin polyklonaalisen aktivoitumisen indusoimat annokset, niin TNP-LPS:n, TI-1-luokan antigeenin, aiheuttama reaktio elpyi noin 3-kertaiseksi, kuten kuvassa 5 on esitetty. TNP-AECM-ficoll:in, TI-2-luokan antigeenin aiheuttama reaktio kasvoi päinvastoin 8,9-kertaiseksi, kuten kuvasta 6 voidaan nähdä.

Tutkimukset, joissa vahingoittumattomat T-solut korvattiin : : : liukoista T-avustaja-aktiivisuutta sisältävillä lymfo- ·;· syyttien sekaviljelmien (MLC) emäliuoksilla, selvittivät lisäksi, oliko 8-MGuo:n elvyttävien vaikutusten koh-.·. : desoluina vasta-ainetta tuottava solu vai T-solu. Katso julkaisu Britton, Scand. J. Immunol., 1:89 (1972). Kuva 7 osoittaa, että B-solujen tuottama vasta-ainereaktio antigeenin ja MLC:n emäliuoksen läsnäollessa kasvoi enemmän kuin yhden kertaluokan, kun 8-MGuo:ta sisältävää valmis-- '· tetta lisättiin kosketuksiin solujen kanssa. Lisäksi kuvan * 7 tiedot osoittavat, että tämä nukleosidi voi korvata T- avustajasolut MLC:n emäliuoksen puuttuessa. 1 ^ Emäliuostekijän ja nukleosidiä sisältävän valmisteen tuot- ; tamien signaalien luonne vaikuttaa selvältä, koska kerran "...· selvää synergiaa havaittiin, kun molempia lisättiin vilje- 26 87733 lykseen samanaikaisesti. Täten MGuo:n apuaineen kaltaiset vaikutukset eivät vaikuta olevan vahingoittumattomien T-solujen välittämiä, mutta ne voivat kohdistua suoraan reaktiota aiheuttavaan B-soluun tai soluun, jossa antigeeni on läsnä.

Tiedetään, että tietyt apuaineet, kuten LPS, kadottavat elvyttävän kykynsä, mikäli ne lisätään viljelmään antigeenin jälkeen päivää tai useampia päiviä myöhemmin. Katso Ortiz-Ortiz ja Jaroslow, Immunology, 19:38 (1970). Herkkyys 8-MGuo:n apuaineen kaltaiselle vaikutukselle ei kuitenkaan rajoitu inkubointijakson varhaiseen osaan, mikä voidaan nähdä kuvasta 8. Piilevän vasta-ainereaktion selvä elpyminen tapahtui, vaikka viljelmiin lisättiin nukleo-sidijohdannaista 4-päiväisen viljelyjakson 3. päivänä. Tästä johtuen on ilmeistä, että apuaineen kaltainen vaikutus kohdistui tapahtumiin, jotka reaktiossa ilmenevät vasta suhteellisen myöhään.

Tämän keksinnön mukainen valmiste tuottaa selvän toisen viestin saatettaessa sitä kosketuksiin solujen kanssa, joka viesti ei ole riippuvainen avusta-T-solujen signaalin läsnäolosta. Edellä esitetyt tulokset kuvaavat myös vasta-:Y: ainereaktion spesifistä, annoksesta riippuvaa kasvamista -[* pitoisuuksissa, jotka ovat puolta kertaluokkaa alempia, kuin pitoisuudet, jotka indusoivat maksimaalisen mitoosi-: jakautumisen ja polyklonaalisen immunoglobuliinin eritty- misen.

i, „ 87733 (Katso julkaisua ‘Goodman ja Weigle, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. ja J. Immunol., 128:2399, supra.)

On huomattavaa, koska tämän keksinnön mukaiset menetelmät ja valmisteet ovat käyttökelpoisia elvyttämään mitoosi jakautumista, polyklonaalisia reaktioita ja apuaineen kaltaista vaikutusta, kuten edellä on esitetty, niin noiden kolmen ominaisuuden epäillään olevan vähintään kahden eri reitin seurauksia, joissa reiteissä mitoosijakautuminen ja polyklonaalinen reaktio ovat usein yhtä aikaa esiintyviä tapahtumia, kun taas apuaineen kaltaiset tulokset poikkeavat usein näistä. Katso esim. julkaisuja Goodman et ai., J. Exp. Med., 147:800 (1978); Mclntire et ai., J. Immunol., 117:674 (1976); ja Hoffman et ai., J. exp. Med., 146 (1977).

Yllä mainitun kolmen ominaisuuden toisistaan erottumista voidaan havainnollistaa edelleen tarkastelemalla kuvaa 31. Tästä voidaan nähdä, että tavalliset (CBA/CaJ) hiiret reagoivat 8-MGuo:n pleiotrooppisiin vaikutuksiin noita kolmea ominaisuutta tutkivissa kokeissa. Kuitenkaan epänormaali hiirikanta (SJL) ei kykene reagoimaan 8-MGuo:hon lisääntyen tai polyklonaalisella (ei-spesifisellä) vasta-ainereaktiolla, mutta reagoi spesifisen antigeenin (SRBC:n) läsnäollessa.

Erillisessä tutkimuksessa, jossa käytettiin SJL-B-soluja antigeeninä toimivan SRBC:n läsnäollessa tai ilman sitä ja T-tyyp-pisiä signaaleja tuottavan 8-MGuo:n läsnäollessa tai ilman sitä, sekä mitoosijakautumisen että TRF-kaltaisen aktiivisuuden todettiin olevan annoksesta riippuvia 8-MGuo:n pitoisuuden suhteen. Kuitenkin mitoosijakatuminen lisääntyi ainoastaan noin 4-5-ker-taiseksi, kun taas TRF:n kaltainen aktiivisuus kasvoi noin 140-kertaiseksi, jonka jälkeen se putosi vastaamaan noin 40-kertaista kasvua 8-MGuo:n samalla pitoisuusalueella (10 - 10 molaarinen), kun SRBC:n pitoisuus pidettiin vakiona 0,01%:ssa.

[.isäksi havaittu annoksesta riippuva mitoosi jakautuminen nähdään ainoastaan spesifisten antigeenien läsnäollessa.

2ft 37733

Lisäksi huomautettakoon, että mitoosi jakautuminen jatkoi kasvuaan 8-MGuo:n tutkitulla annosalueella, kun taas TRF:n kaltainen aktiivisuus saavutti huippunsa tällä pitoisuusalueella. Tulokset osoittavat lisäksi, että mitoosijakautumisen aktiivisuus ei selitä havaittua TRF:n kaltaista aktiivisuutta.

Immuunireaktioiden havaittiin elpyvän kaikilla antigeenin annoksilla, mutta kuitenkin elpymisaste oli tavallisesti suurimmillaan antigeenin optimaalisilla pitoisuuksilla tai lähellä optimaalisia olevilla pitosuuksilla. Tuloksemme osoittivat, että joko 8-MGuo:n tai 8-BrGuo:n apuaineen kaltainen vaikutus oli antigeenin kanssa synergistinen, eikä johtunut ainoastaan antigeenispesifisen ja polyklonaalisen reaktion yhteisvaikutuksesta.

8-MGuo:n aikaansaama vasta-aineiden tuottamisen elpyminen ei käsitä ainoastaan luonnollisia, antigeenisesti kokemattomia B-soluja, vaan myös antigeenisesti kokeneita tai muistavia B-soluja. Täten ensimmäinen IgM sekä sekundaariset IgM- ja IgG-reaktiot lisääntyivät, kun viljelmä saatettiin kosketuksiin vaikuttavana aineena vaikuttavia 8-MGuo-määriä sisältävän valmisteen kanssa.

8-MGuo:n epäillään elvyttävän ensimmäistä humoraalista immuuni-reaktiota vaikuttamalla suoraan B-soluun ja/tai soluun, jossa antigeeniä on läsnä. Täten tämän nukleosidijohdannaisen käyttö elvytti T-riippuvaisia antigeenejä vastaan syntyviä vasta-aine-reaktioita, eli reaktioita, joihin sisältyy B-soluja ja soluja joissa antigeeni on läsnä. Lisäksi 8-MGuo:ta sisältävien valmisteiden apuaineen kaltainen vaikutus ilmenee viljelmissä, joiden kasvattaminen on aloitettu vahingoittumattomien, toiminnallisten T-solujen puuttuessa. T-solujen korvaaminen MCL-emäliuoksessa olevalla T-solujen avustaja-aktiivisuudella ei vähentänyt 8-MGuo:n kykyä lisätä vasta-ainereaktiota. Edelleen liukoisen T-solun signaalin ja guaniinijohdannaista sisältävän valmisteen välillä havaittu synergia osoittaa, että molempien tuottama signaali on kvalitatiivisesti erillinen. Tätä synergiaa havaittiin tietyllä emäliuoksen pitoisuuden alueella, mikä 29 87733 osoittaa sen, että guanosiinijohdannainen ei vain yksinkertaisesti tuottanut enemmän MLC:n kaltaista signaalia. Verrattain samanlainen synergian aste voidaan havaita, kun tällaiset B-solu-viljelmät täydennetään T-soluilla eikä MLC-emäliuoksi.lla (jotka ovat itse asiassa peräisin T-so.luista) antigeenin läsnäollessa ja jotka saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisten, guani-diinijohdannaista sisältävän valmisteen kanssa.

T-solun välittämät 8-MGuo:n apuaineen kaltaiset vaikutukset eivät ole epätavallisia, vaikka tämän apuaineenkaltaisuuden havaitaankin olevan T-riippumaton, eli T-solusta riippumattoman seikan olemassaolo ei estä T-solusta riippuvaisen vaiheen olemassaoloa. Täten guanosiinijohdannaista sisältävän valmisteen aiheuttamaa huomattavampaa elpymistä havaittiin sellaisissa stimulointiolosuhteissa, joissa T-riippuvaista ja T-riippumatonta 2-tyypin antigeeniä oli läsnä (T-solusta riippuvaiset tilanteet) kuin T-riippumattomien (täydellisemmin T-solusta riippumattomien), 1-tyypin antigeenien läsnäollessa, mikä antaa olettaa T-solusta riippuvan komponentin olevan läsnä.

Apuaineen arvo voidaan määrittää sen kyvyllä palauttaa immunologisesta vajavaisten kohteiden immuunireaktio. Täten CBA/N-hiiriä käytettiin X-kromosomiin liittyvän (X-sidotun) ensimmäisen B-solun immunologisen vajavaisuuden hiirimallina. Tämän kannan arvellaan olevan vajavainen Lyb 3/5/7-antigeeneja kantavan, täysin kehittyneiden B-lymfosyyttien alipopulaation toiminnallisen aktiivisuuden suhteen. Katso Huber et ai.,J.Fxp.Med., 145:1 (1977);

Ahmed et ai., J. Exp. Med., 145:101 (1977); ja Subbarao, J. Immunol., 122:2279 (1979). Tätä vajavaisuutta kantavien urospuolisten NCF^ hiirien kyvyttömyys reagoida normaalisti T-riippuvaiseen antigeeniin (Janeway ja Barthold, supra) korjattiin täydentämällä viljelmät 8-BrGuo:lla tasoille, jotka olivat vertailueläinten tasoja korkeammat.

Yllä esitettyjen tulosten yksityiskohdat selviävät seuraavasta kohdasta Materiaalit ja menetelmät, osa A, katso Goodman ja Weigle J. Immunol. 130:2580 (1983).

30 87733

Edellä tässä kappaleessa esitetyt tulokset osoittavat, että T-solun kaltainen signaali välitetään B-soluihin saattamalla nämä B-solut kosketuksiin tämän keksinnön mukaisten valmisteiden kanssa antigeenin läsnäollessa, ja että tämä signaali saa synergiaa aikaan T-soluista tai niiden tuotteista peräisin olevien muiden tiettyjen signaalien kanssa.

Beeta-interferonin ja 8-MGuo:n kyky edistää kasvanutta T-solun kaltaista induktiivista signaalin antoa B-soluissa_

Tutkittaessa nukleosidien C8-johdannaisten vaikutusta lymfosyytin toimintaan havaittiin sen riippuvan nukleosidien kyvystä välittää T-solun kaltainen signaali B-soluihin antigeenin läsnäollessa.

Sen johdosta 8-MGuo:n T-solun kaltaisia induktiivisia vaikutuksia B-soluun ja antigeeniin tutkittiin eräänlaisen, lukuisia T-soluista ja makrofaageista peräisin olevia sytokiineja sisältävän emäliuok-sen läsnäollessa.

Sytokiinit saatiin soluttoman emäliuoksen muodossa CBA/CaJ ja (C57B1/6J x DBA/2)F^ hiirten välisistä lymfosyyttien seosvil-jelmistä. Tämänkaltaiset emäliuokset sisältävät interleukiini-1:tä, interleukiini-2:ta, B-solun kasvutekijöitä, T-solun kor-vaustekijöitä, ja interferoneita, muiden muassa. B-solujen ja näiden emäliuosten yhteisvi.1 jelmät antigeenin läsnäollessa ja 8-MGuo:lla täydennettynä johtivat synergistiseen reaktioon (antigeeni spes i f i set , v.u; l a-a i ne i ta erittävät solui.), kuten kuvasta 23 voidaan havaita, verrattuna siihen reaktioon, joka havaitaan B-soluilla ja antigeenillä pelkästään 8-MGuo:n tai emäliuoksen läsnäollessa.

Ne tutkimukset ovat käynnissä, joissa pyritään tunnistamaan puhdistettujen B-solujen antigeenispesifisen reaktion 8-MGuo:n läsnäollessa tapahtuvan synergistisen laajentumisen aikaansaava(t) sytokiniini(t). Erityisesti interferonit vaikuttavat lupaavilta tässä suhteessa, ja beeta-interferonilla aikaansaadut ensikäden tulokset on esitetty jäljempänä olevassa taulukossa III.

31 87733

Taulukko III

Beeta interferonin ja 8-MGuo:n kyky erikseen ja yhdessä edistää kasvanutta T-solun kaltaista induktiivista signaalin antoa B-soluissaa_____

Beeta-IFNb SRBCT 8-MGuo*3 (Yksikköä/ml) PFCc - - 38+7 + - 63+20 + - 575+31 + + - 2404+283 + 1 50+5 + + 1 3104+56 + - 10 103+28 + + 10 3417+227 + - 100 213+16 + + 100 3675+0 + - 1000 411+45 + + 1000 6175+628 1000 57+7 a 6

Viljelmät toistettiin kolmasti, ja ne sisälsivät 5x10 CBA/CaJ

B-solua millilitrassa (ml) sekä 0.01% SRBC:a, 3xl0-4 molaarista B-MGuo:a ja/tai taulukossa esitetyt Beeta-IFN:n yksiköt. Viljelmiin lisättiin ravinteita kerran päivässä, kuten julkaisussa Mishell ja Dutton, J. Exp. Med., 126:423 (1967) on esitetty. PFC-määritys tehtiin neljäntenä vi1jelypäivänä.

j_

Lampaan veren punasolun (SRBC) antigeenin, 8-MGuo:n ja/tai beeta-interferonin (Beeta-IFN) läsnäolo on osoittettu '^"-merkillä, kun taas minkä tahansa edellä mainitun komponentin puuttuminen on osoitettu "-"-merkillä.

c Täplän muodostavat solut neljän viljelyvuorokauden kuluttua; määritetty kuten kuvassa 1.

Kuten taulukon III tiedot osoittavat, hiiren beeta-interferoni kykenee tuottamaan T-solun kaltaisen induktiivisen signaalin B-soluille ja antigeenille, kuten 8-MGuo:lle. Kuitenkin sekä 32 87733 8-MGuo:n että beeta-interferonin läsnäollessa havaitaan syntyneessä reaktiossa tiettyä synergiaa. Elpynyttä immuunireaktiota, joka on havaittu in vitro saattamalla sellaiset solut, kuten B-solut kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen valmisteen kanssa antigeenin läsnäollessa, joka valmiste sisältää noin lxl0_5:stä _3 noin 1x10 reen molaarista 8-substituoitua guanosiinijohdannaista, voidaan parantaa synergistisesti, kun kyseinen valmiste sisältää 3 9 myös noin 1x10 rsta 5x10 raan yksikköä interferonia, kuten beeta- interferonia, litrassa. Mieluummin, in vitro, interferonin pitoi- 4 6 suus on noin 1x10 rsta noin 5x10 rteen yksikköä litrassa.

Ihmisiin kohdistuvissa in vivo-sovellutuksissa interferoniannos- 3 9 tuksen tulisi olla noin 1x10 rsta noin 5x10 rään yksikköä päivässä yksittäisinä tai toistettavina annoksina annettuna, ja mieluummin 4 6 noin 1x10 rstä noin 5x10 reen yksikköä päivässä. Eläinsovellutus-ten annostukset ovat verrattavissa ihmissovellutuksiin, eli annokset riippuvat eläimien painosta. Tässä sovellutuksessa käytettyjen B-substituoitujen guaniinijohdannaisten, kuten 8-MGuorn, teholliset annokset interferonin, kuten beeta-interferonin, kanssa yhdessä käytettynä esitetään jäljempänä. Tyypillisesti nämä annokset ovat alueella noin lrstä noin 1000reen milligrammaan käsiteltävän ihmisen tai eläimen painokiloa kohden. Alfa- ja gamma-interferoneita sekä muita sytokiineja käyttävät tutkimukset ovat parhaillaan käynnissä, ja niiden uskotaan osoittavan samankaltaista synergiaa.

8-sulfidoguaniinin johdannaisella aktivoitujen lymfosyyttien alapopulaation luonnehdinta_

Kuva 10 esittää CBA/CaJ hiirien pernasolujen inkubaatiotuloksia, kun inkubointi suoritettiin seerumittomissa olosuhteissa 8-MGuorn lisääntyviä pitoisuuksia sisältävien valmisteiden kanssa. Käyrä esittää tuloksena olevaa / H7TdR-kulutusta ja emosolun muodostumista kahden viljelypäivän jälkeen mitattuna, jolloin huippuarvot normitettiin. Stimuloitumattomia ja stimuloituja soluja edustavat kentät nähdään kuvissa 10B ja 10C, vastaavasti. Kuvissa 10A ja 10C esitetyt tulokset osoittavat, että 8-sulfido-substituoituja guaniinijohdannaisia sisältävät valmisteet indusoivat lymfosyyttien aktivoitumista (joka on lisääntymisen merkki) annoksesta riippuvalla tavalla.

33 87733 C57BL/6J hiiristä, joilta synnynnäisesti puuttui kateenkorva (nu/nu), peräisin olevia pernasoluja sekä edellisen kaltaisten hiirien heterotsygoottisista (nu/+) vastineista peräisin olevia pernasoluja viljeltiin seerumittomassa alustassa 8-MGuo:n lisääntyviä annoksia sisältävien valmisteiden läsnäollessa. Tunnetun T-lymfosyytti-mitogeenin, ConArn, aiheuttama reaktio muodostui säätelemään T-solujen kontaminaatiota. 8-MGuo sai aikaan / H7TdR-kulutuksen annoksen aiheuttaman reaktion profiilin, joka on yhdensuuntainen sen profiilin kanssa, jonka CBA/CaJ hiirten viljelmät tuottavat sekä C57BL/6J-puutteellisissa hiirissä että sen heterotsygootti-vastineessa, kuten kuvasta 11 voidaan nähdä.

Se, että toiminnalliset T-solut eivät kontaminoineet näitä populaatioita, voidaan todeta Con A:n nu/nu viljelmissä indusoidun stimuloinnin puuttumisesta. Tämä voidaan nähdä kuvan 11 oikealla puolella.

CBA/CaJ-tymosyyttien, B-souluille rikastettujen pernasolujen ja T-solujen viljelytulokset seerumia sisältävissä olosuhteissa viljeltynä, on esitetty kuvassa 12. Kuvan 12 käyrät osoittavat, että B-lymfosyytit herättivät voimakkaan, lisääntyvän 8-MGuo-reaktion, kun taas ei tymosyytit eivätkä pernasta peräisin olevat T-solut kumpikaan osoittaneet merkittävää reaktiota. Kuitenkin sekä tymo-syyttien että pernasta peäisin olevien T-solujen havaittiin tuottavan voimakkaat T-solun mitogeenin Con A:n reaktiot.

8-MGuo:hon reagoivien solujen solupinnan fenotyyppi määritettiin sellaisia pernasta peräisin olevia lymfosyyttejä käyttäen, joista lymfosyyteistä puuttui lukuisia pinnan merkkiaineita kantavat solut, kuten tarkemmin on esitetty kohdassa Materiaalit ja menetelmät, osa B. Kun pinnan IgM raskasketjua kantavia soluja poistettiin, mitä seurasi samojen solujen uusintapoistaminen, niin tuloksena oleva tyhjennetty populaatio ei reagoinut 8-MGuo:lie tai LPSrlle, mutta se oli täysin reaktiivinen T-solun mitogeenille, Con A:lle (taulukka IV, A, jäljempänä). Samaa tekniikkaa sovellettiin pinnan IgD raskasketjua kantaviin soluihin, 10-4.22 solu-linjan monoklonaalista tuotetta käyttäen, jolloin todettiin, että pinnan IgD-raskasketjua kantavista soluista erotetut populaatiot 34 87733 kykenivät pieneen, mutta merkittävään 8-MGuo:n aikaansaamaan reaktioon. (Taulukko IV, B). Liittymättömän populaation havaittiin reagoivan vaatimattomasti LPS:ään, mutta se säilytti täydellisen reaktiivisuutensa Con A:han.

EA-ruusutustekniikalla FcR+- ja FcR--populaatioihin jaetut perna-solut osoittivat, että vaikka FcR~-solut olivat todella epäreak-tiivisia 8-MGuo:hon, niin FcR+-solut reagoivat hyvin (Taulukko IV, C). Pernasolujen jakaminen komplementin (eli C3:n) vastaanottajia kantaviin populaatioihin ja populaatioihin, joista vastaanottajat puuttuivat, suoritettiin EAC-ruusutuksella. Populaatiot, joista CR+-solut oli poistettu, osoittivat pientä mutta merkittävää 8-MGuo:n aiheuttamaa reaktiota. CR+-alasarjän todettiin olevan erittäin reaktiivinen tätä nukleosidijohdannaista sisältäville valmisteille (Taulukko IV, D).

8-MGuo:n aikaansaama reaktiivisuus arvioitiin CBA/N immunologi-sesti puutteellisessa mallissa tähän tarkoitukseen sopivia, edellä mainittuja hiiriä käyttäen. Tällöin 8-MGuo:ta sisältävien valmisteiden inkubointi NCF^ naaraspuolisten hiirten solujen kanssa aiheutti voimakkaan reaktion. Ainoastaan vaatimaton reaktio havaittiin viljeltäessä NCF^ koiraspuolisten hiirten solujen kanssa (Taulukko IV, E).

35 87733 o o o o o o o o

r—. CM CM CO II II II

I—I · · · · < E PO CO rH ^ ^ +1 +1 +1 +1 C O' o o o o o a o o o o u in cm cm o il li ti rl · · · ·

^ in O CM CM

r~ rt mm cm m

M

E

rH

<D

H rn —'

Q, rl r—! O O O

a -H ·· E O O O

> > -H "-v O O CM O

>· ^ C D> · O ·· Il II II

+j E 0) 3 (Min cm H

o a a> m +1+1 +1+1 CUCPQjO oo oo a; o 'Jo oo oo 4-1-+J1H m ^ in in -h — · ·

C 3 E H1 I" mo II II II

ro +j cm σι cm C 3 >1 Ή C rH -μ

H 3 -P

> a JX :<fl h 1 en

C 05 -H O O OO O

oajOJ o 000 o _^ ·γηΕη rHO rrm cm o 00 eno

ν' 3 |\ «O · « »O OO · O

3 rH Xl rl in cm H, rl ro en m cm in rt o <n o +1+1 +1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 3tni 3-r 00 00 00 00 00 ro \i us 00 00 00 00 00 E-iC SE Γ"ΐη enin H in 00 in 000 Q) I rl · < · · · · * * * •h co —^ h in mm mm oom n- o > o i-~ in cm ri «n h H rl

O

O' ro Φ r, P 0

o O

C ro CM O OO OO OO rIO

o -P rl OO OO OO · O

j3 o) minmmen ririri r- ·· 3 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

0 rH OO OO OO OO OO

3 < OO OO OO OO OO

U enin cm m mm oom o en 2 · % · · » · * · ·· 1 00 cm m cm mcM m h h cm

CO rI

ro ro ero e Λ μ e μ e a» 0) (D Q) <D Λ a e a e m « h -h roro

o e > e > P P

•H <D -H Φ -H m -P

.μ e -h e -h ro o ro -H -P -H -P C Λί ro *H ro ri ro

I rl rl Dl rl Dl O

33 roro ro O + I Ό rl CM

ri a >c >c oios +1 cut.

00 ro 1 · ro 1 · u u · « κ ·υυ wa <PS CQ -P q ui+t, quo wss 36 87733 a 4x10^ elävää CBA/CaJ pernasolua viljeltiin 8-MGuo:n, LPSm tai Con A:n kanssa kaksi vuorokautta kahden petrimaljalle suoritetun levittämisen jälkeen, kun petrimalja sisälsi joko 5% FCS:ää sisältävää alustaa tai anti-IgM vasta-aineita.

k 4x10^ elävää CBA/CaJ pernasolua viljeltiin kaksi vuorokautta 8-MGuo:n, LPS:n tai Con A:n kanssa kahden petrimaljalle suoritetun levityksen jälkeen, jossa petrimaljassa oli joko 5% FCSrää sisältävää alustaa tai anti-IgD vasta-aineita.

C 4x10^ elävää CBA/CaJ pernasolua viljeltiin joko 8-MGuo:n kanssa tai ilman sitä kaksi vuorokautta sen jälkeen kun solut oli eristetty joko FcR+-jakeesta (rakeina) tai FcR--jakeesta (välittäjäpintana), kun nämä jakeet oli saatu aikaan EA-ruusu-tuksena. d 5 4x10 elävää pernasolua, jotka oli eristetty EAC-ruusutettujen solujen CR+-jakeesta (rakeina) tai CR -jakeesta (välittäjäpintana) viljeltiin kaksi vuorokautta 8-MGuo:n läsnäollessa tai ilman sitä. e 5 4x10 joko NCF^ naaraspuolisista tai koiraspuolisista hiiristä peräisin olevaa pernasolua viljeltiin kaksi vuorokautta 8-MGuo:n kanssa tai ilman sitä.

CBA/CaJ (Η-Σ*4) ja BALB/c (H-2^) pernasolua inkuboitiin A. TH anti-A.TL antiseerumin (anti-Ia ) lukuisten laimennosten kanssa 8-MGuo:n optimaalisia pitoisuuksia sisältävien valmisteiden läsnäollessa tai niiden puuttuessa, jotta saataisiin määritetyksi, ovatko 8-MGuo:n aiheuttamat reaktiot herkkiä anti-Ia vasta-aineiden inhibitiolle. Kuten alla olevaa taulukkoa V tarkasteltaessa voidaan todeta, antiseerumin suuret pitoisuudet osoittivat epäspesifisiä inhibitiovaikutuksia, kun taas spesifistä inhibitiota havaittiin alhaisemmissa pitoisuuksissa. Havaittu täydellinen inhibitio osoittanee sen, että merkittävältä joukolta 8-MGuo-reaktiivisia soluja joko puuttuu pinnan Ia tai ne kantavat sitä niin alhaisia pitosuuksia, että solun aktiivisuus ei ilmene vasta-aineen sitoutumisena.

··.

V , ϊ'^4.1 37 8 7 7 3 3

Taulukko V

Anti-Ia vasta-aineiden vaikutukset 8-MGuo:n aiheuttamaan mito- geenireaktioon____ k 8-MGuo:n indusoima/~JH7TdR:n kulutus3

Koe Aiti-Ia laimennos „„„ „k.

I alusta 49.800+810 (100%) 27.480+800 (100%) 1:40 0+2.100 ( 0%) 6.100+600 ( 22%) 1:80 0+2.300 ( 0%) 19.000+580 ( 69%) 1:160 26.470+1.740 ( 53%) 27.220+660 ( 99%) II alusta 31.260+1.250 (100%) 17.700+1.580 (100%) 1:100 7.650+990 ( 24%) 19.950+2.800 (113%) a 4x10^ CBA/CaJ tai Balb/c pernasolua viljeltiin 0,1 ml:ssa seerumitonta alustaa 1 mM 8-MGuo:n läsnäollessa tai sen puuttuessa lukuisten anti-Ia antiseerumin laimennosten kanssa, kuten on esitetty. Viljelmiin laitettiin 1 ^uCi /~^H7TdR:ää kaksi vuorokautta kestävän inkuboinnin 24 viimeisen tunnin ajaksi. Tulokset on esitetty viiteen kertaan toistetun viljelyn aritmeettisena keskiarvona + S.E.

Jotta vahvistettaisiin se, että IgD-, Ia~, CR , tai Lyb 3/5/7 -solujen synnyttämät alhaisen tason reaktiot eivät aiheudu muutamasta sellaisesta kontaminoivasta solusta, jotka yllämainittujen pinnan merkkiaineiden suhteen ovat positiiviset, niin mitogeenisen reaktion ontogeenisyys määritettiin suoraan eri ikäisiä CBA/CaJ hiiriä käyttäen. Kuvassa 13 esitetyt tiedot osoittavat, että neljän vuorokauden iässä, ennen näiden merkkiaineiden ilmenemistä solupinnalla,stimuloitumisindeksi oli suurin piirtein 20-25% kahdeksan viikkoa vanhojen hiirien viljelmän tuottamasta stimuloitu-misindeksistä.

8-MGuo:n aiheuttama reaktio arvioitiin sekä ennen johtamista Sephadex-G-10 hartsin läpi että sen jälkeen, jotta pidättyneiden solujen näyttelemä merkitys tätä guaniinijohdannaista aktiivisena 38 87 733 aineena sisältävien valmisteiden aiheuttamiin reaktioihin saataisiin selvitetyksi. Tällaisesta kolonnista läpitulleet solut eivät kykene reagoimaan 8-MGuo:hon, ja pidättyneiden, sät.eily-tettyjan pernasta peräisin olevien solujen lisääminen pidätty-mättömien solujen viljelmään ei palauttanut niiden reaktiivisuutta 8-MGuo:hon. Tämä esitetään kuvassa 14A. Kuva 14B esittää sitä, että Sephadex G-10 hartsiin pidättynyt solupopulaatio oli rikastunut 8-MGuo:hon reagoivilla soluilla.

8-MGuo stimuloi tavallisia pernasoluja, sekä sellaisia perna-soluja, jotka ovat peräisin synnynnäisesti kateenkorvattomista (nu/nu) hiiristä, joista toiminnalliset T-solut puuttuvat. T-solujen läsnäolo B-solujen viljelmässä ei elvyttänyt 8-MGuo:n aiheuttamaa mitogeenista reaktiota. 8-MGuo:n vaikutus näyttää olevan antigeenin suhteen epäspesifistä, sillä suuri osa pernasta peräisin olevia soluja reagoi siihen emäsolun muodostamalla. Siis spesifisen antigeenin läsnäoloa ei tarvita.

Lymfosyytit, jotka reagoivat mitogeenisesti 8-MGuo:hon, näyttävät olevan yksinomaan B-soluja, jotka pääasiassa ovat täysin kehittyneen pinnan fenotyyppiä. Itse asiassa kaikkien reagoivien solujen tunnusomaisena piirteenä on IgM+ FcR+ Thy 1.2--pinnan fenotyyppi. Useimmat solut tuntuvat siis kantavan pinnan Ia vasta-ainetta, IgD raskasketjua, C3 vastaanottajia ja Lyb 3/5/7 antigeenejä. Reaktioon saattaa liittyä myös toinen B-solujen ryhmä, josta joko kokonaan puuttuu yllä mainitut merkkiaineet, tai niitä on läsnä vain erittäin pieninä pitoisuuksina.

Yllä esitettyjen tulosten yksityiskohdat on esitetty jäljempänä olevassa kohdassa Materiaalit ja menetelmät, osa B. /Ratso Goodman ja Weigle, J. Immunol., 130:551 (1983).7

Immuunireaktion in vivo modulointi

Kuva 15 esittää silmiinpistäviä immunologisia valmiuksia antavia vaikutuksia SRBC:n aiheuttamaan ensimmäiseen vasta-ainereaktioon in vivo, jotka vaikutukset havaittiin, kun 8-MGuo:n suspensiota sisältävää valmistetta injektoitiin CBA/CaJ hiiriin 30 minuuttia 39 87733 SRBC-antigeenin injektoimisen jälkeen. Eläimet sietivät hyvin suhteellisen suuria annoksia, eli noin 25 mg eläintä kohden (noin 1 gramma kilogrammaa kohden). Kuva 16 esittää, että kun 8-MGuo:n antamista siirrettiin tapahtuvaksi noin 3 tai 4 päivää antigeenin antamisen jälkeen, niin suurimman apuaineen kaltaisen vaikutuksen tuottava pitoisuus on noin kaksi kertalukua pienempi ja se on arvoltaan noin 300^ug hiirtä kohden (noin 0,01 grammaa kilogrammaa kohden).

Kuva 17 esittää, että substituoiminen guaniinijohdannaisen 8-asemaan on kriittistä apuaineen kaltaiselle ominaisuudelle, kuten myös mitogeenisyydelle ja polyklonaalisen immunoglobuliinin erittymisen indusoitumiselle, kuten jäljempänä on esitetty. Täten CBA/CaJ hiiriin ruiskutettiin jälleen vatsaontelon sisäisesti (i.p.) SRBC:tä, jota seurasi samankaltainen injektoiminen joko tavallisella suolaliuoksella (NS), 8-BrGuo:lla tai Guo:lla.

Kuten kuvasta 17 voidaan nähdä, NS ja Guo tuottivat samankaltaisen alhaisen ensimmäisen vasta-ainereaktion, kun taas 8-BrGuo tuotti silmiinpistävän vasta-ainereaktion.

Kuva 18 esittää yllä mainittujen hiirien antigeeniannoksen riippuvuutta i.p.-injektoidun, tasoltaan vakiona pysyvän 8-MGuo:n (25 mg eläintä kohden) apuaineen kaltaiseen vaikutukseen, jolloin vertailuna oli NS:n i.p.-injektoinnit. Tämä kuva esittää, että vaikka immuunireaktio elpyikin kaikilla injektoiduilla antigeeni-määrillä, niin elpyminen suureni, kun piilevän reaktion voimakkuus kasvoi. Täten 8-MGuo:n voimistaessa reaktiota antigeenin alhaisilla annoksilla noin kaksinkertaisesta noin kolminkertaiseen, niin antigeenin optimaalisilla annoksilla reaktio voimistui noin kertaluokan verran.

Kuva 19 esittää tämän keksinnön mukaisen, apuaineenaan 8-BrGuo:ta sisältävän valmisteen tehokkuutta parannettaessa in vivo immuno-logisesti vajavaista tilaa. Tämä in vivo esitys vastaa edellä olevassa kuvassa 9 esitettyä in vitro parantamista.

40 87733

Immunologisesti vajavaisiin (CBA/N x CBA/CaJ) hiiriin injektoitiin i.p. SRBCrtä antigeenisiä määriä, jota seurasi joko suolaliuoksen i.p. injektointi tai 25 milligrammaa eläintä kohden 8-BrGuo:n suspensiota sisältävän valmisteen injektointi i.p. Kuva 19 esittää, että kateenkorvasta riippuvaisen antigeenin aiheuttama piilevä vasta-ainereaktio on käytännöllisesti katsoen nolla vajavaisilla (urospuolisilla) eläimillä vertailuryhmän (naaraspuolisiin) eläimiin verrattuna. Tämä on esitetty julkaisuissa Janeway ja Barthold, supra, sekä Scher et ai., J. Immunol., 123:477 (1979). Tämä kuva osoittaa, että 8-BrGuo:n injektoiminen johtaa tämän reaktion huomattavaan (yli 20-kertai-seen) elpymiseen. Tämä moduloiva elvyttäminen kohottaa vajavaisten uroshiirten reaktiotason normaaleissa, naaraspuolisissa hiirissä saavutetun tason yläpuolelle pelkkää antigeeniä käyttäen ja se on verrannollinen 8-BrGuo:n normaaleissa hiirissä tuottaman elpyneen reaktion kanssa.

Yllä esitetyt tulokset osoittavat, että optimaaliset vaikutukset näillä tietyillä eläimillä saavutetaan annostason ollessa noin 25 milligrammaa eläintä kohden (noin yksi gramma kilogrammaa kohden), kun annos injektoidaan lyhyen aikaa antigeenin injektoimisen jälkeen; eli noin saman 24 tunnin jakson aikana antigeenin injektoimisen kanssa, ja annostason ollessa noin 300 ;ug eläintä kohden (0,01 grammaa kilogrammaa kohden), kun antamista viivytetään vähintään noin 3:sta 4:ään vuorokautta siitä hetkestä lukien, jolloin eläinsolut joutuivat alttiiksi in vivo antigeenille.

Myöhemmin etenevän reaktion kuluessa ilmenevä, tämän keksinnön mukaisen valmisteen silmiinpistävä apuaineen kaltainen vaikutus osoittanee, että immunologisesti elvyttävät moduloivat vaikutukset eivät aiheudu antigeeniin reagoivien solujen klonaalisesta laajentumisesta. Pikemminkin luullaan, että tämän keksinnön mukaiset valmisteet synnyttävät lopullisen laukaisevan signaalin solupopulaatioon, jonka aktivoituminen ei muulla tavoin edistyisi keskimääräistä tasoa pitemmälle, ja joka aktivoituminen lopulta katoaisi.

41 87733

Tulokset osoittavat edelleen, että tämän keksinnön mukaiset valmisteet ovat tehokkaampia,kun solut joutuvat näiden valmisteiden kanssa kosketuksiin antigeenin antamisen jälkeisenä aikana, ja ne ovat yhtäpitävät edellä esitettyjen in vivo tutkimusten tulosten kanssa, jotka tutkimukset osoittivat, että näitä valmisteita voidaan saattaa kosketuksiin soluviljelmien kanssa noin 3 vuorokautta antigeenin jälkeen tulosten ollessa yhtä hyvät tai paremmat, kuin jos niitä olisi lisätty viljelmään alussa.

Tämän keksinnön mukaiset valmisteet elvyttävät solureaktioita kaikilla antigeenin annoksilla, mutta kuitenkin elpymisaste oli tavallisesti suurimmillaan optimaalisilla tai lähellä optimaalista olevilla pitoisuuksilla. Tämän keksinnön mukaisten valmisteiden apuaineen kaltaisuuden on osoitettu olevan muuta kuin antigeeni-spesifisen ja -epäspesifisen (polyklonaalisen) reaktion summa.

Tämän keksinnön mukaisten valmisteiden in vivo apuaineen kaltaisuutta voidaan valaista edelleen niiden kyvyllä indusoida vasta-ainereaktioita hiirissä, jotka ovat immunologisesti vajavaisia johtuen X-sitoutuneesta ensimmäisestä B-solusta. Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että tätä geneettistä vajavaisuutta kantavat hiiret reagoivat tavallisesti T-riippuvaiseen antigeeniin, kun niiden solut saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen valmisteen kanssa täydentävällä injektiolla.

Täten tämän keksinnön mukaiset valmisteet ilmentävät voimakasta apuaineen kaltaisuutta, kun niitä annostellaan in vivo. Lisäksi niiden käyttö on edullista, koska ne eivät luonteeltaan ole mik-robi-peräisiä, ne eivät vaadi tappavien öljyemulsioiden injektoimista ja ne tarjoavat uuden mahdollisuuden etenevän immuunireaktion elvyttämiseksi.

Edellä mainittujen tulosten yksityiskohdat on selvitetty kohdassa Materiaalit ja menetelmät, osa C. /Katso Goodman ja Weigle,

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80:3452 (1983)/, 42 87 7 33

Hiiren sekundaarista reaktiota antigeeninä in vivo toimivaan ihmisen gamma-globuliiniin (HGG) on myös tutkittu. 11 A/J hiireen, joista viisi oli vertailuhiirtä ja kuusi oli käsiteltyä hiirtä, injektoitiin suonensisäisesti in vivo 400 mikrogrammaa lämpökäsiteltyä HGG:tä, joka oli puhdistettu DEAE-Sephadex:illa (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), menetelmällä, joka on esitetty julkaisussa Chiller ja Wiegle, J. Immunol. 110:1051 (1973), joka täten yhdistetään hakemukseen tällä viittauksella. Tämän jälkeen vertailuhiiriin injektoitiin vatsaontelon sisäisesti liuosta, jossa suolaliuoksessa (0,15 M NaCl) oli 10 mg/ml karboksimetyyliselluloosaa (CMC), ja käsiteltyihin hiiriin injektoitiin vatsaontelon sisäisesti 25 milligrammaa samanlaisessa CMC-liuoksessa olevaa 8-BrGuo:n liukenematonta suspensiota.

10. päivänä hiirille annettiin vatsaontelon sisäisesti 400 mikro-grammaa lämpökäsiteltyä HGG lisää. 14. päivänä hiirien spesifiset HGGrtä vastaan suuntautuneet, vasta-ainetta erittävät solut arvioitiin menetelmällä, joka on esitetty julkaisussa Chiller ja Wiegle, J. Immunol., supra. Saadut tulokset olivat 2064 PFC/perna vertailuryhmällä (HGG + CMC) ja 8947 PFC/perna HGGrllä ja CMCrssä olevalla 8-BrGuo:lla immunoidulla ryhmällä, joissa tuloksissa molemmat luvut edustavat vastaavien ryhmien aritmeettista keskiarvoa.

Myös HGG:n synnyttämää ensimmäistä reaktiota toistettujen nukleo-sidiannoksien kanssa tutkittiin edellä esitettyä tekniikkaa käyttäen. 400 mikrogrammaa lämpökäsiteltyä HGG:tä annettiin 19 hiirelle suonensisäisesti in vivo 0. päivänä. Kunakin päivänä 0, 2, 4, 6 ja 8 neljään hiireen injektoitiin vatsakalvon sisäisesti karboksimetyyliselluloosaliuosta, viiteen injektoitiin 30 mikro-gramman annos CMCrssä olevaa 8-BrGuo:ta,viiteen injektoitiin 300 mikrogramman annos CMC:ssä olevaa 8-BrGuo:ta ja viiteen injektoitiin 3000 mikrogramman annos CMCrssä olevaa 8-BrGuo:ta. 10. päivänä hiiret tapettiin ja PFCrn lukumäärä/perna mitattiin, jolloin saatiin jäljempänä esitetyn taulukon VI tiedot.

43 87733

Taulukko VI

PFC/perna toistuvien CMC:natai CMC:ssä olevan 8-BrGuo:n injek-tointien jälkeen_ 8-BrGuo:n pitoisuus toistuvassa injektiossa CMC 30 b 300b 3000b PFC/ 461 1046 1224 2480 perna a CMC = 10 mg karboksimetyyliselluloosaa/ml suolaliuosta (0,15 M NaCl).

Hiirelle annettu annos mikrogrammoina.

Kuten kuvassa 29 on esitetty, myös yksittäisen 8-BrGuo-annoksen vaikutusta HGG:n hiirissä synnyttämään ensimmäiseen PFC-reaktioon tutkittiin. A/J hiiriin injektoitiin 0. päivänä 400 mikrogrammaa lämpökäsiteltyä HGGrtä suonensisäisesti in vivo. Kolme tuntia myöhemmin injektoitiin joko karboksimetyyliselluloosan liuosta tai CMC-1luokseen lietetty 8-BrGuo:ta. 6. päivänä pernat poistettiin ja niiden HGGrtä vastaan suuntautunut PFC tutkittiin. Kuvan 29 pilarit ovat standardipoikkeaman pilareita ja mittapis-teet esittävät 12, 11, 12, 12, 12 ja 13 koehiirtä, vastaavasti, vasemmalta oikealle. Kuva 29 esittää, että hiirissä proteiini-antigeenin, ihmisestä peräisin olevan gamma-globuliinin aiheuttama in vivo PFC-reaktio kasvaa jatkuvasti 8-BrGuo:n annosten kasvaessa.

Yllä esitetyt 8-haloguaniinijohdannaisilla, kuten 8-BrGuo:lla saadut tulokset ovat rohkaisevia, mutta kuitenkin tämänkaltaisen materiaalin alustavat toksisuustutkimukset osoittavat, että 8-haloguaniinijohdannaiset, ja erityisesti 8-BrGuo, saattavat olla liian myrkyllisiä in vivo käytössä edullisimmissa pitoisuuksissa.

T-solun korvaava aktiivisuus Tämän keksinnön mukaisten valmisteiden kyky toimia T-solujen korvikkeena T-riippuvaisen antigeenin aiheuttamassa vasta-aine- 44 87733 reaktiossa on esitetty kuvassa 20. Tällöin B-soluja, jotka oli tuotettu in vitro käsittelemällä monoklonaalisella anti-thy 1.2:11a sekä komplementilla, viljeltiin SRBC:n kanssa tai ilman sitä 8-MGuo:n lisääntyviä pitoisuuksia sisältävien valmisteiden läsnäollessa. Kuvan 20 tiedot osoittavat, että näissä olosuhteissa eristettyjen B-solujen viljelmät eivät kykene reagoimaan antigeeniin, ellei niitä olla täydennetty 8-MGuo:lla. 8-MGuo-modu-loitu reaktio on annoksesta riippuva sekä antigeenistä riippuva. Lisäksi tämän reaktion ei voida katsoa johtuvan B-solujen epäspesifisestä polyklonaalisesta aktivoitumisesta (alempi käyrä); Tavallisten pernasolujen reaktio SRBC:hen vaihtelee kasvatusta kohden noin 600:sta noin 1000 PFC:hen.

Tämän keksinnön mukaisten valmisteiden kyky tuottaa T-solun tyyppisten signaalien vaihtoehtoinen lähde on esitetty kuvassa 21, jossa esitetään tämän keksinnön mukaisen valmisteen kapasiteetti palauttaa synnynnäisesti kateenkorvattomista (nu/nu) hiiristä peräisin olevien solujen ensimmäinen vasta-ainereaktio. Tällöin heterotsygoottiset (nu/+) vastineet toimivat vertailuna. Näiden viljelmien täydentäminen niinkin alhaisilla kuin 0,1 millimolaarisilla 8-MGuo:n pitoisuuksilla ei ainoastaan palauttanut nu/nu eläimistä peräisin olevien solujen ensimmäistä vas-taainereaktiota, vaan lisäksi se indusoi myös apuaineen kaltaisen vaikutuksen. Tuloksena olevien äärimmäisten reaktioiden todettiin olevan merkittävästi suuremmat kuin nu/+ viljelmien reaktio pelkästään antigeenille, ja niiden suuruus oli verrannollinen sekä antigeenillä että tämän keksinnön mukaisella valmisteella täydennettyjen nu/+ viljelmien tuottamien reaktioiden suuruuteen. Näistä tuloksista voitaneen päätellä, että täysin kehittyneiden T-solujen läsnäolo saattaa olla tarpeetonta tämän keksinnön mukaisten valmisteiden aktiivisuudelle.

Edellä viljellyt solupopulaatiot säilyttivät todennäköisesti T-avustajasolujen esiasteet. Jotta tällaisten solujen esiasteiden IL-2 riippuvainen lisääntyminen, sekä IL-2:n muodostuminen ensimmäisen immuunireaktion olosuhteissa inhiboitaisiin, niin 45 87733 koko pernasolupopulaatiot viljeltiin antigeenin kanssa 8-MGuo:n optimaalisia pitoisuuksia sisältävien valmisteiden läsnäollessa tai niiden puuttuessa. Syklosporiini A:ta lisättiin kasvavia pitoisuuksia annoksen ollessa IL-2:n tuotantoa inhiboivalla alueella. Bunjes et ai., Eur. J. Immunol., 11:657 (1981).

Kuvan 22 vasemmalla palstalla olevat tiedot esittävät, että syklosporiini A häiritsi progressiivisesti SRBC:n aiheuttamaa pernasolun reaktiota, kunnes se pieneni taustahäiriöiden tasolle. 8-MGuo:lla täydennetyt viljelmät olivat vastustuskykyisiä tälle syklosporiini A:n inhiboivalle vaikutukselle, täten osoittaen tämän ilmiön IL-riippuvuuden.

Kuvan 22 oikeassa palstassa pernasolun reaktio normitettiin 100%:ksi SRBC:n aiheuttamasta reaktiosta syklosporiini A:n puuttuessa.

Kuvassa 23 esitetään antigeeniä sisältävien B-solupopulaatioi-den reaktioita MCL:n emäliuoksen lisääntyviin määriin, joka emäliuos voi sisältää IL-2:ta tai lymfokiineja, 8-MGuo:n läsnäollessa tai sen puuttuessa. Kuvan 23 tiedot esittävät, että vaikka B-solujen viljelmissä MLC-emä1iuokset kykenivätkin ylläpitämään antigeenin aiheuttamaa merkittävää reaktiota, niin tämän reaktion suuruus lisääntyi moninkertaiseksi 8-MGuo:n Läsnäollessa. Täten tämän keksinnön mukaisen valmisteen antaminen indusoi spesifisen vasta-aineen muodostumisen mekanismilla, joka oli erilainen kuin MLC-lymfokiinien mekanismi.

Tämän keksinnön mukaista valmistetta ja T-soluista johdettuja lymfokiineja lisättiin B-solupopulaatioon, joka oli muodostunut in vivo, jonka jälkeen seurasi in vitro käsittelyt joko viljelmän alussa tai 72 tuntia myöhemmin. Näiden määritysten tulokset osoittavat, että nämä viljelmät kadottavat kykynsä reagoida IL-2:een liittyneisiin lymfokiineihin, kun lymfokiinilisäystä lykättiin, mutta ne reagoivat 8-MGuo:hon, joka tällöin lisättiin. Nämä tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa VII. Lisäksi tällaisen IL-2 valmisteiden lisääminen viljelmän alussa 46 87733 ja 8-BrGuo:n lisääminen 72 tunnin kuluttua viljelmän aloittamisesta tuottivat yhteisvaikutuksen, mikä edelleen todistaa sen, että nämä kaksi apuaineluokkaa toimivat erilaisilla mekanismeilla .

Taulukko VII

8-BrGuo:n kineettiset ominaisuudet ja IL-2 T-solun korvaavat vaikutukset__

Lisäyspäiväa Suora PFC .

SRBC . ..... ..... SRBC:hen/viljelmäD

_ 0.päivä 3.päivä _J

190 + 21 + -- -- 230 + 14 + IL-2 -- 1.250 +130 + _ IL-2 220 + 8 + _ 8-BrGuo 760 + 4 + IL-2 8-BrGuo 2,050 +120 a 5x10^ elävää CBA/Caj pernasta peräisin olevaa B-solua, jotka olivat erittäin puutteellisia T-solujen suhteen, viljeltiin 4 vuorokautta 2x10^ SRBC:n kanssa tai ilman niitä. Joko sinä päivänä, kun kasvatus aloitettiin, tai 3 vuorokautta myöhemmin _ 3 IL-2:een liittyneet lymfokiinit (10 yksikköä/ml) tai 10 M 8-BrGuo:ta (lopullinen pitoisuus) lisättiin viljelmään.

b ....

Tulokset on ilmoitettu neljästi toistettujen viljelmien aritmeettisena keskiarvona + S.E.

Yllä olevasta tiedosta ilmenee, että tämän keksinnön mukaiset valmisteet tuottavat T-solun tyyppisen signaalin antigeenin stimuloiville B-soluille, jolloin T-solujen tarve syrjäytyy kokonaan muuten T-riippuvaisen reaktion olosuhteissa. Täten sellaisen T-solujen viljelmän, josta thy 1.2:ta kantavat solut oli poistettu, täydentäminen 8-MGuo:ta sisältävällä valmisteella korvasi täydellisesti T-avustajasolujen tarpeen SRBCrn aiheuttaman ensimmäisen vasta-ainereaktion tuottamisessa. Tämä päti, olipa splenosyyteistä poistettu T-solut in vitro käsittelyllä 47 87733 monoklonaalisella, anti-thy 1.2:11a ja komplementilla, tai ATS:n in vivo injektiolla, jota seurasi in vitro käsittely ATS:1lä, anti-thy 1.2:11a, anti-Lyt l:llä ja anti-Lyt 2:11a ja komplementilla, kuten julkaisussa Harwella et ai., J. Exp. Med. 152:893 (1980) on esitetty. 8-MGuo:ta sisältävien valmisteiden TRF:n tapainen aktiivisuus oli selvästi annoksesta riippuvainen, eikä sen voida katsoa johtuvan B-soluissa tapahtuvan epäspesifisen polyklonaalisen aktivoitumisen johdosta.

Se mahdollisuus, että tämän keksinnön mukaiset valmisteet indusoivat T-avustajien esiasteita kehittymään täysin, jolloin ne myötävaikuttaisivat havaittuihin reaktioihin, saatiin eliminoiduksi yllä esitetyillä määrityksillä syklosporiini A:ta sellaisia määriä käyttäen, joiden määrien on aiemmin osoitettu häiritsevän IL-2:n tuotantoa, mikä olisi saattanut myötävaikuttaa tällaisten solujen klonaaliseen laajentumiseen. (Bunjes et ai., supra.) Vaikka syklosporiini A kumoaakin täysin pernasolujen reaktion SRBC:hen 8-MGuo:n puuttuessa, niin kuitenkin näiden solujen antigeenille altistamisen synnyttämä reaktio 8-MGuo:n läsnäollessa oli vastustuskykyinen syklosporiini A: Ile.

Täten 8-MGuo:n TRF:n kaltainen vaikutus on täydellisesti IL-2:sta riippuvainen. Lisäksi se apuaineominaisuuden lisääntyminen, joka indusoitui saattamalla solut kosketuksiin 8-MGuo:ta sisältävien yhdisteiden kanssa verrattuna viljelmiin, jotka sisälsivät T-soluja ja antigeeniä, mutta joissa ei ollut 8-MGuo:ta, oli myös T-soluista riippumaton ja IL-2 riippumaton. Tästä syystä tämän keksinnön valmisteet toimivat joko vahingoittumattomien T-solujen korvikkeina tai liukoisten T-soluista johdettujen molekyylien korvikkeina antigeenin aiheuttamassa ensimmäisessä humoraalisessa reaktiossa.

Yllä esitetyt tulokset osoittavat myös, että tämän keksinnön mukaisen valmisteen toimintamekanismi poikkesi T-soluista johdettujen lymfokiinien ja niissä olevan, T-solut korvaavan (tai B-soluja stimuloivan) aktiivisuuden toimintamekanismista. Tämän osoitti MLC-emäliuoksiin kehittyneet 8-MGuo:n ja T-avustaja- 4B 87733 tekijän synergistiset vaikutukset, jolloin emäliuoksen ylläpitämä anti-SRBC PFC reaktio voimistui noin 2:sta noin kolminkertaiseksi, kun liuokseen lisättiin 8-MGuo:ta sisältäviä valmisteita .

Lisäksi 8-BrGuo-valmisteet toimivat täysin erilaisilla kineettisillä ominaisuuksilla kuin mitkä on IL-2:een liittyneillä lymfo-kiineilla, jotka tulevat yhtä aikaa IL-2:n kanssa DEAE-Sephadex-kolonnin läpi, siten että lymfokiineja sisältävät valmisteet olivat täysin tehottomia, kun lisäystä viljelmään lykättiin, kun taas solujen saattaminen kosketuksiin 8-BrGuo:ta sisältävien valmisteiden kanssa 72 tunnin kuluttua viljelyn aloittamisesta mahdollisti antigeenin aiheuttaman spesifisen reaktion muodostumisen .

Lisäksi, kun edellä mainitut lymfokiinivalmisteet lisättiin viljelyn alussa, jota seurasi 8-BrGuo:n lykätty lisäys, niin tuloksena oleva reaktio oli kunkin aineen aikaansaaman ainekohtaisen reaktion summa. Tämän havaitun IL-2:een liittyneiden lymfokiinien kanssa syntyvän synergian puuttumisen, verrattuna MLC-emäliuosten havaittuun synergiaan, oletetaan johtuvan MLC-emäliuoksissa olevien muiden lymfokiinien, kuten interferonin, vaikutuksista (katso taulukko III, joka on esitetty edellä).

Tästä johtuen, vaikka tämän keksinnön mukaiset valmisteet ylläpitävätkin T-solusta riippumatonta ja IL-2 riippumatonta antigeenin spesifisiä reaktioita, niin kuitenkin niiden toimintamekanismin on oltava oleellisesti IL-2:een liittyneiden lymfokiinien TRF-aktiivisuuden toimintamekanismista poikkeava, ja toimintamekanismin ?n muistutettava pikemminkin aikaan liittyviltä ominaisuuksiltaan myöhään vaikuttavan T-solun korvaustekijoiden ominaisuuksia, esimerkiksi sellaista, joka on esitetty julkaisussa Schimpl et ai., Nature (New Biol.), 237:15 (1972).

Edellä kuvatun työn kokeelliset yksityiskohdat on esitetty kohdassa Materiaalit ja menetelmät, osa D. (Katso Goodman ja Weigle, J. Immunol., 130:2042 (1983), joka täten on yhdistetty tähän hakemukseen tällä viittauksella.

49 87733

Humoraalisten immuunireaktioiden modulointi immunologisesti vajavaisissa, vanhoissa hiirissä_ 8-MGuo:n ja LPS:n suhteellisia mahdollisuuksia aktivoida hiiren B-lymfosyytit erittämään immunoglobuliinia tutkittiin nuorista ja vanhoista C57BL/6J hiiristä peräisin olevien pernasoluviljel-mien avulla. Kuvassa 24 esitetyt näiden tutkimusten tulokset osoittavat, että sekä 8-MGuo että LPS indusoivat tehokkaasti polyklonaalisen immunoglobuliinin erittymistä sellaisissa perna-solujen viljelmissä, joissa solut olivat peräisin nuoresta aikuisesta hiirestä (avoimet pylväät). Vanhoista hiiristä peräisin olevat solut reagoivat voimakkaasti, kun ne saatettiin kosketuksiin 8-MGuo:ta sisältävien valmisteiden kanssa, vaikkakaan ne eivät kyenneet reagoimaan LPSrään (viivoitetut pylväät). Vaikka vanhoista eläimistä peräisin olevien solujen reaktio 8-MGuo:hon olikin pienempi kuin nuoremmista eläimistä peräisin olevien solujen reaktio, niin kuitenkin ikääntyneiden reaktio 8-MGuo:hon oli suurempi kuin nuorten solujen reaktio LPSiään.

LPS:n on aiemmin osoitettu kohdistavan voimakasta apuaineen kaltaista vaikutusta ensimmäiseen vasta-ainereaktioon in vitro. Chiller et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 70:2129 (1973); Skidmore et ai. J. Immunol., 114:770 (1975). Tämän keksinnön mukaisten valmisteiden apuaineen kaltainen vaikutus on esitetty edellä. LPS:n ja tämän keksinnön mukaisten valmisteiden suhteelliset mahdollisuudet toimia SRBC:n aiheuttaman ensimmäisen vasta-ainereaktion apuaineen on arvioitu pernasolujen viljelmissä, joissa pernasolut olivat peräisin vanhoista C3H/HeN hiiristä, joiden solujen viljelmät kykenevät ainoastaan SRBC:n aiheuttamiin, tilastollisesti merkityksettömiin reaktiohin apuaineen puuttuessa, kuten kuvassa 25 on esitetty.

Kuten kuvasta 25 voidaan nähdä, tässä tilanteessa ei 8-MGuo eikä LPS osoita merkittävää polyklonaalista vaikutusta. Epäillään, että polyklonaalisen 8-MGuo:ta sisältäviin valmisteisiin kohdistuvan vaikutuksen puuttuminen johtui optimaalisen polyklonaalisen ja antigeenin aiheuttamien spesifisten reaktioiden erilaisista annos- ja kineettisistä vaatimuksista. Kuitenkin viljelmien so 87733 täydentäminen antigeenillä 8-MGuo:n läsnäollessa s lii silmiinpistävän antigeenin aiheuttaman reaktion ilmaantumisen, jonka reaktion suuruus oli verrannollinen nuorista aikuisista hiiristä peräisin olevissa soluissa ilmeneviin antigeenin aiheuttamiin reaktioihin 8-MGuo:n puuttuessa, mutta ei sen läsnäollessa.

LPS:n lisääminen vanhoista hiiristä peräisin olevien, antigeenillä stimuloitujen solujen viljelmään oli johdonmukaisesti kyvytön palauttamaan niiden antigeenin aiheuttaman reaktion.

TRF:n kaltainen aktiivisuus osoitettiin 8-MGuo:lle (jäljempänä) ja LPS:lle in vitro /katso julkaisu Sjöberg et ai., Eur. J. Immunol., 2:326 (1972^7, jolloin joko normaalit pernasta peräisin olevat B-solut tai nu/nu hiiristä peräisin olevat pernasolut tehtiin kykeniviksi tuottamaan T-riippuvaisten antigeenien aiheuttama vasta-ainereaktio jomman kumman näiden aktivaattorin läsnäollessa. Näiden kahden aineen suhteellinen TRF:n kaltainen vaikutus on arvioitu vanhoista C57BL/6J-hiiristä peräisin olevien B-solujen viljelmissä.

Kuva 26 esittää, että pelkästään B-solut eivät kyenneet reagoimaan antigeeniin eivätkä LPS-ään ainekohtaisesti, ja nämä aineet eivät tuottaneet suurempaa reaktiota ollessaan yhdessä läsnä viljelmässä. Kuitenkin B-solujen täydentäminen antigeenillä ja 8-MGuo:lla indusoi antigeenin aiheuttaman selvän PFC-reaktion ilmenemisen, joka reaktio oli suuruudeltaan verrattavissa nuorten aikuisten hiirien soluista peräisin olevan pelkän antigeenin aiheuttaman reaktion suuruuteen. Tässä tilanteessa B-substiuoitua guanosiinijohdannaista sisältävän valmisteen aiheuttama vaatimaton polyklonaalinen reaktio antigeenin puuttuessa oli selvästi havaittavissa, ja reaktion epäillään johtuvan näissä kokeissa käytetyistä 8-MGuo:n kolme kertaa korkeammista pitoisuuksista. Nämä tiedot osoittavat selvästi, että tavallisen T-solun SRBCrn aiheuttaman reaktion vaatimusten kiertäminen ei ole pelkästään polyklonaa1isen reaktion ja taustan välisen yhteisvaikutuksen tulos.

\ 51 87733

Yllä olevista tiedoista ilmenee selvästi, että tämän keksinnön mukaisten valmisteiden antaminen eläinsoluilie kykenee palauttamaan antigeenispesifisen sekä epäspesifisen humoraalisen immuniteetin ikääntyneistä, vanhoista hiiristä peräisin olevissa soluviljelmissä, joiden hiirten immuunireaktio oli alentunut ennen tätä antamista. Tämän keksinnön mukaiset valmisteet indusoivat erittäin tehokkaasti polyklonaalisen immunoglobuliinin erittymistä, minkä LPS sai heikosti (mikäli lainkaan) aikaan.

Tämän eron oletetaan johtuvan 8-substituoitujen guaniinijohdannaisten nopeasta siirtymisestä soluun, sekä siitä, että niiden vaikutukset ovat riippumattomia mebraanitoiminnoista Täten signaalin välittyminen membraanin läpi vaikuttaa rajoittavan vanhojen hiirien solujen reaktiivisuutta.

Kuitenkin tämä membraanihäiriö vaikuttaa olevan antigeenispesi-fisen ja antigeeni-epäspesifisen signaalin välinen ero. Tätä kuvaa apuaineen kaltaisuus- ja T-solujen korvaantumistutkimuk-sista saadut tiedot. Näissä tapauksissa antigeeni synnytti yksin vain pienen vasta-ainereaktion tai ei lainkaan vasta-aine-reaktiota. Myöskään LPS, antigeenin kanssa tai ilman sitä, ei kyennyt indusoimaan vasta-aineen muodostumista, kuten julkaisussa Kishimoto et ai., J. Immunol., 166:294 (1976). 8-MGuo herätti yksinään matala-asteisen polyklonaalisen reaktion neljän viljelypäivän jälkeen. Kuitenkin kun 8-substiuoitu guanosiini-johdannainen yhdistettiin antigeenin kanssa, niin silmiinpistävä antigeenireaktio syntyi.

Tämän keksinnön mukaisen valmisteen ja antigeenin yhdessä tapahtuvan antamisen aiheuttaman reaktion suuruus sulkee pois sellaiset triviaalit selitykset, kuten taustan ja epäspesifisten reaktioiden yhteisvaikutuksen. Nämä tulokset osoittavat, että antigeeni välittää signaalin B-soluihin, jotka ovat peräisin vanhoista hiiristä. Ensimmäinen signaali, vaikkakin se on välttämätön kaikissa aintigeenispesifisissä reaktioissa, ei kuitenkaan ole riittävä T-riippuvaisten antigeenien tapauksessa. Yllä olevista tiedoista ilmenee, että vanhat T-solut tuottavat tehottoman toisen siqnaalin, kuten LPS:kin. Tämän keksinnön mukaisen, 8-substituoitua guanosiinijohdannaista sisältävän valmisteen 52 87733 tehokkuuden toisen signaalin välittämisessä arvellaan johtuvan sen kyvystä ohittaa membraaniriippuvaisia tapahtumia.

T-solut eivät tunnu näyttelevän tärkeätä osaa tämän keksinnön mukaisten valmisteiden immunologisia ominaisuuksia palauttavassa vaikutuksessa vanhoissa hiirissä. B-solujen populaatiot ja makrofaagit reagoivat antigeenille toiminnallisten T-solujen puuttuessa niin kauan kuin tämän keksinnön mukaiset valmisteet tuottivat T-solun kaltaisen toisen signaalin, jolloin reaktion suuruus yleisesti ottaen oli verrannollinen tapauksissa, jolloin T-soluja oli läsnä tai niiden puuttuessa. Ne aikaisemmat raportit, joissa vanhoista hiiristä peräisin olevien T-solujen esitetään toimivan huonosti humoraalisissa reaktioissa /Morgan et ai., Cel. Immunol., 63:16 (1981); Krogsrud et ai., J. Immunol., 118:1607 (1977// ja tuottavan vain vähän IL-2:ta, /Miller et ai., Eur. J. Immunol., 11:751 (1981// tarjoavat järkevän perustan näiden havaintojen ymmärtämiselle.

Riittämättömien immuunireaktioiden moduloinnin potentiaalisen isäntään eloonjäämisen arvon arvioiminen on johtanut järjestelmän sisäisen immuniteetin kasvattamismenetelmien intensiiviseen tutkimiseen. Tämänkaltaisen lähestymistavan tärkeys ei missään muualla ole niin ilmeistä, kuin siinä immunologisessa vajavaisuudessa, joka usein esiintyy vanhenemisprosessin yhteydessä. Vanhat yksilöt ovat alttiina useille immuuniperäisille häiriöille. Yllä esitetyt tulokset tukevat vanhoissa hiirissä todettua, tämän keksinnön mukaisten valmisteiden kykyä oikosulkea tärkeä osanen (eli solumembraanin toiminto) siinä tapahtumien ketjussa, joka ketju päättyy B-lymfosyyttitoiminnon indusoitumiseen, ja tämän osasen tiedetään olevan vajavainen vanhoilla eläimillä.

Ne kokeelliset olosuhteet, joita on käytetty yllä esitettyjen tulosten saamiseksi, ovat löydettävissä kohdasta Materiaalit ja menetelmät, osa E, joka on esitetty jäljempänä.

Apuaineen kaltaisuus suun kautta annettaessa Tämän keksinnön mukaisten valmisteiden apuaineen kaltaisuutta in vivo i.p. injektioilla annettaessa pohdittiin jo edellä.

s·’ 87733

Seuraavat tulokset käsittelevät tämän keksinnön mukaisen valmisteen apuaineen kaltaisuutta, kun näitä valmisteita annettiin suun kautta eläimen vatsaan ylettyvän letkun avulla. Nämä tulokset saatiin käyttäen sellaisia olosuhteita, jotka on esitetty kohdassa Materiaalit ja menetelmät, osa C.

SRBC injektoitiin i.p. ja PFC-määritykset tehtiin seitsemän päivän kuluttua SRBC:een alkuperäisestä i.p.-injektoimisesta.

Tämän keksinnön mukaiset, 8-MGuo:ta sisältävät yhdisteet annettiin suun kautta joko sen saman 24 tunnin aikana, kuin SRBC:n antigeenimainen annos tai 72 tuntia tämän jälkeen. Näistä määrityksistä saadut tiedot on esitetty seuraavassa taulukossa VIII.

Taulukko VIII

Suun kautta annetun 8-MGuo:n apuaineen kaltaisuus3 8-MGuo:n Päivä, jona 8-MGuo on annettu u

Antigeeni annos__ 0. päivä 3. päivä

Q

PFC SRBCrtä vastaan/Perna SRBC Puuttuu 5.415 5.415 SRBC 0,3 mg 16.391 29.950

J

SRBC 3,0 mg 21.803 — SRBC 30,0 mg 18.653 — 9 CBA/Caj-hiiriin injektoitiin 0,3 ml 0,l%:sta SRBC:n suspensiota 0. päivänä.

Annostelunopeudet eläintä kohden.

C PFC-määritys suoritettiin kuten kuvassa 15.

d .

ei mitattu.

Kuten edellä esitetyistä tiedoista voidaan nähdä, tämän keksinnön mukaisen tuotteen antaminen tuotti elpyneen antigeenin aiheuttaman ensimmäisen reaktion, saatettiinpa tuote kosketuksiin solujen kanssa saman 24 tunnin jakson aikana, jolloin solut altistettiin 54 87733 antigeenille tai 72 tuntia sen jälkeen. Kuten edellä on esitetty, apuaineen kaltaisuus paranee, kun solujen antigeenille altistaminen ja solujen tämän keksinnön mukaisten valmisteiden kanssa kosketuksiin saattamisen välillä on vähintään noin 3 vuorokauden viive.

Solun aktivoiminen ja erikoistaminen 8-bromoguanosiinijohdannaisilla__

Solun aktivoimis- ja erikoistamistutkimukset (mitoosi jakautuminen) suoritettiin 8-bromo-2 '-O-metyyli-guanosiinia, 8-bromo-2' , 3' , 5 — tr i-O-asetyyliguanosiinia ja 8-bromo-2 ' -deoks i-guanos i in ia käyttäen, seuraten niitä menetelmiä,jotka ovat oleellisesti julkaisussa Goodman ja Weigle, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., supra., esitettyjen menetelmien kanssa samanlaisia. Bromittomat guanosiinijohdannaiset saatiin lähteestä Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Bromaus suoritettiin, kuten on esitetty niissä julkaisuissa, joihin on viitattu, jolloin polyetyleeni-imini-selluloosa-levyille saatiin yksi täplä, kuten on esitetty julkaisuissa, joihin on viitattu. Soluviljelmät aloitettiin 8-substituoidun guaniinijohdannaisen läsnäollessa 24 tunnin ajan, _ O _ jota seurasi / H/TdR:n antaminen, jota edelleen seurasi 24 tunnin inkuboimisjakso, jonka jälkeen tuote otettiin talteen. / H7TdR:n määrittäminen suoritettiin, kuten edellä mainituissa viitteissä on esitetty. Tiedot edellä mainituista 8-BrGuo- johdainais ista on esitetty seuraavassa taulukossa IX.

55 87733

Taulukko IX

8-BrGuo-johdannaisten aikaansaama mitoosi jakautuminen 8-BrGuo-johdannaisen / 3H7TdR:n kulutus viljelmää kohden (cpm)b

Pttoisuus_ 8-BrGuö-ld 8-BrGuo-2e 8-BrGuo-3f 0 5.670 + 230 7.350 + 520 4.906 + 1.417 1 x 10'4 7.890 + 420 19.870 + 370 5.616 + 339 3 x 10"4 16.670 + 140 38.280 +1260 4.866 + 325 1 x 10'3 56.170 +2720 83.100 +2110 10.682 + 761 3 x 10"3 86.890 +1480 1.950 + 230 46.231 + 1.080 1 x 10~2 1.890 + 360 - g 1.249 + 321 a 5 4 x 10 elävää CBA/CaJ-pernasolua viljeltiin 0,1 ml:ssa seeru-mitonta alustaa 8-BrGuo:n johdannaisten lisääntyviä pitoisuuksia sisältävien valmisteiden kanssa.

b 3 H TdR:n kulutus mitattiin, kuten kuvassa 11. c

Mitogeenin molaarinen pitoisuus viljelmässä.

8-bromo-2',31,5'-tri-O-asetyyli-guanosiini.

0 8-bromo-21-0-metyyli-guanosixni.

£ 8-bromo-2'-deoksi-guanosiini. g Tietoja ei kirjattu.

Edellä esitetyt tiedot osoittavat selvästi, että 8-substituoitujen guaniinijohdannaisten aldoosiosan johdannaiset tuottavat 8-BrGuo:n kanssa samankaltaisia solun aktivoimisen erikoistamisvaikutuksia.

Edellä esitettyjä, mitoosi jakautumiseen liittyviä menetelmiä käyttäen suoritettiin 1isävertailuja, kuten taulukosta X ja kuvasta 30 käy ilmi. Jotta niissä esitetyt tiedot olisi saatu, 56 87733 käytettiin julkaisussa, Goodman ja Weigle, J. Immunol., 130:551 (1983) esitettyä koejärjestelyä, joka täten sisältyy tähän hakemukseen tällä viittauksella. Taulukossa X esitetään, että lukuisat okso- ja merkaptoguaniinijohdannaiset edistävät mitoosi jakautumista. Lisäksi kuva 30 esittää 8-MGuo:n ja 8-tio-(beeta-hydroksi-etyyli)Guo:n kykyä edistää mitoosi jakautumista.

Vaikkakin on huomattu, ettei mitoosi jakautumisen ja immunoglo-buliinin erityksen polyklonaalisen aktivoinnin, apuaineen kaltaisuuteen ja antigeeni-spesifisien reaktioiden TRF:n kaltaiseen aktiivisuuteen verrattuna, tarvitse olla samaan aikaan tapahtuvia, niin kuitenkin oletetaan, että edellä hyödyllisiksi kuvatut 8-substituoidut guaniinijohdannaiset, jotka ovat mitogeenisiä, kuten taulukossa X on esitetty ja jotka tuottavat polyklonaalisen aktivoitumisen, kuten taulukossa II on esitetty, tuottavat myös apuaineen kaltaisuutta ja antigeenisten-spesifisten reaktioiden TRF:n kaltaista aktiivisuutta, kuten 8-MGuo ja 8-BrGuo.

57 8 7 7 33

Taulukko X

Guanosiini johdannaisten aikaansaama mitoosi jakautuminen / ^H7TdR:n kulutus (cpm/viljelmä) a

Solu- Guaniini- — -g-^^— tyyppi johdannainen Vertailu .3mM° jmMP 3mM°

Perna 8-oksoGuoC 4.000 7.000 41.000 31.000 8-metoksiGuod 3.700 5-800 25.300 54.700 7- met-8-oksoGuoe 3.800 111.000 141.000 43.000 8- MGuof 3. 400 --h 76.600 --h 8-metyyliMGuog 3. 400 13.500 68.600 72.900

Perna 8-oksoGuoC 6. 000 12. 000 51. 000 91. 000 8-metoksiGuod 6. 000 8. 300 22. 000 65. 000 7- met-8-oksoGuoe 6.000 149.000 179.000 85.000 8- MGuof 6. 000 --h 100. 000 --h 8-metyyliMGuog 5. 000 35. 000 97. 000 88. 000 B-solut 8-metoksiGuod 7. 000 13. 000 40. 000 71. 000 8-metoksiGuod 7. 000 9. 000 21. 000 51. 000 7- met-8-oksoGuoe 7. 000 132. 000 168. 000 81. 000 1 L.

8- MGuof 7. 000 -- 88. 000 8-metyyl iMGuog 5. 000 25. 000 45. 000 63. 000 3 / ^H7TdR:n kulutus mitattiin, kuten kuvan 11 yhteydessä on esitetty.

d Mitogeenin millimolaarinen pitoisuus viljelmää kohden.

C 8-oksoguanosiini d 8-metoksiguanosiini 0 7-metyyli-8-oksoguanosi in i.

^ 8-merkaptoguanos.i ini g 8-metyylit Loguanosiini h

Tietoja ei kirjattu.

58 87733

Neoplastisten solujen kasvun estäminen

Edellä käyty tarkastelu on kohdistunut etupäässä solujen kasvua stimuloiviin ja apuaineen kaltaisiin vaikutuksiin, joita tämän keksinnön mukaisten valmisteiden eri soluille antaminen ja erityisesti leukosyyteille antaminen saa aikaan, joten seuraavat tulokset käsittelevät neoplastisten solujen lisääntymiseen inhiboimista, mikä saavutetaan saattamlla nämä neoplastiset solut kosketuksiin tämän keksinnön mukaisten tuotteiden kanssa. Täsmällisemmin, viljeltyjen lymfoma B-solujen, neoplastisten makro-faagien ja hybridomasolujen viljelmiä inkuboitiin 8-MGuo:n lisääntyvien pitoisuuksien läsnäollessa, jolloin vertailuna käytettiin samanlaisia soluviljelmiä, jotka eivät kuitenkaan sisältäneet 8-MGuo:ta. Myös ei-neoplastisia pernasta peräisin olevia soluja viljeltiin 8-MGuo:n läsnäollessa ja sen puuttuessa, jolloin näitä viljelmiä voitiin verrata neoplastisten solujen viljelmiin.

Näiden viljelytutkimusten tulokset on esitetty kuvassa 27, jossa / H7TdR:n kulutus 8-MGuo:n läsnäollessa jaettuna vertailuviljel-män vastaavalla kulutuksella on esitetty kunkin viljellyn solu-tyypin 8-MGuo:n pitoisuuden funktiona. Kuvan 27 tarkastelu osoittaa, että vaikka pernasta peräisin olevat solut stimuloituvat lisääntymään 8-MGuo:n läsnäollessa, niin kuitenkin kunkin kolmen neoplastisen solutyypin kasvu inhiboituu huomattavasti 8-MGuo:n pitoisuuden ollessa suurempi kuin noin 0,1 millimolaaria. Kulutuksen kinetiikan tarkastelu osoittaa, että tämän keksinnön mukaisen valmisteen antaminen neoplastisi1le soluille aiheuttaa syto-toksisuutta solujen metabolian jonkin vaiheen aikana, pikemminkin kuin lysoitumista.

Mekanismi, jolla neoplastisten solujen kasvu inhiboituu kun nämä solut saatetaan kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen valmisteen kanssa, on tuntematon. Kuitenkin, koska neoplastisuus voidaan selittää sen soluviestin ilmentymisenä, joka viesti saa solut jakautumaan huomattavasti normaalia suuremmalla nopeudella, saattaa olla, että tämän keksinnön mukaiset valmisteet kiihottavat näitä nopeasti jakaantuvia soluja yhä edelleen sellaiseen pisteeseen, jossa solut jakaantuvat niin nopeasti, että ne kuolevat.

59 87733

Interleukiini-l-tyyppisen aktiivisuuden indusoituminen Makrofaagien tuottama IL-1 osallistuu T-soluissa IL-2:n tuottamiseen. IL-2 on T-solujen kasvutekijä, ja se osallistuu T-avus-tajasolujen muuntamiseen.

Käytettäessä säteilytettyjen pernasolujen viljelmien emäliuoksia, joissa vain makrofaagit olivat säteilytyksen jälkeen elossa, /Gorczynski, J. Exp. Med., 134:1201 (1971)7 ja jotka oli täyden netty tämän keksinnön mukaisilla valmisteilla, jotka sisälsivät 8-MGuo:n lisääntyviä pitoisuuksia, todettiin, että tymosyytit saatiin lisääntymään tavalla, joka oli sen tymosyyttien lisääntymistavan kaltainen, joka syntyy IL-l:n läsnäollessa. Näin ollen oletetaan, että tämän keksinnön mukaiset yhdisteet stimuloivat toimintoa, jota voidaan kutsua IL-l:n tyyppiseksi aktiivisuudeksi, koska tällaiset makrofaagien emäliuokset indusoivat tymosyyttisiä reaktioita, jotka ovat samankaltaisia niiden reaktioiden kanssa, joita tymosyytit ilmentävät IL-l:n läsnäollessa. Seuraavan taulukon XI tiedot kuvaavat niitä vaikutuksia, joita aiheutuu tymosyyttien saattamisesta kosketuksiin sellaisten emäliuosten kanssa, jotka emäliuokset eivät sisällä IL-l:tä tai joissa ei IL-l:n kaltaista aktiivisuutta ole läsnä.

60 87733

Taulukko χι 8-MGuo:n indusoima IL-l:n kaltainen aktiivisuus9

Emät juoksen koostumus_ /-3H7TdR:n kulutus vlljel- b c

Pernasolut 8-MGuo:n pitoisuus mää kohden (cpm) + Puuttuu 235 + 80 + 1 x 10-4 710 + 70 -4 + 3 x 10 860 + 40 + 1 x 10-3 3.440 + 170 + 3 x 10-3 3.260 + 120 1 x 10-4 380 + 60 3 x 10"4 540 + 50 1 x 10-3 640 + 110 3 x 10-3 1.480 + 180 a 5 x 104 elävää CBA/CaJ tymosyyttiä viljeltiin säteilytetystä pernasolujen viljelmästä peräisin olevan emäliuoksen kanssa tai ilman sitä, joka viljelmä oli tuotettu 8-MGuo:n lisääntyviä pitoisuuksia sisältävien valmisteiden läsnäollessa.

Pernasolujen läsnäolo emäliuoksessa on merkitty "+"-merkillä, kun taas pernasolujen puuttuminen on merkitty "-"-merkillä.

c

Viljelmissä olevan 8-MGuo:n molaarmen pitoisuus.

/-JH7TdR:n kulutuksen kulutus määritettiin kuten kuvassa 11.

Yllä esitetyt tiedot osoittavat, että radioaktiivinen tymidiini on yhdistyneenä kateenkorvan soluihin pernasolujen emäliuoksen läsnäollessa, joka emäliuos sisälsi tämän keksinnön mukaisia valmisteita.

Endoqeenisen interferonin tuotannon indusoituminen Pernasta peräisin olevia soluja viljeltiin tavalla, joka on esitetty julkaisussa Goodman ja Weigle, J. Immunol., supra, johon edellä on viitattu, 24:n ja 48:n tunnin jaksojen ajan, jonka 61 87733 kuluttua solut otettiin talteen, ja näiden talteenotettujen solujen viljelmien emaliuoksen interferonin tuottoa tutkittiin.

Tämä tutkimus paljasti, että suhteellisen suuria interferoni-määriä muodostui, kun kokeena käytettiin virusperäisen täplän muodostumisen inhibitiota. /Armstrong, Appi. Microbio., 21:723 11971)7.

Mitogeenisten aineiden tiedetään stimuloivan interferonin tuotantoa virusperäisten interferonia indusoivien aineiden puuttuessa. Kuitenkaan eläimet eivät siedä suurinta osaa tällaisista mitogeenisista, interferonia indusoivista aineista, josta syystä niitä ei voida käyttää. Toisaalta, tämän keksinnön mukaisia valmisteita siedetään hyvin, josta syystä ne ovat tehokkaita indusoimaan endogeenisen interferonin tuotantoa luonnossa esiintyvien mikrobiologisten interferonin tuotantoa indusoivien aineiden puuttuessa, sillä ne tuottavat apuaineen kaltaista vaikutusta interferonin tuotannossa interferonin tuotantoa indusoivien aineiden läsnäollessa. Lisäksi perustuen tämän keksinnön mukaisten valmisteiden kykyyn elvyttää kiihotusaineen aiheuttamaa solun reaktiota (apuaineen kaltaisuus), niin oletetaan, että tämänkaltaiset valmisteet lisäävät samalla tavalla interferonin tuotantoa interferonia indusoivien aineiden läsnäollessa tai niiden puuttuessa.

Elpynyt 5'-nukleotidaasiaktiivisuus immunologisesti vajavaisissa tiloissa_

Kuten edellä on huomautettu, eräs apuaineen tärkeä käyttömuoto on immunologisesti vajavaisten tilojen parantaminen. X-sitoutunut veren gammaglobuliinin niukkuus edustaa erästä sellaista immunologisesti vajavaista tilaa, jossa koirailla ilmenee alentunutta lymfosyyttisolun pinnan ekto-5'-nukleotidaasi-(5'NT) aktiivisuutta. Kuvan 28 tiedot esittävät 5'NT:n perusaktiivisuuden prosenttista elpymistä, kun CBA/CaJ-hiirien lymfosyytit saatettiin kosketuksiin tämän keksinnön mukaisten, 8-MGuo:ta sisältävän valmisteen kanssa. Samankaltaisia tuloksia saatiin käyttämällä ihmisestä peräisin olevia lymfosyyttejä, jotka oli saatu eräältä tämän keksinnön keksijöistä. Nämä tiedot valaisevat edelleen tämän keksinnön mukaisten valmisteiden immunologisia toimintoja palauttavaa kapasiteettia, kun näitä valmisteita saatetaan kosketuksiin immunologisesti vajavaisten solujen kanssa.

62 87733

Neutrofiilien entsyymien erittymisen elpyminen

Eräs niistä aktiivisimmista aineista, joka indusoi lysosomaalis-ten entsyymien vapautumista neutrofiileistä, on komplementtiyh-diste C5a. Totesimme, että ihmisestä peräisin olevat neutrofii-lit, jotka oli ensin saostettu dekstraani1la ja kehrätty ficoll-gradientin läpi julkaisussa Chenoweth ja Hugli, Pro Natl. Acad. Sei.

U.S.A., 75:3943 (1978) esitetyn menetelmän mukaisesti, jonka jälkeen ne oli lietetty uudestaan Hank:in tasapainoitettuun suolaliuokseen pitoisuuden ollessa 4x10^ solua millilitrassa ja jonka jälkeen ne saatettiin kosketuksiin tämän keksinnön mukaisen, 8-MGuo:ta sisältävän valmisteen kanssa, vapauttavat elpyneitä lysosomaalisen entsyymin määriä.

Todettu lysosomaalisten entsyymien erittymisen elpyminen oli suurinpiirtein yhtä suuri kuin komplementtikomponentin C5a optimaalisen pitoisuuden käytöllä saavutettu elpyminen, kun tämän keksinnön mukaisessa valmisteessa käytetyn 8-MGuo:n pitoisuus oli noin l:stä noin I0:een millimolaaria. Entsyymin erittyminen arvioitiin julkaisussa Chenoweth ja Hugli, supra.

Tämän keksinnön mukaiset aktiiviset aineet annetaan eläimille suun kautta tai ruuansulatuskanavan ulkopuolisesti tavanomaisten yksikkövalmisteiden annosten muodossa, mikä tarkoittaa, että muodostuvan yksikköannoksen valmisteet käsittävät fysiologisesti siedetyn kantaja-aineen ja aktiivisen aineksen tehokkaan yksikkö-annoksen .

Tässä käytetty termi "muodostuva yksikköannos" viittaa fysikaalisesti erillisiin yksiköihin, jotka soveltuvat yksikköannoksiksi ihmispotilaille ja muille lämminverisille eläimille, jolloin kukin yksikkö käsittää ennalta määrätyn aktiivisen aineksen määrän, jonka on laskettu tuottavan halutun lääkinnällisen vaikutuksen yhdessä vaaditun fysiologisesti siedetyn kantaja-aineen kanssa, joista kantaja-aineista esimerkkinä laimennin tai saattaja-aine. Tämän keksinnön mukaisten uusien muodostuvien yksikkö-annosten spesifikaatiot määräytyvät (a) aktiivisen aineksen ja sen erityisen tavoiteltavan lääkinnällisen vaikutuksen ainutkertaisten tunnusomaisten piirteiden mukaan, sekä (b) niistä rajoi- 63 8 7 7 33 tuksista, jotka välttämättä liittyvät tämänkaltaisen aktiivisen aineksen sekoittamismahdollisuuksiin ihmisten ja eläinten lääkinnällisessä käytössä, ja spesifikaatiot ovat suoraan riippuvaisia näistä seikoista. Esimerkkejä tämän keksinnön mukaisista sopivista muodostuvista yksikköannoksista ovat tabletit, kapselit, pillerit, jauheannokset, rakeet, kiekot, ja muut sen kaltaiset, minkä tahansa edellä luetellun erilliset moninkerrat, sekä liuokset ja suspensiot.

Annettavan aktiivisen aineksen määrä riippuu potilaan painosta, ky seessä olevasta käsiteltävästä tilasta, antamisen esiintymistiheydestä, ja antamistavasta. Annoksen suuruus voi olla noin l:stä noin lOOOreen milligrammaa elopainokiloa kohden, suositeltavammin noin 5:stä noin 250:een milligrammaa elopainokiloa kohden ja suositeltavimmillaan noin I0:stä noin I00:aan milligrammaa elopainokiloa kohden. Aikuisen ihmisen päivittäinen annos on suuruusluokkaa noin 50:stä noin 50 000:een milligrammaan, joka annetaan yhtenä annoksena tai 3 tai 4 jaettuna annoksena. Eläinten annokset vastaavat ihmisten annoksia, jolloin annetut annokset suhteutetaan eläimen painoon, kuten aikuisten ihmisten kohdalla tehdään.

Esimerkki 1. Tabletit

Tabletit valmistetaan seuraavista aineksista:

Paino-osuus 8-BrGuo 5,0 fiaktoosi, jauheena 35,4

Maissitärkkelys , kuiva 33,0

Hienojakoinen S1O2 5,6

Polyvinyylipyrrolidoni 0,6

Magnesiumstearaatti 0,4 80,0 8-BrGuo sekoitetaan huolellisesti laktoosin, 25,0 paino-osan maissitärkkelystä ja 4,0 paino-osan Si02:ta kanssa. Saatu seos kostutetaan tasaisesti polyvinyylipyrrolidonin 5 %:lla etanoli- 64 87 7 33 I luokse L la. Koste.) massa puristetaan mesh-ar voi taan 1 mm olevan seulan läpi, jolloin saadaan rakeita. Saadut rakeet kuivataan 60°C lämpötilassa noin 24 tunnin ajan kuivausuunissa. Kuivattu raeseos puristetaan uudestaan mesh-arvoltaan 1 mm olevan seulan läpi. 70,0 osaa saatua raeseosta sekoitetaan sopivassa sekoitti-messa seokseen, joka sisältää jäljellä olevan Si02:n, jäljellä olevan maissitärkkelyksen ja kaiken magnesiumstearaatin, ja joka seos aiemmin oli puristettu mesh-arvoltaan 1 mm olevan seulan läpi. Täten saatu seos puristetaan tableteiksi, joista kukin painaa 800 mg ja jotka kukin sisältävät 50 mg 8-BrGuo:ta.

Esimerkki 2. Tärkkelyskapselit

Kapselit on valmistettu seuraavista valmistusaineista:

Paino-osuus 8-MGuo 50,0

Laktoosi 450,0

Maissitärkkelys 500,0 1000,0 8-MGuo sekoitetaan asteittain laktoosin kanssa. Kun kaikki laktoosi on sekoitettu, niin saatu seos sekoitetaan maissitärkke-lykseen. Tuloksena olevaa seosta täytetään tämän jälkeen kapse-leihin, joihin mahtuu 1,0 g seosta. Kukin kapseli sisältää 50 mg 8-MGuo:ta.

Esimerkki 3 Tabletit — 4» - 10 000 tabletin erä, joista kukin sisältää 50 mg 8-BrGuo:ta, valmistetaan seuraavista valmistusainetyypeistä ja -määristä: 8-BrGuo 500 grammaa

Dikalsiumfosfaatti 1000 grammaa

Metyyliselluloosaa, U.S.P.(15 eps) 60 grammaa

Talkki 150 grammaa

Maissitärkkelys 200 grammaa

Magnesiumstearaatti 10 grammaa 65 87733 8-BrGuo ja dikalsiumfosfaatti sekoitetaan hyvin, ja siitä tehdään rakeita vedessä olevalla metyyliselluloosan 7,5 %:lla liuoksella, puristetaan seulan n:o 8 (U.S. normaali seulasarja) läpi ja kuivataan huolellisesti. Kuivat rakeet puristetaan seulan n:o 12 (U.S. normaali seulasarja) läpi, sekoitetaan huolellisesti talkin, tärkkelyksen ja magnesiumstearaatin kanssa, ja puristetaan tableteiksi.

Nämä tabletit ovat käyttökelpoisia elvyttämään vasta-aineen tuotantoa, kun niitä nautitaan suun kautta yhdestä kolmeen tabletin annoksina joka kahdeksas tunti.

Esimerkki 4. Injektoitavat valmisteet

Steriili tuote, joka soveltuu injektoitavaksi onteloiden sisäisesti ja joka sisältää 75 mg 8-MGuo:ta millilitrassa, valmistetaan seuraavista valmistusainetyypeistä ja -määristä: 8-MGuo 7 grammaa

Bentsoyylibentsoaatti 200 millilitraa

Metyyliparabeeni 1,5 grammaa

Propyy1iparabeeni 0,5 grammaa

Puuvillan siemenöljy, täytetään 1000 millilitraksi.

Yhdestä kolmeen millilitraa tätä steriiliä valmistetta injektoidaan vatsaontelon sisäisesti kerran päivässä elvyttämään humo-raalista immuniteettia.

Esimerkki 5. Vesipohjainen valmiste suun kautta nautittavaksi Suun kautta nautittava vesipohjainen valmiste, joka sisältää 50 milligrammaa 8-BrGuo:ta 5 millilitrassa (1 teelusikallinen), valmistetaan seuraavista valmistusaineista: 8-BrGuo 55 grammaa

Metyyliparabeeni, U.S.P. 0,75 grammaa

Propyyliparabeeni, U.S.P. 0,25 grammaa

Natriumsakkaridi 1,25 grammaa

Natriumsyklamaatti 0,25 grammaa 66 87 7 33

Glyseriini 300 millilitraa

Traganttikumijauhetta 1,0 grammaa

Appelsiiniöljyn aromia 1,0 grammaa F.D. ja C. appelsiiniväriainetta 0,75 grammaa

Ionitonta vettä, täytettynä 1000 millilitraan.

Yhden teelusikan annos kahdesta neljään kertaa päivässä on käyttökelpoista elvyttämään humoraalista immuniteettia.

Materiaalit ja menetelmät Osa A

Hiiret. CBA/CaJ urospuoliset hiiret, iältään 8-16 viikkoa, saatiin toimittajalta Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. CBA/N-hiirien hedelmöitetty munasolu saatiin lähteestä Animal Production Section, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Kaikkia hiiriä säilytettiin Wayne Lab Blox F6-rakeiden (Allied Mills, Inc., Chicago, IL), ja klooratun veden päällä, jonka veden pH oli laskettu arvoon 3,5 HClrllä.

Sekundaarisen in vitro vasta-ainereaktion alkuunsaattaminen.

Hiiriin injektoitiin i.p. 0,1 millilitraa lampaiden eukarioottien (SRBC) 10%:sta suspensiota. Kuudesta kahdeksaan viikkoa tämän alkuunsaattamisen jälkeen niitä stimuloitiin samalla SRBC:n annoksella, joka annettiin i.p., ja hiiret käytettiin 7 vuorokauden kuluttua.

Antigeenit. SRBC-annos saatiin lähteestä Colorado Serum Co.,

Denver CO. TNP-LPS saatiin lähteestä tohtori John M. Fidlerriltä. TNP-AECM-ficoll hankittiin lähteestä Biosearch, Inc., San Rafael, CA.

Lymfosyyttiviljelmät. Näissä kokeissa käytettyä, seerumia sisältävää viljelmäalustaa valmistettiin seuraavasti: 100 millilitraa sisälsi 90,9 millilitraa RPMI 1640:ä(Flow Laboratories, Inc., Rockville, MD), 0,1 millilitraa 100 x glutamiinia, 1,0 millilitraa 100 x natriumpuryvaattia, 1,0 millilitraa 50 x aminohappoja, 4 jotka eivät olleet essentiaalisia, 1,0 millilitraa 1,0 M HEPES - puskuria (Microbiological Associates, Bethesda, MD), 1,0 millilitraa 4 4 vettä, joka sisälsi 10 yksikköä penisilliini G:tä ja 10 mikrogrammaa 67 87733 streptomysiiniä, sekä tukiaineena 5,0 millilitraa sikiöasteella olevan vasikan seerumia (FCS). Pernasolususpensiot ja pernasta peräisin olevilla B-soluilla rikastetut populaatiot valmistettiin menetelmällä, joka on esitetty julkaisussa Goodman et ai., J. Immunol., 121:1905 (1978).

SRBC:n aiheuttaman ensimmäisen humoraalisen immuunireaktion 7 arvioimiseksi 10 hiiren pernasolua viljeltiin 1,0 millilitrassa 5% FCS:ää sisältävässä alustassa neljän vuorokauden ajan antigeenin useiden pitoisuuksien läsnäollessa, kuten on esitetty.

SRBC:n aiheuttaman sekundaarisen humoraalisen immuunireaktion 7 arvioimiseksi 10 käsitellyistä hiiristä peräisin olevaa perna-solua viljeltiin SRBC:n useiden pitoisuuksien kanssa 1,0 milli-litrassa 5% FCS:ää sisältävässä alustassa 4 tai 5 vuorokautta.

Soluja inkuboitiin viljelymaljoilla (3008, Falcon Plastics,

Oxnard, CA) 37°C:ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa C02-pitoisuus ilmassa oli 10%, käyttämällä kudosviljelylaatikoita (CBS Scientific, Del Mar, CA), joita heilutettiin taajuudella 7 sykliä minuutissa.

7

Lymfosyyttien seosviljelman emäliuokset. 1,5 x 10 CBA/CaJ pernaso- 7 lua viljeltiin 1,5 x 10 BDF^-pernasolujen kanssa 4 vuorokautta 5,0 millilitran tilavuudessa kostutetussa ilmakehässä, jossa CO^rta oli 10% ilmassa, 37 c:ssa. Solut pelletoitiin sentrifugoimalla, ja emäliuos käsiteltiin 0,22 mikronin suodatuksella ennen käyttöä.

Täplän muodostavien solujen koe (PFC). SRBCrtä vastaan kohdistuvat PFC:tä erittävät vasta-aineet arvioitiin 4 viljelyvuorokauden jälkeen käyttämällä julkaisussa Jerne ja Nordin, Science, 140:405 (1963) esitetyn hemolyyttisen täpläkokeen muunnelmaa.

Osa B

Hiiret. CBA/CaJ-hiiret, iältään 8-12 viikkoa, saatiin lähteestä Jackson Laboratory, Bar Harbor,ME. NCF^, C57BL/6J nu/nu ja nu/+ koirashiiret, iältään 8-12 viikkoa, saatiin säätiössä Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA olevasta hiirten-kasvatuslaitoksesta. Kaikkia hiiriä säilytettiin Wayne Lab F6 pellettien (Allied Mills, Inc., Chicago, IL) ja klooratun veden päällä, jonka veden pH oli laskettu arvoon 3,0 HCl:llä.

68 87733

Viljelmien reagenssit. Näissä tutkimuksissa käytettyjen seerumit-tomien viljelyalustojen komponentit on esitetty julkaisussa Goodman et ai., J. Immunol., 121:1905 (1978). Seerumia sisältäviin alustoihin laitettiin tukija-aineeksi FCS:ää 5% RPMI 1640:n tilavuudesta, ja HEPES-puskuri jätettiin kokonaan pois. Escherischia coli 055:B5 LPS:ää saatiin lähteestä Difco Laboratories, Detroit, MI. 8-MGuo:ta saatiin toimittajalta Miles-Yeda Ltd., Rehovot, Israel, sekä toimittajalta Vega Biochemicals, Tucson, AZ sekä toimittajalta Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.

A.TH-anti-A.TL-antiseerumia saatiin tohtori D.C.Shreffler:ilta tohtori J.G. Ray, Jr:n välityksellä Immunology, Allergic and Immunologic Diseases Program, NIAID, Bethesda, MD.

Solujen valmistaminen. Pernan ja kateenkorvan solujen suspensiot valmistettiin, kuten on esitetty julkaisussa Goodman et ai., supra. T-lymfosyyteillä rikastetut pernasolut valmistettiin johtamalla solut nailonvi1 las ta (NW) valmistetun kolonnin läpi, kuten julkaisussa Julius et ai., Eur. J. Immunol., 3:645 (1973) on esitetty. B-soluilla rikastetut populaatiot valmistettiin

Q

käsittelemällä 10 pernasolua monoklonaalisen anti-Thy 1.2:n 1:1000-laimennoksella (New England Nuclear, Boston, MA) 30 minuutin ajan 4°C:ssa. Käsitellyt solut sentrifugoitiin 280 x painovoimaa edustavalla nopeudella 10 minuutin ajan, vasta-aineet poistettiin, ja solut lietettiin uudestaan CBA RBC-adsorboitu-neeseen marsun komplementin 1:6-laimennokseen 37°C:ssa 45 minuutin ajan. Tämän jälkeen solut pestiin ja viljeltiin, kuten edellä on esitetty. Mukaantulleet solut erotettiin johtamalla seos Sephadex G-10-kolonnien läpi, kuten on esitetty julkaisussa Ly ja Mishell, J. Immunol Methods, 5:239 (1974). Sephadex G-lO-kolonniin pidättyneet solut otettiin talteen tyhjentämällä kolonnit petrimaljoille, mitä seurasi voimakas pipetointi. Sen jälkeen kun helmet olivat painuneet pohjalle, suspensiossa olevat solut pestiin kolmasti ja ne käytettiin viljelmään.

CR- ja FcR-lymfosyyttien erottaminen. Komplementin vastaanottajia kantavat solut erotettiin ruusutustoimenpiteellä, joka on esitetty julkaisussa parish ja Hayward, Proc. R. Soc. Lond. B, 187:65 (1974), julkaisu I ja julkaisu II. Lyhyesti, 1 milli- 69 87 733 litra RPMI:tä 10 %: sen FCS:n kanssa yhdistettiin 2 millilitraan NH^Cl-käsiteltyjen CBA/CaJ-pernasoluja, joita oli 25 x lO^/milli-litra ja 1 millilitraan SRBC:n 5 % suspensiota, joka tätä ennen oli herkistetty kaniinin anti-SRBC-IgM:n optimaalisella tiitteril-lä ja tuoreella hiiren komplementilla. Tätä seosta pyöritettiin hitaasti 20°C:ssa 30 minuutin ajan, pelletoitiin sentrifugoimalla ja inkuboitiin 4°C:ssa 10 minuutin ajan. Tämän jälkeen pelletit lietettiin varovaisesti uudelleen, annettiin asettua R.T.-pisteeseen, ja kerrostettiin varovaisesti isopaakki/ficol1-gradienteis-sa silikonikäsitellyissä putkissa. Gradientit sentrifugoitiin nopeudella, joka vastasi 1200 x painovoimaa 30 minuutin ajan, ja pelletti- sekä rajapintasolut otettiin erikseen talteen. Ruusutukset lyysattiin 0,83 %:ssa NH^Clrssa, ja solut laskettiin, pestiin, ja käytettiin viljelmään. Fc-vastaanottajaa kantavat solut erotettiin EA-ruusutuksella (Paris ja Hayward, supra), edellä mainitun julkaisun menetelmää noudattaen, jättäen tuoreen hiiren komplementti pois ja korvaamalla kaniinin anti-SRBC:n IgG kaniinin anti-SRBC:n IgM:llä. Rikastuminen todettiin tutkimalla erotettuja fraktioita mikroskooppisesti. EAC- ja EA-ruusuttamat-tomat fraktiot käsittivät kumpikin 1 % ruusutuksia. 4:n tai useampia erytrosyyttejä sitovia soluja pidettiin positiivisina kyseessä olevan merkkiaineen suhteen.

IgM raskasketjua ja IgD raskasketjua kantavien solujen poistaminen. Tässä käytettiin julkaisussa Wysocki ja Sato, Proc. Natl. Acad.

Sei. U.S.A., esitettyä huuhtomismenetelmää IgM raskasketjua ja IgD raskasketjua kantavien lymfosyyttipernasolujen poistamiseksi. Lyhyesti esitettynä, 10 millilitraa kaniinin anti-hiiri IgM raskas-ketjua (50 mikrogrammaa/millilitra, Bionetics, Kensington, MD) tai 10-4.22 emäliuosta (50 mikrogrammaa/millilitra) hajoitettiin ultrasentrifugoimalla nopeudella 150 000 x painovoima 60 minuutin ajan ja emäliuos siirrettiin varovasti 100 x 15-millimetrisiin, polystyreenistä valmistettuihin, bakteriologisiin petrima1 joihin. Seisottuaan tunnin ajan 20°C:ssa emäliuos dekantoitiin, malja huuhdottiin 4 kertaa PBSrllä ja petrimaljalle lisättiin 3 milli-litraa NH^Cl-käsiteltyjä pernasoluja (10^/millilitra) 4°C:ssa.

70 87733 40 minuutin kuluttua maljoja pyöritettiin varovasti ja niiden annettiin inkuboitua edelleen 30 minuuttia. Pidättymättömät solut huuhtoutuivat kahdesta lisäpyörityksestä PBS:n kanssa syntyneiden huuhtoutumisnesteiden mukana. Pidättyneet solut, mikäli niitä käytettiin, poistettiin kumilastalla. Pidättymättömät solut eivät reagoineet lainkaan (anti-IgM) tai vain heikosti (anti-IgD) LPS:ään, mutta ne olivat täysin reaktiivisia Con A:han.

Lymfosyyttiviljelmät. Hiirestä peräisin olevia pernasoluja viljeltiin mikroviljelymaljoilla (N:o 3546, Costar, Cambridge, MA) solutiheyden ollessa 4xl06 elävää solua/millilitra 0,1 milli-litran tilavuudessa. Mikrovi1jelmiä inkuboitiin 37°C:ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa C02:ta oli 10% ilmassa. Viljelmiin syötettiin päivittäin 8 mikrolitraa ravintoaineseosta Mishell ja Dutton, J. Exp. Med., 126:423 (1967).

DNA-synteesin mittaaminen. Viljelmän 24 viimeisen tunnin aikana solut merkittiin 1,0 mikroCiilla radioaktiivia /~^H/TdR/viljelmä (5 Ci/mM, Amersham Radiochemicals, Amersham, Englanti). Mikro-viljelmistä solut otettiin talteen lasikuituisille suodatinpala-sille Brandelrin solujen talteenottolaitteella, malliltaan M24V (Biological Research and Development Laboratories, Rockville, MD). Suodatinkiekot siirrettiin muovisiin tuikehylsyihin, ne peitettiin nestemäisellä tuikemittausseoksella ja laskeminen suoritettiin nestemäisille näytteille soveltuville Beckman-tuikelaskurilla, Olliltaan LS-230 .

^JDosolujen laskeminen. Yksittäisten lymfosyyttiviljelmien kudos-n^ytteet kehitettiin mikroskoopin aluslevyllä sytosentrifugin avulla. Levyt värjättiin metyylivihreä-pyroniini-Y-menetelmällä, Ooka on esitetty julkaisussa McManus ja Mowry, Staining Methods, Hatper ja Row, New York (1960) sivut 76-78, jolloin pyroniino-^iilisten emosolujen laskeminen yksinkertaistui. Tulokset on esi-tetty neljästi toistettujen viljelmien aritmeettisena keskiarvona i standardipoikkeama.

71 87733

Osa C

Hiiret . CBA/CaJ koirashiiret, iältään 8-16 viikkoa, hankittiin lähteestä Jackson Laboratory, Bar Harbor ME. CNA/N-hiirten hedelmöitetty munasolu saatiin lähteestä Animal Production Section, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Kaikkia hiiriä säilytettiin Wayne Lab Blox F6 pellettien (Allied Mills, Inc.,

Chicago, IL) ja klooratun veden päällä, jonka veden pH oli laskettu arvoon 3,0 HCl:llä.

Injektoinnit. Hiiriin injektoitiin i.p. pestyn SRBCteen suolaliuoksessa olevaa suspensiota, jonka pitoisuus vaihteli. Tämän jälkeen eri aikoina 8-MGuo:n tai 8-BrGuo:n eri määriä injektoitiin i.p. Nämä nukleosidijohdannaiset ovat liukenemattomia tavalliseen suolaliuokseen, ja ne olivat erityisen tehokkaita suspensiona käytettyinä. Suun kautta tapahtuvan ruokinnan kokeissa hiirten kurkusta työnnettiin poly(propyleenistä) oleva putki, joka ulottui suusta vatsalaukkuun, jonka putken läpi johdettiin mitattavat apu-ainevalmisteen määrät.

Täplän muodostavien solujen (PFC) koe. Vasta-aineita SRBC:tä vastaan erittävien PFC:n lukumäärä arvioitin 5-7 päivää antigeenin injektoimisen jälkeen, jolloin käytettiin julkaisussa Jerne ja Nordin, supra esitetyn hemolyyttisen täpläkokeen muunnelmaa.

Osa D

Hiiret. C57BL/6J nu/nu ja nu/+, CBA/CaJ ja BDF^ koirashiiret, iältään 8-16 viikkoa, hankittiin hiirtenkasvatuslaitoksesta, joka sijaitsi laitoksessa Scripps Clinic and Research Foundation,

La Jolla, California. Kaikkia hiiriä säilytettiin Wayne Lab Blox F6-pellettien (Allied Mills, Inc., Chicago, Illinois ja klooratun veden päällä, jonka veden pH oli laskettu arvoon 3,0 HC1:llä.

Kudosviljelyreagenssit. Huuhdotut SRBC:t hankittiin yhtiöstä Colorado Serum Company, Denver, Colorado. 8-MGuo:ta ja 8-BrGuo:ta hankittiin lähteestä Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, IL-2-valmistetta, joka oli valmistettu DEAE-fraktioinnilla, kuten julkaisussa Mier ja Gallo, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 77:6134 (1980)T on esitetty, hankittiin lähteestä Collaborative Research^ Inc., Waltham, MA.

72 87733

Lymfosyyttiviljelmät. Näissä kokeissa käytetyt seerumia sisältävät viljelyalustat, sekä pernan B-soluilla rikastettujen perna-solususpensioiden ja -populaatioiden valmistusmenetelmät on esitetty julkaisussa Goodman ja Weigle, J. Exp. Med., 145:473 (1977). Tietyissä kokeissa B-soluja tuotettiin 60 mikrolitran ATS:ää erä 15038, Microbiological Associates in vivo injektiolla 1 ja 3 vuorokautta ennen käyttöä, jota seurasi in vitro ATS-, monoklonaa-linen anti-thy 1.2-, monoklonaalinen anti-Lyt 1.1- ja monoklonaa-linen anti-Lyt 2.1- (New England Nuclear) käsittely sekä kaniinin ja marsun komplementtien seos Harwell et ai., J. Exp. Med., 152:893 (1980). SRBC:n aiheuttaman ensimmäisen humoraalisen immuunireaktion arvioimiseksi 10^ hiiren pernasolua tai 4-5x10^ hiiren pernan B-solua viljeltiin 1,0 millilitrassa 5% FCS:ää sisältävässä alustassa 4 vuorokautta muovisella 24 kolon viljely-levyllä (n:o 3524, CoStar, Cambridge, MA) antigeenin läsnäollessa, tai sen puuttuessa, kuten on esitetty. Soluja inkuboitiin 37° C:ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 10¾ C02:ta ilmassa, käyttäen soluvi1jelylaatikoita, joita heilutettiin taajuudella seitsemän sykliä minuutissa.

Solun vasta-ainetuotannon mittaaminen. Suora täplän muodostavan solun (PFC) reaktio SRBC:hen määritettiin 4 viljelyvuorokauden kuluttua käyttäen hemolyyttisen täpläkokeen modifikaatiota, esitetty julkaisussa Jerne ja Nordin, supra.

Seoslymfosyyttiviljelmän (MLC) emäliuosten tuottaminen. 2,5 milli- litraa CBA/CaJ- ja BDF.-pernasoluja, kutakin, viljeltiin pitoisuu- g J- dessa 6x10 /millilitra 60 millimetrin petrimaljoilla. Viljelmät siirrettiin putkiin, sentrifugoitiin ja emäliuosalusta otettiin talteen 4 vuorokautta viljelmän aloittamisesta.

Osa E

Hiiret. C57BL/6J ja C3H/HeN koirashiiret, iältään joko 8-16 viikkoa tai 2 vuotta, hankittiin hiirtenkasvatuslaitoksesta Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, California. Kaikkia hiiriä säilytettiin Wayne Lab Blox F6-pellettien (Allied Mills,

Inc. Chicago, Illinois) ja klooratun veden päällä, jonka veden pH oli laskettu arvoon 3,0 HCl:llä.

73 87733

Antigeenit ja aktivaattorit. Huuhdotut SRBC:t hankittiin lähteestä Colorado Serum Company, Denver, Colorado. Bakteeriperäinen lipopolysakkaridi (LPS) 055:B5, joka oli uutettu Boivin:in tekniikkaa käyttäen, hankittiin lähteestä Difco Laboratories, Detroit, Michigan. 8-MGuo:ta hankittiin lähteestä Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri.

Lymfosyyttiviljelmät. Näissä kokeissa käytetyt seerumia sisältävät viljelmäalustat, sekä pernan B-soluilla rikastetut pernasolujen suspensioiden ja -populaatioiden valmistusmenetelmät on esitetty julkaisussa Goodman ja Weigle, J. Exp. Med., 145:473 (1977). Polyklonaalisen immunoglobuiiinin erityksen indusoimiseksi perna-soluja viljeltiin muovisilla 24 kolon levyillä (N:o 3524, CoStar, Cambridge, Mass.) solutiheyden ollessa 5x10^ elävää solua/milli-litra 1,0 millilitran tilavuudessa. Viljelylevyjä inkuboitiin 37°C:ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa CC^ta oli 5% ilmassa.

Ensimmäisen SRBC:n aiheuttaman humoraalisen immuunireaktion arvioi-7 6 miseksi 10 hiiren pernasolua tai 4-5x10 hiiren pernan B-solua viljeltiin 1,0 millilitrassa 5% FCS-ää sisältävässä alustassa 4 vuorokauden ajan antigeenin läsnäollessa tai sen puuttuessa, kuten on esitetty. Soluja inkuboitiin viljelyalustoilla kuten edellä 37°C:ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa C02-'ta oli 10% ilmassa kudosviljelylaatikoita käyttäen, joita laatikoita heilutettiin taajuudella seitsemän sykliä minuutissa.

Solun vasta-ainetuotannon mittaaminen. Suora täplän muodostavan solun (PFC) reaktio SRBC:hen arvioitiin 4 viljelyvuorokauden kuluttua käyttäen hemolyytisen täpläkokeen modifikaatiota, joka on esitetty julkaisussa Jerne ja Nordin, supra.

Edellä esitetty on tarkoitettu tätä keksintöä valaisevaksi mutta ei rajoittavaksi. Lukuisia muunnelmia ja modifikaatioita voidaan toteuttaa poikkeamatta keksinnön uusien piirteiden todellisesta hengestä tai tavoitteesta.

Claims (17)

1. 74 8 7 7 3 3
2. 1. Menetelmä antigeenispesifisen humoraalisen immuunivasteen elvyttämiseksi B-lymfosyytissä, tunnettu siitä, että lymfosyytti saatetaan kosketukseen in vitro koostumuksen kanssa, jossa on aktiivisena aineosana tehokas määrä 8-substituoitua guaniinijohdannaista, joka johdannainen on 9-1'-sidottu 5 tai 6 hiiliatomia aldoosiketjussaan sisältävään aldoosiin, sähkö-varauksen puuttuessa guaniinijohdannaisesta (paitsi guaniini-tähteen typpiatomit), 8-substituentin sisältäessä alle 15 atomia ja omatessa sulfido- tai oksosidoksen guaniinijohdannaisen 8-asemassa, yhdessä fysiologisesti siedetyn kantaja-aineen laimeiden määrien kanssa, jolloin B-lymfosyytti saatetaan kosketukseen mainitun koostumuksen kanssa yhdessä lisämäärän kanssa mainittua antigeeniä tai B-lymfosyytti altistetaan antigeenille ennen yhteensaattamista mainitun koostumuksen kanssa .
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että guaniinijohdannaisen 8-asemassa on sulfidosidos.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 8-substituoitu guaniinijohdannainen on 8-merkaptoguano- siini.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 8-substituoitu guaniinijohdannainen on 8-oksoguanosiini-johdannainen. ·--· 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 8-oksoguanosiinijohdannainen on 7-metyyli-8-oksoguanosiini. ·/ 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitulla aldoosilla on rakenne 7S s 7 7 ?. 3 r''-o-ch, \ o .... Hf\ ./A" i n- V H V jossa n on yksi tai nolla; R1 on vety, hydroksi, metoksi, etoksi tai asetoksi; R2 on hydroksi, metoksi, etoksi, asetoksi, amino, mono- tai disubstituoitu Ci-C2-amino tai asetamido; R3 on hydroksi, metoksi, etoksi tai asetoksi; ja R4 on vety, metyyli, etyyli tai 1-24 hiiliatomisen karboksyyli- hapon asyyliosa.
6. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että B-lymfosyytti altistetaan antigeenille ennen saattamista kosketuksiin koostumuksen kanssa. R. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että B-lymf:osyytti saatetaan kosketuksiin mainitun koostumuksen kanssa yhdessä ylimääräisen antigeenimäärän kanssa.
7. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu koostumus saatetaan kosketuksiin B-lymfosyytin kanssa sellaisessa ympäristössä, jossa ilmenee T-lymfosyytin avustajan aktiivisuutta.
8. 10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että B-lymfosyytti saatetaan kosketuksiin mainitun koostumuksen kanssa ympäristössä, jossa T-lymfosyytin avustajan aktiivisuutta ei oleellisesti ilmene. 76 87 733
9. 11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että B-lymfosyytissä ilmenee pienentynyt immuunivaste ennen kosketuksiin saattamista.
10. 12. Menetelmä neoplastisten solujen kasvun inhiboimiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää neoplastisten solujen saattamisen kosketuksiin in vitro koostumuksen kanssa, joka koostumus sisältää aktiivisena aineenaan vaikuttavan määrän 8-substituoitua guaniinijohdannaista, joka on 9-11-sitoutunut aldoosiin, jonka aldoosiketjussa on 5 tai 6 hiiliatomia, sähkövarauksen puuttuessa guaniinijohdannaisesta (paitsi guanii-nitähteen typpiatomit) 8-substituentin käsittäessä vähemmän kuin noin 15 atomia ja omatessa sulfido- tai oksidosidoksen guaniinijohdannaisen 8-asemassa, yhdessä fysiologisesti siedetyn kantaja-aineen laimeiden määrien kanssa.
11. 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 8-substituoitu guaniinijohdannainen on 8-merkapto-guanosiini.
12. 14. Menetelmä interferonin tuotannon indusoimiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää elävien eläinsolujen saattamisen kosketuksiin in vitro koostumuksen kanssa, joka koostumus sisältää aktiivisena aineosanaan vaikuttavan määrän 8-substi-tuoitua guaniini johdannaista, joka johdannainen on 9-1'-sitoutunut aldoosiin, jonka aldoosiketjussa on 5 tai 6 hiiliatomia, sähkövarauksen puuttuessa mainitusta guaniinijohdannaisesta .·.: (paitsi guaniinitähteen typpiatomit) 8-substituentin käsittä- ' / essä vähemmän kuin noin 15 atomia ja omatessa sulfido- tai oksidosidoksen guaniinijohdannaisen 8-asemassa, yhdessä fysiologisesti siedetyn kantaja-aineen laimeiden määrien kanssa, mainitun vaikuttavan määrän indusoidessa interferonin tuotantoa interferonia indusoivien aineiden läsnäollessa tai niiden puuttuessa. ____ 15. Menetelmä interleukiini-1:n kaltaisen aktiivisuuden indusoimiseksi makrofageihin, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää mainittujen makrofagien saattamisen kosketuksiin in 77 8 7 7 33 vitro koostumuksen kanssa, joka koostumus sisältää aktiivisena aineosanaan vaikuttavan määrän 8-substituoitua guaniinijohdannaista, joka johdannainen on 9-1'-sitoutunut aldoosiin, jonka aldoosiketjussa on 5 tai 6 hiiliatomia, sähkövarauksen puuttuessa guaniinijohdannaisesta (paitsi guaniinitähteen typpi-atomit) 8-substituentin käsittäessä vähemmän kuin noin 15 atomia ja omatessa sulfido- tai oksidosidoksen guaniinijohdannaisen 8-asemassa, yhdessä fysiologisesti siedetyn kantaja-aineen laimeiden määrien kanssa.
13. 16. Menetelmä lisääntyneen T-lymfosyytin kaltaisen induktiivisen aktiivisuuden indusoimiseksi B-lymfosyytteihin, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää mainittujen B-lymfosyyttien saattamisen kosketuksiin in vitro koostumuksen kanssa, jossa koostumuksessa aktiivisina aineosina on (a) vaikuttava määrä 8-substituoitua guaniinijohdannaista, joka johdannainen on 9-1'-sitoutunut aldoosiin, jonka aldoosiketjussa on 5 tai 6 hiiliatomia, sähkövarauksen puuttuessa guaniinijohdannaisesta (paitsi guaniinitähteen typpiatomit) 8-substituentin käsittäessä vähemmän kuin noin 15 atomia ja omatessa sulfido- tai oksidosidoksen guaniinijohdannaisen 8-asemassa, ja (b) toinen vaikuttava määrä interferonia, mainittujen aktiivisten aineosien ollessa yhdessä mainitussa koostumuksessa fysiologisesti siedetyn kantaja-aineen laimean määrän kanssa. 78 87733