DK158282B - Fremgangsmaade til fremstilling af et fast fibrinogenpraeparat - Google Patents

Description

DK 158282 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et fast fibrinogenpræparat.

Det er kendt, at lyofiliseret fibrinogen og lyofili-sater af plasmaproteiner, der indeholder en høj andel af 5 fibrinogen, kun langsomt ved forhøjet temperatur og kun i ringe koncentration igen kan bringes i opløsning.

I nogen tid har man anvendt fibrinogen som fysiologisk klæbestof ved behandlingen af beskadigelser af parenchymatøse organer, knogler og kar. Til denne indikation er det nødvenlo digt at opløse fibrinogenet i højest mulig koncentration, eftersom klæbevirkningen er en funktion af fibrinogenkon-centrationen. Da fibrinogenopløsninger med det påkrævede indhold på 8-10% koagulerbart fibrinogen kun vanskeligt kan fremstilles ud fra fibrinogenlyofilisater, anvender man 15 dybfrosset, fibrinogenholdigt, såkaldt kryopræcipitat til vævsklæbning.

Denne anvendelse af dybfrosset kryopræcipitat er imidlertid behæftet med ulemper, eftersom sådanne præparater er instabile og frem til anvendelsen skal holdes på en tem-20 peratur på under -20°C.

Et fast fibrinogenpræparat, der lader sig opløse til en fibrinogenopløsning med mindst 7 g pr. 100 ml, ville således være af stor fordel.

Endvidere kan en sådan fibrinogenopløsning i en lavere 25 koncentration på ca. 2% fibrinogen anvendes som intravenøst præparat i situationer med akut forbrug af fibrinogen hos patienter med forskellige lidelser. Hertil anvendes der i dag fibrinogenkoncentrater, der fremstilles ud fra kryopræcipitat og yderligere indeholder forskellige plasmaproteiner.

30 Rent fibrinogen anvendes derimod ikke i dag.

Det er således formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe et præparat på basis af rent fibrinogen, hvilket præparat på grund af sine egenskaber kan anvendes såvel som fibrinklæber som fibrinogenkoncentrat 35 til intravenøs indgivelse til mennesker, og som udviser en god opløselighed.

DK 158282 B

2

Et fibrinogenlyofilisat, der skal være egnet som vævsklæbestof, er kendt fra DE offentliggørelsesskrift nr.

3 002 934. Ved dette lyofilisat er der ligeledes tale om et kryopræcipitat, som i overensstemmelse hermed ud over fi-5 brinogen og faktor XIII yderligere indeholder plasminogen, albumin og andre plasmabestanddele. Til stabilisering af lyofilisatet og den rekonstituerede opløsning tilsættes der en plasminogen-aktivator-inhibitor. Dette lyofilisat er dårligt opløseligt og kun ved forhøjet temperatur (37°C).

10 Efter rekonstitution er produktet maksimalt stabilt i 4 timer ved stuetemperatur.

Der er nu blevet tilvejebragt et lyofiliseret fi-brinogenpræparat, der til stabilisering hverken behøver at indeholde en plasminogen-aktivator-inhibitor eller albumin, 15 og som også ved stuetemperatur er egnet til fremstilling af højkoncentrerede fibrinogenopløsninger (ca. 8%). Det er ikke nødvendigt som udgangsprodukt at anvende kryopræcipitat, eftersom også anvendelsen af renfibrinogen som udgangsprodukt er mulig.

20 Dette er muliggjort på basis af den overraskende erkendelse, at man ved tilsætning af stoffer, der indeholder en urinstof- eller guanidino-gruppering, forøger opløseligheden af fibrinogen-lyofilisater, idet den for forarbejdningen betydningsfulde viskositet af derudfra fremstillede 25 opløsninger formindskes.

Disse virlqiinger kan yderligere forbedres ved, at man fraskiller de i udgangsproduktet indeholdte fibrinogen-polymere, således at der ikke kun kan anvendes kryopræcipi-tater som udgangsmateriale, men også andre fibrinogen-fæld-30 ninger. Herved er f.eks. en mere økonomisk udnyttelse af det- dyre kryopræcipitat mulig: således kan der ud fra et kryopræcipitat ved siden af F VIII-koncentrat også fremstilles fibrinogenkoncentrater.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til frem-35 stilling af et fast fibrinogenpræparat, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en fibrinogenholdig opløsning ved

DK 158282 B

3 en pH-værdi på 6 til 8 holdes så længe ved en temperatur på 0-15°C, at de fibrinogen-polymere er udfældet, hvorpå disse fraskilles, hvorefter der tilsættes et urinstof- eller guani-dinrestholdigt stof og eventuelt en aminosyre med hydrofob 5 sidekæde eller en vandopløselig fedtsyre og eventuelt, faktor XIII og aprotinin, og blandingen tørres og opbevares eventuelt under en carbondioxidholdig gas.

Der tilsættes fortrinsvis en guanidinforbindelse. Særlig egnet er arginin. Disse forbindelser tilsættes i en 10 sådan mængde, at deres indhold i præparatet er fra 0,05 til 5 vægtprocent.

Præparatet tørres, idet det fortrinsvis lyolifiseres.

Til yderligere forbedring af opløseligheden af et sådant fibrinogenpræparat kan der til dette sættes en amino-15 syre med hydrofob sidekæde, f,eks. L-leucin, eller en vandopløselig fedtsyre, f.eks. smørsyre, i en mængde på hver gang fra 0,1 til 5 vægtprocent.

En forbedring af opløsningshastigheden kan opnås ved, at gasrummet over det faste fibrinogenpræparat fyldes 20 med mindst 20 rumfangsprocent carbondioxid. Resten af gasatmosfæren kan være nitrogen, en anden indifferent gas eller luft.

Præparatet kan endvidere også tilsættes albumin.

Ved anvendelsen som fibrinklæber kan der desuden til 25 forøgelse af overrivningsstyrken ved det beskrevne rotte-hudsoverrivningsforsøg tilsættes faktor XIII fra humant plasma eller placenta. En koncentration mellem 40 og 60 enheder faktor XIII pr. ml fibrinogenkoncentrat har vist sig at være optimal.

30 Tilsætningen af en fibrinolyse-inhibitor, f.eks.

aprotinin, kan ske ved opløsningen af fibrinogenkoncentratet: et fibrinogenkoncentrat med 60 enheder faktor XIII, 1% albumin og 8% koagulerbart fibrinogen opløses f.eks. sammen med en aprotinin-opløsning med 1000 kallikrein-inhibitor-35 enheder, hvorpå der fremkaldes koagulation med en blanding af thrombin og calciumchlorid. Denne blanding sikrer en

DK 158282 B

4 fast sårlukning og tillige vidtgående beskyttelse mod en for hurtig fibrinolyse.

Det faste fibrinogenpræparat fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opløses hurtigere og i højere 5 koncentrationer end de ifølge den kendte teknik fremstillede fibrinogenpræparater. Der kan fås vandige opløsninger ved stuetemperatur, hvilke opløsninger indeholder op til 14 g fibrinogen pr. 100 ml. Opløses der f.eks. ved 37“C, kan der opnås endnu højere koncentrationer.

10 Eftersom klæbestyrken af sådanne fibrinogenopløs- ninger, når de anvendes som vævsklæbemidler, tiltager med indholdet af fibrinogen, opnås der med vævsklæbemidler ud fra ifølge opfindelsen fremstillede koncentrater højere styrker.

15 Dette kan eftervises ved rottehudsoverrivningsfor- søget: fra huden af et forsøgsdyr i narkose udstanses der et cirkelformet hudstykke. Dette hudstykke bestryges med en blanding af 1 rumfangsdel af den her omhandlede fibrinogen-opløsning og 1 rumgangsdel thrombinopløsning (400 NIH-enheder 20 pr. ml) og presses mod det udstansede sår, efterlades dér i 15 minutter, og derefter bestemmes afrivningsvægten.

DK 158282 B

5

Tabel

Afhængighed mellem klæbestyrken og fibrinogenkoncent rat ionen ved rottehudsoverrivningsforsøget.

5

Afrivningsvægt i gram: middelværdi for 10 forsøg

Fibrinogenkoncen- - s 10 tration % x (standardafgivelse ±) 12 206 39 8 132 36 4 113 51 15 0 (kontrol) 16 12

En yderligere fordel ved de på den beskrevne måde fremstillede fibrinogenkoncentrater er deres stabilitet 20 efter rekonstitution. Da der i kryopræcipitater normalt er tilblandinger af prothrombinfaktorer og plasminogen til stede, er stabiliteten af kryopræcipitatopløsninger ved stuetemperatur begrænset til 2 til 4 timer. Fibrinogenkoncentrater, der er fremstillet ifølge det efterstående eksem-25 pel 2, er derimod stabil over én arbejdsdag ved stuetemperatur.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen.

30 Eksempel 1

Fremstilling af fibrinoaenkoncentrat ud fra krvopræcipitat Et kryopræcipitat af citratplasma opløses i en 0,01 M Na-citratopløsning med en pH-værdi på 8,5 indeholdende 1% 35 (vægt/rumfang) arginin ved 37°C. Den ikke opløste andel fraskilles ved centrifugering i en ultracentrifuge (Beckman

DK 158282 B

6 J 21-B, Rotor JA 14) i 45 minutter og ved 15.000 o/min. og kasseres.

Efter indstilling af fibrinogenkoncentrationen på ca. 5% (vaegt/rumfang) protein holdes pH-værdien mellem 7,0 5 og 9,0. Efter sterilfiltrering, påfyldning og skylning af beholderen med 100 rumfangsprocent carbondioxid fås der et lyofilisat, ud fra hvilket der ved stuetemperatur kan fremstilles vandige fibrinogenopløsninger med op til 12% (vægt/-rumfang) fibrinogen.

10

Eksempel 2

Fremstilling af et fibrinogenkoncentrat ud fra en fibrinoqen-faldning 15 6 kg af et ud fra et kryopræcipitat af citratplasma ved hjælp af en 2 M glycinopløsning fældet fibrinogeribundfald vaskes med 35 liter puffer (0,15 M NaCl, 0,01 M citrat, 1 M glycin) med pH-værdi 8,0, og den ovenstående væske skilles fra ved centrifugering. Remanensen opløses i 9 liter 0,01 M 20 citrat og 0,15 M NaCl med pH-værdi 8,0 ved 37°C. pH-Værdien skal ligge under 8. Opløsningen henstilles natten over ved fra 8 til 10"C, og bundfaldet skilles fra ved centrifugering ved 8eC.

Den ovenstående væske dialyseres to gange mod en 25 puffer med pH-værdi på 8, der består af 0,05 M NaCl, 0,005 M citrat, 1 g L-arginin pr. 100 ml og 0,8 g L-leucin pr.

100 ml.

Efter dialysen tilsættes der ved anvendelse som fi-brinklæber 60 enheder faktor XIII pr. ml og 10 mg humant 30 albumin pr. ml.

Opløsningen sterilfiltreres og lyofiliseres, og produktet overlejres med en blanding af 50 rumfangsprocent carbondioxid og 50 rumfangsprocent nitrogen.

Lyofilisateme kan til intravenøs anvendelse opløses 35 til påfyldningskoncentrationen på ca. 2 til ca. 3% fibrinogen. Til anvendelse som fibrinklæber opløses der i tilsva-

DK 158282 B

7 rende mindre opløsningsmiddel, således at der opnås koncentrationer på mellem 8 og 10% fibrinogen.

Claims (1)

1. DK 158282B PATENTKRAV. Fremgangsmåde til fremstilling af et fast fibrinogen-præparat, kendetegnet ved, at en fibrinogenholdig opløsning ved en pH-værdi på 6 til 8 holdes så længe ved en 5 temperatur på 0-15'C. at de fibrinogen-polymere er udfældet, hvorpå disse fraskilles, hvorefter der tilsættes et urinstofeller guanidinrestholdigt stof og eventuelt en aminosyre med hydrofob sidekæde eller en vandopløselig fedtsyre og eventuelt faktor XIII og aprotinin, og blandingen tørres og 10 opbevares eventuelt under en carbondioxidholdig gas.