FI77985C - Foerfarande foer framstaellning av en fibrinogenprodukt. - Google Patents

Description

77985

Menetelmä fibrinogeenivalmisteen valmistamiseksi.

Keksintö koskee menetelmää kiinteän fibrinogeenivalmisteen valmistamiseksi. Tästä valmisteesta voidaan val-5 mistaa fibrinogeeniliuos, joka sopii ihmis- ja eläinkudosten liimaksi.

Tunnetusti lyofilisoitu fibrinogeeni ja lyofilisaa-tit, jotka on saatu paljon fibrinogeeniä sisältävistä plasmaproteiineista, voidaan liuottaa uudelleen liuoksek-10 si vain hitaasti ja kohotetussa lämpötilassa ja vain vähäisinä konsentraatioina.

Fibrinogeeniä on jo jonkin aikaa käytetty fysiologisena liima-aineena korjattaessa vaurioituneita perus-kudoselimiä, luita tai verisuonia. Tätä tarkoitusta varten 15 on välttämätöntä valmistaa mahdollisimman konsentroitu liuos, koska liimausteho riippuu fibrinogeenikonsentraa-tiosta. Koska fibrinogeenilyofilisaateista pystytään vain vaivoin valmistamaan fibrinogeeniliuoksia, jotka sisältävät riittävästi eli 8-10 % hyytyvää fibrinogeeniä, käytetään 20 kudosten liimauksessa syväjäähdytettyä, fibrinogeenipi-toista ns. kryosaostumaa.

Tähän syväjäähdytetyn kryosaostuman käyttöön liittyy kuitenkin haittoja, koska tällaiset valmisteet ovat pysy-mättömiä ja koska ne on käyttöhetkeen saakka säilytettä-25 vä alle -20°C lämpötilassa.

Siksi olisi erittäin edullista saada käyttöön kiinteä fibrinogeenivalmiste, josta saatava fibrinogeeniliuos sisältää vähintään 7 g/100 ml liuennutta fibrinogeeniä.

Lisäksi tällaista fibrinogeeniliuosta, joka sisältää 30 vähemmän eli n. 2 % fibrinogeeniä, voidaan käyttää laskimon-sisäisenä valmisteena tilanteissa, joissa määrättyjen sairauksien vuoksi potilaalla on akuutti fibrinogeenitarve.

Tähän tarkoitukseen käytetään nykyään fibrinogeenikonsentraat-teja, jotka valmistetaan kryosaostumasta ja jotka lisäksi 35 sisältävät erilaisia plasmaproteiineja. Puhdasta fibrino geeniä ei nykyään käytetä.

2 77985 Käsiteltävänä olevan keksinnön tehtävänä on siis saada aikaan puhtaaseen fibrinogeeniin perustuva valmiste, jota ominaisuuksiensa vuoksi voidaan käyttää sekä fibriiniliimana että myös fibrinogeenikonsentraattina ih-5 misen laskimoon antoa varten ja jonka liukoisuus on hyvä.

Fibrinogeenilyofilisaatti, joka lienee sopiva kudosten liimaukseen, tunnetaan saksalaisesta hakemusjulkaisusta 30 02 934. Tämäkin lyofilisaatti on kryosaostuma, joka siis fibrinogeenin ja tekijän XIII lisäksi sisältää 10 plasminogeeniä, albumiinia ja plasman muita aineosia. Lyo- filisaatin ja rekonstituoidun liuoksen stabiloimiseksi on lisätty plasminogeenin aktivaattori-inhibiittiä. Tämä lyo-filisaatti liukenee huonosti ja vain kohotetussa lämpötilassa (37°C). Rekonstituution jälkeen tuote on huoneenlämpö-15 tilassa pysyvä enintään neljä tuntia.

Nyt on keksitty lyofilisoitu fibrinogeenivalmiste, jota ei tarvitse stabiloida plasminogeenin aktivaattori-inhi-biitillä ja joka ei sisällä albumiinia ja josta huoneenlämpötilassakin voidaan valmistaa suuren konsentraation 20 omaavia fibrinogeeniliuoksia (n. 8 %). Ei ole tarpeen lähteä kryosaostumasta, koska lähtöaineena voidaan käyttää myös puhdasta fibrinogeeniä.

Keksintö perustuu yllättävään havaintoon, jonka mukaan urea- tai guanidinoryhmittymän sisältävien aineiden lisäämi-25 nen parantaa fibrinogeenilyofilisaattien liukoisuutta ja alentaa näistä valmistettujen liuosten työstettävyyden kannalta tärkeää viskositeettia.

Lisäparannuksia voidaan saavuttaa siten, että otetaan talteen lähtötuotteessa olevat fibrinogeenipolymee-30 rit, jolloin lähtöaineksena voidaan käyttää ei vain krvosa-ostumia, vaan myös muita fibrinogeenisaostumia. Niinpä esim. voidaan taloudellisesti hyödyntää kallis kryosaostuma eli kryosaostumasta voidaan F VIII-konsentraatin ohella valmistaa myös fibrinogeenikonsentraatteja.

35 Keksinnön kohteena on siis kiinteä fibrinogeenival miste, joka sisältää urea- tai guanidiinitähteen sisältävää ainetta.

3 77985

Edullisesti lisätään guanidinoyhdistettä. Erityisen sopiva on arginiini. Näitä yhdisteitä lisätään sellainen määrä, että pitoisuus valmisteessa on 0,05 - 5 paino-%.

Valmiste kuivataan ja edullisesti lyof ilisoidaan.

5 Tällaisen fibrinogeenivalmisteen liukoisuutta voidaan edelleen parantaa lisäämällä aminohappoa, jossa on hydrofobinen sivuketju, esim. L-leusiinia, tai vesiliukoista rasvahappoa, esim. voihappoa kummassakin tapauksessa määränä 0,1 - 5 paino-%.

10 Liukenemisnopeutta voidaan parantaa siten, että kiin teän fibrinogeenivalmisteen päällä olevaan kaasutilaan lisätään vähintään 20 tilavuus-% hiilidioksidia. Loput kaasukehästä voidaan muodostua typestä, jostakin muusta inert-tikaasusta tai ilmasta.

15 Valmiste voi lisäksi sisältää albumiinia.

Käytettäessä fibriinilimana voidaan vetolujuuden parantamiseksi kuvatussa rotan ihon vetolujuuskokeessa lisätä vielä ihmisen plasmasta tai istukasta saatua tekijää XIII. Optimaaliseksi on osoittautunut konsentraatio 20 40 - 60 yksikköä tekijää XIII/ml fibrinogeenikonsentraattia.

Fibrinogeenikonsentraatin liuottamisen yhteydessä voidaan lisätä fibrinolyysi-inhibiittoriaesim. aprotiniinia, jolloin liuotetaan fibrinogeenikonsentraattia, jossa on 60 yksikköä tekijää XIII, 1 % albumiinia ja 8 % hyytyvää fib-25 rinogeeniä ja esim. aprotiniiniliuosta, jossa on 1000 kal-likreiini-inhibiittiyksikköä, minkä jälkeen hyydytetään trombiinin ja kalsiumkloridin seoksella. Tällä seoksella haava saadaan sulkeutumaan pitävästi ja aikaansaadaan myös suoja liian nopeata fibrinolyysiä vastaan.

3® Keksinnön kohteena on menetelmä fibrinogeenivalmis teen valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista se, että fib-rinogeeniliuosta, jonka pH-arvo on 5-8, pidetään 0-15°C:n lämpötilassa, kunnes fibrinogeenipolymeerit ovat saostuneet, erotetaan polymeerit, lisätään urea- tai guanadiini-3!5 tähteen sisältävää ainetta ja mahdollisesti aminohappoa, jolla on hydrofobinen sivuketju, tai vesiliukoista rasva- 4 77985 happoa ja mahdollisesti tekijää XIII ja mahdollisesti ap-rotiinia, kuivataan ja peitetään mahdollisesti hiilidioksidia sisältävällä kaasulla.

Keksinnön mukainen kiinteä tibrinogeenivalmiste liu-5 kenee nopeammin ja suurempaan konsentraatioon kuin tunne tut valmisteet. Huoneen lämpötilassa voidaan saada vesi-liuoksia, jotka sisältävät jopa 14 g/100 ml fibrinogeeniä.

Jos liuotetaan esim. 37°C:ssa voidaan saavuttaa vieläkin suurempia konsentraatioita.

1C Koska tällaisten kudosliimana käytettävien fibrino- geeniliuosten liimauslujuus kasvaa fibrinogeenipitoisuu-den kasvaessa, saavutetaan keksinnön mukaisesti valmistetuista konsentraateista saaduilla kudosliimoilla suurempia lujuuksia.

15 Tämä voidaan osoittaa rotan ihon vetolujuuskokeella, jossa nukutetun koe-eläimen ihosta leikataan meistillä pyöreä ihokappale. Tähän ihokappaleeseen levitetään seos, joka muodostuu yhdestä tilavuusosasta trombiiniliuosta (400 NIH-yksikköä/ml) ja ihokappale puristetaan meistin 20 aiheuttamaan haavaan kiinni, annetaan olla paikallaan 15 minuuttia ja määritetään lopuksi irtivetämiseen tarvittava massa.

Taulukko

Liimauslujuudenriippuvuus fibrinogeenikonsentraatiosta 25 rotan ihon vetolujuuskokeessa k0keen

Fibrinogeenikonsentraatio% Irtivetämismassa g, keskiarvo s x Γ2 206 39 8 132 36 30 4 113 51 0(kontrolli) 16 12

Kuvatulla tavalla valmistettujen fibrinogeenikonsentraat-tien lisäetuna on niiden pysyvyys rekonstituution jälkeen.

Koska kryosaostumissa on normaalisti pieniä määriä protrombii-35 nitekijöitä ja plasminogeeniä, kryosaostumaliuosten pysyvyys huoneenlämpötilassa rajoittuu 2-4 tuntiin. Sen sijaan seuraavan esimerkin 2 mukaan valmistetut fibrino-geenikonsentraatit ovat huoneen lämpötilassa pysyviä työpäivän ajan.

5 77985

Seuraavien esimerkkien tehtävänä on selventää keksintöä.

Esimerkki 1

Fibrinogeenikonsentraatin valmistus kryosaostumasta.

5 Sitraattiplasmasta vai mLstettu kryosaostuma liuotettiin 3 7°C :ssa 0,01-m Na-sitraattilluokseen, jonka pH oli 8,5 ja joka sisälsi 1 p/t-% arginiinia. Liukenematta jäänyt aines poistettiin sentrifugoimalla ultrasentrifugissa (Beckman J 21-B, roottori JA 14) 45 minuuttia 15 000 kierr/ 10 min ja hylättiin.

Kun fibrinogeenikonsentraatio oli säädetty n. 5 p/t-%:iksi proteiinin pH pidettiin arvossa 7,0-9,0. Steriilisuodattamisen, säiliöön valuttamisen ja 100 t-%:isel-la hiilidioksidilla huuhtelun jälkeen saatiin lyofilisaatti, 15 josta voitiin huoneenlämpötilassa valmistaa fibrinogeeni- vesiliuoksia, jotka sisälsivät 12 p/t-%:iin saakka fibrino-geeniä.

Esimerkki 2

Fibrinogeenikonsentraatin valmistus fibrinogeenisa- 20 kasta.

Kuusi kiloa 2-m glysiiniliuoksella saostettua fib-rinogeenisakkaa, joka oli saatu sitraattiplasmasta valmistetusta kryosaostumasta, pestiin 35 litralla pH 8,0-pus-kuria (0,15-m NaCl, 0,01-m sitraattia, 1-m glysiiniä) 25 ja supernatantti poistettiin sentrifugoimalla. Jäännös liuotettiin 37°C:ssa 9 litraan liuosta, josssa oli 0,01-m sitraattia ja 0,15-m NaCl ja jonka pH oli 8,0. Seoksen pH-arvon on oltava alle 8. Liuosta seisotettiin yli yön 8-10°C:ssa ja sakka poistettiin sentrifugoimalla 8°C:ssa.

30 Supernatantti dialysoitiin kahdesti puskuria vas taan, jonka pH oli 8 ja jossa oli 0,05-m NaCl, 0,005-m sitraattia, 1 g/100 ml L-arginiinia ja 0,8 g/100 ml L-leusiinia.

Dialyysin jälkeen lisättiin fibriiniliimana käyttöä 25 varten tekijää XIII 60 yksikköä/ml ja ihmisalbumiinia 10 mg/ml.

Claims (2)

1. 6 77985 Liuos steriilisuodatettiin, lyofilisoitiin ja tuote peitettiin seoksella, jossa oli 50 t-% hiilidioksidia ja 50 t-% typpeä. Lyofilisaatit voidaan laskimoon antoa varten liuottaa 5 valmisliuoskonsentraatioon n. 2-3 % fibrinogeeniä. Käytettäessä fibriinillimana liuotetaan vastaavasti pienempään määrään liuotinta,jolloin saavutetaan fibrinogeenikonsent-raatio 8-10 %. 10 Patenttivaatimus:
2. 1. Menetelmä kiinteän fibrinogeenivalmisteen valmis-15 tamiseksi, tunnettu siitä, että fibrinogeeniä sisältävää liuosta, jonka pH on 6 - 8, pidetään 0 - 15°C:n lämpötilassa, kunnes fibrinogeenipolymeerit ovat saostuneet, nämä erotetaan, lisätään urea- tai guanidiinitähteen sisältävää ainetta ja mahdollisesti aminohappoa, jolla on 20 hydrofobinen sivuketju, tai vesiliukoista rasvahappoa ja mahdollisesti tekijää XIII ja mahdollisesti aprotiniinia, kuivataan ja peitetään mahdollisesti hiilidioksidia sisältävällä kaasulla.