FI71323C - Foerfarande foer framstaellning av vaermestabila e.coli enterotoxinderivat - Google Patents

Description

1 71323

Menetelmä E.coli'n lämmönkestävien enterotoksiini-johdannaisten valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää uusien immunogeenis-ten E. coli'n lämmönkestävien enterotoksiinijohdannaisten valmistamiseksi sekä profylaktisia ripuli-lääkkeitä, jotka sisältävät näitä immunogeenisiä E. coli'n lämmönkestäviä enterotoksiinijohdannaisia annettavaksi ihmiselle ja eläimille.

Tiedetään, että Escherichia coli-kannat voivat aiheuttaa ripulisairauksia ihmisissä ja eläimissä ja eri tutkimuksissa (esim. Gyles & Barnum, J.Infect.Dis 120, 419-426, 1969) on todettu, että E.coli-kannan entero-patogeenisuus on suhteessa enterotoksiinin tuotantoon.

On kuvattu kaksi eri enterotoksiinia: Lämpölabiili (LT) enterotoksiini ja lämmönkestävä (ST) enterotoksiini, ja Smith & Gyles (J.Med.Microbiol. 3, 387-401, 1970) ovat luokitelleet eri eläinlähteestä peräisin olevia tiettyjä enteropatogeenisia E.coli-kantoja sellaisiin, jotka tuottavat joko LT- tai ST-enterotoksii-nia tai ainoastaan ST-enterotoksiinia. Ihmisestä peräisin olevia ST-tuottavia E.coli-kantoja on myös useasti kuvattu ja esitetty (esim. R.A. Gianella, Infect.Immun. 14, 95-99, 1976). Lämpölabiili enterotoksiini on geneettisen kontrollin alaisena periytyvän plasmidin kautta; ja se näyttää koostuvan ryhmästä toisiinsa sidottuja peptidejä, jolla on molekyylipaino noin 24 000. LT-enterotoksiini absorboituu ohutsuolen epiteelisolujen nukkalisäkealueella gangliosideihin, jossa se entsy-maattisen reaktiosarjän välityksellä aiheuttaa veden ja kloridien liikaeritystä suoleen ja estää natriumin uudelleen absorboitumista siten, että suoli pullistuu 2 71323 nesteen vaikutuksesta, joka johtaa suolen liikaliikku-vuuteen ja ripuliin. LT-enterotoksiini on antigeeninen ja se stimuloi neutralisoivia seerumin vasta-aineita ihmisillä tai eläimillä, jotka ovat aikaisemmin saaneet infektion toksiinia tuottavista E.coli-kannoista. Läm-mönkestävä enterotoksiini on geneettisen kontrollin alaisena heterogeenisen plasmidiryhmän kautta; ja se aiheuttaa myös ripulia, ehkä stimuloimalla guanidiini-syklaasia (J.M. Hughes et.ai., Nature 271, 766-767, 1978). Smith & Gyles (loc.cit.) päätyivät siihen, ettei ST ole antigeeninen, koska LT:tä ja ST:tä tuottavia organismeja vastaan tuotettu antiseerumi neutralisoi LT:n muttei ST:tä ja antiseerumi, joka valmistettiin vastaavalla tavalla ST:tä vastaan ei osoittanut neutralisoivaa vaikutusta ST:tä tai LT:tä kohtaan. Julkaisussa "Purification and Chemical Characterization of the Heat-Stable Enterotoxin Produced by Porcine Strains of Enterotoxygenic Escherichia coli" (Infect.Immun 19, 1021-1030, 1978) ovat J.F. Alderete & D.C. Robertson esittäneet, että puhdistetulla ST:llä "on molekyylipai-no 4400, määritettynä sekä natriumdodekyylisulfaatti-geelielektroforeesilla ja -geelisuodatuksella" ja, että "aminohappo-analyysin perusteella saatiin molekyylipai-noksi 5100 vastaten 47 jäännöstä"; kirjoittajat esittävät myös, että "ST:llä tai naudan seerumialbumiiniin kytketyllä ST:llä immunoiduista kaneista saatu antiseerumi neutralisoi enterotoksiinin vaikutuksen imeväisillä hiirillä, kuitenkin passiivinen hemagglutinaatio- ja hemolyysi-tiitteri viittasi siihen, että ST on huono antigeeni". Muiden tutkijoiden suorittamat ST:n mole-kyylipainomääritykset ovat antaneet eriäviä ja pienempiä arvoja (esim. 1000-1200, 1500-2000 ja 2500 daltonia, kuten ilmenee julkaisussa American Society of Microbiology Meeting, 1973 abstract M168, 1979 abstract B34 ja 1979 abstract P29, E.V. Lee et.al., R. Lallier et.al.

II

3 71323 ja G.L. Madsen et.ai.) näiden arvojen eriävyyden johtuessa mahdollisesti ST:n valmistusmenetelmistä, eristämis- ja puhdistusvaiheista kuten myös erilaisista entsymaattisista tapahtumista enterotoksiinin poistuessa solusta.

Vastikään tehdyissä tutkimuksissa (R.A. Kapitany et.ai.. Infect.Immun. 26, 173-177, 1979) selvitellään ST:n heterogeenisyyttä, mutta R.A. Kapitany et.ai. toteamat eri ST:n tyypit, perustuen aminohappokoostumukseen, lämmönkestävyysominaisuuksiin ja biologiseen aktiivisuuteen, ei vaikuta esillä olevaan keksintöön, jota voidaan soveltaa kuhunkin eri aminohappokoostumuksen omaavaan ST-enterotoksiiniin.

Tutkijat ovat käyttäneet monia eri väliaineita ja inku-bointimenetelmiä ST:tä tuottavien eri E.coli-kantojen kasvatuksessa. Esimerkkejä tällaisista väliaineista ovat F.G. Evans'in et.ai. (Infect.Immun. 8, 731-735, 1973) esittämä monimutkainen väliaine ja J.F. Alderete'n et.ai. (Infect.Immun. 15, 781-788, 1977) esittämä minimi vaatimusväliaine sekä näiden modifikaatiot.

Seuraavissa esimerkeissä valmistetaan ST-enterotoksii-nia sian-E.coli-kannasta K12, joka on 13.03.1980 deponoitu laitokseen American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA) deponointitunnuksella ATCC 31621.

E.coli-kanta ATCC 31621 on tunnetusta E.coli-kannasta K12 johdettu mutanttikanta, joka kanta K12 on vuonna 1922 eristetty kurkkumädästä toipuvan potilaan ulosteesta ja jota kantaa käytetään yleisesti bakteerigenetiikan ja molekyylibiologian perustutkimuksessa (B.J. Bachmann, Bacteriol.Rev. 36,4,525, 1972). E.coli K12 on sauvan-muotoinen gramnegatiivinen bakteeri, jonka pituus on 4 71323 noin 2 mikronia ja poikkileikkaus noin 1 mikroni.

Kanta kasvaa parhaiten 37°C:ssa, mutta kasvua tapahtuu myös niin alhaisissa lämpötiloissa kuin 20°C. E.coli K12 on ei-kapseloitunut liikkuva bakteeri, jolla on O :K (?):H48 serotyyppi; ja sillä on hyvin spesifinen herkkyys lambda-faagia kohtaan.

E.coli-kannalla ATCC 31621 on yllä esitetyt K12 kannan tyypilliset ominaisuudet, ja sillä on tämän lisäksi fenyylialaniinin, tryptofaanin, histidiinin ja proliinin auksotroofinen tarve, eikä se fermentoi laktoosia, todennäköisesti lac y mutaation vuoksi (se muodostaa valkoisia pesäkkeitä McConcey'n laktoosiväliaineella). E.coli ATCC 31621:llä on rekombinoitu plasmidi, jossa g on 2,1*10 daltonin DNA-fragmentti, joka on saatu suorittamalla plasmidi-DNA:n rajoitettu endonukleaasi-pilkkominen, joka plasmidi-DNA on saatu sian patogeenisestä E.coli-kannasta, ja joka käsittää geenin, joka sisältää koodin lämmönkestävän enterotoksiinin synteesiä varten. Kanta on resistentti kloramfenikolille (25 ^ug/ml).

Kuten yllä mainittiin, keksintö ei rajoitu E.coli-kannan ATCC 31621 käyttöön tai seuraavassa esitettävään fermen-tointimenetelmään, koska mainittu kanta ja fermentointi-olosuhteet ovat vain esimerkkejä ST-enterotoksiinin valmistamisesta .

Keksinnön mukaan saadaan aikaan menetelmä ST-enterotok-siinijohdannaisten valmistamiseksi, jossa menetelmässä annetaan ST-enterotoksiinin reagoida kaksifunktionaali-sen proteiinien ristisidosaineen kanssa, ja näin saadut ST-enterotoksiinijohdannaiset ovat täten inter- ja intramolekyläärisesti ristisidottuja enterotoksiineja, joilla on huomattavasti suurempi molekyylipaino kuin itse ST-enterotoksiinilla.

5 71323

Keksinnön mukaisessa menetelmässä ST-enterotoksiinin annetaan reagoida myrkyttömän kaksifunktionaalisen proteiinien ristisidosaineen kanssa, joka vaikuttaa joko homofunktionaalisena reagenssina tai heterofunktionaa-lisena reagenssina ristisidotun ST-enterotoksiinin saamiseksi. Esimerkkejä bifunktionaalisista proteiineja ristisitovista aineista, jotka vaikuttavat homofunktio-naalisina reagensseina ovat; dialdehydit, diketonit, karbodi-imidit, di-isosyanaatit, di-isotiosyanaatit, aryylidiatsidit, asyylidiatsidit, aryyli (aktivoitu)-difluoridit, aryylidisulfonyyli(aktivoitu)-kloridit tai -bromidit, dikarboksyylihappo(aktivoitu)-atsidit, kloridit tai esterit, di-a-halogeeniketonit, polymety-leeni (n=3-12)-di-imidihappoesterit, bis-(maleidimetyy-li)-eetterit, gem-bis-diatsoasetyylialkanit, bis-diatsoareenit ja N,N'-aryleenidimaleiinihappoimidit, ja esimerkkejä heterofunktionaalisista reagensseista on sellaiset reagenssit, joilla on kaksi erilaista mutta yhteensopivaa yllä mainittua funktionaalista ryhmää, erikoisesti isosyanaatti- ja isotiosyanaattiaree-nit, (aktivoitu)fluori- ja atsidoareenit, (aktivoitu) atsido- ja fluoriareenit, (aktivoitu) atsido-aryyli-a-halogeenialkyyliketonit, kloori- tai bromiasetimidihap-pojen alemmat alkyyliesterit, kloorimuurahaishapon alemmat alkyyliesterit ja epihalogeenihydriinit.

Selityksessä mainitut proteiinien kaksifunktionaaliset ristisidosaineet ovat tunnettuja yhdisteitä. Esimerkiksi julkaisussa "Advances in Experimental Medicine and Biology, Rosa Uy & Finn Wold, 9, ed. Mendel Friedman, Plenum Press, New York, on otsikolla "Protein Crosslinking (Biochemical and molecular Aspects)", esitetty katsaus proteiinien keinotekoisista ristisi-doksista.

Näistä eri ristisidosaineista käytetään käytännön syistä yleisimmin homofunktionaalisia reagensseja kuten glutaa- 6 71323 rialdehydia, difluoridinitrobentseeniä, isosyanaatti-ja isotiosyanaattiyhdisteitä, karbodi-imidejä ja di-imidihappoestereitä.

Keksintö koskee täten menetelmää E.coli ST-enterotok-siinijohdannaisten valmistamiseksi, jossa menetelmässä annetaan ST-enterotoksiinin reagoida proteiini-risti-sidosaineen kanssa.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä lähtöaineena käytettävä ST-enterotoksiini saadaan jostakin E.coli ST-enterotoksiinia tuottavasta kannasta.

Muodostuva ST-enterotoksiini, joka saadaan viljelmän yllä sijaitsevasta nesteestä, tavallisesti uutetaan ja puhdistetaan osan epäpuhtauksien poistamiseksi, esim. ultrasuodattamalla, geelisuodatuskromatografiällä, ioninvaihtokromatografiällä, uuttamalla etanolilla tai polyakryyliamidigeelikiekkoelektroforeesilla. Julkaisussa "Infect.Immun. 25, 978-985, 1979, Y. Takeda et.ai." käsitellään joitakin näistä menetelmistä.

ST-enterotoksiinin ollessa varsin lämmönkestävä voidaan keksinnön mukainen menetelmä suorittaa laajalla lämpötila-alueella, käytännössä on edullista työskennellä lämpötilassa, joka on alle 37°C ja erityisesti huone-lämpötilassa eli 20-25°C.

Reaktio suoritetaan vesi- ja edullisesti puskuroidussa väliaineessa, pH-arvon riippuessa ristisidosaineen ominaisuuksista. Esimerkiksi kun on kysymys dialdehydeis-ta tai diketoneista ei pH-arvolla ole oleellista merkitystä, sen ollessa välillä noin 4-8, edullisesti noin 5, jolloin vältetään hyvin alhaisten pH-arvojen käyttämistä, aldehydien mahdollisen itsekondensoitumisen välttämiseksi. Karbodi-imidi ja isosyanaatti ristisidosaineille 7 71323 on myös pH-arvo noin 5 sovelias mutta epihalogeeni-hydriinille sopii lievästi emäksinen pH-arvo (esim. noin 8).

Kun dialdehydia tai diketonia käytetään väliaineessa pienenä pitoisuutena esiintyvän ST-enterotoksiinin ristisitomiseen, voidaan ristisidosreaktiota parantaa saostamalla ST saostusmenetelmin, esim. lisäämällä nat-riumsulfaattia ennen ristisidosreagenssia.

Saadun ST-enterotoksiinijohdannaisen liukoisuus riippuu mahdollisista erilaisista ristisidosasteista.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuista ST-enterotoksiini johdannaisista voidaan valmistaa farmaseuttisia tai eläinlääketieteeseen tarkoitettuja preparaatteja lihaksensisäistä tai suun kautta tapahtuvaa antoa varten lisäämällä sopivaa kantajaa tällaiseen preparaattiin. Sopivia kantajia ovat isotoniset suolaliuokset tai puskuriliuokset ja muut tunnetut aineet.

Riippuen ST-enterotoksiinijohdannaisen liukoisuudesta veteen voi annettava farmaseuttinen tai eläinlääketieteellinen preparaatti olla joko liuoksen tai suspension muodossa, voidaan myös lisätä adjuvanttia kuten Freundin täydellinen adjuvantti (eläinlääketieteessä), alumiinihydroksidia tai vastaavaa, käytännössä preparaattia säilytetään pakkaskuivattuna ja liuos (suspensio) valmistetaan tarvittaessa, esim. lisäämällä Freundin täydellistä adjuvanttia. Yksikköannos keksinnön mukaista ST-enterotoksiini johdannaista sisältää esim. 0,1 mg ristisidottua ST/kg ruumiinpainoa.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja ST-enterotoksiini johdannaisia voidaan myös käyttää muihin tarkoituksiin kuten immuunimäärityksissä käyttökelpoisten anti-ST-antiseerumien valmistamiseen.

β 71323 Lähtöaineena käytettävän ST-enterotoksiinin tuottaminen .

E.coli-kanta ATCC 31621 rehydratoitiin steriilillä vedellä ja inkuboitiin 18 tunnin ajan 37°C:ssa petrimaljoilla, joka kukin sisälsi 20 ml selektiivistä LB-agari kiintoväliainetta (valmistaa Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA), joihin oli lisätty 25 ^ug kloramfenikolia/ml ja joita oli edeltä lämmitetty 45 minuutin ajan 115°C:ssa.

Nestemäinen ravintoväliaine (merkitään PP3) valmistettiin liuottamalla "Proteose-peptone n:o 3" (30 g) (valmistaa Difco Laboratories), hiivauutetta (4 g) ja dekstroosia (5 g) litraan vettä 60°C:ssa. Jäähdyttämisen jälkeen lisättiin 5 g NaCl, 5,05 g Na2HP04 ja 1,2 g KE^PO^. Väliaine, jonka pH-arvo oli 6,9-7,0, suodatettiin Seitz EKS suodattimena, ja jaettiin 30 ml:n annoksina viljelypulloihin.

Näihin viljelypulloihin siirrostettiin petrimaljoilta saatuja tasaisia pesäkkeitä, lisäten neljä pesäkettä 30 ml nestemäistä väliainetta kohti, ja inkuboitiin 37QC:ssa ravistelemalla samalla ravisteluhyllyissä (20-30 ravis-telua/minuutti).

Tämän jälkeen suoritettiin toinen kasvatus (16 tunnin ajan) 800 ml:ssa PP3 väliainetta 6 litran kartiokol-vissa käyttäen siirrosteena 5 % (til./til.) ensimmäisen kasvatuksen siirrostemateriaalia.

Saatua esiviljelmää käytettiin siirrostemateriaalina (5 % til./til.) tuotantovaiheessa, joka suoritettiin 80 1 modifioitua Alderete-väliainetta (8,71 g I^HPO^ 2,35 g NaCl, 1,0 g NH4C1, 1,8 g trisiiniä, 50 mg MgS04, 7H20, 4,95 mg MnCl2, 4h20 ja 4,9 mg FeCl^ litrassa vettä) sisältävässä fermentointisäiliössä, joka väliaine steriloitiin kuumentamalla 121°C:ssa 30 minuutin ajan, jonka jälkeen siihen lisättiin 1,42 g L-proliinia, 0,87 g L-asparagiinihappoa, 0,39 g L-alaniinia, 0,69 g 71 323 9 L-seriinia, 0,05 g L-fenyylialaniinia, 0,05 g L-histi-diiniä, 0,05 g L-tryptofaania ja 5 g Kasaminohappoja (tuote, jota valmistaa Difco Laboratories, Detroit 1, Michigan, USA) yhtä litraa kohti lopullista liuosta, jolloin aminohappoainekset valmistettiin erikseen 10-kertaisesti konsentroituna liuoksena, jonka pH-arvo oli 7,5 ja joka steriloitiin 121°C:ssa 30 minuutin ajan, ennen niiden lisäämistä yllä mainittuun liuokseen.

Tuotantoväliainetta inkuboitiin aerobisesti sekoittaen 36°C:ssa 10-15 tunnin ajan, eli kunnes pH saavutti arvon 8,2-8,4 ja kun hapenkulutus läheni O-pistettä.

Tuotantovaiheen lopulla kasvatusliuoksen lämpötila laskettiin 3°C:een 30 minuutin ajaksi ja sentrifugoitiin (6000 g), ja supernatanttiliuos suodatettiin Seitz EKS1 suodattimena.

ST-enterotoksiini väkevöitiin ja puhdistettiin seuraavan kolmen vaiheen mukaan:

Ensimmäisessä vaiheessa väkevöitiin 40 1 suodatettua fermenttiväliainetta tilavuuteen 5 1 suodattamalla "Pellicon PTAC-membraanilla", jonka pidätyskyky on 1000 (Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, USA, selluloosan sekaestereille tarkoitettu ultrasuodatus-membraani), jonka jälkeen suoritettiin dialysointi käyttäen samaa Pellicon PTAC-membraania, kunnes sähkönjohtavuus oli laskenut arvoon 500 ^uSiemens. Saatua fraktiota väkevöitiin vielä tilavuuteen 1 litra ja lyo-filisoitiin. Pakkaskuivattua tuotetta merkittiin ST-MP.

Toisessa vaiheessa liuotettiin 3 g ST-MP:tä 150 ml:aan vettä, ja liuosta jäähdytettiin lämpötilaan 0-4°C. Lisättiin tipoittain kylmää asetonia (1,5 1) samalla sekoittaen, ja sekoittamista jatkettiin 30 minuuttia 10 71 323 asetonin lisäämisen jälkeen. Seos sentrifugoitiin (3000 g), ja supernatantti väkevöitiin alennetussa paineessa tilavuuteen 30 ml, johon lisättiin 180 ml seosta, joka sisälsi meta-nolia ja kloroformia 2:1 (til./til.). Voimakkaan sekoittamisen jälkeen lisättiin 42 ml vettä, ja ylin kerros otettiin talteen, haihdutettiin kuiviin alennetussa paineessa ja pakkaskuivattiin. Pakkaskuivattua tuotetta merkittiin ST-ACF-D.

Kolmannessa vaiheessa liuotettiin 200 ml ST-ACF-D:tä 2 mlraan vettä ja asetettiin jäähdytetyn kolonnin (2,5.30 cm) yläpäähän, joka kolonni sisälsi 50 g "Servachrom-8:aa" (Serva GmbH & Co., Heidelberg, Saksan liittotasavalta, kromatografista laatua oleva polyakryylimetyyliesteri), ja joka oli tasapainotettu vedellä. Eluointi suoritettiin vedellä. Ensimmäisen fraktion eluoinnin jälkeen eluointia jatkettiin metanoli/vedellä (6:4) (til./til.) ST:tä sisältävän fraktion saamiseksi. ST eristettiin liuottimen haihduttamisella, ja saatua jäännöstä merkitään ST-PAE.

ST-PAE:llä on alkuperäisen tuotteen aktiivisuuteen verrattuna puhdistuskerroin 1000-4000, ja sen spesifinen aktiivisuus vaihtelee välillä 5,5-15 ng erästä riippuen.

Saatujen fraktioiden biologinen aktiivisuus määritettiin hiirenpoikasille suoritetuin kokein, (A.G. Dean, J. Infect. Dis. 125, 407-411, 1972). 48-72 tuntia vanhoihin hiirenpoi- kasiin siirrostettiin ruoansulatuskanavan sisään 0,025 ml toksiiniliuosta ja nesteen kerääntyminen suoleen mitattiin kahden tunnin kuluttua. Suhde suolenpaino/elopaino antaa toksiinin biologisen aktiivisuuden. Positiivisina pidetään arvoja, jotka ovat suurempia tai yhtä suuria kuin 0,09. ST-fraktion spesifinen aktiivisuus ilmaistaan määränä ST:tä (ng lyofilisoitua tuotetta), joka antaa suolenpaino/elopaino-arvon 0,100 hiirenpoikasille tehdyissä määrityksissä.

n 71323

Esimerkki X

10 mg ST-PAE:ta liuotettiin 0,25 mitään asetaattipus-kuria (pH 5,1) ja saostettiin tästä lisäämällä 36 %:sta (paino/til.) natriumsulfaattiliuosta samassa puskurissa. Lisättiin vesipitoista glutaarialdehydiä (20 ^,ul 25 %:sta liuosta til./til.), ja reaktion annettiin jatkua 2 tunnin ajan huonelämpötilassa. Tämän reaktio-ajan jälkeen poistettiin ylimääräinen reagenssi sentri-fugoimalla ja pesemällä vedellä, ja sakka pakkaskuivat-tiin.

Pakkaskuivattu tuote koostuu immunogeenisestä risti-sidotusta STtstä, jolla on suurempi molekyylipaino kuin modifioimattomalla lähtöaineena käytetyllä ST:llä, joka molekyylipaino määritettiin geelikromatografialla "Sephadex G-100"-kolonnilla (valmistaa Pharmacia, Uppsala, Ruotsi).

Molekyylipainon kasvun osoittamiseksi liuotettiin pak-kaskuivattua tuotetta osittain veteen lisäämällä 1 ml vettä ja seosta sekoitettiin huonelämpötilassa 2 tunnin ajan. Liuennut fraktio edustaa 30-50 % liukenemattomasta fraktiosta ja sillä on päähuippu 10 000 kohdalla samalla kun lähtöaine ST-PAE:llä on päähuippu 4000 kohdalla (huippu Vt:n jälkeen "Sephadex G-l00"lla, Vt on pakatun kolonnin tilavuus).

Esimerkki 2 20 mg ST-PAE:tä liuotettiin 1 ml:aan vettä ja lisättiin liuos, joka sisälsi 200 mg l-etyyli-3(3-dimetyyliamino-propyyli)-karbodi-imidihydrokloridia. Seoksen annettiin seistä 25°C:ssa 12 tunnin ajan, jona aikana tapahtuu ristisidosreaktio. Liukeneva reaktiotuote dialy-soitiin "PM-10 Amicon"-membraanilla (ultrasuodatus-membraani, valmistaa Amicon Corporation, Lexington, Massachusetts, USA) reagoimattoman ST:n poistamiseksi, ja kalvon pidättämä fraktio (13 mg) pakkaskuivattiin.

12 71323 Tämän ristisidotun ST:n molekyylipaino oli noin 10 000 (lähtöaineen molekyylipaino 2000), määritettynä esimerkissä 2 esitetyllä tavalla "Sephadex G-100"-geelikroma-tografialla. Tämän ristisidotun ST:n absorptiospektri oli myös erilainen kuin lähtöaineena käytetyn ST-PAE:n absorptiospektri.

Esimerkki 3 5 mg ST-PAE liuotettiin 0,5 ml:aan 0,1M boraattipusku-ria (Na2B407/Na0H), pH 8,0, ja lisättiin 100 ^ul 0,02 M difluoridinitrobentseeniä etanolissa. Ristisidosreaktion annettiin jatkua 4 tunnin ajan samalla sekoittaen huone-lämpötilassa. Tämän reaktioajan jälkeen poistetaan reagoimaton ST dialysoimalla "Spectrapor" dialyysiputken läpi (valmistaa Spectrum Medical Industries, New York, USA), jonka pidätyskyky on 14 OOO.

Geelikromatografiällä "Sephadex G-100":11a (kuten esimerkissä 2 on esitetty) saatiin tämän liukenevan risti-sidotun ST:n molekyylipainoksi 50 000 (lähtöaine-ST-PAE:n molekyylipaino oli 2000). Tämän ristisidotun ST:n absorptiospektrissä oli lisäksi ylimääräinen huippu 350 nm kohdalla verrattuna lähtöaine-ST-PAE:hen.

Preparaatin valmistus kokeita 1, 2, 3 ja 4 varten. Esimerkin 2 lopulla saatua pakkaskuivattua ST-entero-toksiinijohdannaista suspendoitiin 0,5 litraan fysiologista suolaliuosta ja 0,5 litraan Freundin täydellistä adjuvanttia, ja seos jaettiin lasipulloihin, joissa jokaisessa oli tehokas annos ristisidottua ST-enterotok-siinia eläinlääketieteelliseen käyttöön. Pullot suljettiin tämän jälkeen tiiviisti ja säilytettiin 4°C:ssa.

,3 71 323

Koe 1

Koetta varten valmistettua preparaattia annettiin ihonalaisesti kolmelle kanille (A, B ja C), yksikköannoksen ollessa 0,1 mg eläintä kohti ja samanlainen ihonalainen anto toistettiin 21 päivän kuluttua. Verikokeita (eli antiseerumi) otettiin 28. päivänä ensimmäisen antamisen jälkeen.

Määritettiin miten tehokkaasti immunisoitujen kanien seerumit neutralisoivat (in vivo, 2 tuntia lämpötilassa 37°C) ennalta määrätyn määrän ST:tä soveltamalla mainittua A.G. Deanin hiiren-poikaskoetta. Kontrollina käytettiin joko suolaliuosta sisältävää fosfaattipuskuria tai normaalia seerumia antiseerumin sijasta.

Seroneutralisaatio-kokeiden tulokset on esitetty taulukossa I, jossa - PBS tarkoittaa puskuriliuosta, joka sisältää 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g , 0,2 g KI^PO^ 800 ml:ssa tislattua vettä, johon on sekoitettu liuos, joka sisältää 100 mg MgC^ 100 mlrssa tislattua vettä ja tämän jälkeen liuos, joka sisältää 0,1 g CaCl2 100 mltssa tislattua vettä.

- gw/bw-arvot, jotka ovat alle 0,09 osoittavat, että ST-neut-ralisointia on tapahtunut.

- jokainen gw/bw-arvo on kolmen määrityksen keskiarvo, ja kukin arvo gw/bw edustaa kolmen hiirenpoikasen ryhmää.

71 323 14 - ST:n tilavuudet viittaavat ST-liuokseen, joka sisältää 1,4 ^ug ST-ACF-D-laadun toksiinia/ml.

Taulukko I

Imnunisointikaavio Antiseerumin gw/bw laimennus

Kontrolli 0,5 ml ST + 0,5 ml PBS - 0,102

Kaniini A

0,5 ml ST + 0,5 ml 1/16 0,064 antiseerumi 1/32 0,087 1/128 0,097

Kaniini B

0,5 ml ST + 0,5 ml 1/4 0,059 antiseerumi 1/8 0,100

Kaniini C

0,5 ml ST + 0,5 ml 1/8 0,098 antiseerumi 1/16 0,098

Tulokset osoittavat ristisidotun ST:n inununogeenisyyden.

Koe 2

Koetta varten valmistettua preparaattia, joka sisälsi esimerkin 3 mukaan valmistettua toksiinia (liukenevan fraktion molekyylipaino yli 10 000) annettiin ihonalaisesti kolmelle kanille (K, L ja M) yksikköannoksen ollessa 0,1 mg eläintä kohti ja samanlainen ihonalainen antaminen toistettiin 21 päivän kuluttua. Verikokeita (eli antiseerumi) otettiin 28 päivänä ensimmäisen antamisen jälkeen, ja suoritettiin esimerkissä 7 esitetyt sero-neutralisointikokeet, mutta käyttämällä normaaliseerumia PSB:n sijasta.

Tulokset on esitetty taulukossa II, jossa ilmenee risti-sidotun ST:n immunogeenisyys yhdessä eläimessä kolmesta.

15 71323

Taulukko II

Immunisointikaavio Antiseerumin gw/bw laimennus

Kontrolli 0,5 ml ST + 0,5 ml - 0,129 seerumi

Kaniini L

0,5 ml ST + 0,5 ml 1/1 0,060 antiseerumi

Kaniini K

0,5 ml ST + 0,5 ml 1/1 0,100 antiseerumi

Kaniini M

0,5 ml ST + 0,5 ml 1/1 0,111 antiseerumi

Koe 3

Koetta varten valmistettua preparaattia, joka sisälsi esimerkin 4 mukaan valmistettua toksiinia (liukenevan fraktion molekyylipaino yli 14 000) annettiin kolmelle kanille (H, I ja J) yksikköannoksen ollessa 0,5 mg eläintä kohti, ja samanlainen ihonalainen antaminen toistettiin 21 päivän kuluttua. Verikokeita (eli anti-seerumi) otettiin 28 päivänä ensimmäisen antamisen jälkeen, ja suoritettiin esimerkissä 7 esitetyt sero-neutralisointikokeet.

Tulokset on esitetty taulukossa III, joka osoittaa risti-sidotun ST:n immunogeenisyyden.

ie 71323

Taulukko III

Immunisointikaavio Antiseerumin gw/bw laimennus

Kontrolli 0,5 ml ST + 0,5 ml PBS - 0,114

Kaniini H

0,5 ml ST + 0,5 ml antiseerumi 1/1 0,078

Kaniini I

0,5 ml ST + 0,5 ml antiseerumi 1/1 0,073

Kaniini J

0,5 ml ST + 0,5 ml antiseerumi 1/1 0,061

Koe 4

Koetta varten valmistettua preparaattia annettiin ihonalaisesti kolmelle imevälle porsaalle (elopaino 20 kg) yksikköannoksen porsaille A ja B ollessa 0,5 mg (päivä 0), 0,5 mg (päivä 21) ja 5 mg (päivä 46) ja porsaalle C 0,1 mg (päivä 0), 1 mg (päivä 21) ja 5 mg (päivä 46). Verikokeita (eli antiseerumi) otettiin 61 päivänä, ja suoritettiin esimerkissä 7 esitetyt seroneutralisoin-tikokeet.

Tulokset on esitetty taulukossa IV, joka osoittaa risti-sidotun ST:n immunogeenisyyden.

71 323 17

Taulukko IV

Immunisointikaavio Antiseerumin gw/bw laimennus

Kontrolli 0,5 ml ST + 0,5 ml PBS - 0,111

Porsas A

0,5 ml ST + 0,5 ml 1/32 0,054 antiseerumi 1/64 0,062 1/28 0,920

Porsas B

0,5 ml ST + 0,5 ml 1/8 0,065 antiseerumi 1/16 0,076 1/32 0,108

Porsas C

0,5 ml ST + 0,5 ml 1/16 0,055 antiseerumi 1/32 0,059 1/64 0,095