FI85027C - Foerfarande foer extrahering av ett protein som utgoers av hepatit b -ytantigen eller alfa-1-antitrypsin ur supernatant och rening av detta protein. - Google Patents
Foerfarande foer extrahering av ett protein som utgoers av hepatit b -ytantigen eller alfa-1-antitrypsin ur supernatant och rening av detta protein. Download PDFInfo
- Publication number
- FI85027C FI85027C FI861251A FI861251A FI85027C FI 85027 C FI85027 C FI 85027C FI 861251 A FI861251 A FI 861251A FI 861251 A FI861251 A FI 861251A FI 85027 C FI85027 C FI 85027C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- protein
- supernatant
- peg
- hbsag
- polysorbate
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
- C07K1/303—Extraction; Separation; Purification by precipitation by salting out
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
- C12N1/063—Lysis of microorganisms of yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
1 85027
Menetelmä proteiinin, joka on hepatiitti B -pinta-antigeeni tai alfa-l-antitrypsiini, uuttamiseksi supernatant!sta ja tämän proteiinin puhdistamiseksi
Keksintö koskee parannettua menetelmää proteiinin, joka on hepatiitti B -pinta-antigeeni tai alfa-l-antitrypsiini, uuttamiseksi supernatantista, joka on saatu rikottaessa sellaisia geenitekniikalla eli yhdistelmä-DNA-tekniikalla aikaansaatuja hiivasoluja, jotka ovat tuottaneet mainitun soluihin sidotun proteiinin, ei-ionisen pinta-aktiivisen aineen läsnäollessa, ja tämän proteiinin puhdistamiseksi.
Erilaisia mikro-organismeja, kuten bakteereja ja hiivoja, voidaan käyttää isäntäorganismeina eri plasmideille, joissa on tiettyä proteiinia koodittavan nukleotidisekvenssin sisältävä DNA-molekyyli. Näistä mikro-organismeista hiivat asetetaan nykyään käytössä etusijalle. Esimerkiksi EP-pa-tenttijulkaisussa 0 106 828 selostetaan Saccharomyces cere-visiae -kantojen käyttöä hepatiitti B -viruksen pinta-antigeenin (HBsAg) tuottamiseen ja EP-patenttihakemusjulkaisussa 0 103 409 kuvataan alfa-l-antitrypsiinin valmistusta hiiva-plasmideilla.
Proteiinien tuotanto hiivakannoilla sisältää todella huomattavia etuja bakteerikannoilla tapahtuvaan tuotantoon verrattuna. Nämä edut ovat seurausta siitä, että hiivoja on melko helppo kasvattaa suurissa fermentoreissa, ja siitä, että hiivat, toisin kuin bakteerit, näyttävät muistuttavan nisä-kässoluja kyvyssään lisätä hiilihydraattiryhmiä vastasynte-tisoimiinsa proteiineihin.
Kuitenkin proteiinien uuttaminen ja puhdistaminen hiivavil-jelmistä on teknisesti vaikeata, koska hiivasolujen kemiallinen rakenne on melko monimutkainen, ja ennen kaikkea, koska läsnä on suuria lipidimääriä, jos hiivan kasvuaikaa pidennetään polypeptidisaannon parantamiseksi.
2 85027
Esimerkiksi Saccharomyces-soluseinän ajatellaan koostuvan kolmesta kerroksesta: (a) alkaliin liukenemattomasta 3-glukaani- sisäkerroksesta, (b) alkaliin liukenevasta 3-glukaanikeski-kerroksesta ja (c) glykoproteiiniulkokerroksesta, jonka hiilihydraatti koostuu fosforyloituneesta mannaanista; soluseinän alla on sytoplasmamembraani, joka koostuu seoksesta, jossa on neutraaleja lipidejä (mono-, di- ja triglyseridejä), vapaita ja esteröityjä steroleja, monimutkaista sfingolipidiä, glysero-fosfatidejä ja neutraaleja sekä happamia glykolipidejä; tuma sisältää DNA:ta, eri RNA-laatuja ja polyfosfaattia; vakuolit voivat sisältää mitä erilaisimpia sekä suuri- että pienimolekyylisiä aineosia ja ne toimivat varastovesikkeleinä lukuisille hydrolyyttisille entsyymeille; mitokondriot sisältävät paljon kalvosysteemin lipidi-, fosfolipidi- ja ergosterolikomponentte-ja; ja sytoplasma sisältää mm. suuria määriä ribosomeja, poly-fosfaatteja, glykogeeniä ja monia glykolyyttisiä entsyymejä. Useimmat hiivasolut (kuten Saccharomyces-laji) sisältävät myös jonkin verran lipidiä globulimuodossa, jonka määrä kasvaa viljelyajan pidetessä.
" ; Ennestään tunnetaan useita monivaiheisia menetelmiä proteiinien uuttamiseksi ja puhdistamiseksi eri lähteistä. Geenitekniikalla aikaansaaduilla mikro-organismeilla tuotettuja proteiineja on selostettu esim. seuraavissa julkaisuissa:Th. Staehelin et ai. (J.Biol.Chem. 256; 9750-54; 1981), K. Murray et ai. (The Embo J.
ss. 645-650; 1984) ja R.A. Hitzeman et ai. (Nucl. Ac.
Res. 11; 2745-2763; 1983).
Jos tuotettu proteiini sisältyy soluun, nämä eri menetelmät vaativat tavallisesti kolme käsittelyvaihetta.
Ensimmäisessä käsittelyvaiheessa haluttu proteiini poistetaan solun sisältä. Tätä varten solut joko lysoidaan (esim. entsyy-mikäsittelyllä) tai rikotaan (esim. mekaanisesti, kuten leik-kausvoimalla, esim. X-puristimella tai ranskalaisella puristimella) tai ravistelemalla lasihelmien kanssa, jolloin mahdollisesti lisätään pinta-aktiivista ainetta (ks. esim. K. Murray 3 85027 et ai. loc. cit. ja R.A. Hitzeman et ai. loc. cit.).
Toisessa käsittelyvaiheessa väliaine rikastetaan halutun proteiinin suhteen, esim. fraktionaalisessa saostuksessa lisäämällä ammoniumsulfaattia mahdollisesti polyetyleeniglykolin läsnäollessa.
Lopuksi kolmannessa käsittelyvaiheessa oleellisesti ottaen kaikki epäpuhtaudet poistetaan väliaineesta käyttämällä esim. ultra-suodatusta, ioninvaihtoa, geelisuodatusta tai tiheysgradientti-sentrifugointia tai jotakin näiden yhdistelmää.
On selvää, että tällaisessa menetelmässä on epäpuhtauksilla, kuten muilla proteiineilla (ks. R.A. Hitzemann et ai., loc. cit.), nukleiinihapoilla ja lipideillä ja erityisesti suurilla lipidimäärillä, haitallinen vaikutus vähintään yhdessä kolmannen käsittelyvaiheen osassa (esim. ultrasuodatus ja pylväskroma-tografia) ja proteolyyttiset entsyymit pitää poistaa väliaineesta nopeasti. Lisäksi on havaittu, ettei ammoniumsulfaatti-saostus onnistu, jollei lipidejä poisteta karkeasti sitä ennen, koska lipidit haittaavat tätä saostumista.
Näin ollen on erittäin tärkeätä saada käyttöön sellainen menetelmä, jossa suurin osa epäpuhtauksista on poistettu ennen kolmatta käsittelyvaihetta.
Joissakin ennestään tunnetuissa menetelmissä käytetään polyety-leeniglykolia selektiivisenä saostusaineena proteiineille ja on myös kuvattu menetelmää, jossa saostetaan lipoproteiinit plasmasta käyttämällä lipoproteiini-polyanioni-metallivuoro-vaikutuksia.
Menetelmän, jolla saostetaan proteiinit fraktionaalisesti käyttämällä ei-ionisia, vesiliukoisia polymeerejä, erityisesti polyetyleeniglykolia (PEG), ovat kehittäneet Poison et ai.
. . (Biochem. Biophys. Acta 8_2; 463-475; 1964) ja useat kirjoittajat ovat käsitelleet sitä. Näistä W. Honig et ai. (Analyt.
4 85027
Biochem. 12j 502-512; 1976) mainitsevat, että "saostumisen spesifisyyttä eli halutun proteiinin ja kokonaisproteiinin välistä suhdetta voidaan parantaa käyttämällä PEG-jakeita, joiden keskimääräinen molekyylipaino on pienempi kuin tavallisesti käytetyn PEG 6000:n". Vaikka "pH:ta säätämällä voidaankin saada yksittäisten plasmaproteiinien konsentraatteja", kirjoittajat lisäävät, että "monimutkaisempien proteiiniseos-ten, kuten soluhomogenaatin emäliuoksen, puhdistuminen on heikompaa".
P.R. Foster et ai. (Biochim. Biophys. Acta 317; 505-516; 1973) ovat selostaneet menetelmää entsyymien saostamiseksi Saccharomyces cerevisiae-solu-uutteista PEGillä. Menetelmiä virusten ja bakteriofagien konsentroimiseksi ja puhdistamiseksi PEG:llä on selostettu julkaisuissa B.P. Vajda (Folia Microbiol. 23, 88-96; 1978) ja G.J. Lancz (Arch. Virusforsch. 42^ 303-306; 1973). Julkaisussa Ph. Adamowicz et. ai. (s. 37-49 INSERM SYMPOSIUM No. 18, HEPATITIS B VACCINE. Pubi. ELSEVIER, Amsterdam, Holland, 1981) hepatiittiantigeenin eristämisen alalta on selostettu hepatiitti B:n pinta-antigeenin (HBsAg) puhdistamista menetelmällä, joka sisältää kaksi peräkkäistä käsittelyä PEG 6000:11a. Tässä menetelmässä HBsAg:n puhdistamiseksi plasmasta immuunikompleksit ja suurin osa lipoproteiineista saoste-taan ensimmäisessä vaiheessa seerumista PEG 6000:11a, jonka pitoisuus on 5,5 %, ja toisessa vaiheessa HBsAg saostetaan eristetystä emäliuoksesta lisäämällä PEG:tä niin, että lopulliseksi pitoisuudeksi tulee 10 %.
Patenttikirjallisuudesta mainittakoon seuraavat: US-patenttijulkaisussa 3 790 552 selostetaan menetelmää hepatiittiin liittyvän antigeenin poistamiseksi proteiinijakeesta siten, että yhdessä käsittelyvaiheessa lisätään PEG:tä, jonka molekyylipaino on 200-6000, 12-30 % (paino/tilavuus) mainitun : antigeenin saostamiseksi.
5 85027 US-patenttijulkaisussa 3 951 937 selostetaan menetelmää hepatiitti B -antigeenin (HBAg) puhdistamiseksi käyttämällä HBAg:n kaksoissaostusta PEGrllä (4,0 - 4,5 paino-%), jonka molekyylipaino on vähintään 600.
US-patenttijulkaisussa 3 994 870 selostetaan menetelmää hepatiitti B -antigeenin (HBAg) puhdistamiseksi siten, että HBAg saostetaan lisäämällä 4,0 - 4,5 paino-% PEG:tä ja sen jälkeen suoritetaan affiniteettikromatografia käyttämällä liukenematonta konkavaliini A:ta kromatografisena adsorbenttina.
EP-patenttihakemusjulkaisussa 0 112 506 selostetaan menetelmää hepatiitti B -tartunnan estävän rokotteen valmistamiseksi plasmasta suorittamalla ammoniumsulfaattisaostus ja sen jälkeen adsorptio kolloidiseen silikaattiin ja kaksi peräkkäistä saostusta PEG:llä (molekyylipaino 2000 - 10 000) pitoisuutena 3 - 7 % (paino/tilavuus) hepatiitti B -viruksen ja immuunikopleksien saostamiseksi ja pitoisuutena 15 - 20% (paino/tilavuus) supernatantissa HBsAgrn saostamiseksi.
Alfa-l-antitrypsiinin eristämisen alalta löytyy JP-patentti-hakemus 9128-335 (Derwent abstract 84-217127), jossa selostetaan alfa-l-antitrypsiinin seostamista plasmasta lisäämällä PEG:tä 15 - 20 % (paino/tilavuus).
Kuten jo aiemmin mainittiin, ennestään tunnetaan myös menetelmä lipoproteiinien saostamiseksi käyttämällä lipoprote-iinipolyanionimetallivuorovaikutuksia (esim. M. Burstein et ai. Adv. Lip. Res. 11_; 67-108; 1973 ja A. van Dalen et ai. Biochim. et Biophys. Acta 147; 421-427; 1967). Kyseisessä menetelmässä tapahtuu vuorovaikutus lipoproteiinien, kahden-arvoisen metallikationin ja happaman polysakkaridin välillä ja näissä toimintaolosuhteissa on sakan määrä verrannollinen kahdenarvoisen metallikationin pitoisuuteen väliaineessa.
Keksintö koskee näin ollen menetelmää proteiinin, joka on hepatiitti B -pinta-antigeeni tai alfa-l-antitrypsiini, uuttamiseksi supernatantista, joka on saatu rikottaessa sellaisia geenitekniikalla aikaansaatuja hiivasoluja, jotka ovat tuottaneet mainitun soluihin sidotun proteiinin, ei- 6 85027 ionisen pinta-aktiivisen aineen läsnäollessa, ja tämän proteiinin puhdistamiseksi, ja keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että ei-ionisena pinta-aktiivisena aineena käytetään polysorbaattia ja että supernatantin pH säädetään arvoon 6 (± 0,1), siihen lisätään joko nestemäistä polyety-leeniglykolia sellainen määrä, että lopullinen pitoisuus on 10 - 35 tilavuus-%, tai kiinteätä polyetyleeniglykolia sellainen määrä, että lopullinen pitoisuus on 6 - 12 % (paino/-tilavuus), jolloin supernatantti kirkastuu ja kirkastettu supernatantti käsitellään joko kalsium- tai mangaanikationil-la tai ammoniumsulfaatilla, minkä jälkeen suoritetaan ultra-suodatus ja ioninvaihtokromatografia halutun puhdistetun proteiinin saamiseksi.
Tämän keksinnön mukaisen menetelmän lähtöaine (josta tässä käytetään myös nimeä "raakauute") on supernatantti (emäliu-os), joka on saatu rikkomalla pinta-aktiivisen polysorbaatin läsnäollessa hiivasolut, jotka on saatu aikaan geenitekniikalla ja sisältävät soluissaan proteiinin, kuten alalla hyvin tunnetaan.
Sen jälkeen suoritetaan tämän keksinnön mukaisesti yhdistel-mäkäsittely, joka koostuu PEG:llä tapahtuvasta fraktionaali-sesta saostuksesta (josta tässä käytetään nimeä ensimmäinen vaihe) ja joko kalsium- tai mangaanikationilla tapahtuvasta fraktionaalisesta saostuksesta tai ammoniumsulfaattikäsitte-lystä, jota ammoniumsulfaattikäsittelyä mahdollisesti edeltää ensimmäisessä vaiheessa saadun supernatantin ultrasuoda-tus.
Esillä oleva keksintö juontaa juurensa siitä havainnosta, että käytettäessä kiinteää PEG:tä (esim. PEG 6000) 6 - 12 % (paino/tilavuus) pitoisuutena HBsAg:n uuttamiseen geenitekniikalla aikaansaaduista hiivasoluista, jotka on sitä ennen rikottu pinta-aktiivisen polysorbaatin läsnäollessa, HBsAg ei saostu. Kun tämän jälkeen lisätään ammoniumsulfaattia, muodostuu kaksivaiheinen systeemi, jolle on ominaista se, että HBsAg on läsnä PEG-faasissa, kun taas suurin osa epäpuhtauksista on vesifaasissa. Tämä tulos on yllättävä, koska muihin raakauutteisiin liittyvien aikaisempien tietojen 7 85027 perusteella pitäisi näiden toimintaolosuhteiden saada aikaan HBsAg:n saostuminen. Näin ollen tämän keksinnön ensimmäisenä kohteena on käyttää PEGrtä liuottimena hiivaviljelmissä tuotetulle halutulle proteiinille samalla, kun suurin osa epäpuhtauksista poistetaan väliaineesta seostamalla.
Molekyylipainosta riippuen PEG esiintyy joko kiinteässä tai nestemäisessä muodossa ja näiden muotojen välinen raja on suunnilleen molekyylipainossa 1500.
Keksinnön mukaisen menetelmän ensimmäisessä vaiheessa (voidaan myös pitää kirkastusvaiheena) molekyylipainoltaan erilaisia PEG-laatuja voidaan käyttää säätämällä pitoisuus sopivaksi molekyylipainon mukaan.
PEG-pitoisuus on 6 - 12 % (paino/tilavuus) käytettäessä kiinteätä PEGrtä (esim. PEG 6000) ja 10 - 35 % (tilavuus/tila-vuus), erityisesti 20 - 30 % (tilavuus/tilavuus), käytettäessä nestemäistä PEGrtä (esim. PEG 300 tai 400). Kuitenkin nestemäisen PEGrn käyttö asetetaan etusijalle teknisistä syistä, joista mainittakoon myöhemmän ultrasuodatuksen helppous. PEGrn mainitut ylärajat määräytyvät pääasiassa saavutetun kirkastumispisteen mukaan, koska PEGrn lisäämisellä vielä tämän jälkeen on vain haittavaikutuksia, kuten väliaineen korkeampi viskositeetti ja HBsAgrn tai alfa-l-antitrypsiinin ei-toivottu saostuminen mukana.
Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä PEGrtä pidetään polymeerisenä orgaanisena liuottimena, joka edesauttaa mm. sellaisten (lipo)proteiinien saostumista, joiden isoelektrinen piste on lähellä pH-arvoa 6, ja muiden (lipo)proteiinien liukenemista eli niiden, joilla on huomattavasti poikkeava isoelektrinen piste, ja niiden, jotka ovat voimakkasti hydrofobisia.
On havaittu, että tämä PEG-kirkastusvaihe saostaa noin 75 % proteiiniepäpuhtauksista, 90 % polysakkarideista, 94 % nukleiinihapoista ja 45 % lipideistä, kun taas HBsAg tai alfa-1-antitrypsiini jäävät käytännöllisesti katsoen kokonaan super-natanttiin.
8 85027
Kuten jo edellä mainittiin, tämä keksintö sisältää yhdistel-mäkäsittelyn, joista ensimmäinen vaihe on kirkastusvaihe, jonka tuloksena on osittain puhdistunut ja mahdollisesti hieman opaloiva halutun proteiinin liuos.
Keksinnön mukaisen menetelmän toisessa vaiheessa näin saatu osittain puhdistettu liuos käsitellään joko kalsium- tai man-gaanikationilla, kuten kalsium- tai mangaanikloridin vesiliuoksella, niin että lopulliseksi väkevyydeksi tulee 30 mM, tai ammoniumsulfaatilla, joka ammoniumsulfaattikäsittely suoritetaan joko siten, että ensin opaloiva liuos ultrasuoda-tetaan ja vasta sen jälkeen lisätään ammoniumsulfaattia 40 -50 % kyllästymisasteeseen, joka merkitsee klassista halutun proteiinin suolasaostusta, joka sakka voidaan siirtää fosfaattipuskuriin, tai siten, että ammoniumsulfaattia lisätään PEG-pitoiseen supernatanttiin 40 - 50 % kyllästymisasteeseen, jolloin muodostuu kaksivaiheinen systeemi, jossa haluttu proteiini on PEG-faasissa.
Kukin näistä toisen käsittelyvaiheen muunnoksista antaa halutun proteiinin kirkkaana liuoksena, josta puhdistuksessa ovat poistuneet polysakkaridit, nukleiinihapot, lipidit ja proteiiniepäpuhtaudet oleellisesti ottaen kokonaan.
Näin saatu liuos voidaan sen jälkeen käsitellä edellä määritellyllä klassisella kolmannella käsittelyvaiheella, eli ult-rasuodatuksella, mahdollisella geelisuodatuksella ja pylväs-kromatografisesti, ja tämän keksinnön edullisessa toteutustavassa tämä kolmas käsittelyvaihe koostuu peräkkäisesti ult-rasuodatuksesta, ensimmäisestä geelisuodatuksesta, pylväskro-matografiästä heikosti alkalisessa anioninvaihtimessa, jossa on dietyyliaminoetyyliryhmiä (DEAE), ja toisesta geelisuodatuksesta tai keesiumkloridigradienttisentrifugoinnista, jolloin tuotteeksi saadaan lääketieteelliseen käyttöön soveltuva, erittäin puhdas HBsAg-liuos tai alfa-l-antitrypsiini-liuos.
Kun testattiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (nat-riumdodekyylisulfaatti), osoittautui toisessa geelisuodatuk- 9 85027 sessa saatu tuote yli 98 % puhtaaksi, mitä tulee 23 K:n vyöhykkeeseen, joka on luonteenomainen hiiva-alkuperää olevalle HBsAg:lie.
Näin ollen tämän keksinnön mukaisen menetelmän pääetu on se, että se poistaa oleellisesti ottaen kaikki polysakkaridit, nukleiinihapot, lipidit ja proteiinipitoisen materiaalin, ja toinen keksinnön mukaisen menetelmän etu on se, että haluttu proteiini voidaan lopuksi erottaa suhteellisen korkealla saannolla.
Kun keksinnön mukaista menetelmää sovelletaan geenitekniikalla valmistetuista hiivasoluista saatuun HBsAg-raakauut-teeseen, saatu HBsAg sitoutuu pinta-aktiiviseen polysorbaat-tiin muodostaen sen kanssa komposiittimisellejä, joiden halkaisija on 17 - 20 nm, ja on havaittu, että suhde, joka ilmaisee polysorbaatin määrän verrattuna proteiinin, koko-naislipidien ja polysorbaatin kokonaismäärään polysorbaatti-komposiittimisellissä, on 15 - 35 % (paino/tilavuus), kun proteiinit (Lowry), kokonaislipidimäärä (Zolliner) ja po-lysorbaatti (Huddleston ja Allred) määritetään kolorimetri-sellä menetelmällä.
Edellä mainitut komposiittimisellit ovat uusia yhdisteitä ja ne ovat immunogeenisiä ja ne voidaan formuloida rokotteiksi kuten klassinen HBsAg, kuten ennestään hyvin tunnetaan hepatiitti B -virusrokotteiden valmistuksen alalla.
Keksintöä valaistaan, mutta ei rajoiteta, seuraavilla esimerkeillä.
Esimerkki 1
Pelletoidut hiivasolut (3850 g), jotka on saatu geenitekniikalla valmistetusta hiivakannasta, joka ilmentää HBsAg:tä, ja jota on kasvatettu korkeintaan pitoisuuteen 30 g solu-kuivapainoa per litra viljelmää, suspendoidaan 7,12 litraan Na2HP04~liuosta (7,098 g/1).
10 85027 Tähän suspensioon lisätään 142,5 ml 4 % (paino/tilavuus) EDTA-liuosta, 38,5 ml polysorbaatti 20 ja 385 ml isopropanolia, jossa on 2,7 g fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF). pH säädetään arvoon 8,1 (_+ 0,1) natriumhydroksidillä (10 % paino/ tilavuus vedessä). Suspensio jäähdytetään jäähauteella ja solut rikotaan laskemalla 2 kertaa homogenisaattorin läpi, jossa on jäähdytettyjä lasihelmiä. Sen jälkeen homogenaattia (raaka-uute) sentrifugoidaan 30 minuuttia nopeudella 13000 g.
PEG 400 (2,5 1) lisätään hitaasti ja samalla sekoittaen raakauut-teeseen (7,7 1), jonka lämpötila pidetään alle 15°C:ssa. Sen jälkeen pH säädetään arvoon 6 (_+ 0,1) lisäämällä etikkahappoa (5 M) ja saatua seosta säilytetään 1 tunti 4°C:ssa, jonka jälkeen sitä sentrifugoidaan 45 minuuttia nopeudella 7400-11 000 g.
Emäliuoksen pH säädetään arvoon 7,0 (+^ 0,05) 1 N natriumhydrok-sidilla ja sen jälkeen lisätään 300 ml 1 M CaC^ (so. 30 ml per litra emäliuosta). Sen jälkeen pH säädetään uudestaan arvoon 7 (_+ 0,05) 1 N natriumhydroksidilla ja saatua seosta säilytetään yön yli 4°C:ssa. Suspensio sentrifugoidaan nopeudella 3600 g (45 min) ja emäliuos ultrasentrifugoidaan AMICON DCrllä (laitteen toimittaja AMICON Corp., Danvers, MA, USA), joka on varustettu hylsyllä, jossa on katkaisu 100 000 daltonin kohdalla, jolloin ensin suoritetaan väkevöinti korkeintaan neljäsosaan (1500 ml) alkuperäisestä tilavuudesta. Liuosta pestään sen jälkeen jatkuvatoimisesti 12,5 litralla liuosta, jossa on 10 mM trometamolia, jonka pH on säädetty arvoon 8 (+_ 0,1) lisäämällä 1 N suolahappoa (tästä puskurista käytetään tästä lähtien nimitystä trometamol pH 8), ja johon on lisätty täydennykseksi PMSF (1 mM), isopropanolia (2,5 tilavuus-%) ja EDTA (2 mM) (lopullisia pitoisuuksia). Sen jälkeen retentaatti konsentroidaan 350 mlrksi.
Väkevöity liuos sijoitetaanpylvääseen (0 10 cm x 100 cm), joka sisältää 7 1 FRACTOGElÖ^TSK HW65(F) (puolijäykkä geeli, joka muodostuu hydrofiilisistä vinyylipolymeereistä, ja sisältää lukuisia hydroksyyliryhmiä matriisipinnassa, hiukkaskoko 11 85027 32-63 yum, valmistaja ja myyjä E. Merck, Darmstadt, Saksan liittotasavalta) , joka on tasapainotettu trometamol/HCl-puskuril-la 10 mM pH 7 (_+ 0,01) , johon on lisätty 5 tilavuus-% etyleeni-glykolia.
HBsAg-antigeenin sisältävä piikki sijoitetaan pylvääseen (0 5 cm x 30 cm), jossa on 300 ml FRACTOGED^ TSK DEAE 650 (M) (heikosti emäksinen anioninvaihdin, jossa dietyyliaminoetyyliryhmät ovat sitoutuneina FRACTOGEL TSK HW-65-matriisin hydroksyyliryhmiin eetterisidoksilla, valmistaja ja myyjä E. Merck, Darmstadt,
Saksan liittotasavalta), ja joka on tasapainotettu trometamolil-la pH 8 4°C:ssa. Pylväs pestään trometamolilla pH 8, joka sisältää 0,05 M NaCl, ja HBsAg eluoidaan liuoksella, jossa on 0,15 M NaCl trometamolissa pH 8.
Eluaatti sijoitetaan FRACTOGEI^TSK HW65(F)-pylvääseen, joka on tasapainotettu Na2HP0ij/NaH2P0ij-puskurilla (10 mM) pH 6,8, johon on lisätty NaCl (150 mM), jolloin saadaan HBsAg/polysor-baattikomposiittimiselliliuos.
‘ Kussakin puhdistusvaiheessa saavutettu puhdistumistaso on ’ esitetty taulukossa I.
Taulukko I
Jae Tila- Kokonais- Kokonais- Kokonais- Koko- Koko- vuus HBsAg RIA: proteii- polysakka- nais- nais- (1) 11a (mg) nit (g) ridit (g) nukleii- lipi- nihapot dit __________(mg) (g)
Raakauute 7,7 1232 259 114 32500 104 PEG-emäliuos 8,02 1100 64 9,5 641 53,7
CaCl-emäliuos 8 1190 37 3,8 512 27,2
Retentaatti 0,350 1320 26,7 0,744 37,6 3,596 HBsAg-piikki TSK 1,06 736 0,935 0,014 16 0,352 TSK-DEAE- Y eluaatti 0,15 722 0,428 0,0084 2,6 0,275 HBsAg-piikki TSK 0,45 1117 0,244 0,0094 2 0,179 PIA: Radioimraunoanalyysi
Seuraavassa taulukossa II on esitetty 3 eri rokote-erän kompo- siittimisellien koostumus, jotka on saatu edellä esitetyllä menetelmällä käyttämällä polysorbaatti 20:tä.
12 85027
Taulukko II
Erä Proteiinit Kokonais- Polysorbaatti Suhde
( ,ug/ml) lipidit 20 C
(/ug/ml) ( /Ug/ml) a/r/c _ (A) 7 (B) 7 (C) 77 I 20 20 8,5 18 II 20 16 8,4 19 III 20 14,5 15,6 31
Esimerkki 2 PEG 400 (882 ml) lisätään hitaasti 2650 litraan esimerkin 1 mukaisesti valmistettua raakauutetta ja pH säädetään arvoon 6 (_+ 0,1) . Seosta pidetään 1 tunti 4°C:ssa ja sen jälkeen sentri-fugoidaan nopeudella 7400 g. Emäliuos väkevöidään 1000 ml:aan AMICON DC-laitteella, joka on varustettu hylsyllä, joka suorittaa leikkauksen 100 000 daltonin kohdalla, ja sen jälkeen pestään 3 tilavuudella 20 mM trometamolia pH 8. Sen jälkeen retentaat-tiin lisätään hitaasti jauhemaista ammoniumsulfaattia (277 g) samalla 4°C:ssa sekoittaen. Kun on pidetty 1 tunti 4°C:ssa, sakka sentrifugoidaan 15 minuutissa nopeudella 1000 g. Emäliuos heitetään pois ja sakka liuotetaan 400 ml:aan 20 mM trometamolia pH 8, johon on lisätty 1 mM PMSF. Liuos ultrasentrifugoi-daan Amicon DC-laitteella, joka on varustettu hylsyllä, joka g suorittaa leikkauksen 10 daltonin kohdalla. Retentaatti (500 ml) pestään 2 tilavuudella trometamolia pH 8 ja sen jälkeen sijoitetaan pylvääseen, joka sisältää 300 ml TSK-DEAE 650 M geeliä, joka on tasapainotettu trometamolilla pH 8. Kun näyte on kulkenut kokonaan läpi, pylväs pestään 0,05 M natriumkloridillä, joka on tehty trometamoliin pH 8, ja sen jälkeen pylvääseen tuodaan lineaarinen NaCl-gradientti (0,05 M - 0,5 M). Jae, joka eluoituu 0,15 M NaCl:llä, sisältää HBsAg:n, ja tämä jae väkevöidään 50 ml:ksi Amicon DC-laitteella, joka on varustettu hylsyllä, joka suorittaa leikkauksen 10 OOO daltonin kohdalla, ja saatu liuos sijoitetaan Sepharose 4B-Cl-pylvääseen (50 x 100 an) 13 85027 (agaroosigeeli, jota valmistaa ja myy Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi), joka on tasapainotettu 20 mM troraetamolilla pH 8, johon on lisätty 5 % etyleeniglykolia, ja näin saadaan HBsAg/polysorbaattikomposiittimiselliliuos.
Kussakin vaiheessa saavutettu puhdistumistaso on esitetty taulukossa III.
Taulukko III
Jae Tilavuus Kokonais- Kokonais- Kokonais- Kokonaisiini) HBsAg proteii- polysakka- nukleiini- RIAtlla nit ridit hapot _ _ (mg) (g) (g) (mg)_
Raakauute 2650 188 114,721 36,9 9250 FEG-emäliuos 2530 160 22,755 3,321 536
Retentaatti 105 1000 150 7,468 0,181 175 AMS-pelletti 400 80,8 1,248 0,0248 160
Retentaatti 106 1000 72,4 0,529 0,029 88
Eluaatti I5K- DEAE 560 44 0,157 0,073 3 HBsAg-piikki
Sepharose 4B-C1 200 23 0,030 0,0003 0,05 RIA: Radioimmunoanalyysi
Esimerkki 3 HBsAg-raakauute (2 litraa) kirkastetaan PEG 400:11a esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Jauhemaista ammoniumsulfaattia (AMS) (450 g) lisätään samalla sekoittaen (lopullinen pitoisuus vastaa 45 %:n AMS-kyllästymisastetta). Kun AMS on liuennut, saatua liuosta pidetään 3 tuntia 4°C:ssa, jonka kuluttua saadaan kaksi erillistä faasia, jotka erotetaan erotussuppilossa: kirkas (keltainen) ylempi faasi (PEG 400-faasi) ja kirkas alempi faasi (ve-sifaasi) , joista kumpikin faasi edustaa noin _+ 50 % alkuperäisestä tilavuudesta. Vesifaasi heitetään pois ja ylempi faasi ultrasuodatetaan Amicon DC-laitteella, kuten CaC^-emäliuoksen kohdalla on selostettu esimerkissä 1. Puhdistus suoritetaan loppuun esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ja saadaan HBsAg/polysor-baattikomposiittimiselliliuos.
14 85027
Kussakin vaiheessa saavutettu puhdistumistaso on esitetty taulukossa IV.
Taulukko IV
Jae Tilavuus Kokonais- Kokonais- Kokonais- Kokonaisiini ) HBsAg probeii- polysakka- nukleiini- RIA-mene- nit ridit hapot telmällä (g) (g) (mg) _____ _ (mg)____
Raakauute 2000 99 55 22 5588 PEG-emäliuos 2000 92 13,2 5,68 243 PEG-faasi 1000 98 2,8 1,536 98
Retentaatti 50 98 1,5 0,14 6,66 HBsAg-piikki TSK 123 52 0,288 0,0077 2,84
Eluaatti TSK- DEAE 25 54 0,0377 0,0011 0,44 HBsAg-piikki TSK 60 35 0,0207 0,00154 0,39 RIA: Radioimmunoanalyysi
Esimerkki 4 HBsAg-raakauute (2 litraa) kirkastetaan PEG 400:11a esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Ammoniumsulfaattijauhetta (AMS) (450 g) lisätään samalla sekoittaen (lopullinen pitoisuus vastaa 45 %:n AMS-kyllästymisastetta). Kun AMS on liuennut, saatua liuosta pidetään 3 tuntia 4°C:ssa, jonka kuluttua on muodostunut 2 erillistä faasia, jotka erotetaan toisistaan erotussuppilossa: kirkas (keltainen) ylempi faasi (PEG 400-faasi) ja kirkas alempi faasi (vesifaasi) , joista kukin edustaa noin _+ 50 % alkuperäisestä tilavuudesta. Vesifaasi heitetään pois ja 1 litran erä PEG-faasista (ylempi faasi) laimennetaan kaksinkertaiseksi 10 mM trometamolilla pH 8 ja sijoitetaan pylvääseen, jossa on 300 ml FRACTOGEL TSK-DEAE 650 (M)-geeliä, joka on tasapainotettu trometamolilla pH 8 virtausnopeudella 100 ml/h.
Geeli pestään trometamolilla pH 8, joka sisältää 0,05 M NaCl ja sen jälkeen HBsAg eluoidaan NaCl-gradientilla (0,05-0,5 M NaCl trometamolissa pH 8). HBsAg-piikki eluoituu 0,15 M NaCl:11a ja sille suoritetaan väkevöinti AMICON DC-laitteessa, joka on is 85027 varustettu hylsyllä, joka suorittaa leikkauksen 10 000 dalto-nin kohdalla, ja saatu retentaatti sijoitetaan Sepharose 4B-C1-pylvääseen (5 x 100 cm), joka on tasapainotettu trometamolilla pH 8, joka sisältää 5 tilavuus-% etyleeniglykolia, ja saadaan HBsAg/polysorbaattikomposiittiraisellipiikki.
Kussakin vaiheessa saavutettu puhdistumistaso on esitetty taulukossa V.
Taulukko V
Jae Tilavuus Kokonais- Kokonais- Kokonais- Kokonaisiini) HBsAg proteii- polysakka- nukleiini- RIAtlla nit ridit hapot _ _ (mg) (g) (g) (mg)
Raakauute 2100 200 60,600 19,000 4860 PEG-faasi 1200 210 3,100 1,436 80 ELuaatti TSK- DEAE 460 134 0,750 0,0048 05 HBsAg-piikki
Sepharose 4B-CL 150 110 0,120 0,0014 0,3 RIA: Radioimmunomääritys
Esimerkki 5 HBsAg-raakauute (500 ml) kirkastetaan lisäämällä hitaasti 4°C:ssa samalla sekoittaen liuos, jossa on 50 g PEG 6000 160 ml:ssa vettä. pH säädetään arvoon 6,1 lisäämällä 5 M etikkahappoa.
Kun on säilytetty 1 tunti 4°C:ssa, uutetta sentrifugoidaan 15 minuuttia nopeudella 7000 g. Sen jälkeen emäliuokseen lisätään samalla sekoittaen jauhemaista ammoniumsulfaattia (157 g) (lopullinen pitoisuus vastaa 50 %:n AMS-kyllästymisastetta). Kun liukeneminen on tapahtunut, liuosta pidetään 3 tuntia 4°C:ssa, jonka kuluttua saadaan 2 erillistä faasia, jotka erotetaan toisistaan erotussuppilossa. Ylempi faasi (PEG-faasi, joka sisältää HBsAgrn) laimennetaan kaksinkertaiseksi trometamolilla pH 8 ja sijoitetaan sen jälkeen pylvääseen, joka sisältää 300 ml TSK-DEAE 650 (M)-geeliä, joka on tasapainotettu trometamolilla pH 8 virtausnopeudella 100 ml/h. Geeli pestään tro-metamolilla pH 8, joka sisältää 0,05 M NaCl, ja sen jälkeen ie 85027 HBsAg-antigeeni eluoidaan trometamolilla pH 8, joka sisältää 0,15 M NaCl, väkevöidään AMICON DC-laitteella, joka on varustettu hylsyllä, joka suorittaa katkaisun 10 000 daltonin kohdalla, ja saatu retentaatti sijoitetaan 2 litran FRACTOGEL TSK-HW65 (F)-pylvääseen (5 x 100 cm), joka on tasapainotettu trometamolilla pH 8, joka sisältää 10 tilavuus-% etyleeniglyko-lia, jolloin saadaan HBsAg/polysorbaattikomposiittimiselli-liuos.
Kussakin vaiheessa saavutettu puhdistumistaso on esitetty taulukossa VI.
Taulukko VI
Jae Tilavuus Kokonais- Kokonais- Kokonais- Kokonaisiini) HBsAg proteii- polysakka- nukleiini- RIA:lla nit ridit hapot _ _ (mg) (g) (g) (mg)
Raakauute 500 123 22,600 6,400 1200 PEG-emäliuos 490 100 4,153 0,509 24 PEG-faasi 270 110 1,820 0,2096 5,3
Eluaatti TSK- DEAE 150 66 0,258 0,028 0,4 HBsAg-piikki TSK 60 68 0,065 0,00048 0,084 RIA: Radioimmunomääritys
Esimerkki 6
PEG 400 (13 ml) lisätään hitaasti alfa-l-antitrypsiiniraaka-uutteeseen (120 ml), joka oli saatu geenitekniikalla aikaansaadusta hiivaviljelraästä, ja pH säädetään arvoon 6,1 lisäämällä 5 M etikkahappoa. Saatua seosta pidetään 1 tunti 4°C:ssa, sen jälkeen sentrifugoidaan 15 minuuttia nopeudella 5000 g ja lisätään hitaasti 1 M CaC^-liuosta niin, että lopulliseksi pitoisuudeksi tulee 40 mM. pH säädetään 1 M natriumhydroksi-dilla arvoon 7 ja saatua seosta pidetään yön yli 4°C:ssa ja sentrifugoidaan 15 minuuttia nopeudella 7000 g. Emäliuos laimennetaan kaksinkertaiseksi 50 mM trometamolilla, jonka pH
I? 85027 on säädetty arvoon 8,7 lisäämällä 0,1 N suolahappoa, ja sijoitetaan FRACTOGEL TSK-DEAE 650 (M)-pylvääseen (20 ml), joka on tasapainotettu 50 mM trometamolilla pH 8,7, joka on valmistettu edelläkuvatulla tavalla, mutta sisältää myös 5 mM merkapto-etanolia. Pylväs pestään trometamolilla pH 8,7, joka on valmistettu edellä kuvatulla tavalla, mutta sisältää vielä 10 mM NaCl, ja sen jälkeen tuodaan NaCl-gradientti (10 mM - 250 mM), jolloin alfa-l-antitrypsiini eluoituu NaCl-väkevyydessä 124 mM ja saadaan aikaan erottuminen 80 mM NaCl:llä elutoituvasta proteiinipiikistä. Alfa-l-antitrypsiinipiikki väkevöidään AMICON DC-laitteella, joka on varustettu hylsyllä, joka suorittaa leikkauksen kohdassa 10 000 daltonia, ja piikki sijoitetaan Sephadex 150-pylvääseen, joka on tasapainotettu 50 mM trometamolilla pH 8,7, joka on valmistettu edellä kuvatulla tavalla, ja saadaan tuotteeksi puhdistettu alfa-l-antitrypsiini.
Kussakin vaiheessa saavutettu puhdistumistaso on esitetty taulukossa VII.
Taulukko VII
Jae Tilavuus Kokonais- Kokonais- Kokonaisiini) AAT proteiinit polysakkaridit ELISA :11a (g) (g) _ _ (mg) _ _
Raakauute 120 180 4,018 0,538 PEG-emäliuos 100 212 1,300 0,290
CaC^-emäliuos 100 194 0,660 0,110
Eluaatti TSK- DEAE 520 180 0,210 0,0052 AAT: Alfa-l-antitrypsiini • - Esimerkki 7
Toimitaan samoin kuin esimerkissä 1, mutta käytetään 300 ml 1 M MnCl2 siinä käytetyn 1 M CaC^in (300 ml) tilalla. Lopputuotteen ominaisuudet ovat samanlaiset kuin esimerkin 1 lopussa saadulla tuotteella.
is 85027
Esimerkki 8
Toimitaan samoin kuin esimerkissä 1, mutta nyt käytetään 20 ml Triton X-IOO (valmistaja Rohm and Haas, Darmstadt, Saksan liittotasavalta) siinä käytetyn polysorbaatti 20 (38,5 ml) tilalla. Lopputuotteen ominaisuudet ovat samanlaiset kuin esimerkin 1 lopussa saadulla tuotteella.
Esimerkki 9
Toimitaan samoin kuin esimerkissä 1, mutta nyt käytetään 38,5 ml polysorbaatti 80 siinä käytetyn polysorbaatti 20 (38,5 ml) tilalla. Lopputuotteen ominaisuudet ovat samat kuin esimerkin 1 lopussa saadulla tuotteella.
Esimerkki 10
Esimerkin 1 lopussa saadun HBsAg-komposiittimisellin proteiinipitoisuus säädetään määrään 10 ^,ug per ml lisäämällä NaCl, fosfaattipuskuria (Na2HPO^/NaH2PO^) ja ALHYDROGED^ (alumiini-hydroksidigeeli, valmistaja ja myyjä Superphos Export Co., Kööpenhamina, Tanska) niin, että lopullisiksi pitoisuuksiksi tulee 0,9 % (paino/tilavuus), 20 mM ja 0,15 % (paino/tilavuus) AI(OH)2 vastaavasti, ja lopullinen pH on 6,9.
Valmiste steriloidaan ja jaetaan 2 ml:n lääkepulloihin niin, että kuhunkin tulee 1 ml:n annosyksikkö rokotetta.
Esimerkki 11
Esimerkin 10 mukaista rokotetta on annettu annosyksiköt intra-muskulaarisesti 2 sarjalle seronegatiivisia kohteita kahtena peräkkäisenä ruiskeena 1 kuukauden välein. Vaikka nämä ruiskeet pitäisi katsoa esirokotuksiksi, joiden jälkeen pitäisi antaa tehoste, esim. 2 kuukauden kuluttua ensimmäisestä ruiskeesta, havaittiin positiivisia vasta-ainevasteita jo yhden ja kahden kuukauden kuluttua ensimmäisestä ruiskeesta lukien.
Ensimmäisessä sarjassa (käsitti 32 seronegatiivista kohdetta) oli 1 kuukauden kuluttua ensimmäisen ruiskeen antamisesta is 85027 serokonversio 20/32 eli 62,5 %, geometrisen keskitiitterin (geometrical mean titre, GMT) ollessa 9,95 kansainvälistä milli-yksikköä (milli international units, MIU) ja yhden kuukauden kuluttua toisesta antamisesta oli serokonversiotaso 31/32 eli 96,9 % ja GMT 36 MIU.
Toisessa sarjassa (sisälsi 46 seronegatiivista kohdetta) oli serokonversiotaso kuukauden kuluttua ensimmäisestä antamisesta 31/46 eli 67,4 % ja GMT 13/6 MIU).
Kliinisten merkkien ja oireiden tarkkailussa ei paljastunut yhtään lämmönnousua tai havaittavaa paikallista reaktiota rokotettujen joukossa.
Claims (4)
1. Menetelmä proteiinin, joka on hepatiitti B -pinta-antigeeni tai alfa-l-antitrypsiini, uuttamiseksi supernatantis-ta, joka on saatu rikottaessa sellaisia geenitekniikalla aikaansaatuja hiivasoluja, jotka ovat tuottaneet mainitun soluihin sidotun proteiinin, ei-ionisen pinta-aktiivisen aineen läsnäollessa, ja tämän proteiinin puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että ei-ionisena pinta-aktiivisena aineena käytetään polysorbaattia ja että supernatantin pH säädetään arvoon 6 (± 0,1), siihen lisätään joko nestemäistä polyety-leeniglykolia sellainen määrä, että lopullinen pitoisuus on 10-35 tilavuus-%, tai kiinteätä polyetyleeniglykolia sellainen määrä, että lopullinen pitoisuus on 6-12 % (pai-no/tilavuus), jolloin supernatantti kirkastuu ja kirkastettu supernatantti käsitellään joko kalsium- tai mangaanikatio-nilla tai ammoniumsulfaatilla, minkä jälkeen suoritetaan ultrasuodatus ja ioninvaihtokromatografia halutun puhdistetun proteiinin saamiseksi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kalsium- tai mangaanikationilla suoritetun käsittelyn jälkeen sakka erotetaan, liuos ultrasuodatetaan, retentaatti geelisuodatetaan, proteiinin sisältävä piikki käsitellään ioninvaihtokromatografiällä ja mahdollisesti suoritetaan toinen geelisuodatus tai keesiumkloridigradient-tisentrifugointi.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely ammoniumsulfaatilla suoritetaan 40-50 % kyllästymisasteeseen asti ja että polyetyleeniglykoli-faasille suoritetaan ultrasuodatus ja sen jälkeen ioninvaihtokromatograf ia ja mahdollisesti geelisuodatus.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polysorbaatti on polysorbaatti 20. 2i 85027
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/719,601 US4683294A (en) | 1985-04-03 | 1985-04-03 | Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them |
| US71960185 | 1985-04-03 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI861251A0 FI861251A0 (fi) | 1986-03-24 |
| FI861251A FI861251A (fi) | 1986-10-04 |
| FI85027B FI85027B (fi) | 1991-11-15 |
| FI85027C true FI85027C (fi) | 1992-02-25 |
Family
ID=24890650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI861251A FI85027C (fi) | 1985-04-03 | 1986-03-24 | Foerfarande foer extrahering av ett protein som utgoers av hepatit b -ytantigen eller alfa-1-antitrypsin ur supernatant och rening av detta protein. |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4683294A (fi) |
| EP (1) | EP0199698B1 (fi) |
| JP (1) | JP2512430B2 (fi) |
| KR (1) | KR940010283B1 (fi) |
| CN (1) | CN86101798A (fi) |
| AR (1) | AR241596A1 (fi) |
| AT (1) | ATE66694T1 (fi) |
| AU (1) | AU580494B2 (fi) |
| CA (1) | CA1272457A (fi) |
| CS (1) | CS259537B2 (fi) |
| DE (1) | DE3681058D1 (fi) |
| DK (1) | DK152286A (fi) |
| EG (1) | EG17972A (fi) |
| ES (1) | ES8706166A1 (fi) |
| FI (1) | FI85027C (fi) |
| GR (1) | GR860874B (fi) |
| HU (1) | HU206125B (fi) |
| IE (1) | IE58854B1 (fi) |
| IL (1) | IL78824A (fi) |
| MY (1) | MY102936A (fi) |
| NO (1) | NO170421C (fi) |
| NZ (1) | NZ215618A (fi) |
| PH (1) | PH22110A (fi) |
| PL (1) | PL152568B1 (fi) |
| PT (1) | PT82219B (fi) |
| RO (1) | RO95349B (fi) |
| SU (1) | SU1604144A3 (fi) |
| YU (1) | YU46304B (fi) |
| ZA (1) | ZA862374B (fi) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1268437A (en) * | 1984-12-21 | 1990-05-01 | Haruo Fujita | Method for purification of hbc antigen and method for measurement of hbc antibody by using said purified hbc antigen |
| US4683294A (en) * | 1985-04-03 | 1987-07-28 | Smith Kline Rit, S.A. | Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them |
| US5124256A (en) * | 1985-11-13 | 1992-06-23 | Labofina, S.A. | Process for recovering polypeptides localized in the periplasmic space of yeast without breaking the cell wall by using an non-ionic detergent and a neutral salt |
| US4742158A (en) * | 1986-04-25 | 1988-05-03 | Merck & Co., Inc. | Purification of hepatitis pre-S antigens by polymerized serum albumin affinity binding |
| FR2608052B1 (fr) * | 1986-12-10 | 1990-04-13 | Pasteur Vaccins | Procede de preparation d'un vaccin contre l'hepatite b et vaccin obtenu |
| AP56A (en) * | 1987-01-30 | 1989-09-26 | Smithkline Biologicals S A | Hepatitis B virus surface antigens and hybrid antigehs containing them. |
| US5026828A (en) * | 1987-02-27 | 1991-06-25 | Merck & Co., Inc. | Method of purifying recombinant pres-1/S-2/S/S hepatitis B antigen from yeast |
| NZ225583A (en) * | 1987-08-06 | 1991-07-26 | Merck & Co Inc | Process for purifying hepatitis a virions (hav) |
| US4883865A (en) * | 1987-09-30 | 1989-11-28 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+s antigen |
| US5011915A (en) * | 1987-10-26 | 1991-04-30 | Merck & Co., Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| US5043287A (en) * | 1989-05-16 | 1991-08-27 | The Standard Oil Company | Recovery of water soluble biopolymers from an aqueous solution by employing a polyoxide |
| US5139943A (en) * | 1989-06-13 | 1992-08-18 | Genencor International, Inc. | Processes for the recovery of microbially produced chymosin |
| US5151358A (en) * | 1989-06-13 | 1992-09-29 | Genencor International, Inc. | Processes for the recovery of naturally produced chymosin |
| DE4021979A1 (de) * | 1989-07-15 | 1991-01-31 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur reinigung von annexinen |
| US5109121A (en) * | 1990-01-22 | 1992-04-28 | Pitman-Moore, Inc. | Method for recovering recombinant proteins |
| US4988798A (en) * | 1990-01-22 | 1991-01-29 | Pitman-Moore, Inc. | Method for recovering recombinant proteins |
| US5177194A (en) * | 1990-02-01 | 1993-01-05 | Baxter International, Inc. | Process for purifying immune serum globulins |
| US5290474A (en) * | 1990-10-05 | 1994-03-01 | Genencor International, Inc. | Detergent composition for treating cotton-containing fabrics containing a surfactant and a cellulase composition containing endolucanase III from trichoderma ssp |
| CA2093422C (en) * | 1990-10-05 | 2001-04-03 | DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING LOW CBH I CONTENT CELLULASE COMPOSITIONS | |
| US5328841A (en) * | 1990-10-05 | 1994-07-12 | Genencor International, Inc. | Methods for isolating EG III cellulase component and EG III cellulase in polyethylene glycol using inorganic salt and polyethylene glycol |
| US5102989A (en) * | 1991-03-15 | 1992-04-07 | Merck & Co., Inc. | Method of stabilizing recombinant hepatitis B virus surface proteins from recombinant host cells |
| US5525519A (en) * | 1992-01-07 | 1996-06-11 | Middlesex Sciences, Inc. | Method for isolating biomolecules from a biological sample with linear polymers |
| US6509192B1 (en) * | 1992-02-24 | 2003-01-21 | Coulter International Corp. | Quality control method |
| US6362003B1 (en) | 1992-02-24 | 2002-03-26 | Coulter Corporation | Hematological reference control composition containing leukocyte analogs, methods of making, and uses thereof |
| HRP950097A2 (en) | 1994-03-08 | 1997-06-30 | Merck & Co Inc | Hepatitis a virus culture process |
| KR100254828B1 (ko) * | 1994-12-24 | 2000-05-01 | 성재갑 | 재조합 효모로 부터 발현된 b형 간염 항원의 추출 방법 |
| US5869604A (en) * | 1995-11-09 | 1999-02-09 | Georgia Institute Of Technology | Crystallization and purification of polypeptides |
| UA79735C2 (uk) * | 2000-08-10 | 2007-07-25 | Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. | Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах |
| HUE027196T2 (hu) * | 2002-09-06 | 2016-10-28 | Genentech Inc | Eljárás fehérjeextrakcióra |
| US7777006B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-08-17 | Csl Behring L.L.C. | Method for purification of alpha-1-antitrypsin |
| WO2004081034A2 (en) * | 2003-03-11 | 2004-09-23 | Advanced Biocatalytics Corporation | Altering metabolism in biological processes |
| US8323949B2 (en) * | 2003-03-11 | 2012-12-04 | Advanced Biocatalytics Corporation | Altering metabolism in biological processes |
| EP1664123B2 (en) * | 2003-09-22 | 2011-11-30 | Kamada Ltd. | Large scale preparation of alpha-1 proteinase inhibitor and use thereof |
| CA2548378A1 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-14 | Bharat Biotech International Limited | A process for the preparation and purification of recombinant proteins |
| SE0400886D0 (sv) * | 2004-04-02 | 2004-04-02 | Amersham Biosciences Ab | Process of purification |
| CN1314447C (zh) * | 2004-04-12 | 2007-05-09 | 爱华生物科技(香港)有限公司 | 一种具有抑制蛋白酶作用的药物的制备方法 |
| EP2329843A3 (en) | 2005-04-18 | 2011-09-14 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Expressing Hepatitis B Virus surface antigen for vaccine preparation |
| DK1909830T3 (da) * | 2005-08-02 | 2011-12-19 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Formindskelse af interferens mellem olieholdige adjuvanser og antigener indeholdende overfladeaktivt middel |
| AU2007351548B2 (en) * | 2006-11-01 | 2012-08-16 | Biogen Ma Inc. | Method of isolating biomacromolecules using low pH and divalent cations |
| US11051532B2 (en) | 2017-09-22 | 2021-07-06 | Impossible Foods Inc. | Methods for purifying protein |
| EP3670646A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-06-24 | Ohly GmbH | Functional yeast protein concentrate |
| US12011016B2 (en) | 2020-09-14 | 2024-06-18 | Impossible Foods Inc. | Protein methods and compositions |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
| US3790552A (en) * | 1972-03-16 | 1974-02-05 | Us Health | Method of removing hepatitis-associated antigen from a protein fraction using polyethylene glycol |
| US3994879A (en) * | 1972-12-18 | 1976-11-30 | Hoechst Aktiengesellschaft | Process for the preparation of benzofuran compounds |
| US3951937A (en) * | 1973-12-20 | 1976-04-20 | The Community Blood Council Of Greater New York, Inc. | Large scale purification of hepatitis type B antigen using polyethylene glycol |
| US3994870A (en) * | 1974-01-31 | 1976-11-30 | The Community Blood Council Of Greater New York, Inc. | Purification of hepatitis B surface antigen |
| SE437329B (sv) * | 1975-03-14 | 1985-02-25 | Community Blood Council | Sett att ur blodserum framstella vaccin mot virushepatit |
| NZ180199A (en) * | 1976-03-04 | 1978-11-13 | New Zealand Dev Finance | Method of testing for the presence of elevated plasma liprotein concentration |
| US4113712A (en) * | 1976-03-08 | 1978-09-12 | The Green Cross Corporation | HBsAG Particle composed of single polypeptide subunits and the preparation procedure |
| GB1589581A (en) * | 1976-04-14 | 1981-05-13 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Process for the separation of enzymes |
| US4102996A (en) * | 1977-04-20 | 1978-07-25 | Merck & Co., Inc. | Method of preparing hepatitis B core antigen |
| DE2750045A1 (de) * | 1977-11-09 | 1979-05-10 | Behringwerke Ag | Verfahren zur entfernung von detergentien aus virusantigensuspensionen |
| FR2470795A1 (fr) * | 1979-12-07 | 1981-06-12 | Pasteur Institut | Procede de purification de particules d'origine biologique, notamment de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b (aghbs) et les produits obtenus |
| US4349539A (en) * | 1980-08-15 | 1982-09-14 | Merck & Co., Inc. | Separation of hepatitis B surface antigen |
| US4314997A (en) * | 1980-10-06 | 1982-02-09 | Edward Shanbrom | Purification of plasma protein products |
| JPH0625069B2 (ja) * | 1981-01-29 | 1994-04-06 | ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・リミテッド | Ｂ型肝炎ワクチン製造方法 |
| US4542016A (en) * | 1981-03-27 | 1985-09-17 | Institut Merieux | Non-a non-b hepatitis surface antigen useful for the preparation of vaccines and methods of use |
| US4329471A (en) * | 1981-05-04 | 1982-05-11 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | 4-(4-Phenyl-1-piperidinyl)methyl-5-acyl-1,3-dihydro-2H-imidazol-2-ones |
| PL133476B1 (en) * | 1981-06-10 | 1985-06-29 | Akad Medyczna | Method of obtaining pure antigen hba from human serum |
| US4379087A (en) * | 1982-06-17 | 1983-04-05 | Cutter Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
| AU577259B2 (en) * | 1982-08-13 | 1988-09-22 | Zymogenetics Inc. | Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor |
| IL69202A (en) * | 1982-09-08 | 1991-08-16 | Smith Kline Rit | Surface antigen polypeptides of hbv virus produced in yeast and the preparation thereof |
| SE8205892D0 (sv) * | 1982-10-18 | 1982-10-18 | Bror Morein | Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin |
| JPS59101426A (ja) * | 1982-11-29 | 1984-06-12 | Green Cross Corp:The | Ｂ型肝炎感染予防用ワクチンの製造方法 |
| US4683294A (en) * | 1985-04-03 | 1987-07-28 | Smith Kline Rit, S.A. | Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them |
| US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
-
1985
- 1985-04-03 US US06/719,601 patent/US4683294A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-02-20 AU AU53786/86A patent/AU580494B2/en not_active Ceased
- 1986-02-24 IL IL78824A patent/IL78824A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-03-06 PH PH33485A patent/PH22110A/en unknown
- 1986-03-18 PT PT82219A patent/PT82219B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-03-19 CN CN198686101798A patent/CN86101798A/zh active Pending
- 1986-03-24 FI FI861251A patent/FI85027C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-03-25 YU YU46386A patent/YU46304B/sh unknown
- 1986-03-26 NO NO861234A patent/NO170421C/no unknown
- 1986-03-26 NZ NZ215618A patent/NZ215618A/xx unknown
- 1986-03-27 IE IE82686A patent/IE58854B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-03-31 EG EG164/86A patent/EG17972A/xx active
- 1986-04-01 CS CS862233A patent/CS259537B2/cs unknown
- 1986-04-01 ZA ZA862374A patent/ZA862374B/xx unknown
- 1986-04-01 HU HU861411A patent/HU206125B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-04-01 RO RO122841A patent/RO95349B/ro unknown
- 1986-04-02 ES ES553633A patent/ES8706166A1/es not_active Expired
- 1986-04-02 AT AT86870041T patent/ATE66694T1/de active
- 1986-04-02 SU SU864027296A patent/SU1604144A3/ru active
- 1986-04-02 CA CA000505602A patent/CA1272457A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-02 JP JP61077518A patent/JP2512430B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-02 EP EP86870041A patent/EP0199698B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-02 GR GR860874A patent/GR860874B/el unknown
- 1986-04-02 DE DE8686870041T patent/DE3681058D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-04-02 KR KR1019860002480A patent/KR940010283B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-04-03 AR AR86303954A patent/AR241596A1/es active
- 1986-04-03 PL PL1986258745A patent/PL152568B1/pl unknown
- 1986-04-03 DK DK152286A patent/DK152286A/da not_active Application Discontinuation
-
1987
- 1987-04-27 US US07/042,914 patent/US4857317A/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-09-30 MY MYPI87002368A patent/MY102936A/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI85027C (fi) | Foerfarande foer extrahering av ett protein som utgoers av hepatit b -ytantigen eller alfa-1-antitrypsin ur supernatant och rening av detta protein. | |
| Ghosh et al. | Purification and properties of molecular-weight variants of human placental alkaline phosphatase | |
| US4649192A (en) | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate | |
| US7125552B2 (en) | Method for high yield purification of immune globulins from blood plasma and blood plasma intermediates | |
| JPS60193925A (ja) | 凍結乾燥製剤化ワクチン | |
| US4624918A (en) | Purification process for hepatitis surface antigen and product thereof | |
| JP3771935B2 (ja) | 水溶性血漿タンパク質の純化方法 | |
| EP0155007A2 (en) | Method for purification of HBs antigen | |
| EP0138167B1 (en) | Method for purification of hbs antigen | |
| EP0003916B1 (en) | Purification of pertussis haemagglutinins | |
| KR20080062328A (ko) | ＡｐｏＡ-Ｉ의 정제방법 및 정제된ＡｐｏＡ-Ｉ을 이용한재구축 ＨＤＬ의 생산 방법 | |
| Bartlett et al. | High molecular weight factor V of bovine and human plasma | |
| DE69012903T2 (de) | Verfahren zur herstellung und reinigung von hepatitis b-impfstoff. | |
| JP3747077B2 (ja) | 百日咳菌由来感染防御成分の分離取得方法 | |
| CN118852395A (zh) | 一种人血清中天然α2巨球蛋白高纯抗原的制备方法 | |
| CN118324877A (zh) | 一种基于疏水层析的猪伪狂犬病毒重组gB蛋白的纯化方法及重组gB蛋白 | |
| DD247685A5 (de) | Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Proteinen aus den erzeugenden Kulturmedien | |
| JPH0819159B2 (ja) | 殺菌された抗プラスミン溶液の製造方法 | |
| CS246055B2 (cs) | Způsob isolace enzymu aminoacylasy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: SMITHKLINE BIOLOGICALS S.A. |