PL126748B1 - Method of obtaining thermally stable derivative of e. coli enterotoxin - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania trwalej termicznie pochodnej enterotoksyny E coli, zwlaszcza nowych immunogenicznych pochodnych trwalej termicznie enterotoksyny E. coli. Nowa pochodna stosuje sie jako srodek przeciw biegunce przeznaczony do podawania ludziom i zwierzetom.Wiadomo jest, ze szczepy Escherichia coli moga byc odpowiedzialne za biegunke u ludzi i zwierzat, a takze wiadomo z róznych badan (np. Gyles i Barnum, J. Infect. Dis., 120, 419-426, 1969), ze en- teropatogennosc szczepu E. coli jest zwiazana z wytwarzaniem enterotoksyn.Opisane sa dwie enterotoksyny, a mianowicie enterotoksyna nietrwala termicznie (LT) i entero- toksyna trwala termicznie (ST). Smith i Gyles (J. Med. Microbiol., 3, 387-401, 1970) sklasyfikowali szereg enteropatogennych szczepów E. coli róznego pochodzenia zwierzecego jako producentów entero- toksyn LT i ST lub wylacznie ST. Wytwarzajace enterotoksyny ST szczepy E. coli pochodzenia ludz¬ kiego zostaly takze opisane lub wzmiankowane przez róznych autorów (np. R. A. Giannella, Infect.Immun., 14, 95-99, 1976). Nietrwala termicznie enterotoksyna jest pódl kontrola genetyczna przeno- szalnego plazmidu. Wydaje sie, ze z grupy zwiazanych peptydów o ciezarze czastecz- 10 15 20 25 kowym okolo 24.000. Enterotoksyna LT jest absor¬ bowana przez zwoje szczotkowatych krawedzi ko¬ mórek nablonkowych jelita cienkiego, za posrednic¬ twem procesu enzymatycznego, co powoduje nad¬ mierne wydzielanie wody i chlorków do jelita i hamuje reabsorpcje sodu, w wyniku czego prze¬ krój jelita zostaje rozszerzony plynem, co powoduje nadmierna ruchliwosc i biegunke, Enterotoksyna LT jest antygeniczna i stymuluje zobojetnienie przeciwcial w surowicy krwi ludjzi lub zwierzat zakazonych uprzednio szczepami E". coli wytwarzajacymi toksyny. Enterotoksyna trwala termicznie jest pod genetyczna kontrola heteroge¬ nicznej grupy plazmidów i takze wywoluje bie¬ gunke, prawdopodobnie przez stymulowanie cyklazy guanidynowej (J. M. Hughes i wsp., Nature, 271, 766-767, 1978).Zwazywszy, ze surowica odpornosciowa produko¬ wana przeciw organizmom wytwarzajacym entero¬ toksyny LT i ST zobojetnia enterotoksyne LT ale nie ST, i ze surowice odpornosciowe sporzadzane * w podobny sposób przeciw ST nie zobojetnialy ST lub LT, Smith i Gyles w cytowanej pracy doszli do wniosku, ze enterotoksyna ST nie jest anty¬ geniczna.W pracy zatytuowanej „Purification and Chemical 126 7483 126 748 4 Characterization of the Heat-Stable Enterotoxin Produced by Porcine Strains of Enterotoxygenic Escherichia coli" Infect. Immun., 19, 1021-1030, 1978) J. F. Alderete d D. C. Robertson donosza, ze oczyszczona enterotoksyna ST „wykazuje ciezar czasteczkowy 4.400 oznaczony zorówno metoda elektroforezy na dodecylosiarczanic sodowym i zelu jak i za pomoca filtracji na zelu" oraz, ze „ciezar czasteczkowy wynoszacy 5.100 i odnoszacy sie do 47 reszt, zostal obliczony z danych z analizy aminokwasowej".Wskazuja oni takze, ze „surowica odpornosciowa otrzymana z królików immunizowanych enteroto¬ ksyna ST lub ta enterotoksyna sprzegnieta z albu¬ mina surowicy wolowej zobojetnia dzialanie entero- toksyny u ssaków myszy, ale badania biernej hemaglutancji i miana hemolizy wykazuja, ze en¬ terotoksyna ST jest slabym antygenem".Oznaczenia ciezaru czasteczkowego enterotoksyny ST wykonane przez innych autorów dawaly inne i nizsze wartosci, np. 1000-1200, 1500-2000 i 2500 daltonów, jak to zostalo podlane w streszczeniach prac ze zjazdów American Society of Microbiology, odpowiednio E. V. Lee i wsp., 1973 streszczenie M168, R. Lalier i wsp., 1979 streszczenie B34 i G.L. Madsen i wsp., 1979 streszczenie P29. Te roz¬ bieznosci sa wynikiem róznic w metodach wytwa¬ rzania enterotoksyny ST, izolacji lub oczyszczania, a takze róznych procesów enzymatycznych podczas uwalniania enterotoksyny z komórki.^Pstatnie prace (R. A. Kapitany i wsp., Infect.Immun., 26, 173-177, 1979) dotycza kwestii rózno¬ rodnosci enterotoksyny ST, ale stwierdzenie istnie¬ nia róznych typów ST przejawiajacych sie, jak to stwierdzili R. A. Kapitany i wsp. w cytowanej pracy, w skladzie aminokwasowym, trwalosci cieplnej i aktywnosci biologicznej, nie ma wplywu na sposób wedlug wynalazku, który jest z nie¬ jasnych powodów stosowalny dla kazdego skladu aminokwasowego róznych enterotoksyn ST.Rózni badacze stosowali rózne pozywki i metody inkubowania podczas hodowli róznych szczepów E. coli producentów enterotoksyny ST. Przykladem takich pozywek sa pozywka kompleksowa F. G.Evansa i wsp. opisana w Infect. Immun. 8, 731-735 (1973) oraz malo zdefiniowana pozywka J. F.Alderete'a i wsp. opisana w Infect. Immun., 15, 781-788 (1977), a takze ich modyfikacje.W podanych ponizej przykladach enterotoksyne ST wytwarza sie z wystepujacego u swini szczepu E. coli K12, zo)eponowanego 13 marca 1980 roku w American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA), pod numerem ATCC 31621.Szczep E. coli ATCC 31621 jest mutantem otrzy¬ manym z dobrze znanego szczepu E. coli K12 izolo¬ wanego ze stolca rekonwalescenta po blonicy w 1922 roku i powszechnie stosowanego w podstawo¬ wych badaniach genetycznych bakterii i biologii molekularnej (B. J. Bachmann, Bacteriol. Rev., 36, 4, 525, 1972). E. coli K12 jest bakteria Gram- -ujemna o ksztalcie paleczki o dlugosci okolo 2 mikronów i srednicy 1 mikrona, Najlepszy wzrost zachodzi w temperaturze 37QC ale szczep rosnie takze i dzieli sie w temperaturze tak niskiej jak 20°C. E. coli szczep K12 jest nieotorbiona ruchliwa bakteria o serotypie O— :K (?):H 48, wykazujaca bardzo specyficzna wrazliwosc wobec faga lambda.Szczep E. coli ATCC 31621 posiada taka sama 5 typowa charakterystyke jak E. coli K12 i co wiecej wymaga dla wzrostu fenyloalaniny, tryptofanu, histydyny i proliny oraz nie fermentuje laktozy, prawdopodobnie ze wzgledu na mutacje lac y (wy¬ twarza biale kolonie na pozywce laktozowej Mc 10 Conkey'a). Szczep E. coli ATCC 31621 zawiera rekombinant plazmidu z fragmentu DNA o 2,lxl0fc daltonach, otrzymany w wyniku ograniczenia wewnatrzjadrowego zuzywania plazmidu DNA po¬ chodzacego z patogennego szczepu E. coli ze swini 15 i przenoszacego kod getnetyczny o^la syntezy trwalej termicznie enterotoksyny. Szczep jest oporny na chloramfenikol w stezeniu 25 mcg/ml.Jak wspomniano powyzej, sposób wedlug wyna¬ lazku nie jest ograniczony tylko do stosowania 20 szczepu E. coli ATCC 31621 lub opisanego procesu fermentacji. Zarówno powyzszy szczep jak i wa¬ runki fermentacji sa opisane tylko jako przyklad sposobu wytwarzania enterotoksyny ST.Sposób wedlug wynalazku dotyczy wytwarzania 25 pochodnych enterotoksyny ST i polega na tym, ze enterotoksyne ST poddaje sie reakcji z dwu- funkcyjnym czynnikiem sieciujacym proteiny. Otrzy¬ muje sie pochodne enterotoksyny ST usieciowane miedzy soba lub wewnetrznie o znacznie wyzszym 30 ciezarze czasteczkowym od wyjsciowej entero¬ toksyny ST.W sposobie wedlug wynalazku enterotoksyne ST poddaje sie reakcji z nietoksycznym dwufunkcyjnym czynnikiem sieciujacym proteiny dzialajacym jako 35 homofunkcyjny albo jako heterofunkcyjny odczyn¬ nik sluzacy do otrzymania usieciowanej entero¬ toksyny ST.Przykladami dwufunkcyjnych czynników sieciu¬ jacych dla protein dzialajacych jako czynniki homo- 40 funkcyjne sa dwualdehydy, dwuketony, karbodwu- imidy, dwuizocyjaniany, dwuizotiocyjaniany, dwu- azydki arylowe, dwuazydki kwasowe, aktywowane dwufluorki arylowe, aktywowane chlorki lub bromki arylodwusulfonylowe, aktywowane azydki, 45 chlorki lub estry kwasów oTwukarboksylowych, dwu-a-chlorowcoketony, estry kwasów polimety- leno(n=3-12)-dwuimidowych, etery bis-(maleidome- tylowe), geminalne bis-dwuacetylo-alkany, bis-dwu- azoareny, N, N-aryleno-dwumaleidoamidy. 50 Przykladami heterofunkcyjnych czynników sa zwiazki rózne ale mogace razem wspólistniec grupy funkcyjne, takie jak w przedstawionych powyzej czynnikach sieciujacych. Sa to np. izo- cyjanianoareny, izotiocyjanianoareny, aktywowane 55 fluoro- i azydo-areny, aktywowane azydo - fluoro- areny, aktywowane ketony azydoarylo-a-chlorow- coalkilowe, nizsze estry alkilowe kwasu bromo- lub chloroacetoimidowego, nizsze estry alkilowe kwasu chloromrówkowego oraz epichlorowcohydryny. 60 Przedstawione powyzej dwufunkcyjne czynniki sieciujace dla protein sa zwiazkami dobrze znanymi.Np., przeglad sztucznego sieciowania protein zostal przedstawiony przez Rosa'e Uy i Finna Wolda w rozdziale 9 „Advances in Experimental Medicine 65 and) Biology", zatytulowanym „Sieciowanie pro-126 748 5 tein" (Aspekty biochemiczne i molekularne), wy¬ dawca Mendel Friedman, Plenum Press, New York.Z powyzszych róznych czynników sieciujacych najczesciej ze wzgledów praktycznych sa stosowane homofunkcyjne czynniki, takie jak aldehyd gluta- rowy, dwufluorodwunitrobenzen, izocyjaniany, izo- tiocyjaniany^ karbodwuimidy i estry kwasu dwu- imidowego.Przedmiotem wynalazku jest wiec sposób wytwa¬ rzania pochodnych enterotoksyny ST E. coli pole¬ gajacy na poddawaniu enterotoksyny ST reakcji z czynnikiem sieciujacym proteiny.Enterotoksyne ST E. coli stosowana jako ma¬ terial wyjsciowy w sposobie wedlug wynalazku mozna otrzymywac z dowolnego wytwarzajacego te toksyne szczepu E. coli.Enterotoksyne ST obecna w supernatancie z ho¬ dowli ekstrahuje sie zwykle i oczyszcza usuwajac niektóre zanieczyszczenia. Do tego celu stosuje sie np. ultrafiitracje, chromatografie na zelu, chro¬ matografie jonowymienna, ekstrakcje etanolem lub elektroforeze na krazkach z zelem poliakryloamido- wym. Opis niektórych z tych technik podali Y. Takeda i wsp. w Infect. Immun., 25, 978-985 (1979).Poniewaz enterotoksyna ST jest wyraznie odporna na dzialanie temperatury, proces wedlug wyna¬ lazku mozna prowadzic w szerokim zakresie tem¬ peratur. W praktyce korzystnie jest stosowac tem¬ perature ponizej 37°C, zwlaszcza pokojowa, to zna¬ czy okolo 20—25°C.Reakcje prowadzi sie w srodowisku wodnym, korzystnie w buforze, przy pH zaleznym od rodzaju czynnika sieciujacego. Np., w przypadku dwuketo- nów wartosc pH nie jest krytyczna i odpowiedni zakres wynosi od okolo 4 do okolo 8, korzystnie okolo 5. Unika sie niskich pH, aby nie zachodzila samokondensacja aldehydu. Tak samo, pH 5 jest odpowiednie dla karbodwuimidówych i izocyjania- nowych czynników sieciujacych, natomiast dla epi- chlorowcohydryny korzysne jest srodowisko lekko alkaliczne, np. o pH okolo 8.W przypadku stosowania dwualdehydu lub dwu- ketonu do sieciowania enterotoksyny ST obecnej w malym stezeniu w srodowisku, warunki siecio¬ wania mozna poprawiac stracajac ST za pomoca wysalania, np. siarczanem sodowym, przed doda¬ niem czynnika sieciujacego.Na rozpuszczalnosc otrzymanej.pochodnej entero¬ toksyny ST ma wplyw rózny mozliwy stopien usieciowania.Pochodne enterotoksyny ST wytwarzane sposo¬ bem wedlug wynalazku mozna formulowac w pre¬ paraty farmaceutyczne lub weterynaryjne do poda¬ wania domiesniowego lub doustnego, mieszajac je z dopuszczalnym dla daaego sposobu podawania nosnikiem, Odpowiednimi nosnikami sa izotoniczne roztwory soli lub roztwory buforowe i inne dobrze znane materialy.W zaleznosci od rozpuszczalnosci pochodnej entero¬ toksyny ST w wodzie, kompozycja farmaceutyczna lub weterynaryjna moze miec postac roztworu lub zawiesiny, z dodatkiem jednak adjuwanta, takiego jak adjuwant Freunda (do uzytku weterynaryjnego, wodorotlenek glinu lub- podobny. 6 W praktyce, kompozycje przechowuje sie w postaci liofilizatu i roztwór lub zawiesine przyrzadza sie bezposrednio przed uzyciem, dodajac np. adjuwant Freunda. Dawka jednostkowa pochodnej enteroto- 5 ksyny ST wytwarzanej sposobem wedlug wyna¬ lazku moze zawierac np. 0,1 mg usieciowanej ST na kilogram ciezaru ciala.Pochodne enterotoksyny ST wytwarzane spo¬ sobem wedlug wynalazku moga takze sluzyc do io innych celów, np. dla sporzadzania przeciwcial ST do badan immunologicznych.Przyklad L Szczep ATCC 31621 E. coli zawie¬ szono w jalowym wodnym roztworze chlorku so¬ dowego i inkubowano w ciagu 18 godzin w tempe- 15 raturze 37°C na plytkach Petrfego zawierajacych po 20 ml stalej pozywki agarowej (Selective LB agar, wytwarzany i sprzedawany przez Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) i 25 mcg/ml chloramfenikolu, ogrzewanych uprzednio w tempera- » turze 115°C.Nastepnie przygotowano plynna pozywke (nazwa¬ na PP3), rozpuszczajac 30 g peptonu (Proteose peptone nr 3, wytwarzany i sprzedawany przez Difco Laboratories),"4 g wyciagu drozdzowego i 25 5 g dekstrozy w 1 litrze w temperaturze 80°C.Po ochlodzeniu dodano 5 g NaCl, 5,05 g Na2HP04 i 1,2 g KHjPO^ Otrzymana pozywke o pH 6,9-7,0 przesaczono przez filtr Seitz EKS i rozlano po 30 ml do kolb hodowlanych o pojemnosci 250 ml. 30 Kolby te zakazono koloniami z plytek Petrfego, stosujac po 4 kolonie na 30 ml plynnej pozywki PP3 i inkubowano w ciagu 7 godzin w temperaturze 37°C na trzesawce wahadlowej (20—30 ruchów na minute). 35 Drugie pasazowanie prowadzono w ciagu 16 go¬ dzin stosujac 800 ml pozywki PP3 w kolbie stoz¬ kowej o pojemnosci 6 litrów oraz 5% (objetosc na objetosc) inokulum z pierwszego posiewu.Otrzymana hodowle stosowano jako inokulum 40 (5% objetosc na objetosc) w etapie prodtikcyjnym prowadzonym w fermentorze zawierajacym 80 li¬ trów zmodyfikowanej pozywki Alderate'a o skla¬ dzie 8,71 g KjHPO^ 2,35 g NaCl, 1,0 g NH4C1, 1,8 g preparatu „tricine", 50 mg MgS04 • 7RjO; 45 4,95 mg MnCl2 • 4HjO oraz 4,9 mg FeCl3 w jednym litrze wody. Pozywke sterylizowano w ciagu 30 mi¬ nut w temperaturze 121°C i nastepnie dodawano 1,42 g 1-piroliny, 0,87 g kwasu 1-asparaginowego, 0,39 g 1-alaniny, 0,69 g 1-seryny, 0,05 g 1-fenylo- so alaniny, 0,05 g 1-histydyny, 0,05 g l-tryptofanu i 5 g produktu firmy Difco o nazwie „Casamino Acicfc", na jeden litr koncowego roztworu. Amino¬ kwasy przyrzadzano osobno w postaci roztwdru o stezeniu 10-krotnie wyzszym, pH doprowadzono 55 do wartosci 7,5 i wyjalawiano w ciagu 39 minut w temperaturze 121ÓC, przed dodaniem ich do pozywki.Pozywke produkcyjna inkubowano z napowietrza¬ niem podczas mieszania w temperaturze 36aC w oo ciagu 10—15 godzin, to znaczy do osiagniecia pH 8,2—8,4 i spadku zuzycia tlenu do zera.Po zakonczeniu fermentacji brzeczka ogrzewano w ciagu 30 minut w temperaturze 60*C,ocfwiró- wano przy 60ÓG g i supernatant przesaczono, przez •s filtr Seitz EKS1. Enterotoksyne ST zatezano i7 126 748 « oczyszczano stosujac nastepujacy trzyetapowy pro¬ ces.W pierwszym etapie, 40 litrów przesaczonej brzeczki fermentacyjnej zatezono do objetosci 5 li¬ trów droga saczenia przez blone Pellieon PTAC zatrzymujaca material o ciezarze czasteczkowym powyzej 1000 (ultramembrana z mieszanych estrów celulozy, wytwarzana i sprzedawana przez Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, USA), po czym dializowano przez taka sama blone Pellieon PTAC az do spadku przewodnosci do 500 mikrosiemensów.Zatrzymana frakcje dalej zatezano do objetosci 1 litra i liofilizowano. kiofilizat oznaczono symbolem ST-MP.W drugim etapie 3 g produktu ST-MP rozpusz¬ czono w 150 ml wody i roztwór ochlodzono do tempertaury 0—4°C, po czym dodano 1,5 litra zimnego acetonu, Calosc mieszano w ciagu 30 mi¬ nut a nastepnie wirowano przy 3000 g i super- natant zatezono pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 30 mi. Do zatezonego roztworu dodano 100 ml mieszaniny 2:1 metanolu i chloroformu, dobrze wytrzasnieto i dodano 42 ml wody, Górna warstwe podzielono i odparowano pod zmniejszo¬ nym cisnieniem, po czym zliofilizowano i otrzymano produkt oznaczony symbolem ST-ACF-D, W trzecim etapie 200 mg produktu ST-ACF-d rozpuszczono w 2 ml wody i podano na szczyt chlodzonej kolumny o wymiarach 2,5 x 30 cm zawierajacej 50 g zywicy Servachrom 8 (nazwa firmowa poliakrylanu metylu przeznaczonego do chromatografii i wytwarzanego przez Serva G • m • • b • H & Co Heidelberg, RFN) i równowazonej woda. Pierwsza frakcje eluowano woda a nastepnie mieszanina 6:4 metanolu i wody eluowano frakcje zawierajace STf po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano produkt okreslony symbolem ST-PAE.Wspólczynnik oczyszczania dla ST-PAE w sto¬ sunku do wyjsciowej wynosil 1000^4000, Aktyw¬ nosc wlasciwa 3T-PAE wynosila w zaleznosci od próbki 9d 5,5 do 15 nanogramów.Aktywnosc biologiczna frakcji oznaczano w tes¬ cie na oseskach myszy zgodni z metoda opisana przez A. G. Pean'a w J. Jnfect. Dis., 125, 407-41! (1072), Oseski myszy w wieku 48^72 godzin zaka¬ zano dozoladkowo 0,025 ml roztworu toksyny i gromadzenie §ie plynu w jelicie mierzono po uplywie 2 godzin. Miara aktywnosci biologicznej toksyny jest stosunek ciezaru jelita do ciezaru ciala. Wartosci wyzsze lub równe 0,09 przyjmowano za pozytywne. Aktywnosc wlasciwa frakcji ST wyrazano wiec jako ilosc ST (w nanogramach liofilizowanego produktu) dajaca w tescie na oseskach myszy wartosc stosunku ciezaru jelita do ciezaru wynoszaca 0.100.Praykiad U, 10 mg st-pae rozpuszczono w 0,25 ml buforu fosforanowego o wartosci pH 5,1 i wytracono dbdatkiem 0,25 ml 3a% (waga/objetesc) roztworu siarczanu sodowego w tym samym bu¬ forze, Nastepnie dodano 0,020 ml 25% wodnego roztworu aldehydu giutarowego i calosc pozostawio¬ no w ciagu 2 godzin w pokojowej temperaturze.Nadmiar odczynnika oddzielono droga odwirowania, przemyto woda i ogafl zUfiUzowgnp. \ ^liofilizowany produkt hyl immunegeniczna uiie* ciowana enterotoksyna ST o zwiekszonym ciezarze czasteczkowym w stosunku do niemodyfikowanej ST stosowanej jako material wyjsciowy. Stwierdzo¬ no to za pomoca chromatografii na zelu Sephadex 5 G-100 (dekstran do chromatografii wytwarzany i sprzedawany przez firme Pharmacia, Uppsala, Szwecja).Dla wykazania wzrostu ciezaru czasteczkowego zliofilizowany produkt rozpuszczono czesciowo do- 10 dajac 1 ml wody i mieszano w ciagu 2 godzin w pokojowej temperaturze. Frakcja rozpuszczona reprezentowala 30 do 50% frakcji nierozpuszczalnej i wykazywala glówne pasmo przy 10,000, natomiast w takich samych warunkach wyjsciowych material 15 ST-PAE wykazywal glówne pasmo przy 4000 (pasmo za objetoscia zloza (Vt) w kolumnie z zelem Sephadex O-100).Przyklad III. 20 mg ST-PAE rozpuszczono w 1 ml wody i dodano roztwór 200 mg chlorowodorku 30 l-etylo^3-(3-dwumetyleaminopropylo)-karbodwuimi^- du. Mieszanine pozostawiono w temperaturze 25^0 w ciagu 12 godzin, w którym to czasie zachodzilo sieciowanie, Rozpuszczalny produkt reakcji dializo¬ wano przez membrane PM-10 Amicon (nazwa fir- 25 mowa ultramembrany wytwarzanej i sprzedawanej przez Amieon Corporation, Lexington, Massachuse¬ tts, USA) w celu usuniecia nieprzereagowanej ST, a zatrzymana frakcje (13 mg) liofilizowano. Ciezar czasteczkowy taj usieciowanej ST wynosil okolo 30 10.000, wobec 2000 dla wyjsciowego materialu, co oznaczono na zelu Sephadex 0^100 w sposób opisany w przykladzie IL Widmo absorpcyjne usieciowanej ST bylo takze rózne od widma frakcji ST-PAE stosowanej jako material wyjsciowy. 3S Przyklad IV. 5 mg ST-rPAE rozpuszczono w 0,5 ml 0,1 molarnego roztworu buforu boranowego (Na2B4Q7/NaiQH) o wartosci pH 8 i dodano 0,100 ml 0,02 molarnego roztworu dwufluorodwunitroben- zenu w etanolu. Reakcje sieciowania prowadzono 40 mieszajac w ciagu 4 godzin w pokojowej tempera¬ turze. Po zakonczeniu reakcji nieprzereagowana ST usunieta droga dializy przez rure dó dializy Spectrappr nie przepuszczajaca czastek o ciezarze czasteczkowym wiekszym nii 14.000 (Spectrapor 45 jeiist nazwa firmowa rur do dializy wytwarzanych i sprzedawanych przez Spectrum Medical Industrie, Nowy Jork, USA), Za pomoca chromatografii na zelu Sephadex G-100 (jak w przykladzie II) ciezar czasteczkowy 50 powyzej rozpuszczalnej usieciowanej ST oznaczono na 50.000, w stosunku do 2000 dla wyjsciowej ST-PAE, W widmie absorbacji usieciowanej ST wystepowalo w utoiunku do widma wyjsciowej ST^PAE ojodatkowe paimo przy 350 nm. 55 Przyklad v, 100 mg zliofilizowanej pochodnej enterotoksyny ST otrzymanej jak w przykladzie II zawieszono w 0,5 litra roztworu soli filzjologieznej i 0,5 litra adjuwanta Freunda, Otrzymany roztwór rozlano do szklanych fiolek. Fiolki zawierajace 60 skutecznie dzialajaca dawke usieciowanej enteroto- ksyny ST do stosowania weterynaryjnego szczelnie zamykano i przetrzymywano w temperaturze 4ac.PriyMad VI. 100 mg zliofilizowanej pochodnej enteroteknyny ST (przyklad II) zawieszono w ! C§ litrze roztworu soli filjoloficznej, dodano 10 g9 126 748 10 preparatu Alhydrogel (produkt wytwarzany i sprze¬ dawany przez Superfos Export Company, Kopenhaga, Dania) i otrzymana kompozycje rozlano do szkla¬ nych fiolek. Fiolki zawierajace sztucznie dzialajaca dawke usieciowanej enterotoksyny ST do stosowa¬ nia dla ludzi szczelnie zamykano i przetrzymywano w temperaturze 4°C.Przyklad VII. Kompozycje przygotowana w spo¬ sób opisany w przykladzie V podawano podskórnie trzem królikom (A, B i C) w ilosci po 0,1 ml i taka sama iniekcje podskórna powtarzano po 21 dfniach. Próbki krwi (to znaczy surowicy odporno¬ sciowej) pobierano 28 dnia po pierwszym podaniu.Surowice immunizowanych królików testowano na ich zdolnosc zobojetniania (in vitro, 2 godziny w temperaturze 37°C) okreslonej ilosci ST oznaczo¬ nej w tescie na oseskach myszy (A. G. Dean, cytowana praca). Dla kontroli zamiast surowicy odpornosciowej stosowano bufor fosforanowy z roztworem chlorku sodowego lub zwykla surowice.Wyniki testu na zobojetnienie surowicy przedsta¬ wiono w tablicy 1, w której: — PBS oznacza roztwór buforowy, który otrzy¬ mano rozpuszczajac 8 g NaCl, 0,2 g KC1, 1,15 g Na2HP04 i 0,2 g KI^PC^ w 800 ml destylowanej wody i nastepnie dodajac roztwór 100 mg MgCl9. • 6H20 w 100 ml destylowanej wody i roztwór 0,1 g CaC^ w 100 ml destylowanej wo^y; — wartosc stosunku ciezaru jelita do ciezaru ciala mniejsza niz 0,09 wskazywala na zobojetnie¬ nie ST; — kazda wartosc stosunku ciezaru jelita do ciezaru ciala jest przecietna wartoscia z trzech oznaczen, z których kazde reprezentuje stosunek ciezaru jelita i ciala dla grupy 4 osesków myszy; — roztwory ST zawieraly 1,4 mcg/ml toksyny ST-ACF-D.Tablica 1 Iniekcja Kontrola 0,5 ml ST + 0,5 ml PBS Królik A 0,5 ml ST + 0,5 ml surowicy odpornosciowej Królik B 0,5 ml ST + 0,5 ml surowicy odpornosciowej Królik C 0,5 ml ST + 0.5 ml surowicy odpornosciowej Rozcien¬ czenie surowicy odpor¬ nosciowej — 1/16 1/32 1/128 1/4 1/8. 1/8 1/16 Stosunek ciezaru jelita do ciezaru ciala 0,102 0,064 0,087 0,097 0,059 0,100 0,059 0,093 Wyniki wskazuja na immunogennosc usieciowa¬ nej ST.Przyklad VIII. Kompozycje sporzadzona jak w przykladzie V ale z usieciowanej toksyny wedlug przykladu III (frakcja rozpuszczalna o ciezarze czasteczkowym powyzej 10.000) podawano podskór¬ nie trzem królikom (K, 1^ i M) w dawce 0,1 mg i te iniekcje powtarzano po uplywie 21 dni. Próbki krwi (to znaczy surowicy odpornosciowej) pobierano po 28 dniach od pierwszego podania i przeprowa¬ dzano test na zobojetnianie surowicy, stosujac sposób opisany w przykladzie VII ale zamiast PBS uzywano normalna surowice. Wyniki przedstawiono w tablicy 2 wykazuja immunogenicznosc usiecio¬ wanej ST u jednego z trzech zwierzat.Tablica 2 20 Iniekcja Kontrola 0,5 ml ST + 0,5 ml surowicy Królik L 0,5 ml ST + 0,5 ml surowicy v odpornosciowej Królik K 0,5 ml ST + 0,5 ml surowicy odpornosciowej Królik M 0,5 ml ST + 0,5 ml surowicy odpornosciowej Rozcien¬ czenie surowicy odpor¬ nosciowej — 1/1 1/1 1/1 Stosunek ciezaru jelita do ciezaru - ciala 0,129 0.060 0,100 0,111 1 Przyklad IX. Kompozycje sporzadzona jak w przykladzie V ale z usieciowanej toksyny wedlug 55 przykladu IV (frakcja rozpuszczalna o ciezarze czasteczkowym powyzej 14.000) podawano podskór¬ nie trzem królikom (H, I i J) w dawce 0,5 mg i iniekcje te powtarzano po 21 dniach. Próbki krwi (to znaczy surowicy odpornosciowej) pobierano po 60 28 dniach od pierwszego podania i przeprowadzano test na zobojetnianie surowicy stosujac sposób z * przykladu VII.Wyniki przedstawione w tabeli 3 wskazuja na 65 immunogennosc usieciowanej ST.126 748 11 Tablica 3 Iniekcja Kontrola 0,5 ml ST+ 0,5 ml PBS Królik H 0,5 ml ST + 0,5 ml surowicy odpornosciowej Królik I 0,5 ml ST + 0,5 ml surowicy odpornosciowej Królik J 0,5 ml ST + 0,5 ml surowicy odpornosciowej Rozcien¬ czenie surowicy odpor¬ nosciowej vi i/i i/i Stosunek ciezaru jelita do ciezaru ciala 0,114 0,078 0,073 0,061 20 12 Tablica 4 Iniekcja Kontrola 0,5 ml ST + 0,5 ml PBS Prosie A 0,5 ml ST + 0,5 ml surowicy odpornosciowej Prosie B 0,5 ml ST + 0,5 ml surowicy 1 odpornosciowej Prosie C 0,5 ml ST + 0,5 ml surowicy odpornosciowej Rozcien¬ czenie surowicy odpor¬ nosciowej 1/32 1/64 1/28 1/8 1/16 1/32 1/16 1/32 1/64 Stosunek ciezaru jelita do ciezaru ciala 0,111 0,054 0,062 0,920 0,065 0,076 0,108 0,055 0,059 0,095 Przyklad X. Kompozycje sporzadzona jak w przykladzie V podawano trzem prosietom (ciezar ciala 20 kg), w tym prosietom A i B 0,5 mg (dzien 0), 0,5 mg (dzien 21) oraz 5 mg (dzien 46) oraz prosieciu C 0,1 mg (dzien 0), 1 mg (dzien 21) i 5 mg (dzien 46). Pobierano próbki krwi (to znaczy surowicy odpornosciowej) po 61 dniach i test na zobojetnienie surowicy prowadzono w sposób opisa¬ ny w przykladzie VII.Wyniki przedstawione w tablicy 4 wskazuja na immunogennosc usieciowanej ST. 35 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania trwalej termicznie pochod¬ nej enterotoksyny E. coli, znamienny tym, ze trwala termicznie enterotoksyne E. coli poddaje sie reakcji z nietoksycznym dwufunkcyjnym czynnikiem sieciu¬ jacym proteiny i wyodrebnia sie tak otrzymana trwala termicznie pochodna enterotoksyny E. coli. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako dwufunkcyjny czynnik sieciujacy stosuje sie dwualdehyd, dwuketon, karbodlwuimid, izocyjanian, epichlorowcohydryne lub dwufluorek arylowy. 54 KZG Kielce. 80 egz. A4.Cena 100 zl. PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania trwalej termicznie pochod¬ nej enterotoksyny E. coli, znamienny tym, ze trwala termicznie enterotoksyne E. coli poddaje sie reakcji z nietoksycznym dwufunkcyjnym czynnikiem sieciu¬ jacym proteiny i wyodrebnia sie tak otrzymana trwala termicznie pochodna enterotoksyny E. coli.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako dwufunkcyjny czynnik sieciujacy stosuje sie dwualdehyd, dwuketon, karbodlwuimid, izocyjanian, epichlorowcohydryne lub dwufluorek arylowy. 54 KZG Kielce. 80 egz. A4. Cena 100 zl. PL