JP2965046B2 - ブタ赤痢用の減少化タンパク質のサブユニットワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は、ブタ赤痢、すなわち嫌気性スピロヘータの
トレポネーマヒョーディセンテリア［Treponema hyodys
enteriae］が原因で発生するブタの病気に有効なワクチ
ンの製造法に関する。

関連情報の開示 トレポネーマヒョーディセンテリアはブタ赤痢の主た
る病原として認められている。（１）トレポネーマヒョ
ーディセンテリアに感染したブタは、回復するとその後
のトレポネーマヒョーディセンテリア感染に対する抵抗
力ができるが、トレポネーマヒョーディセンテリアを殺
した細胞を非経口投与することによって免疫性を誘導し
ようとする努力はあまり成功せず、臨床使用には効果が
概してない。（２）殺した全細胞トレポネーマヒョーデ
ィセンテリアのバクテリンは発生させられているが、し
ばしば鉱油ベースのアジュバントを用いるか、（３）あ
るいはトレポネーマヒョーディセンテリア細胞をそのバ
クテリンとしての効果増強のため前処理することがなか
った。

トレポネーマヒョーディセンテリアの生きた非病原性
の株［strain］をワクチンとして使用することも感染し
たブタ（4,5）を予防するには十分でなかった。殺した
トレポネーマヒョーディセンテリアのバクテリンの組合
せや、非病原性のトレポネーマヒョーディセンテリアの
ワクチンも試みられた（６）。

従来法で産生したトレポネーマヒョーディセンテリア
細胞を殺した全細胞バクテリンが臨床的に製造され使用
されているが、こうした調製品の効果は、ワクチン投与
していない対照ブタに比しブタ赤痢発生が50％あると報
告された程度で、あまり高くない（７）。バクテリとし
て投与する殺したトレポネーマヒョーディセンテリア細
胞から作ったその他の調製品もほとんど成功をしておら
ず、ブタ赤痢による死亡および病床例がワクチンを投与
した動物と非投与のものとの双方に報告されている
（８）。

今日まで研究されてきたワクチン効果が十分でなかっ
た主原因は、より機能的に免疫原的な抗原をもつその他
のトレポネーマヒョーディセンテリア抗原による妨害が
あるからであろうと考えられる。感染予防的抗原に対す
る宿主応答にとって損失であることとして、感染予防的
でない強力な免疫原的抗原は、宿主動物の免疫応答の大
部分が非感染予防抗原に対して向けられるほど感染予防
的抗原よりそれだけ免疫原的である。つまり非機能的な
抗原（病気耐性を示さないもの）が機能的抗原と競合す
るのではないか、ということである。これを説明するこ
のほかの理由は、機能的抗原が非機能的抗原によって
（立体的に）隠されるか、あるいは非感染予防的抗原に
産生された抗体が感染予防抗原をブロックし、したがっ
て宿主免疫系が働くなくなるのだ、というものである。

トレポネーマヒョーディセンテリアは螺旋状の嫌気性
スピロヘータであるが、ごく最近の1988年に、研究者ら
はこの有機体の「生理学、細胞生化学、栄養学について
殆ど情報がない」と宣言している。

JoensのWO90/02565（広告日:1990年３月22日）はブタ
赤痢のサブユニットワクチンの調製法に関する。このサ
ブユニットは外層膜タンパク質とトレポネーマヒョーデ
ィセンテリアのリポ多糖とのタンパク質に富む炭水化物
の混合物で、細胞の外層膜の塩抽出物［salt extract］
として調製される。プロテイナーゼＫまたはＭ過ヨウ素
酸塩ナトリウムとこの塩抽出物との処理は、CF1マウス
モデル中の免疫原性を減殺すると言われている。SDS−P
AGEで分離され、銀で染色した感染予防抽出物は、47−4
3、35−33、14−12、および10−8kDaのバンドを有して
いた。リポオリゴ糖（LOS）をトレポネーマヒョーディ
センテリア血清型１〜７の外層膜から高温フェノール水
で抽出した（14）。これらLOSはトレポネーマヒョーデ
ィセンテリア抗原に対する抗体検出のため酵素結合イム
ノソーベントアッセイ［immunosorbent assay］におい
て抗原試薬として使用した。これはLOSがワクチンとし
ての使用に適した感染予防抗原であるのか否かの問題を
未解決のままに残すことになった。また、トレポネーマ
リポ多糖は有毒であるとする報告書もある。

ここに引例の文献がいずれも先行技術である、と自認
するものでは決してない。関連技術としてここに述べた
のは、それらの公表された技術内容にのみ基づくもので
あって、本件出願人を拘束するものではない。

発明の概要 本発明はトレポネーマヒョーディセンテリアを殺した
調製品の有効性を増強する方法に関する。その方法と
は、活性免疫感作剤としてのトレポネーマヒョーディセ
ンテリア細胞および同トレポネーマヒョーディセンテリ
ア成分のタンパク質濃度を薄めるように前処理した細胞
下［subcellular］成分とを有するワクチンまたはバク
テリンの非経口投与である。既存の培地のいずれかの中
で従来法により育成した全細胞を溶解させ、そのペレッ
ト化したライゼートをタンパク質存在量が減るように処
理する。このタンパク質を減少化した（以下、「減少化
タンパク質」）調製品を、ブタ、好ましくはトレポネー
マヒョーディセンテリアに感染する前のブタに非経口注
射により投与する。

バクテリンまたはワクチンのタンパク質濃度を薄める
ように処理された殺したトレポネーマヒョーディセンテ
リアの細胞５×10⁹個等量は、トレポネーマヒョーディ
センテリア感染に引き起こされるブタ赤痢に起因の死亡
率および罹患率を有意的に減少する。トレポネーマヒョ
ーディセンテリア感染に起因するブタ赤痢による死亡率
および罹患率双方に対する減少化タンパク質のワクチン
またはバクテリンの予防効果は、タンパク質濃度が薄ま
るよう前処理していない殺したトレポネーマヒョーディ
センテリア細胞または細胞下成分からなる類似の調製品
による効果より優れている。

トレポネーマヒョーディセンテリア細胞のLOS様また
はLPS様成分に対するブタ細胞系およびブタ体液性免疫
系による全系応答が関与しているらしいことまでは分か
っているが、抗原の免疫反応についての正確な性質は知
られていない。トレポネーマヒョーディセンテリア細胞
のPLS様成分に対するこの免疫反応は、トレポネーマヒ
ョーディセンテリアのLPS様成分に対する特異的免疫応
答を引き出すこと［elicitation］を妨害するとみられ
るトレポネーマヒョーディセンテリア細胞その他の源か
らの外来性タンパク質を減少させることにより促進され
る傾向にある（９）。しかしプロテイナーゼ処理したペ
レット化ライゼートで得た免疫応答は精製LPSで得たも
のより優れている。

図面の簡単な説明 図１はPK（プロテナーゼＫ）消化に対する免疫応答
（第Ａ列，第Ｄ列および第Ｅ列）と、精製LPSに対する
免疫応答（第Ｂ列および第Ｃ列）とのウエスタンブロッ
トアッセイによる比較例である。

好ましい実施例の詳細な説明 １実施例において本発明は、ワクチン接種後にチャレ
ンジしたブタ統計上有意な罹患率（粘血便）減少度の観
察できるように、タンパク質濃度を実質的に薄めたトレ
ポネーマヒョーディセンテリアから得られたワクチン調
製品に関係する。好ましくはこの調製品は10,000ドルト
ンまたはそれ以上の１μg/ml以下の手をつけていないタ
ンパク質を含有するのがよい。また好ましくは、10,000
ドルトン以上の大きさの全細胞ライゼートタンパク質の
90％以上が、10,000ドルトン以下に小さい断片に減少さ
れているのがよい。

トレポネーマヒョーディセンテリア株（好気性、嫌気
性ともに）は、米国ならびに外国の培養菌寄託所あるい
は私的な培養菌銀行から入手可能である。トレポネーマ
ヒョーディセンテリアのいくつかの種類の血清型（現在
７つ）が存在すること、およびそれらが感受性動物にブ
タ赤痢を引き起こすものであることが知られている。ト
レポネーマヒョーディセンテリアの単離法は文献（10）
に既述されている。適切な単離体としてはアメリカンタ
イプカルチャコレクションから得られる血清型２の株番
号31212（またはB204）がある（a,11）。しかしブタに
疾病を引き起こすことができるトレポネーマヒョーディ
センテリアから得た単離体ならいずれも本発明の実施に
使えるものである。

トレポネーマヒョーディセンテリア細胞は抗体培地で
もあるいは液体培地でも、いずれの増殖培地でも培養で
きる。7.5％のウマ血清（HS）、0.5％の酵母抽出物、VP
I嫌気性塩（12）ならびに0.05％のＬ−システイン含有
トリプティケースソイブイヨン（TSB）が本発明実施の
ためのトレポネーマヒョーディセンテリア細胞を調製す
るのに適切である。もっともこのほかの適切な培地につ
いては文献（13）に知られている。トレポネーマヒョー
ディセンテリア細胞は、35〜40℃で、酸素を減少させた
雰囲気中で嫌気的または微好気的に生育させる。成長後
はホルマリン、merthiolate（商標）あるいは熱処理等
の標準的方法でトレポネーマヒョーディセンテリア細胞
を殺し（merthiolateが好ましいが）、遠心分離または
限外濾過によって集める。トレポネーマヒョーディセン
テリア細胞はまた、圧力処理、あるいは音波処理のよう
な物理的方法により、あるいは周囲の培地のpHや張性を
変化させたりして行う細胞溶解工程を経て殺すことでも
よい。

適切なトレポネーマヒョーディセンテリア細胞を調製
し溶解したら、そのライゼートの不可溶成分（例えば膜
［membrane］）をその調製品のタンパク質濃度を薄める
ために処理する。このようなタンパク質濃度減少化はプ
ロテイナーゼＫのようなタンパク質分解酵素による処理
で行うことができる。文献には多数のタンパク質分解酵
素が公表されているが、本調製品のようなタンパク質濃
度の有意的減少をもたらすものであれば、どんな酵素
も、あるいは物理的または化学的な処理のどんなもので
も、本方法の実施に適用可能である。ここで処理として
は、単一酵素の使用ばかりでなく、種々の酵素の経時的
または同時的な組合せの使用も含む。タンパク質減少化
が発生する温度、pHその他の物理的値に関する特定条件
は、使用される酵素あるいはタンパク質減少系に依存す
るものであり、所望の感染予防効果が得られる限り可変
である。例えばプロテイナーゼＫが使われるときは、ペ
レット化ライゼートの懸濁液に市販のプロテイナーゼＫ
調製品を加え、好ましくは次にこれを56℃で２時間イン
キュベートし、さらに37℃で12時間インキュベートす
る。

SDS−PAGEで全細胞ライゼートを消化したプロテイナ
ーゼＫを分析すると、クーマシーブルー染色法で３〜４
の手をつけられていないタンパク質のバンドが見られ
る。これらのタンパク質バンドは30kDa〜40kDaの見かけ
分子質量をもっている（注意：これらのバンドはスピロ
ヘータ鞭毛に関係するタンパク質と一致している）。こ
れらタンパク質の１個（最大分子質量）以外は全部、プ
ロテイナーゼＫの10倍濃度で消化することによってこの
調製品から除去することができる。上記した手をつけて
いないタンパク質のほかに、染料最前部［dye front］
の先のゲル領域中の塗布材［smear］のように無数の低
分子質量ペプチド（＜10kDa）が観察できる。未消化の
全細胞ライゼートのタンパク質の輪郭［profilelは20〜
150kDaの見かけ分子質量の多数のタンパク質バンド（＞
50）からなり、染料最前部近傍には検出可能なペプチド
の塗布材はない。PK消化および全細胞ライゼート共に16
〜24kDaの３つの主バンドをもつLPS様材を有している。
LPSバンドはクーマシーブルーで染色されないが、銀染
色法で検出可能である。18〜20kDaバンドはウエスタン
プロット分析による抗血清で認められる主要バンドであ
るが、その他の２つのバンドも顕著である。

PK消化を電子顕微鏡で検査した。電子顕微鏡写真はト
レポネーマ鞭毛と一致するもとのままの［intact］構造
を現した。PK消化の構成もまた、微生物の細胞壁（ペプ
チドグリカン）、リボソーム、核酸、ホスホメンブレン
物質［phosphomembranous material］を含んでいる。ペ
プチドグリカンおよびその他の物質は、ワクチンの調製
にとってアジュバンド的性質を与えるものと考えられ
る。

好ましくは、トレポネーマヒョーディセンテリア細胞
および細胞下成分の減少化タンパク質懸濁液は１服用量
当たり少なくとも約５×10⁹のトレポネーマヒョーディ
センテリア細胞と等量のものを含有するが、１服用量当
たり少なくとも１×10¹⁰のトレポネーマヒョーディセン
テリア細胞に等しい抗原レベルがよい。この調製品は鉱
油、代謝性有機油、乳化剤あるいはメタルソルトのよう
なワクチン効果を高めるものとして文献上知られた種々
のアジュバンド調製品と混合して使用することができ
る。好ましいアジュバンドとしては、フロイントの不完
全アジュバンドとかスクアレン（鮫油）がある。鉱油は
発癌物質かもしれないし、また不利な反応をするかもし
れないので好ましくないが、所望なら使用も可能であ
る。種々のアジュバンド調整品を使用すればこのワクチ
ンの、あるいはすべてのワクチンの効果を向上させるか
もしれないが、本方法の実施にとり、その使用は必須で
ないことに注意されるべきである。IgG応答よりもIgM応
答を誘導することが好ましいアジュバンドの使用こそ好
ましい。

この方法で調製したワクチンを非経口、一般に筋肉注
射もしくは皮下注射でブタに投与する。ブタ赤痢の症状
をまだ示していなくて健康なブタに投与したとき、この
ワクチンは最も効果的である。ワクチンは２〜３週間の
間隔をあけて少なくとも２回の服用を連続して投与する
ことが好ましい。これ以外の免疫感作計画でもよく、従
来法により決定してよい。

本発明の方法については以下の実験例で詳しく説明す
る。

例１ ブタから単離しＢ−204と指定されているトレポネー
マヒョーディセンテリア血清型２の１株を、5.0％ウマ
血清（HS）、0.5％酵母抽出物、VPI嫌気性ソルト（12）
および0.05％Ｌ−システイン支持のトリプティケース
［trypticase］大豆ブイヨンでできた液体媒地で純粋培
養した。この培養体を、39℃の10％CO₂、10％H₂および8
0％N₂の雰囲気中で12時間成長させた。この12時間以内
にトレポネーマヒョーディセンテリアの成長の大半は止
まった。トレポネーマヒョーディセンテリア細胞は次に
1:10,000のメルチオレート［merthiolate］を添加して
殺した。殺した細胞は20,000×ｇで45分間遠心分離して
収集し、殺菌した0.85％生理的食塩水中で再懸濁し、フ
レンチプレス細胞（5,000psi）で加圧して溶解し、その
溶解液を100,000×ｇで２時間遠心分離することでトレ
ポネーマヒョーディセンテリア細胞の細胞膜を収集し
た。この膜材は殺菌したフォスファート緩衝の0.85％生
理的食塩水（pH7.2）中で再懸濁しプロテアーゼ型XI−
Ｓ（プロテイナーゼＫ）で56℃で２時間処理し、次いで
さらに37℃で12時間インキュベートした。プロテアーゼ
処理後、トレポネーマヒョーディセンテリア細胞下成分
を４℃で貯蔵し、収集したワクチンとした。この収集ワ
クチンを25％不完全フロイントアジュバンド（FIA）と
混合し、試験動物に注射する油中水懸濁液を作った。同
様な調製品をFIA中の全細胞の未処理トレポネーマヒョ
ーディセンテリア細胞と、FIA中の未処理トレポネーマ
ヒョーディセンテリア細胞膜とで作り、タンパク質減少
化の効果をテストした。

減少化タンパク質調製品を、未処理トレポネーマヒョ
ーディセンテリア膜を対照にしてSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（SDS−PAGE）アッセイで外層膜のタン
パク質濃度のテストをした。適切なプロトコルについて
はMerrillら、Science,211:1437（1981年）参照。未処
理トレポネーマヒョーディセンテリア膜は銀染色法後ゲ
ル中に明らかに多数のタンパク質バンドを持つが、減少
化タンパク質トレポネーマヒョーディセンテリア膜には
３つのタンパク質バンドしか見つからなかった。これは
生の、つまり天然のトレポネーマヒョーディセンテリア
膜タンパク質の大半がプロテイナーゼＫ処理によって特
定タンパク質を検出するSDS−PAGE/銀染色法のアッセイ
能力以下のレベルに減少化されたことを示している。

ブタ赤痢にかかっていないことが分かっている群から
16頭のSPF［Specific Pathogen Free］、つまり特定病
原菌のないブタの目方を測り、上記調製品のテストに使
用した。そしてブタはランダムにグループに分けた。４
頭のブタに１回の服用量当たり４×10¹⁰トレポネーマヒ
ョーディセンテリア細胞に等量のFIA/回数分の減少化タ
ンパク質ワクチンを２週間おきに２回服用で投与した。
また４頭のブタにプロテイナーゼＫで処理していない全
細胞トレポネーマヒョーディセンテリアをFIA中の服用
量当たり２×10¹⁰トレポネーマヒョーディセンテリア細
胞の服用量だけ２週間おきに２回投与した。別の４頭の
ブタには１回の服用量当たり４×10¹⁰トレポネーマヒョ
ーディセンテリア細胞に等量のFIA/回数分の減少化タン
パク質ワクチンを２週間おきに２回服用で投与した。こ
の実験グループにつき表１にまとめてある。

第２回目のワクチンから10日後に実験ブタ全部を24時
間断食させ、再度体重測定してから、1.69×10¹¹の活発
に生育している自動性トレポネーマヒョーディセンテリ
ア細胞を経口接種した。ワクチン接種していない対照ブ
タを、この経口接種の前後を通じてワクチンを接種した
ブタと継続的に接触させた。そして全部のブタを接触後
21日間毎日観察し、ブタ赤痢の徴候（例えば粘血便）を
記録した。21日間の観察期間終了時に生き残ったブタ全
部を再測定し、殺し、死体解剖した。螺旋状の結腸およ
び盲腸の腸内にある内容物からトレポネーマヒョーディ
センテリアを再単離するため試料を採取した。ブタ赤痢
に典型的な発疹を死体解剖中記録した。

全グループの投与後の観察結果は表２の通りである。

実験結果 ブタ赤痢に典型的な粘血便（下痢罹患率）は，ワクチ
ン接種していない対照動物につき毎日の観察で21.7％だ
け見られた。粘血便はタンパク質減少化法で処理してい
ないトレポネーマヒョーディセンテリア膜のワクチンを
接種したブタにつき毎日の観察で16.1％見られた。未処
理トレポネーマヒョーディセンテリアの全細胞を接種さ
れたブタは何らの粘血便症状を示さなかった。減少化タ
ンパク質トレポネーマヒョーディセンテリアワクチンを
接種した４頭のブタはどれもブタ赤痢に典型的な粘血便
症状を示さなかった。こうしたデータは減少化タンパク
質トレポネーマヒョーディセンテリアワクチンが、ワク
チン処理していない対照ブタに比較しブタ赤痢に典型的
な血便症状を減らす効果があることを明確に示してい
る。また、粘血便に対する予防効果は報告されている方
法（７）に従い調製した未処理全細胞トレポネーマヒョ
ーディセンテリアのものに見られる効果よりも有意的に
大きかった。

この予防効果はさらに、従来法で殺した未処理の全細
胞トレポネーマヒョーディセンテリアワクチンを接種し
たブタの平均体重日毎増加（0.47ポンド／日）に比較し
た場合の減少化タンパク質トレポネーマヒョーディセン
テリアのワクチンを接種したブタの平均体重日毎増加
（0.98ポンド／日）にも表れていた。もっとも対照ブタ
はこのテストではあまり差を示さなかった。

実験後、４頭のワクチン非接種の対照ブタのうち２頭
から（50％）、また、従来法で殺した未処理の全細胞ト
レポネーマヒョーディセンテリアワクチンを接種した４
頭のブタからは１頭から（25％）、各々トレポネーマヒ
ョーディセンテリアを再単離したが、減少化タンパク質
トレポネーマヒョーディセンテリアワクチンを接種した
４頭のブタからは１頭もトレポネーマヒョーディセンテ
リアを再単離することがなかった。これらのデータは本
発明の方法で調製した減少化タンパク質トレポネーマヒ
ョーディセンテリアワクチンがブタ赤痢の症状（粘血
便）や、トレポネーマヒョーディセンテリア感染による
体重損失、およびトレポネーマヒョーディセンテリアの
再単離に対して本発明の調製品を接種のブタを予防する
ことを明確に示している。さらにこの予防効果は単に未
接種の対照ブタに比較して優れているばかりでなく、従
来法で調製した殺した全細胞トレポネーマヒョーディセ
ンテリアまたは膜トレポネーマヒョーディセンテリアの
ワクチに比較しても優れている。ブタに投与する前にト
レポネーマヒョーディセンテリアワクチンのタンパク質
成分を減少させる方法は、これまで利用できた方法より
も優れたトレポネーマヒョーディセンテリア感染由来の
ブタ赤痢に対してブタをよりよく予防するものであるこ
とが明らかである。

例２ 上述した研究の継続として、ブタ赤痢に罹っていない
群から30頭のSPF（特定病原菌のない）ブタを体重測定
し、減少化タンパク質膜、未処理膜、または未処理全細
胞という種々のものから作った調製品をテストするため
実験した。ブタをランダムにグループに分けた。６頭の
ブタに１服当たり２×10¹⁰のトレポネーマヒョーディセ
ンテリア細胞に相当する量の減少化タンパク質ワクチン
であってFIAを２週間間隔で２服投与した。別の６頭の
ブタには１服当たり２×10¹⁰トレポネーマヒョーディセ
ンテリアでFIAをプロテイナーゼＫで処理していない全
細胞トレポネーマヒョーディセンテリアを３週間間隔で
２服投与した。また別の６頭のブタには１服当たり２×
10¹⁰トレポネーマヒョーディセンテリア細胞と等量中に
プロテイナーゼＫで処理していないFIAのトレポネーマ
ヒョーディセンテリアワクチンを３週間間隔で２服投与
した。減少化タンパク質ワクチンの服量／反応をテスト
するため、ブタ２頭のグループの複数にFIAの減少化タ
ンパク質ワクチンの４倍、1/2倍、1/4倍を３週間おいて
２服投与した。全実験動物は１大広間に一緒にし、給餌
し個々に取り扱った。これら実験された複数のグループ
につき表３に示す。

２回目のワクチ接種後８日目に全実験ブタを給餌しな
いで24時間おき、再度体重測定してから５×10¹⁰の活発
に成長している自動性［motile］トレポネーマヒョーデ
ィセンテリア細胞を経口接種してチャレンジした。これ
と同様なチャレンジを翌日も繰り返した（第２回接種後
９日目）。ブタ全頭数は一緒にしてあるので、ワクチン
を接種していない対照ブタはチャレンジの前後を通じて
接種ブタと常に接触状態においてある。ブタ全頭数を第
２回チャレンジ後25日間毎日観察し、ブタ赤痢の症状な
ら何でも（例えば粘血便）記録した。25日の観察期間経
過時点で、生き残ったブタ全頭数を再度体重測定し、殺
し、死体解剖した。トレポネーマヒョーディセンテリア
を再単離するための螺旋結腸、回盲腸部口および盲腸の
嚢内容物をサンプルとして採取した。死体解剖中にはブ
タ赤痢に典型的な発疹が記録された。

全グループについての実験後の観察結果を表４に示
す。

実験結果 ブタ赤痢に典型的な粘血便がワクチン非接種の対照動
物の5/6（83％）に観察された。粘血便はまた、タンパ
ク質減少化法で処理していないトレポネーマヒョーディ
センテリア膜で調製したワクチンを接種したブタの5/6
（83％）に観察された。全細胞未処理トレポネーマヒョ
ーディセンテリア接種のブタの2/6（33％）が粘血便を
示した。しかし、減少化タンパク質トレポネーマヒョー
ディセンテリアのワクチンを接種したブタ10頭は、ワク
チンを４倍、１倍、1/2倍で服用したもののいずれもブ
タ赤痢に典型的な粘血便を１頭たりとも示さなかった。
減少化タンパク質トレポネーマヒョーディセンテリアワ
クチンが１服につき1/4に薄められたとき、このワクチ
ンを接種されたブタ２頭のうち１頭が粘血便を示した
が、これは減少化タンパク質トレポネーマヒョーディセ
ンテリアワクチンに対する用量反応を示すものである。
これらのデータは減少化タンパク質トレポネーマヒョー
ディセンテリアワクチンがワクチン非接種の対照ブタに
比しブタ赤痢に典型的な粘血便の頻度を減少するのに優
れていることを明白に示している。さらに、粘血便の予
防効果は従来技術（７）で調製した未処理全細胞トレポ
ネーマヒョーディセンテリアワクチンでみられたものよ
り有意に大きかった。

この予防効果は、日平均体重増加率にも表れ、ワクチ
ン非接種の対照ブタ（0.37ポンド／日）、従来の殺した
未処理全細胞トレポネーマヒョーディセンテリアワクチ
ン接種のブタ（0.63ポンド／日）に比し減少化タンパク
質トレポネーマヒョーディセンテリアワクチン接種のブ
タ（0.91ポンド／日）は大きかった。死亡率は減少化タ
ンパク質トレポネーマヒョーディセンテリアワクチン接
種のブタは、未処理全細胞ワクチン接種のブタおよびワ
クチン非接種の対照ブタに比し100％減少した。

１倍の減少化タンパク質ワクチン接種のブタ（グルー
プ３）は日平均体重増加（ｐ＝0.065）測定でチャレン
ジに対して予防効果があり、罹患率（粘血便）も減らし
た（ｐ＝0.007）。1/2倍の減少化タンパク質ワクチン
（グループ４）は、罹患率（粘血便）を減らしたが（ｐ
＝0.088）、日平均体重増加は向上させなかった（ｐ＝
0.317）。1/4倍の減少化タンパク質ワクチン（グループ
５）は罹患率（粘血便）測定で有意的に予防効果を示さ
ず（ｐ＝0.241）、日平均体重増加（ｐ＝0.739）も示さ
なかった。全分析はクラスカル・ワリスの変動に関する
ワンウエイ分析によった。上記のように、減少化タンパ
ク質ワクチンは少なくとも約1/2倍濃度で有意な予防効
果を統計的に示す。調製品は、５〜8,000ダルトンまた
はそれ以上の１μg/ml以下処女タンパク質を使用時に含
有していた。

６頭の非接種対照ブタのうちの３頭（50％）から、ま
た、従来法の殺した未処理全細胞トレポネーマヒョーデ
ィセンテリアワクチン接種のブタ６頭のうち３頭（50
％）からは、チャレンジ後にそれぞれトレポネーマヒョ
ーディセンテリアを再単離したが、４倍、１倍、1/2倍
の減少化タンパク質トレポネーマヒョーディセンテリア
ワクチンの接種のブタ10頭からは１頭のみしかトレポネ
ーマヒョーディセンテリアを再単離しなかった。

これらのデータは、本発明法で調製した減少化タンパ
ク質トレポネーマヒョーディセンテリアワクチンは、同
ワクチン接種のブタからブタ赤痢の諸症状（死亡、粘血
便）、トレポネーマヒョーディセンテリア感染による体
重減少、およびトレポネーマヒョーディセンテリアの再
単離に対してブタを予防することを明らかに示してい
る。しかもこの予防効果は、ワクチン非接種の対照ブタ
に対してだけでなく、殺した全細胞すなわち従来法で調
製した膜トレポネーマヒョーディセンテリアワクチンに
対しても著しく優れている。ブタへの投与前にトレポネ
ーマヒョーディセンテリアワクチンのタンパク質濃度を
薄めるこの方法は、これまで行うことができた方法に比
し優れた効果をもつもので、トレポネーマヒョーディセ
ンテリア感染によるブタ赤痢に対する予防効果を明らか
に促進する。

表５、６、７はプロテイナーゼＫ消化の全細胞ライゼ
ートおよび内毒素の調製品の利点を示す。表５では盲腸
が一層重くなり総体的病変からの解放状態の向上がある
ことが見られる。表６は、チャレンジ後にワクチン接種
マウスから採集したトレポネーマヒョーディセンテリア
の数が最も効果的にプロテイナーゼＫ消化により減少し
ていることを示している。最後に表７はコロニー形成単
位を比較的低水準な数に向かわしめる傾向を示してい
る。

例３ 本発明のプロテイナーゼＫ消化の減少化タンパク質全
細胞ライゼートを接種したブタからとった血清は、Wann
emuehlerらの感染と免疫［Infection and Immunity］、
56:3032−39（1988年12月）に記載の16〜20kDaのLPS抗
原と免疫反応性を示すことを発見した。しかし、フェノ
ール／水抽出のLPSでワクチン接種したブタからとった
血清は全細胞ライゼートと反応しなかった。これは精製
LPSが免疫応答を誘発しないことを示唆する。

トレポネーマヒョーディセンテリアのリポ多糖［Lipopo
lysaccharide］（LPS）の調製 ５％のウマ血清および１％の酵母抽出物で補助したト
リプティケース大豆ブイヨン［trypticase soy broth］
（TSB）中でトレポネーマヒョーディセンテリアを一晩
育成した。その細胞を遠心分離して採取し、リン酸緩衝
液生理的食塩水中で再懸濁し、再度遠心分離機にかけ
た。この細胞ペレットをパイロージェンの無い水２重量
部［vol/wt］と88％フェノールの１重量部［vol/wt］中
で再懸濁した。この細胞懸濁液を２時間室温にて撹拌
し、次に４℃で48時間撹拌した。フェノールと水の各層
は４℃で７日間かかって分離させた。この水の層（上
側）を採取し0.5％NaClで透析した。その溶液をRNアー
ゼ（10μg/ml）で２時間消化し、その後プロテイナーゼ
Ｋ（10μg/ml）で２時間消化した。この溶液を68℃にま
で温め、等量の温かい88％フェノールを加えた。この物
質を68℃で15分間撹拌した。その溶液を冷やし、各層を
遠心分離（500×ｇ）した。その水を回収し0.5％NaClで
透析した。沈殿物を遠心分離（7,500×ｇ）で集め、冷
却エタノールで１度洗浄した。その沈殿物をパイロージ
ェンのない最小限量の水中に溶かし急速冷凍し（ドライ
アイスとアルコール浴で）、凍結乾燥し、マイナス20℃
で貯蔵した。

プロテイナーゼＫで消化した物質とLPSをブタにワクチ
ン接種 ６週間齢の（特定病原菌のない、つまりSPFの）交配
種ブタをトレポネーマLPSまたはプロテイナーゼＫ消化
の全細胞ライゼート（PK消化）のいずれかを100μg/m
l、１×10¹⁰細胞の等量服用で筋肉内注射でワクチン接
種した。12日後、これらのブタを同一調製品で再接種し
た。各抗原服用を殺菌生理食塩水0.5ml中に混ぜ合わ
せ、0.5mlのフロイント不完全アジュバンド（FIA）とブ
タ１頭当たり全部で1.0mlの接種物で混合した。ウエス
タンブロット分析に使用するため第２回目の免疫感作
後、血清を10日間採集した。

ウエスタンブロットの説明 トレポネーマヒョーディセンテリア細胞を音波処理、
急速冷凍、および凍結乾燥により溶解した。全細胞ライ
ゼート（WCL）を１〜2mg/ml（wt/vol）の殺菌生理食塩
水中で再懸濁した。このWCLをラエムリの処理緩衝液と
混合し、５分間沸騰させた後、同物質を電気泳動法で分
離した。タンパク質250μｇ含有のWCL1服を、予備の各
ポリアクリルアミドゲル（12％）に添加し、分離後、抗
原をナイロン膜に電気泳動で移した。これらの膜は５％
スキムミルクでブロックし、トリス緩衝生理食塩水で洗
浄し、特異的抗体サンプルで反応させた。ブタ抗血清で
インキュベーション後、このナイロン膜を洗浄し、アル
カリホスファターゼ結合のヤギの対ブタ免疫グロブリン
（μ特異的、またはｃ特異的）と反応させた。基質溶液
はトリス緩衝液（pH8.0）中のファーストレッドとナフ
トールAS−MXフォスフェートとで構成した。

ウエスタンブロット分析結果は次のことを示した。す
なわち、プロテイナーゼＫ消化でワクチン接種したブタ
（図１において列A,D及びＥ）はWCLのLPS成分に対する
免疫グロブリンＭ抗体を発生［develop］させるが、LPS
接種したブタ（列B,C）はLPS特異的抗体を発生すること
はできなかったということである。免疫グロブリンＧの
免疫応答を調べたとき、抗体はプロテイナーゼＫ消化中
に発見された処女タンパク質に対しては勿論、PLS成分
に対しても検出された。ここでも、LPSワクチン接種し
たブタはトリポネーマ特異的抗体を発生させなかった。

引例した参考文献 a.Glockら、米国特許第4,100,272号 b.Goodnow,米国特許第4,152,413号 c.Harris,米国特許第4,152,414号 d.Harris及びGoodnow,米国特許第4,152,415 e.Setsuo,米国特許第4,794,105号 f.Parizek,米国特許第4,758,517号 g.Lysons,米国特許第4,748,019号 h.Glock,米国特許第4,203,968号 i.Gabe、欧州特許第282,965号 j.Coloe,WP88/04555 k.Parizek,欧州特許第201,976号 1.Harris,D.L.,Glock,R.D.,Christiansen,C.R.及びKiny
on,J.M.獣医学 小動物診療所 67:61（1972年） 2.Joens,L.A.,Whipp,S.C.,Glock,R.D.,及びM.E.Neussen
感染と免疫39（１）:460（1983年） 3.Fernie,D.S.,Ripley,P.H.,及びWalker,P.D.学術獣医
科学35−217（1983年） 4.Hudson,M.J.,T.J.L.,Lysons,R.J.及びWellstead,P.D.
英国獣医学130（２）：（1974年） 5.Hudson,M.J.,T.J.L.,Lysons,R.J.及びPrescott,J.F.
学術獣医科学21:366（1976年） 6.Lysons,R.J.国際特許番号WO 85/03875（1985年３月） 7.Parizek,J.,Stewart,R.,Brown,K.及びBlevins,D.獣医
学 1985年７月:80（1985年） 8.Olson,L.D.,及びDayalu,K.I..G.A.若年ブタ会議1987:
122（1987年） 9.Greer,J.M.及びWannemuehler,M.J.感染と免疫57
（３）:717（1988年） 10.Jonkinson,S.R.及びWingar,C.R.Vet.Rec.109:384（1
981年） 11.Kinyon,J.M.及びHaris,D.L.Vet.Rec.95:219（1974
年） 12.Holdeman,L.V.,Cato,E.P.及びMoore,W.E.C.嫌気性生
物研究所マニュアル第四版バージニア ポリテクニック
インスティチュート（1977年） 13.Stanton,T.B.及びLebo,D.F.獣医微生物18:177（1988
年） 14.Halter及びJones感染と免疫 56:3152−56（1988年1
2月） 15.Wannemuhler,M.J.,Hubbard,R.D.及びGreer,J.M.感染
と免疫 56:3032−39（1988年12月） 16.Joens,L.A.,Nord,L.A.,Kinyon,J.M.及びEgan,I.T.,
J.臨床微生物学 15:249−52（1982年）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 オストル、アンソニー ジィ. アメリカ合衆国、50063 アイオワ州、 ダラス センター、ピーオーボックス 522 (72)発明者 ワンネミューラー、マイケル ジェイ アメリカ合衆国、50010 アイオワ州、 エームズ、ジュウエル ドライブ 612 (56)参考文献 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍ ｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．56，Ｎｏ．12 （1988），Ｐ．3032−3039 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 39/00 - 39/44

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】トレポネーマヒョーディセンテリア細胞ラ
   イゼートの不溶性成分から調整した免疫原的調整品であ
   って、同細胞ライゼートの不溶性成分に比し実質的に減
   少されたタンパク質濃度をなす薬学許容のキャリヤ含有
   のワクチン。
2. 【請求項２】感染前にブタをワクチンで免疫させること
   によりトレポネーマヒョーディセンテリア感染に起因す
   る罹患率を統計的有意に減少させる請求項１のワクチ
   ン。
3. 【請求項３】殺した全細胞トレポネーマヒョーディセン
   テリアワクチンが示す減少した罹患率よりも一層減少し
   た罹患率を示すことを特徴とする請求項２のワクチン。
4. 【請求項４】30,000〜40,000ドルトンの見かけ分子量を
   もつタンパク質以外の10,000ドルトン以上の見かけ分子
   量タンパク質は、通常の荷電による銀染色法では上記調
   整品中に検出できないことを特徴とする請求項１のワク
   チン。
5. 【請求項５】タンパク質濃度が酵素で減少されている請
   求項１のワクチン。
6. 【請求項６】酵素がプロテイナーゼＫの特徴的な基質特
   異性をもつものである請求項５のワクチン。
7. 【請求項７】上記調整品がトレポネーマヒョーディセン
   テリア細胞の外層膜抽出物から調整されている請求項１
   のワクチン。
8. 【請求項８】トレポネーマヒョーディセンテリア細胞ま
   たは細胞下膜成分のタンパク質濃度を酵素で減少するこ
   とを特徴とする請求項１のワクチンの調整方法。
9. 【請求項９】タンパク質濃度をプロテイナーゼＫの特徴
   的な基質特異性をもつ酵素で減少する請求項８の方法。
10. 【請求項１０】免疫学的に有効な量の請求項１〜７のい
    ずれかのワクチンを敏感なブタに投与することを特徴と
    するトレポネーマヒョーディセンテリアに対するブタの
    抵抗力を強化する方法。
11. 【請求項１１】トレポネーマヒョーディセンテリア細胞
    から作る抗原調整品であって、トレポネーマヒョーディ
    センテリアに対するブタの抵抗力を強化する混合物の製
    造における上記トレポネーマヒョーディセンテリア細胞
    に比し実質的に減少したタンパク質濃度のものの使用
    法。
12. 【請求項１２】精製リポ多糖トレポネーマヒョーディセ
    ンテリアワクチンによる減少した罹患率より一層減少し
    た罹患率を示すことを特徴とする請求項２のワクチン。