HU183388B - Process for producing heat resistant enterotoxin derivatives of escherichia coli - Google Patents
Process for producing heat resistant enterotoxin derivatives of escherichia coli Download PDFInfo
- Publication number
- HU183388B HU183388B HU81869A HU86981A HU183388B HU 183388 B HU183388 B HU 183388B HU 81869 A HU81869 A HU 81869A HU 86981 A HU86981 A HU 86981A HU 183388 B HU183388 B HU 183388B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- enterotoxin
- coli
- antiserum
- escherichia coli
- preparation
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0258—Escherichia
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás új immunizáló E.coli hőstabil enterotoxin származékok és a származékokat tartalmazó profilaktikus hasmenés ellenes gyógyászati és állatgyógyászati készítmények előállítására.
Ismeretes, hogy az Escherichia coli törzsek felelősek lehetnek az ember és az állat hasmenéses megbetegedésének kiváltásáért. Erről különböző tanulmányok készültek, pl. Gyles és Bamum J. infect. Dis. 120.419—426, [1969]. Kimutatták, hogy az E.coli törzs enteropatogenitása az enterotoxinok termelésével kapcsolatos.
Két enterotoxint írtak le: a hőlabilis enterotoxint (LT) és a hőstabil enterotoxint (ST) és Smith és Gyles (J. Med. Microbiol. 3. 387-401. 1970) enteropatogén E.coli törzseket, vagy mint LT és ST enterotoxin-termelőket, vagy mint kizálólag ST enterotoxin-termelőket osztályozta. Emberi eredetű ST termelő E.coli törzseket is leírtak különböző szerzők, pl. Giamella (Infect. Immun. 14, 95-99, 1976). A hőlabilis enterotoxint egy örökölhető plazmid szabályozza genetikusán és feltételezhetően körülbelül 24 000 molekulasúlyú összekapcsolt peptidekből áll. Az LT enterotoxint a vékonybél hámsejtjeinek kefeszegélyén a gangliozidák adszorbeálják, ahol enzimatikus úton fokozott víz és klorid kiválasztást okoznak a bélüregbe és meggátolják a nátrium újrafelszívódását úgy, hogy a bélüreg megduzzad a folyadéktól és fokozott motilitást és hasmenést okoz. Az LT enterotoxin antigén és ember és állat szérumában stimulálja a semlegesítő antitesteket az előzőleg toxin-termelő E.coli törzsekkel megfertőzött ember vagy állat szérumában. A hőstabil enterotoxint plazmidok heterogén csoportja szabályozza genetikailag, és szintén hasmenést okoz, talán a guanidin cikláz stimulálása által (J. M. Hughes és társai, Natúré 271, 766-7,1978).
Tekintettel arra, hogy az LT-t és ST-t termelő organizmusok ellen készített antiszérum semlegesítőleg hat az LT-re, de az ST-re nem, és tekintettel arra, hogy az ST ellen hasonlóan előállított antiszérumok nem semlegesítették sem az ST-t, sem az LT-t, Smith és Gyles (lásd fent) arra a következtetésre jutottak, hogy az ST nem antigén. A „Purification and Chemical Cnaracterization of the Heat-Stable Enterotoxin Produced by Porcine Strains of Enterotoxygenic Escherichia coli” (Infect. Immun. 19, 1021-1030,1978) című cikkben J. F. Alderete és D. C. Robertson azt írták le, hogy a tisztított ST molekulasúlya 4400 (nátriumdodecilszulfát-gél elektroforézissel és gélszűréssel meghatározva) és az aminosav analízis adatokból 5100 molekulasúlyt számoltak, amely 47 maradéknak felel meg, és a cikk azt is leírja, hogy ST-vel vagy marhaszérumalbuminnal összekapcsolt ST-vel immunizált, nyulakból nyert antiszérum semlegesítette az enterotoxin hatását szopós egéren, azonban a passzív hemagglutináció és hemolízis titer kísérletek arra vallottak, hogy az ST gyenge antigén. Más szerzők ST molekulasúly meghatározásánál más és alacsonyabb értékeket kaptak, (pl. 1000—1200, 1500—2000 és 2500 dalion: E. V. Lee és társai, R. Lallier és társai és G. L. Madsen és társai: American Society of Microbiology konferencia, 1973, M168 számú kivonat, 19?9.B34 számú kivonat és 1979, P29 számú kivonat). Ezek az eltérések feltehetőleg az ST-termelésben, izolálásban vagy tisztítási lépésben bekövetkező különbségeknek tudhatok be, valamint a különböző enzimes folyamatoknak, amelyek akkor játszódnak le, amikor az enterotoxin elhagyja a sejtet.
Újabb tanulmányok (R. A. Kapitány és társai Infect.
Immun. 26, 173—177, 1979) eljutnak'32 tásának kérdéséig, azonban az aminosavösszév®^^ hőstabilitási tulajdonságokon és biológiai hatáson alapuló különböző ST-típusok (R. A. Kapitány, lásd fent) mellékesek a találmány szempontjából, mert a találmány a különböző ST-enterotoxinok valamennyi aminosav· összetételre alkalmazható.
Különböző kutatók eltérő tápközegeket és inkubációs módszereket használtak a különböző E.coli ST-termelő törzsek tenyészetében. Ilyen tápközegek pl. az F. G. Evans és társai által használt komplex tápközeg (Infect. Immun. 8, 731—35, 1973) és a J. F. Alderete és társai (Infect. Immun. 75, 781—88, 1977) által használt definiált minimál tápközeg és ezek módosulatai,
Az alábbi példákban az ST enterotoxint egy sertés E.coli K12 törzsből állítottuk elő, mely az American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA) deponálóhelyen ATCC 31621 számon lett deponálva 1980. március 13-án.
Az ATCC 31621 számú E.coli törzs a jól ismert E.coli K12 törzsből származó mutáns törzs, amelyet 1922-ben izoláltak egy lábadozó diftériás beteg székletéből,.és ezt használták a bakteriális genetika és molekuláris biológia alapkutatásban (B. J. Bachmann, Bacteriol. Rév. 36, 4, 525, 1972). Az E.coli K12 törzs pálcikaformájú gramnegatív baktérium, melynek hossza kb. 2 mikron és átmérője 1 mikron. A legjobb növekedés 37 °C-on észlelhető, de a törzs növekszik és osztódik 20 °C-on is. Az E.coli K12 törzs toknélküli aktív baktérium, 0’ :K: H 48 szerótípusú és igen specifikus érzékenységet mutat a lambda fággal szemben.
Az E.coli ATCC 31621 törzs az E.coli K 12 törzs fenti jellegzetes tulajdonságait mutatja, továbbá auxotróf igényeket támaszt fenilalaninra, triptofánra, hisztidinre és prolinra és nem fermentál laktózt. Valószínű lac mutáció következtében (Mc Conkey — laktóz táptalajon fehér telepeket képez). Az E.coli ATCC 31621 törzs rekombináns plazmidot képez 2.1.106 dalton DNSfragmenssel, melyet eredetileg egy atogén sertés E.coli törzsből származó plazmid DNS restrikciós endonukleázos emésztésével kapunk, és amely a hőstabil enterotoxin szintézisét kódoló gént hordozza. A törzs klóramfenikollal szemben rezisztens (25 mcg/ml).
Mint már említettük, a találmány nem korlátozódik sem az E.coli ATCC 31621 törzs alkalmazására, sem pedig az ezután leírt fermentációs eljárásra, a törzs és a fermentációs feltételek csak példaképpen szolgálnak az ST enterotoxin előállítására.
A találmány szerint ST enterotoxin származékokat állítunk elő oly módon, hogy az ST enterotoxint fehérjéknél alkalmazható bifunkciós térhálósító szerrel reagáltatjuk, és az így kapott ST enterotoxin származékok inter- vagy intramolekulárísan térhálós ST enterotoxinok, amelyeknek molekulasúlya nagyobb, mint magának az ST enterotoxinnak.
Az eljárás során az ST enterotoxint nemtoxikus bifunkciós térhálósító szerrel reagáltatjuk, amely vagy homofunkciós vagy heterofunkciós reagensként hat és térhálós ST enterotoxint eredményez. Bifunkciós fehéije térhálósító szerek, amelyek homofunkcionálisan hatnak, pl. a következők lehetnek: dialdehidek, diketonok, karbodiimidek, diizocianátok, diizotiocianátok, diazidok, arildiazidok, acil-diazidok, aril (aktivált) difluoridok, arildiszulfonil (aktivált) kloridok vagy bromidok, dikarbonsav (aktivált) azidok, kloridok vagy észterek; di-a-ha-21
183 388 loketonok: polimetilén (n = 3—12) diimedsavészterek; bisz-(maleidometil)éterek; gem-bisz-diazoacetil-alkánok; bisz-diazoarének és Ν,Ν’-arilén-dimaleimidek. Heterofunkcionális reagensekre példaképpen azokat a vegyületeket említhetjük, amelyek a fent említett térhálósítószerek két különböző, de kompatibilis funkciós csoportját tartalmazzák, különösen izocianáto- és izotiocianátoarének, (aktivált) fluor- és azidoarének; (aktivált) azido-aril-a-halogénalkü-ketonok; (aktivált) azido- és fluoroarének; klór- vagy bróm-aeetimidsav rövidszénláncú alkilészterek; klórhangyasav rövidszénláncú alkilészterek és epihalohidrinek.
A fehérjéknél használatos bifunkcionális térhálósítószerek az irodalomból ismertek. így például a fehérjéknél használt mesterséges térhálósítók áttekintése megtalálható Rosa UY és Finn WOLD: Advances in Experimental Medicine andBiology 9. fejezetében; Protein Crosslinking (Bíochemical and Molecular Aspects) címmel (kiadó: Mendel Friedman, Plenum Press, New York).
A különböző térhálósító szerek közül gyakorlati célokra leginkább a homofunkcionális szereket, például glutáraldehidet, difluordinitrobenzolt, diizocianát és diizotiocianát vegyületeket, valamint karbodiimideket és diimidsavésztereket használhatunk.
A találmány szerint az E.coli ST enterotoxin származékokat úgy állítjuk elő, hogy az ST enterotoxint fehérjetérhálósító szerrel reagáltatjuk.
A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként használt E.coli ST enterotoxin bármelyik E.coli ST enterotoxin termelőtörzsből előállítható.
A szupematáns kultúrában jelenlevő kapott ST enterotoxint rendszerint extraháljuk és a szennyeződések eltávolításával, pl. ultraszűréssel, gélszűrő kromatografálással, ioncserélő kromatografálással, etanollal történő extrakcióval, vagy poliakrilamid gél lemez-elektroforézissel tisztítjuk. Ezeknek a technológiáknak a leírását megtalálhatjuk Y. Takeda és társai cikkében (Infect. Immun. 25, 978-985,1979).
Minthogy az ST enterotoxin viszonylag jól áll ellen a hőnek, a találmány szerinti eljárást széles hőmérsékleti intervallumon belül folytathatjuk, gyakorlatban előnyösen 37 °C alatt, különösen szobahőmérsékleten, pl. 20-25 °C körüli hőmérsékleten dolgozunk.
A reakció vizes és előnyösen pufferes közegben megy végbe, a térhálósító szer természetétől függő pH-η, így pl. dialdehidek vagy diketonok esetében a reakcióelegy pH-ja nem döntő, és 4-8, előnyösen 5 körüli pH-η végezzük a reakciót. Az igen alacsony pH értékeket jobb elkerülni, hogy az aldehid önkondenzációjának lehetőségét csökkentsük. A pH 5 érték szintén megfelelő a karbodiimid és diizocianát térhálósító szereknél, de az epihalogénhidrin esetében enyhén lúgos pH-t, pl. pH = = 8-at használunk.
Ha dialdehidet vagy diketont használunk ST enterotoxin térhálósítására, amely a táptalajban alacsony koncentrációban van jelen, akkor a térhálósító reakciót úgy javíthatjuk, hogy az ST-t kisózással csapjuk ki, pl. nátriumszulfátot adunk hozzá a térhálósítószer hozzáadása előtt. A kapott ST enterotoxin származék oldékonyságát a térhálósítás különböző fokai befolyásolják.
A találmány szerint előállított ST enterotoxin származékokat gyógyászati vagy állatgyógyászati készítményekké készíthetjük ki, amelyek intramuszkuláris vagy orális adagolásra alkalmasak, a kikészítés során megfelelő hordozót adunk a hatóanyaghoz. Hordozóként izotóniás sót vagy puffer oldatot vagy egyéb irodalomból ismert anyagot használhatunk.
Az ST enterotoxin származék vizoldékonysága szerint az adagolt gyógyászati vagy állatgyógyásazti készítmény oldat vagy szuszpenzió formájában fordulhat elő, azonban tartalmazhat még segédanyagot, pl. Freund adjuvánst (állatgyógyászati felhasználásra), vagy aluminiumhidroxidot és a gyakorlatban a készítményt fagyasztva szárított formában tároljuk és az oldatot vagy szuszpenziót például a Freund teljes adjuváns hozzáadásával azonnali felhasználásra tesszük alkalmassá. A találmány szerint előállított ST enterotoxin származékot tartalmazó dózisegység pl. 0,1 mg térhálós ST-t tartalmaz testsúly kg-onként.
A találmány szerint előállított ST enterotoxin származékok más célt is szolgálhatnak, pl. az immuno teszthez hasznos anti ST antiszérumok könnyű előállítására alkalmasak.
1. példa
ATCC 31621 E.coli törzset steril fiziológiai sóoldattal rehidrálunk és 18 óra hosszat 37 °C-on Petri-csészékben inkubálunk; minden egyes Petri-csésze 20 ml feletti szelektív LB agar szilárd táptalajt tartalmaz (DIFCO Laboratories, Detroit, Michigan, Amerikai Egyesült Államokbeli cég gyártmánya), amely táptalajt milliliterenként 25 meg klóramfenikollal egészítettünk ki és amely táptalajt előzőleg 115 °C-on 45 percig hőkezeltünk.
Ezután egy folyékony tápközeget állítunk elő (PP3) oly módon, hogy Proteos pepton 3-at (DIFCO Laboratories cég terméke) 30 g mennyiségben, 4 g élesztőkivonatot és 5 g dextrózt 60 °C-on 1 liter vízben feloldunk. Hűtés után 5 g nátriumkloridot, 5,05 g dinátriumhidrogénfoszfátot és 1,2 g káliumdihidrogénfoszfátot adunk hozzá. A 6,9-7,0 pH értékű tápközeget Seitz EKS szű-őn keresztül leszűijük, és 30 ml alikvotokat osztunk szét 250 ml-es tenyészlombikokba.
Ezeket a lombikokat beoltjuk a Petri-csészékben kapott sima kolóniákkal, 30 ml. PP3 folyékony tápközegre 4 kolóniát használva, és 7 óráig 37 °C-on rázó polcokon inkubáljuk (percenként 20-30 ringás). Ezt nevezzük „első inokulum”-nak.
Ezután 16 óra múlva átoltás következik 6 literes Erlenmayer lombikba, amely 800 ml PP3 tápközeget tartalmaz, az átoltáshoz 5 térfogat/térfogat% „első inokulum”-ot használunk. így nyeljük a „második inokulum”ot. A kapott „második inokulum”-ot használjuk inokulumként (5 térfogat/térfogat%) a termelési lépésben, amelyet 80 liter módosított Alderete tápközeget tartalmazó fermentorban végzünk. A tápközeg összetétele az alábbi 8,71 g K2HPO4; 2,35 g NaCl; 1,0 g ΝΗ,ϋΙ; 1,8 g tricin; N-[trisz-(hidroximetil)-metil]-glicin 50 mg MgSO4J7H2O; 4,95 mg MnCl2*4H2O és 4<,9 mg FeCl3 1 liter vizben, a táptalajt 30 percig 121 °C-on sterilizáljuk, majd 1,42 g 1-prolint; 0,87 g 1-aszparaginsavat, 0,39 g l-alanint, 0,69 g 1-szerint; 0,05 g 1-fenilalanint; 0,05 g 1-hisztidint; 0,5 g 1-triptofánt és 5 gCasaminosavat (a DIFCO Laboratories, Detroit 1. Michigan, USA cég terméke) adunk hozzá 1 liter végső oldatra számítva; az aminosav-komponenseket külön állítjuk elő, mint tízszer koncentrált oldatot, melynek pH-ját 7,5-re állítottuk be és a kezdeti oldathoz való keverés előtt 30 percig 121 °C-on sterilizáltuk.
-3183 388
Ezt a tápközeget aerob inkubáljuk 36 °C-on 10-15 óráig keverve, azaz addig keverve, amíg pH eléri a 8,28,4 értéket és az oxigénfogyasztás megközelíti a 0-t.
Az előállítási lépés végén a fermentlevet 30 percig 60 °C-ra melegítjük és 6000 g-nál centrifugáljuk, majd a szupematánst Seitz EKS1 szűrőn keresztül leszűijük.
Az ST enterotoxint ezután három lépéses folyamatban koncentráljuk és tisztítjuk a következő módon:
Az első lépésben a szűrt fermentlé 40 literes alikvotját 5 liter térfogatra koncentráljuk, ezernél kisebb molekulasúlyú termékeket átengedő és nagyobb molekulasúlyú termékeket át nem eresztő Pellicon PTAC membránon keresztül történő szűréssel (Pellicon PTAC egy cellulóz vegyes észtereket tartalmazó ultra membrán védjegye, melyet a Millipore Corporation, Bedford Massachusettes, Amerikai Egyesült Államok-beli cég állít elő), majd ugyanezen a Pellicon PTAC membránon keresztül dialízissel, amíg a vezetőképesség 500 mikrosiemensre nem csökken. A kapott frakciót ezután továbbkoncentráljuk, míg a térfogat 1 liter lesz és liofilizáljuk. A fagyasztva szárított terméket ST-MP-nek nevezzük.
A második lépésben az ST-MP termék 3 grammos alikvotját 150 ml vízben oldjuk és az oldatot 0-4°C-ra hűtjük. 1,5 liter hideg acetont csepegtetünk hozzá keverés közben és az elegyet 30 percig keveijük, miután a teljes acetont hozzáadtuk. Az elegyet 300 grammnál centrifugáljuk és a szupematánst csökkentett nyomáson 30 ml térfogatra koncentráljuk, majd ehhez 180 ml 2:1 v/v arányú metanol és kloroform elegyet adunk. Intenzív rázás után 42 ml vizet adunk hozzá, és a felső réteget elválasztjuk, csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és liofilizáljuk. A liofilizált terméket ST-ACF-Dnek nevezzük.
A harmadik lépésben az ST-ACF-D termék 200 mg-os alikvotját 2 ml vízben oldjuk és 2,5X30 cm-es, 50 g Servachrom-8-at tartalmazó, vízzel egyensúlyozott hűtött oszlop tetejére visszük. (A Servachrom-8 a Serva GmbH és Co. Heidelberg, NSZK-beli cég kromatográfiás poliakrilmetilészterének védjegye). Az eluálást vízzel végezzük, az első frakció eluálása után az eluálást metanol és víz 6:4 v/v arányú elegyével folytatjuk, hogy az St-tartalmú frakciót eluáljuk. Az ST-t az oldószer elpárologtatásával izoláljuk és a kapott maradékot ST-PAE-nek nevezzük.
Az ST-PAE 1000-4000 tisztasági tényezőt mutat a kiindulási aktivitáshoz képest és az ST-PAE-termék fajlagos aktivitása sarasonként 5,5 és 15 nanogram között változik.
A frakciók biológiai aktivitását újszülött egér-teszttel mutatjuk ki. A. G. Dean (J. Infect. Dis. 125, 407-411, 1972) módszere szerint. A módszer szerint 48-72 órás egereket intragasztikusan beoltjuk 0,025 ml toxin oldattal és 2 óra múlva méljük a bélben felhalmozódott folyadék mennyiségét. A bélsúly/testsúly arány a toxin biológiai aktivitásának mértéke. A 0,09 értéknél nagyobb, ill. azzal egyenlő értékeket pozitívnak tekintjük. Az ST frakció fajlagos aktivitását az ST-nek a liofilizált termék nanogrammjaiban megadott olyan mennyiségében fejezzük ki, amely segítségével az egér-tesztnél a bélsúly/testsúly érték 0,100-nak adódik.
2. példa
10mg ST-PAE-t 0,25 ml 5,1 pH értékű acetát pufferben oldunk és ebből ugyanebben a pufferben oldott
0,25 ml 36 súly/térfogat%-os nátriumszulfát hu val csapjuk ki. Vizes glutáraldehidet adunk , (a 25 v/v%-os oldat 20 mikroliterét) és a reakciót szOv hőmérsékleten 2 óráig folytatjuk. A reakcióidő lejárta után a reagens feleslegét centrifugálással választjuk el, vízzel mossuk és a csapadékot liofilizáljuk.
A liofilizált termék a módosítatlan kiindulási anyagként használt ST-hez képest megnövekedett molekulasúlyú immonogén térhálós ST-t tartalmaz, amint ezt a Sephadex G-100-οη történő gélkromatográfiával meghatároztuk. (A Sephadex kromatografálás során használt töltet dextrán készítmény, melyet a svéd, uppsala-i Pharmacia cég hoz forgalomba).
A molekulasúly megnövekedésének kimutatására a liofilizált terméket 1 ml víz hozzáadásával és az elegy két óráig tartó szobahőmérsékleten történő keverésével részben feloldjuk. A feloldott frakció az oldhatatlan frakció 30-50 %-át képezi és 10 000-nél mutatja a fő csúcsot, míg ugyanolyan feltételek mellett a kiindulási ST-PAE a főcsúcsot 4000-nél mutatja (a csúcs a Sephadex G-100on a Vt mögött, a Vt az oszlop ágytérfogata).
3. példa mg ST-PAE-t 1 ml vízben feloldunk és 200 mg l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodíimid-liidrokloridot adunk hozzá. Az elegyet 25 °C-on 12 óráig állni hagyjuk, ezalatt a térhálósodási reakció lejátszódik. Az oldódó reakcióterméket PM-10 Amicon membránon dializáljuk (az Amicon az Amicon Társaság, Lexington, Massachusettes, Amerikai Egyesült Államok-beli cég által forgalmazott ultramembrán védjegy), ily módon a nem reagált ST-t eltávolítjuk és a visszamaradt 13 mg frakciót liofilizáljuk. Az ily módon térhálósított ST molekulasúlya kb. 10 000 (a kündulási anyag 2000 molekulasúlyával szemben), a molekulasúlyt a 2. példában jelzett módon gélkromatográfiával állapítjuk meg Sephadex G-100-οη. A térhálós ST abszorpciós spektruma is eltér a kiindulási anyagként használt ST-PAE frakció abszorpciós spektrumától. ’
4. példa mg ST-PAE-t feloldunk 0,5 ml 0,1 mólos, 8,0 pH-jú borátban pufferban (Na2 B4 O7/NaOH) és 100 mikroliter 0,02 mólos etanolos difluordinitrobenzol oldatot adunk hozzá. A térhálósító reakciót keverés közben 4 óra hoszszat szobahőmérsékleten folytatjuk. A reakcióidő elteltével a nem reagált ST-t Spectrapor dialízis csövön keresztül dializáljuk, amely a 14 000-nél kisebb molekulasúlyú termékeket engedi át. (Spectrapor a Spectrum Medical Industrie New York, Amerikai Egyesült Államok-beli cég által forgalmazott dializálócső védjegye).
A 2. példa szerint végzett gélkromatográfia szerint Sephadex G-100-οη az oldódó térhálós ST molekulasúlyát 50 000-re becsüljük, a kündulási anyagként használt ST-PAE 2000-es molekulasúlyával szemben. A kapott térhálós ST-abszorpciós spektruma további csúcsot mutat 350 nanométernél a kiindulási anyagként használt ST-PAE abszorpciós spektrumához képest.
183 388
I. táblázat
5. példa
100 mg liofilizált ST enterotoxin származékot, melyet a 2. példa vége szerint kapunk, 0,5 liter fiziológiai sóoldatban és 0,5 liter Freund-féle komplett adjuvánsban oldunk és a készítményt egyenként a hatásos állatgyógyászati alkalmazásra használatos mennyiségű térhálós ST enterotoxin dózisnak megfelelően üvegampullákba osztjuk szét. Az ampullákat légmentesen lezárjuk és 4° C-on tartjuk.
6. példa
100 mg liofilizált ST enterotoxin származékot, melyet a 2. példa vége szerint kapunk, 1 liter fiziológiás sóoldatban és 10 g Alhydrogélben szuszpendálunk (az Alhydrogél a Superfos Export Company, Copenhagen, Dánia cég terméke), és a térhálós, humán gyógyászatra alkalmas ST enterotoxint tartalmazó készítményt hatásos dózisokban üvegampullákba helyezzük. Az ampullákat hermetikusan lezárjuk és 4 °C-on tartjuk.
7. példa
Az 5. példa szerint előállított készítményt három (A, B és C) nyúlnak szubkután adagoljuk 0,1 mg/állat dózisegységenként és ugyanezt a szubkután adagolást 21 nap múlva megismételjük. Vérmintákat, azaz antiszérumot veszünk az első adagolás után 28 nappal. Az immunizált nyulak vérszérumát megvizsgáljuk, hogy mennyire semlegesítették in vitro 2 óra alatt 37 °C-on az első egér-teszttel mért, rögzített mennyiségű ST-t. (A. G. Dean, lásd fent) Kontrollként foszfátpuffert alkalmaztunk fiziológiai sóoldattal vagy normális szérumot az antiszérum helyett.
A szérum semlegesítési teszt eredményeit az alábbi
I. táblázat foglalja össze, ahol a PBS jelentése 8 g nátriumkloridot, 0,2 g káliumkloridot, 1,15 g dinátriumhidrogénfoszfátot, 0,2 g káliumdihidrogénfoszfátot tartalmazó 800 ml vízben oldott pufferoldatot jelent összekeverve 100 mg magnéziumklorid-6H2O 100 ml desztillált vízzel készített oldatával, majd 0,1 g kalciumklorid 100 ml desztillált vízzel készített oldatával,
- a bélsúly/testsúly értékek 0,09-nél kisebb értékei az ST semlegesítést mutatják;
- minden bélsúly/testsúly érték három mérés átlageredménye és minden érték 4 egérből álló csoport bélsúly/testsúly arányát mutatja;
- az ST térfogatok ml-enként 1,4 meg ST-ACF-D toxint tartalmazó ST oldatra vonatkoznak.
| Séma | Antiszérum | bélsúly/ |
| hígítás | testsúly | |
| 0,5 ml ST + 0,5 ml PBS | — | 0,102 |
| \ nyúl 0,5 ml ST + 0,5 ml | 1/16 | 0,064 |
| antiszérum | 1/32 | 0,087 |
| 1/128 | 0,097 | |
| B nyúl 0,3 ml ST + 0,5 ml | 1/4 | 0,059 |
| antiszérum | 1/8 | 0,100 |
| C nyúl 0,5 ml ST + 0,5 ml | 1/8 | 0,059 |
| antiszérum | 1/16 | 0,098 |
Az eredmények a térhálós ST immunogenicitását mutatják.
8. példa
Az 5. példa szerint előállított, de a 3. példa szerint térhálósított toxint tartalmazó készítmény (az oldható frakció molekulasúlya 10 000 fölött) szubkután 3 nyúlnak, a K, L és M nyúlnak adagoltuk 0,1 mg/állat dózissal és ugyanezt a szubkután adagolást megismételtük 21 nappal később. Vérmintákat, azaz antiszérum mintákat vettünk az első adagolás után a 28. napon és a szérumsemlegesítési kísérleteket a 7. példában leírt módon végeztük, de PBS helyett normál szérumot használtunk. Az eredményeket a 2. táblázat mutatja, amely a három állat közül egy állatnál mutatja a térhálós ST immunogenicitását.
II. táblázat
| Séma | Antiszérum hígítás | bélsúly/ testsúly |
| Kontroll 0,5 ml ST + 0,5 ml szérum | 0,129 | |
| L nyúl 0,5 ml ST + 0,5 ml antiszérum | 1/1 | 0,060 |
| K nyúl 0,5 ml ST + 0,5 ml antiszérum | 1/1 | 0,100 |
| M nyúl 0,5 ml ST + 0,5 ml antiszérum | 1/1 | 0,111 |
9. példa
Az 5. példában leírt módon előállított, de a 4. példa szerint kapott térhálós toxint tartalmazó (14 000-en felüli molekulasúly oldékony frakció) készítményt szubkután 3 nyúlnak, a Η, I és J nyúlnak adagoljuk állatonként 0,5 ml dózisegységben és ugyanezt a szubkután adagolást 21 nap múlva megismételjük. Az adagolás után 28 nappal vérmintát, ill. antiszérum mintát veszünk és a szérumneutralizációs tesztet a 7. példa szerint megismételjük.
Az eredményeket a III. táblázat mutatja, amely a térhálós ST immungenicitását is jelzi.
-5183 388
III. táblázat
IV. táblázat
| Séma | Antiszérum hígítás | bélsúly/ testsúly |
| Kontroll 0 5 ml ST + 0,5 ml PBS | 0,114 | |
| H nyúl 0,5 ml ST + 0,5 ml antiszérum | 1/1 | 0,078 |
| K nyúl 0,5 ml ST + 0,5 ml antiszérum | 1/1 | 0,073 |
| J nyúl 0,5 ml ST + 0,5 ml antiszérum | 1/1 | 0,061 |
| Immunizálási séma | Antiszérum hígítás | bélsúly/ testsúly |
| Kontroll | ||
| 0,5 ml ST + 0,5 ml PBS | 0,111 | |
| A sertés | 1/32 | 0,054 |
| 0,5 ml ST + 0,5 ml antiszérum | 1/64 | 0,062 |
| 1/28 | 0,920 | |
| B sertés | 1/8 | 0,065 |
| 0,5 ml ST + 0,5 ml antiszérum | 1/16 | 0,076 |
| 1/32 | 0,108 | |
| C sertés | 1/16 | 0,055 |
| 0,5 ml ST + 0,5 ml antiszérum | 1/32 | 0,059 |
| 1/64 | 0,095 |
10. példa
Az 5. példa szerint előállított készítményt három, 20 kg testsúlyú sertésnek szubkután adagoljuk; az A. és
B. sertéseknek az első napon 0,5 mg dózisegységben, a 21. napon 0,5 mg dózisegységben, a 46. napon 5 mg dózisegységben; a C. sertésnek az 1. napon 0,1 mg dózisegységben, a 21. napon 1 mg dózisegységben és a 46. napon 5 mg dózisegységben. Vérmintákat, azaz antiszérumot veszünk a 61. napon és a szérumsemlegesítési tesztet a 7. példa szerint végezzük.
Az eredményeket a IV. táblázat mutatja, amely a térhálós ST immunogenicitását is jelzi.
Claims (3)
- 20 Szabadalmi igénypontok1. Eljárás E.coli ST enterotoxin származék előállítására, azzal jellemezve, hogy E.coli ST enterotoxint nfem toxikus bifunkcionális fehéijetérhálósító szerrel reagálta25 tünk és az így kapott E.coli ST enterotoxin származékot izoláljuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy bifunkcionális térhálósítószerként dialdehidet, karbodiimidet, vagy difluoridot30 használunk.
- 3. Eljárás hasmenés elleni gyógyászati készítmények és állatgyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként valamely, 1 igénypont szerint előállított, térhálósított E.coli ST enterotoxin szár35 mazékot a szokásos hordozóanyagokkal és adott esetben egyéb segédanyagokkal összekeveijük és gyógyszerkészítménnyé, illetve állatgyógyászati készítménnyé alakítjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/137,326 US4314993A (en) | 1980-04-04 | 1980-04-04 | Immunogenic E. coli ST enterotoxin derivatives and compositions containing them |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU183388B true HU183388B (en) | 1984-04-28 |
Family
ID=22476873
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU81869A HU183388B (en) | 1980-04-04 | 1981-04-03 | Process for producing heat resistant enterotoxin derivatives of escherichia coli |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4314993A (hu) |
| EP (1) | EP0037522B1 (hu) |
| JP (1) | JPS56152495A (hu) |
| AR (1) | AR224928A1 (hu) |
| AT (1) | ATE5075T1 (hu) |
| AU (1) | AU543697B2 (hu) |
| CA (1) | CA1148467A (hu) |
| DE (1) | DE3161217D1 (hu) |
| DK (1) | DK157245C (hu) |
| EG (1) | EG15107A (hu) |
| ES (1) | ES8206447A1 (hu) |
| FI (1) | FI71323C (hu) |
| GR (1) | GR74813B (hu) |
| HU (1) | HU183388B (hu) |
| IE (1) | IE51133B1 (hu) |
| IL (1) | IL62177A (hu) |
| IN (1) | IN155308B (hu) |
| MX (1) | MX6746E (hu) |
| NO (1) | NO152281C (hu) |
| NZ (1) | NZ196413A (hu) |
| PH (1) | PH17009A (hu) |
| PL (1) | PL126748B1 (hu) |
| PT (1) | PT72649B (hu) |
| RO (1) | RO81387B (hu) |
| ZA (1) | ZA811221B (hu) |
| ZW (1) | ZW4281A1 (hu) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU551370B2 (en) * | 1981-06-22 | 1986-04-24 | University Of Rochester | Composition of a novel immunogen for protection against diarrheal disease caused by enterotoxigenic escherichia coli |
| US4411888A (en) * | 1981-06-22 | 1983-10-25 | The University Of Rochester | Composition of a novel immunogen for protection against diarrheal disease caused by enterotoxigenic Escherichia coli |
| US4428931A (en) * | 1982-03-15 | 1984-01-31 | Merck & Co., Inc. | Bacterial toxoids and gram-negative immune globulin therefrom |
| FR2525592B1 (hu) * | 1982-04-26 | 1984-09-14 | Pasteur Institut | |
| US4758655A (en) * | 1983-01-03 | 1988-07-19 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic polypeptide corresponding to a portion of the heat-labile enterotoxin of escherichia coli, compositions and methods of therewith |
| US4886663A (en) * | 1983-01-03 | 1989-12-12 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic heat-stable enterotoxin polypeptide of Escherichia coli and multimers thereof |
| SE8303401D0 (sv) * | 1983-06-15 | 1983-06-15 | Pharmacia Ab | Beredning och dess anvendning |
| ZA839512B (en) * | 1983-12-12 | 1984-08-29 | Scripps Clinic Res | Synthetic heat-stable enterotoxin polypeptide of escherichia coli and multimers thereof |
| US4740585A (en) * | 1984-07-30 | 1988-04-26 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Synthetic vaccine against urinary infections |
| CA1255285A (en) * | 1984-08-08 | 1989-06-06 | Johannes K. Minderhoud | Catalyst mixtures for aromatic hydrocarbon synthesis |
| GB8512972D0 (en) * | 1985-05-22 | 1985-06-26 | Univ Glasgow | Vaccine production |
| US4762710A (en) * | 1986-06-16 | 1988-08-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Novel method of preparing toxoid by oxidation and metal ions |
| US5110794A (en) * | 1987-01-30 | 1992-05-05 | Abbott Laboratories | Method of immunization with partially cationized substances and said partially cationized substances |
| US6413523B1 (en) | 1989-06-02 | 2002-07-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Pharmaceutical composition of escherichia coli heat-labile enterotoxin adjuvant and methods of use |
| US5316732A (en) * | 1992-07-01 | 1994-05-31 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Extraction vial |
| US8728478B2 (en) | 2008-09-03 | 2014-05-20 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Immunogenic Escherichia coli heat stable enterotoxin |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1282163A (en) * | 1969-08-06 | 1972-07-19 | Beecham Group Ltd | Modified allergens and a process for their preparation |
| US3761585A (en) * | 1971-04-05 | 1973-09-25 | Beecham Group Ltd | Vaccines containing modified allergenic material |
| DE2137630C3 (de) * | 1971-07-28 | 1975-06-05 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur Toxoidierung von Bakterientoxinen |
| US4180562A (en) * | 1973-05-08 | 1979-12-25 | Northwestern University | Glutaraldehyde polymerized ragweed antigen E preparation for treatment of allergic patients sensitive to ragweed pollen |
| GB1452648A (en) | 1973-11-21 | 1976-10-13 | American Home Prod | Cholera toxoid |
| FR2270891A2 (en) * | 1974-05-15 | 1975-12-12 | Anvar | Vaccines by glutaraldehyde detoxification - especially multivalent vaccines e.g. against tetanus and diphtheria |
| US4237115A (en) * | 1977-11-23 | 1980-12-02 | Bactex, Inc. | Method of immunization against enterotoxogenic infection by Escherichia coli |
| US4220584A (en) * | 1978-01-30 | 1980-09-02 | Merck & Co., Inc. | E. coli enterotoxin vaccine for veterinary and human use |
-
1980
- 1980-04-04 US US06/137,326 patent/US4314993A/en not_active Expired - Lifetime
-
1981
- 1981-02-20 IL IL62177A patent/IL62177A/xx unknown
- 1981-02-24 ZW ZW42/81A patent/ZW4281A1/xx unknown
- 1981-02-24 IN IN103/DEL/81A patent/IN155308B/en unknown
- 1981-02-24 ZA ZA00811221A patent/ZA811221B/xx unknown
- 1981-02-27 DK DK089881A patent/DK157245C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-02-27 PH PH25278A patent/PH17009A/en unknown
- 1981-03-04 NZ NZ196413A patent/NZ196413A/xx unknown
- 1981-03-05 AR AR284529A patent/AR224928A1/es active
- 1981-03-11 PT PT72649A patent/PT72649B/pt unknown
- 1981-03-19 CA CA000373427A patent/CA1148467A/en not_active Expired
- 1981-03-25 AU AU68743/81A patent/AU543697B2/en not_active Ceased
- 1981-03-26 AT AT81102264T patent/ATE5075T1/de not_active IP Right Cessation
- 1981-03-26 DE DE8181102264T patent/DE3161217D1/de not_active Expired
- 1981-03-26 EP EP81102264A patent/EP0037522B1/fr not_active Expired
- 1981-03-27 ES ES500765A patent/ES8206447A1/es not_active Expired
- 1981-03-30 GR GR64527A patent/GR74813B/el unknown
- 1981-03-30 PL PL1981230428A patent/PL126748B1/pl unknown
- 1981-03-31 FI FI810994A patent/FI71323C/fi not_active IP Right Cessation
- 1981-03-31 RO RO103870A patent/RO81387B/ro unknown
- 1981-04-01 EG EG176/81A patent/EG15107A/xx active
- 1981-04-03 JP JP5103981A patent/JPS56152495A/ja active Pending
- 1981-04-03 NO NO811168A patent/NO152281C/no unknown
- 1981-04-03 HU HU81869A patent/HU183388B/hu unknown
- 1981-04-03 IE IE764/81A patent/IE51133B1/en unknown
- 1981-04-03 MX MX819392U patent/MX6746E/es unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0118831B1 (en) | Vaccines for gram-negative bacteria and method for the preparation thereof | |
| HU183388B (en) | Process for producing heat resistant enterotoxin derivatives of escherichia coli | |
| EP0549617B1 (en) | Improved vaccine compositions | |
| JP2921574B2 (ja) | 接合体ワクチンの担体分子としてのｔ細胞のエピトープ | |
| US4693891A (en) | Vaccine for Pseudomonas aeruginosa | |
| Burroughs et al. | A structure-activity relationship for induction of meningeal inflammation by muramyl peptides. | |
| JPH0662434B2 (ja) | グラム陰性菌による感染に対する接合ワクチン及びその使用法 | |
| WO1992016232A1 (en) | Polysaccharide-protein conjugates | |
| KR100628657B1 (ko) | ＡｒｏＣ, ＯｍｐＦ 및 ＯｍｐＣ 유전자 각각에 비복귀돌연변이로 약독화된 백신에 유용한 박테리아 | |
| US4285931A (en) | E. coli enterotoxin vaccine for veterinary and human use | |
| US4220584A (en) | E. coli enterotoxin vaccine for veterinary and human use | |
| JP5490341B2 (ja) | Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染のための多糖ワクチン | |
| EP0287732B1 (en) | A method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine | |
| EP0365646B1 (en) | Synthetic peptides from streptococcal m protein and vaccines prepared therefrom | |
| Beachey et al. | Opsonic antibodies evoked by hybrid peptide copies of types 5 and 24 streptococcal M proteins synthesized in tandem. | |
| HU213924B (en) | Method for producing vaccine against enteric infection caused by enterotoxigenic e.coli bacteria in humans, containing formalin-killed e.coli strain having the ability of expressing colonization factor antigens | |
| JPS58164514A (ja) | 免疫刺激性プロテオグリカンおよびその製造方法 | |
| US5139776A (en) | Method for culturing Bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine | |
| EP1481053B1 (en) | Method of making cs6 antigen vaccine for treating, preventing, or inhibiting enterotoxigenic escherichia coli infections | |
| KR840001513B1 (ko) | 대장균 내열성 장독소 유도체의 제조방법 | |
| HUT75556A (en) | Vaccine design and production | |
| EP0238739B1 (en) | Klebsiella capsular polysaccharide vaccine | |
| AU662141C (en) | Polysaccharide-protein conjugates | |
| EP0420743A1 (fr) | Vaccin protecteur contre l'hémophilose porcine | |
| JPH0645554B2 (ja) | クレブシェラ莢膜多糖類ワクチンおよびその製法 |