JPH06505226A - ブタ赤痢用の減少化タンパク質のサブユニットワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ブタ赤痢用の減少化タンパク質のサブユニットワクチン発明の背景 発明の分野 本発明は、ブタ赤痢、すなわち嫌気性スピロヘータのトレポネーマヒョーデイセ ンテリア［Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅｌが原因て発生 するブタの病気に有効なワクチンの製造法に関する。

関連情報の開示 トレポネーマヒョーディセンテリアはブタ赤痢の主たる病原として認められてい る。（１）トレポネーマヒョーディセンテリアに感染したブタは、回復するとそ の後のトレポネーマヒョーディセンテリア感染に対する抵抗力ができるが、トレ ポネーマヒョーディセンテリアを殺した細胞を非経口投与することによって免疫 性を誘導しようとする努力はあまり成功せず、臨床使用には効果か概してない。

（２）殺した全細胞トレポネーマヒョーディセンテリアのバクテリンは発生させ られているが、しばしば鉱油ベースのアジュバントを用いるか、（３）あるいは トレポネーマヒョーディセンテリア細胞をそのハクテリンとしての効果増強のた め前処理することかなかった。

トレポネーマヒョーディセンテリアの生きた非病原性の株［５ｔｒａｉｎ］をワ クチンとして使用することも感染したブタ（４，５）を予防するには十分でなか った。殺したトレポネーマヒョーディセンテリアのバクテリンの組合せや、非病 原性のトレポネーマヒョーディセンテリアのワクチンも試みられた（６）。

従来法で産生じたトレポネーマヒョーディセンテリア細胞を殺した全細胞バクテ リンが臨床的に製造され使用されているが、こうした調製品の効果は、ワクチン 投与していない対照ブタに比しブタ赤痢発生か５０％あると報告された程度で、 あまり高くない（７）。バクテリンとして投与する殺したトレポネーマヒョーデ ィセンテリア細胞から作ったその他の調製品もほとんど成功をしておらず、ブタ 赤痢による死亡および病床例がワクチンを投与した動物と非投与のものとの双方 に報告されている（８）。

今日まで研究されてきたワクチン効果か十分でなかった主原因は、より機能的に 免疫原的な抗原をもつその他のトレポネーマヒョーディセンテリア抗原による妨 害があるからであろうと考えられる。感染予防的抗原に対する宿主応答にとって 損失であることとして、感染予防的でない強力な免疫原的抗原は、宿主動物の免 疫応答の大部分か非感染予防抗原に対して向けられるほど感染予防的抗原よりそ れだけ免疫原的である。つまり非機能的な抗原（病気耐性を示さないもの）が機 能的抗原と競合するのではないのか、ということである。これを説明するこのほ かの理由は、機能的抗原が非機能的抗原によって（立体的に）隠されるか、ある いは非感染予防的抗原に産生された抗体か感染予防抗原をブロックし、したかっ て宿主免疫系か働（なくなるのだ、というものである。

トレポネーマヒョーディセンテリアは螺旋状の嫌気性スピロヘータであるが、ご く最近の１９８８年に、研究者らはこの有機体の「生理学、細胞生化学、栄養学 について殆ど情報がない」と宣言している。

Ｊｏｅｎｓの１０９０１０２５６５　（公告臼：　１９９０年３月２２日）はブ タ赤痢のサブユニットワクチンの調製法に関する。このサブユニットは外層膜タ ンパク質とトレポネーマヒョーディセンテリアのリポ多糖とのタンパク質に富む 炭水化物の混合物で、細胞の外層膜の塩抽出物［５ａｌｔ　ｅｘｔｒａｃｔ］と して調製される。プロテイナーゼＫまたはＭ過ヨウ素酸塩ナトリウムとこの塩抽 出物との処理は、ＣＦＩマウスモデル中の免疫原性を減殺すると言われている。

５Ｏ８−ＰＡＧＥで分離され、銀で染色した感染予防抽出物は、４７−４３．３ ５−３３．１４−１２、および１０−８　ｋＤａのバンドを有していた。リボオ リゴｍ　（ＬＯ５）をトレポネーマヒョーディセンテリア血清型１〜７の外層膜 から高温フェノール水で抽出した（１４）。これらＬＯ３はトレポネーマヒョー ディセンテリア抗原に対する抗体検出のため酵素結合イムノソーペントアッセイ ［ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ］において抗原試薬として使用し た。これはＬＯ５がワクチンとしての使用に適した感染予防抗原であるのか否か の問題を未解決のままに残すことになった。また、トレポネーマリポ多糖は有毒 であるとする報告書もある。

ここに引例の文献がいずれも先行技術である、と自認するものでは決してない。

関連技術としてここに述べたのは、それらの公表された技術内容にのみ基づくも のであって、本件出願人を拘束するものではない。

発明の概要 本発明はトレポネーマヒョーディセンテリアを殺した調製品の有効性を増強する 方法に関する。その方法とは、活性免疫感作剤としてのトレポネーマヒョーディ センテリア細胞および同トレポネーマヒョーディセンテリア成分のタンパク質濃 度を薄めるように前処理した細胞下［５ｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌ成分とを含有す るワクチンまたはバクテリンの非経口投与である。既存の培地のいずれかの中で 従来法により育成した全細胞を溶解させ、そのペレット化したライゼートをタン パク質存在量が減るように処理する。このタンパク質を減少化した（以下、「減 少化タンパク質」）調製品を、ブタ、好ましくはトレポネーマヒョーディセンテ リアに感染する前のブタに非経口注射により投与する。

バクテリンまたはワクチンのタンパク質濃度を薄めるように処理された殺したト レポネーマヒョーディセンテリアの細胞５×１０９個等量は、トレポネーマヒョ ーディセンテリア感染に引き起こされるブタ赤痢に起因の死亡率および罹患率を 有意的に減少する。トレポネーマヒョーディセンテリア感染に起因するブタ赤痢 による死亡率および罹患率双方に対する減少化タンパク質のワクチンまたはバク テリンの予防効果は、タンパク質濃度が薄まるよう前処理していない殺したトレ ポネーマヒョーディセンテリア細胞または細胞上成分からなる類似の調製品によ る効果より優れている。

トレポネーマヒョーディセンテリア細胞のＬＯ８様またはＬＰＳ様成分に対する ブタ細胞系およびブタ体液性免疫系による全系応答か関与しているらしいことま では分かつているか、抗原の免疫反応についての正確な性質は知られていない。

トレポネーマヒョーディセンテリア細胞のＬＰＳ様成分に対するこの免疫応答は 、トレポネーマヒョーディセンテリアのＬＰＳ様成分に対する特異的免疫応答を 引き出すこと［ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ］を妨害するとみられるトレポネーマヒ ョーディセンテリア細胞その他の源からの外来性タンパク質を減少させることに より促進される傾向にある（９）。しかしプロテイナーゼ処理したペレット化ラ イセードで得た免疫応答は精製ＬＰＳで得たものより優れている。

図面の簡単な説明 図１は、ＰＫ　（プロテイナーゼＫ）消化に対する免疫応答（第Ａ列、第り列お よび第Ｅ列）と、精製ＬＰＳに対する免疫応答（第８列および第Ｃ列）とのウェ スタンプロットアッセイによる比較例である。、 好ましい実施例の詳細な説明 １実施例において本発明は、ワクチン接種後にチャレンジしたブタに統計上有意 な罹患率（粘血便）減少度が観察できるように、タンパク質濃度を実質的に薄め たトレポネーマヒョーデイセンテリアから得られたワクチン調製品に関係する。

好ましくはこの調製品は１０．０００ドルトンまたはそれ以上の１μｇ／ｍｌ以 下の手をつけていないタンパク質を含有するのがよい。また好ましくは、ｉｏ、 　０００ドルトン以上の大きさの全細胞ライセードタンパク質の９０％以上が、 １０．０００ドルトン以下に小さい断片に減少されているのがよい。

トレポネーマヒョーディセンテリア株（好気性、嫌気性ともに）は、米国ならび に外国の培養菌寄託所あるいは私的な培養菌銀行から入手可能である。トレポネ ーマヒョーディセンテリアのいくつかの種類の血清型（現在７つ）が存在するこ と、およびそれらが感受性動物にブタ赤痢を引き起こすものであることが知られ ている。トレポネーマヒョーディセンテリアの単離法は文献（１０）に記述され ている。適切な単離体としてはアメリカンタイプカルチャコレクションから得ら れる血清型２の株番号３１２１２（またはＢ２０４）がある（ａ、　１１）。し かしブタに疾病を引き起こすことができるトレポネーマヒョーディセンテリアが ら得た単離体ならいずれでも本発明の実施に使えるものである。

トレポネーマヒョーディセンテリア細胞は固体培地でもあるいは液体培地でも、 いずれの増殖培地でも培養できる。７．５％のウマ血清（ＵＳ）、０．５％の酵 母抽出物、ＶＰＩ嫌気性塩（１２）ならびに０．０５％のＬ−システィン含有ト リブティケースソイブイヨン（ＴＳＢ）が本発明実施のためのトレポネーマヒョ ーディセンテリア細胞を調製するのに適切である。もっともこのほかの適切な培 地については文献（１３）に知られている。トレポネーマヒョーディセンテリア 細胞は、３５〜４０°Ｃで、酸素を減少させた雰囲気中で嫌気的または微好気的 に生育させる。成長後はホルマリン、ｉ＋ｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ　（商標）ある いは熱処理等の標準的方法でトレポネーマヒョーディセンテリア細胞を殺しくＩ Ｉｅｒｔｈｉｏｌａｔｃか好ましいが）、遠心分離または限外濾過によって集め る。

トレポネーマヒョーディセンテリア細胞はまた、圧力処理、あるいは音波処理の ような物理的方法番、τより、あるいは周囲の培地のｐＨや偏性を変化さぜたり して行う細胞溶解工程を経て殺すことでもよい。

適切なトレポネーマヒョーディセンテリア細胞を調製し溶解したら、そのライゼ ートの不可溶成分（例えば膜［ｍｅＩＩｂｒａｎｅ］　）をその調製品のタンパ ク質濃度を薄めるために処理する。このようなタンパク質濃度減少化はプロテイ ナーゼにのようなタンパク質分解酵素による処理で行うことかできる。文献には 多数のタンパク質分解酵素が公表されているが、本調製品のようなタンパク質濃 度の有意的減少をもたらすものであれば、どんな酵素も、あるいは物理的または 化学的な処理のどんなものでも、本方法の実施に適用可能である。ここて刺理吉 は、単一酵素の使用ばかりでなく、種々の酵素の経時的または同時的な組合せの 使用も含む。タンパク質減少化が発生する温度、ｐ　Ｈその他の物理的値に関す る特定条件は、使用される酵素あるいはタンパク質減少系に依存するものであり 、所望の感染予防効果か得られる限り可変である。例えばプロテイナーゼＫが使 われるときは、ぺ１ノツト化ライゼートの懸濁液に市販のプロテイナーゼに調製 品を加え、好ましくは次にこれを５６°Ｃて２時間インキコベートし、さらに３ ７°Ｃて１２時間インキュベートする。

５ＤＳ−ＰＡＧＥで全細胞ライゼートを消化したプロテイナーゼＫを分析すると 、クーマシーブルー染色法で３〜４の手をつけられていないタンパク質のバンド が見られる。Ｓ、れらのタンパク質バンドは３０ｋＤａ・＝　４０　ｋＤａの見 かけ分子質量をもっでいる（注意：これらのバント・はスピロへ・−タ鞭毛に関 係するタンパク質と一致している）。これらタンパク質の１個（最大分子質量） 以外は全部、ブロティナーセにの１０倍濃度で消化することによってこの調製品 から除去することができる。−ヒ記（−た手をつけていないタンパク質のほかに 、染料最前部［ｄｙｅ　ｆｒｏｎｔ］の先のゲル領域中の塗布材［ｓｍｅａｒ］ のように無数の低分子質量ペプチド（〈１０　ｋＤａ）か観察できる。未消化の 全細胞ライゼートのタンパク質の輪郭［ｐｒｏｆｉｌｅ］は２０〜１５０　ｋＤ ａの見かけ分子質量の多数のタンパク質バンド（＞５０）からなり、染料最前部 近傍には検出可能なペプチドの塗布材はない。ＰＫ消化および全細胞ライゼート 共に１６〜２４ｋＤａの３つの主バンドをもつＬＰＳ様材を有している。ｆ、Ｐ Ｓバンドはクーマシーブルーで染色されないが、銀染色法で検出可能である。１ ８〜２０ｋＤａバンドはウェスタンプロット分析による抗血清で認められる主要 バンドであるが、その他の２つのバンドも顕著である。

ＰＫ消化を電子顕微鏡で検査した。電子顕微鏡写真はトレポネーマ鞭毛と一致す るもとのままの［１ｎｔａｃｔｌ構造を現した。ＰＫ消化の構成もまた、微生物 の細胞壁（ペプチドグリカン）、リポソーム、核酸、ホスホメンブレン物質［ｐ ｈｏｓｐｈｏｍｅ［Ｉｂｒａｎｏｕｓ　ｉ＋ａｔｅｒ１ａ１］を含んでいる。ペ プチドグリカンおよびその他の物質は、ワクチンの調製にとってアジュバント的 性質を与えるものと考えられる。

好ましくは、トレポネーマヒョーディセンテリア細胞および細胞上成分の減少化 タンパク質懸濁液は１服用量当たり少なくとも約５×１０９のトレポネーマヒョ ーディセンテリア細胞と等量のものを含有するか、１−服用量当たり少なくとも １×１０１０のトレポネーマヒョーディセンテリア細胞に等しい抗原レベルかよ い。この調製品は鉱油、代謝性有機油、乳化剤あるいはメタルソルトのようなワ クチン効果を高めるものとして文献上知られた種々のアジュバント調製品と混合 して使用することかできる。好ましいアジュバントとしては、フロイントの不完 全アジュバントとかスクアレン（鮫油）がある。鉱油は発癌物質かもしれないし 、また不利な反応をするかもしれないので好ましくないが、所望なら使用も可能 である。種々のアジュバント調製品を使用すればこのワクチンの、あるいはすへ てのワクチンの効果を向上させるかもしれないが、本方法の実施にとり、その使 用は必須でないことに注意されるべきである。ＩｇＧ応答よりもＩｇＭ応答を誘 導することか好ましいアジュバントの使用こそ好ましい。

この方法で調製したワクチンを非経口、一般に筋肉注射もしくは皮下注射てブタ に投与する。ブタ赤痢の症状をまだ示していなくて健康なブタに投与したとき、 このワクチンは最も効果、的である。ワクチンは２〜３週間の間隔をあけて少な くとも２回の服用を連続して投与することか好ましいが、これ以外の免疫感作計 画でもよく、従来法により決定してよい。

本発明の方法については以下の実験例で詳しく説明する。

例１ ブタから単離しＢ−２０４と指定されているトレポネーマヒョーディセンテリア 血清型２の１株を、５．０％ウマ血清（ＨＳ）、０．５％酵母抽出物、ＶＰＩ嫌 気性ソルト（１２）および０．０５％Ｌ−システィン支持のトリブティケース［ ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ］大豆ブイヨンでできた液体媒地で純粋培養した。この培 養体を、３９℃の１０％ＣＯ２，１０％Ｎ２および８０％Ｎ２の雰囲気中で１２ 時間成長させた。この１２時間以内にトレポネーマヒョーディセンテリアの成長 の大半は止まった。トレポネーマヒョーディセンテリア細胞は次に１１１０．０ ００のメルチオレート［ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ］を添加して殺した。殺した細 胞は２０．０００　Ｘ　ｇで４５分間遠心分離して収集し、殺菌した０、８５％ 生理的食塩水中で再懸濁し、フレンチプレス細胞（５，０００ｐｓｉ）で加圧し て溶解し、その溶解液を１００，０００　Ｘｇて２時間遠心分離することでトレ ポネーマヒョーディセンテリア細胞の細胞膜を収集した。この膜材は殺菌したフ ォスフアート緩衝の０．８５％生理的食塩水（ｐＨ７，２）中で再懸濁しプロテ アーゼ型Ｘｌ−３（ブロテイナーセＫ）で５６°Ｃで２時間処理し、次いでさら に３７°Ｃで１２時間インキュベートした。プロテアーゼ処理後、トレポネーマ ヒョーディセンテリア細胞下成分を４°Ｃで貯蔵し、収集したワクチンとした。

この収集ワクチンを２５％不完全フロインドアジュバント（ＦＩＡ）と混合し、 試験動物に注射する油中水懸濁液を作った。同様な調製品をＦＩＡ中の全細胞の 未処理トレポネーマヒョーディセンテリア細胞と、ＦＩＡ中の未処理トレポネー マヒョーディセンテリア細胞膜とで作り、／）電／バク實減少化の効果を１−ス トｌ、　１．：。

ｇ１少化タンパク質調製品を、未処理１．　Ｌ／ボネー′マ゛ヒ＊−１，イセン ノーリア膜を対照に１−２てＳ　ｎ　Ｓポリアクリル７Ｅドゲル電気泳動（ＳＤ Ｓ　ＰＡＧＥ）”アッセイＣ外層股のクツバク質濃度の−ｊ−ストグ・しり、、 適切ｉ；　、ｆ　ｒＩｊ＝　＝ｙルｊＣ−ｖ　ｔ、ｓではＭｃｒｃｉｉｉら、５ ｃｉｅｎｃｅ、　２４１　：１４３７　（１９８２年）Ｖ照。未処理トレポネー ゛７ヒニＪ−ディ）ブンｊ−゛リア′膜は銀染色法後ゲル中に明らかに多数のタ ンパク質バンドを持つが、減少仕タンパク質トレポネーマ］−ヨー・ディセンチ リア膜には３つのタンパク質バンドしか見っがらながった。これは生の、つまり 天然のトレポネーマヒョーディセンテリア膜タンパク質の大半かブロティナーゼ に処理によって特定タンパク質を検出する５ＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色法のアッセ イ能力以下のレベルに減少化されたことを示している。

ブタ赤痢にかかっていないことか分がっている群がら１６頭のＳＰＦ［５ｐｅｅ ｉｆｉｃ　Ｐａｔｂｏｇｅｎ　Ｆｒｅｅ］、つまり特定病原菌のないブタの目方 を測り、上記調製品のテストに使用した。そしてブタはランダムにグループに分 けた。４頭のブタに１回の服用量当たり４Ｘ１０”）−レポネーマヒョーディセ ンテリア細胞に等量のＦＩＡ／回数分の減少化タンパク質ワクチンを２週問おき に２回服用で投与した。また４頭のブタにプロティナーゼにて処理していない全 細胞トレポネーマヒョーディセンテリアをＦＩＡ中の服用量当たり２×１０１０ トレポネーマヒヨーデイセンテリア細胞の服用量だけ２週問おきに２回投与した 。別の４頭のブタには」回の服用量当たり４Ｘ１０１０トレポネーマヒヨーデイ センテリア細胞に等量のＦＩＡ／回数分の減少化タンパク質ワクチンを：）、Ａ 間、」・）きも−２回服用ζ、（Ｗ与１．た。Ｊ−の実験グル、プＧ７τ−少き 表１によ、」−め゛て−ある。

表１− 処理の実験グループ グループ　ブタ頭数　ワクチン　服用量１　４　２倍減少化タンパク質膜　２服 ２週問おき ２　４　１倍未処理全細胞　２服 ２週問おき ３　４　２倍未処理膜　２服 ２週問おき ４　４　なしく対照）　なし 第２回目のワクチンから１０日後に実験ブタ全部を２４時間断食させ、再度体重 測定してから、１．．６９ｘｉＯ”の活発に生育している自動性トレポネーマヒ ョーディセンテリア細胞を経口接種した。ワクチン接種していない対照ブタを、 この経口接種の前後を通じてワクチン接触したブタと継続的に接触させた。そし て全部のブタを接触後２１日間毎日観察し、ブタ赤痢の徴候（例えば粘血便）を 記録した。２１日間の観察期間終了時に生き残ったブタ全部を再測定し、殺し、 死体解剖した。螺旋状の結腸および盲腸の腸内にある内容物からトレポネーマヒ ョーディセンテリアを再単離するため試料を採取した。ブタ赤痢に典型的な発疹 を死体解剖中記録した。

全グループの投与後の観察結果は表２の通りである。

表２ ワクチン接種ブタおよび対照ブタの接種後の状態観察グル　処　理　ブタ　完全 罹　下痢の罹　平均体重日増加　死亡率　＊Ｔ、ｈｙ。

数　意字＠　意字＠＠ ３　膜　４１６．１％　１６．１％　０．８７ポント／日　０％　３／４４　対 照　４　３３．１％　２１．７％　０．９４ポンド／日　０％　２／４脚注 ＊Ｔ、ｈｙｏ　糞便から再単離したトレポネーマヒョーディセンテリア。トレポ ネーマヒョーディセンテリアを有するブタ数／グループ中のブタ数＠　全罹患率 、観察された全症状。百分率（症状の出た延日数／ブタと日の延日数）＠＠　下 痢のみの罹患率。完全罹患率との違いは、完全罹患率欄中のものの目立った弱り や、やつれ。

実験結果 ブタ赤痢に典型的な粘血便（下痢罹患率）は、ワクチン接種していない対照動物 につき毎日の観察で２１．７％だけ見られた。粘血便はタンパク質減少化法で処 理していないトレポネーマヒョーディセンテリア膜のワクチンを接種したブタに つき毎日の観察で１６．１％見られた。未処理トレポネーマヒョーディセンテリ アの全細胞を接種されたブタは何らの粘血便症状を示さなかった。減少化タンパ ク質トレポネーマヒョーディセンテリアワクチンを接種した４頭のブタはどれも ブタ赤痢に典型的な粘血便症状を示さなかった。こうしたデータは減少化タンパ ク質トレポネーマヒョーディセンテリアワクチンか、ワクチン処理していない対 照ブタに比較しブタ赤痢に典型的な血便症状を減らす効果かあることを明確に示 している。また、粘血便に対する予防効果は報告されている方法（７）に従い調 製した未処理全細胞トレポネーマヒョーディセンテリアのものに見られる効果よ りも有意的に大きがった。

この予防効果はさらに、従来法で殺した未処理の全細胞トレポネーマヒョーディ センテリアワクチンを接種したブタの平均体重日毎増加（０，４７ポンド／日） に比較した場合の減少化タンパク質トレポネーマヒョーディセンテリアのワクチ ンを接種したブタの平均体重日毎増加（０，９８ポンド／日）にも表れていた。

もっとも対照ブタはこのテストではあまり差を示さながった。

実験後、４頭のワクチン非接種の対照ブタのうち２頭がら（５０％ン、また、従 来法で殺した未処理の全細胞トレポネーマヒョーディセンテリアワクチンを接種 した４頭のブタからは１頭から（２５％）、各々トレポネーマヒョーディセンテ リアを再単離したか、減少化タンパク質トレポネーマヒョーディセンテリアワク チンを接種した４頭のブタからは１頭もトレポネーマヒョーディセンテリアを再 単離することかなかった。これらのデータは本発明の方法で調製した減少化タン パク質トレポネーマヒョーディセンテリアワクチンがブタ赤痢の症状（粘血便） や、トレポネーマヒョーディセンテリア感染による体重損失、およびトレポネー マヒョーディセンテリアの再単離に対して本発明の調製品を接種のブタを予防す ることを明確に示している。さらにこの予防効果は単に未接種の対照ブタに比較 して優れているばかりでなく、従来法で調製した殺した全細胞トレポネーマヒョ ーディセンテリアまたは膜トレポネーマヒョーデイセンテリアのワクチンに比較 しても優れている。ブタに投与する前にトレポネーマヒョーディセンテリアワク チンのタンパク質成分を減少させる方法は、これまで利用できた方法よりも優れ たトレポネーマヒョーディセンテリア感染由来のブタ赤痢に対してブタをよりよ く予防するものであることが明らかである。

例２ 上述（７た研究の継続として、ブタ赤痢に罹っていない群から３０頭のＳＰＦ　 （特定病原菌のない）ブタを体重測定し、減少化タンパク質膜、未処理膜、また は未処理全細胞という種々のものから作った調製品をテストするため実験した。

ブタをランダムにグループに分けた。６頭のブタに１服当たり２Ｘ１０”のトレ ポネーマヒョーデイセンテリア細胞に相当する量の減少化タンパク質ワクチンで あってＦＩＡを２週間間隔て２服投与した。

別の６頭のブタには１服当たり２Ｘ１０１０トレポネーマヒヨーデイセンテリア てＦＩＡをプロテイナーゼにて処理していない全細胞トレポネーマヒョーデイセ ンテリアを３週間間隔で２服投与した。また別の６頭のブタには１服当たり２× １０１０トレポネーマヒヨーデイセンテリア細胞と等量中にプロテイナーセにで 処理していないＦＩＡのトレポネーマヒョーデイセンテリアワクチンを３週間間 隔で２服投与した。減少化タン＜り質ワクチンの服量／反応をテストするため、 ブタ２頭のクループの複数にＦＩＡの減少化タンパク質ワクチンの４倍、１／２ 倍、１／４倍を３週問おいて２服投与した。全実験動物は１大仏間に一緒にし、 給餌し個々に取り扱った。これら実験された複数のグループにつき表３に示す。

表３ 実験したグループと処理 グループ　ブタ頭数　ワクチンの種類 １　２　４倍の減少化タンパク質膜 ２　６　１倍の減少化タンパク質膜 ３　２　１／２倍の減少化タンパク質膜４　２　１／４倍の減少化タンパク質膜 ５　６　１倍の未処理全細胞 ６　６　１倍の未処理膜 ７　６　なしく対照） グループ１〜６の各々につき、ワクチン２服を３週問おいて投与。

２回目のワクチン接種後８日目に全実験ブタを給餌しないで２４時間おき、再度 体重測定してから５Ｘ１０１０の活発に成長している自動性［ａ＋ｏｔｉｌｅ］ 　トレポネーマヒョーディセンテリア細胞を経口接種してチャレンジした。これ と同様なチャレンジを翌日も繰り返した（第２同棲種後９日目）。ブタ全頭数は 一緒にしであるので、ワクチン接種していない対照ブタはチャレンジの前後を通 じて接種ブタと常に接触状態においである。ブタ全頭数を第２回チャレンジ後２ ５日間毎日観察し、ブタ赤痢の症状なら何でも（例えば粘血便）記録した。２５ 日の観察期間経過時点で、生き残ったブタ全頭数を再度体重測定し、殺し、死体 解剖した。トレポネーマヒョーディセンテリアを再単離するため螺旋結腸、回盲 腸部口および盲腸の嚢内容物をサンプルとして採取した。死体解剖中にはブタ赤 痢に典型的な発疹が記録された。

全グループについての実験後の観察結果を表４に示す。

表４ ワクチン接種ブタと対照ブタとのチャレンジ後の観察結果ワクチン　ブタ　死亡 　粘血　粘血便　下痢　Ｔ、　ｈｙｏ　ＡＤＧ　＊　＊の種類　数　数　便数　 ＭＩＤ＊　菖■Ｄ＠　再単離　ポンド７日タンパク質 減少化膜４倍　２　０　０（０％）　０％　８．０％　１（５０％）　０．８６ タンパク質 減少化膜１倍　６　０　０（０％）　０％　０．０％　０（０％）　０．９１タ ンパク質 減少化Ｍｌ／２倍　２　０　０（０％）　０％　０．０％　０（０％＞　０．７ ０タンパク質 減少化膜１／４倍　２　１　１（５０％）５．４％　０％　１（５０％＞　０． ４０全細胞　６（１７％）１２（３３％）７．５％　８．８％　３（５０％）　 ０．６３Ｗ１４　６（０％）　０　５（８３％）　１６．７％４．７％　５（８ ３％＞　０．３９対照　６（１７％）１５（８３％）２９６％６．３％　３（５ ０％）　０．３７ＭＩＤＩ　罹患率および罹患期間のこと。同等数（粘血便日数 ／チャレンジから死までの日数）　Ｘ　１００ ＭＩＤ＠　罹患率および罹患期間のこと。同等数（粘血便ではない下痢の日数／ チャレンジから死までの日数）ｘｌＯＯ ＾圓＊＊　１日平均体重増加のこと。同等数（死亡時の体重−チャレンジ後の体 重／チャレンジから死までの日数）Ｘ１００ 実験結果 ブタ赤痢に典型的な粘血便がワクチン非接種の対照動物の５／６（８３％）に観 察された。粘血便はまた、タンパク質減少化法で処理していないトレポネーマヒ ョーディセンテリア膜で調製したワクチンを接種したブタの５／６　（８３％） に観察された。全細胞未処理トレポネーマヒョーディセンテリア接種のブタの２ ／６　（３３％）が粘血便を示した。しかし、減少化タンパク質トレポネーマヒ ョーディセンテリアのワクチンを接種したブタ１０頭は、ワクチンを４倍、１倍 、１／２倍で服用したもののいずれもブタ赤痢に典型的な粘血便を１頭たりとも 示さなかった。減少化タンパク質トレポネーマヒョーデイセンテリアワクチンが １服につき１／４に薄められたとき、このワクチンを接種されたブタ２頭のうち １頭が粘血便を示したか、これは減少化タンパク質トレポネーマヒョーデイセン テリアワクチンに対する用量反応を示すものである。これらのデータは減少化タ ンパク質トレポネーマヒョーディセンテリアワクチンかワクチン非接種の対照ブ タに比しブタ赤痢に典型的な粘血便の頻度を減少するのに優れていることを明白 に示し、でいる。さらに、粘血便の予防効果は従来技術（７）で調製し／Ｊ未処 理全細胞トレポネーマヒョーディセンテリアワクチニノでみられたものより有意 に大きかった。

この予防効果は、日平均体重増加率にも表れ、ワクチン非接種の対照ブタ（０， ３７ポンド７日）、従来の殺［また未処理全細胞トレポネーマヒョーディセンテ リアワクチン接種のブタ（０，６３ポンド７日）に比し減少化タンパク質トレポ ネーマヒョーディセンテリアワクチン接種のブタ（０，９１ポンド７日）は大き かった。死亡率は減少化タンパク質トレポネーマヒョーディセンテリアワクチン 接種のブタは、未処理全細胞ワクチン接種のブタおよびワクチン非接種の対照ブ タに比し１００％減少した。

１倍の減少化タンパク質ワクチン接種のブタ（グループ３）は日平均体重増加（ ｐ　＝　０．０６５）測定でチャレンジに対して予防効果があり、罹患率（粘血 便）も減らした（　ｐ　＝　０．００７）。１／２倍の減少化タンパク質ワクチ ン（グループ４）は、罹患率（粘血便）を減らしたか（ｐ−０，０８８）、日平 均体重増加は向上させなかった（　ｐ　＝　０．３１７）。１／４倍の減少化タ ンパク質ワクチン（グループ５）は罹患率（粘血便）測定で有意的に予防効果を 示さず（ｐ−〇、２４］、）、日平均体重増加（ｐ＝０．７３９）も示さなかっ た。全分析はクラスカル・ワリスの変動に関するワンウェイ分析によった。

上記のように、減少化タンパク質ワクチンは少なくとも約１／２倍濃度で有意な 予防効果を統計的に示す。調製品は、５〜８，０００ダルトンまたはそれ以上の １μｇ／ｍｌ以下処女タンパク質を使用時に含有していた。

６頭の非接種対照ブタの・うちの３頭（５０％）から、また、従来法の殺した未 処理全細胞１司ノボネーマヒヨーデイセンデリアワクチン接種のブタ６頭のうち の３頭（５０％）からは、チャレンジ後にそれぞれトレポネーマヒョーディセン テリアを再単離したが、４倍、１倍、１／２倍の減少化タンパク質トレポネーマ ヒョーディセンテリアワクチン接種のブタ１０頭がらは１頭のろしかトレポネー マヒョーディセンテリアを再単離しなが−った。

これらのデータは、本発明法で調製した減少化タンパク質トレポネーマヒョーデ ィセンテリアワクチンは、同ワクチン接種のブタからブタ赤痢の諸症状（死亡、 粘血便）、トレポネーマヒョーディセンテリア感染による体重減少、およびトレ ポネーマヒョーディセンテリアの再単離に対してブタを予防することを明らかに 示している。しがもこの予防効果は、ワクチン非接種の対照ブタに対【７てだけ てなく、殺した全細胞すなわち従来法で調製した膜トレポネーマヒョーディセン テリアワクチンに対しても著しく優れている。ブタへの投与前にトレポネーマヒ ョーディセンテリアワクチンのタンパク質濃度を薄めるこの方法は、これまで行 うことができた方法に比し優れた効果をも一つもので、トレポネーマヒョーディ センテリア感染によるブタ赤痢に対する予防効果を明らかに促進する。

表５．６．７はブロティナーゼに消化の全細胞ライゼートおよび内毒素の調製品 の利点を示す。表５では盲腸が一層重くなり総体的病変からの解放状態の向上が あるこ吉が見られる。表６は、チャレンジ後にワクチン接種マウスから採集した トレポネーマヒョーディセンテリアの数か最も効果的にブロテイナーセに消化に より減少していることを示している。最後に表７はコロニー形成単位を比較的低 水準な数に向かわしめる傾向を示している。

表５ 免疫感作後のトレポネーマヒョーディ センテリア感染からのマウス予防効果 処　理　動物　臨床　盲腸の　暗算顕微鏡番号　徴候ａ　重さｂ　検査Ｃ 生理的食塩水　Ｉ　ＮＧＬ　Ｏ，２４Ｎ、Ｄ。

２　ＸＭＸＭ　０．１９　＋２ ３　ＮＧＬ　Ｏ，３０Ｎ、Ｄ。

４　ＸＭ＆Ａｔ　０．１３　＋２ ５　ＸＭ＆Ａｔ、　０．１０　＋３ ６　ＸＭ　Ｏ，２３＋１ 全細胞ライセードｄ　８　ＮＧＬ　Ｏ，１８Ｎ、Ｄ。

９　ＮＧＬ　Ｏ，２４Ｎ、Ｄ。

１０　ＸＭ　Ｏ，１３→−２ １１ＸＭ　０．１８　Ｎ、Ｄ。

１．２　ＮＧＬ　Ｏ，２６＋１ １．３　ＸＭ　Ｏ，１８＋２ １４　ＮＧＬ　ル」ユ　Ｎ、　Ｄ 平均０．２０±０．０４ 内毒素ｅ　１５　ＸＭ　Ｏ，２３＋１ １６　ＮＧＬ　Ｏ，２３Ｎ、Ｄ。

１７　ＮＧＬ　Ｏ，２４Ｎ、Ｄ。

１８　ＮＧＬ　Ｏ，３６Ｎ、Ｄ。

１９　ＸＭ　Ｏ，２０＋１ ２０　ＮＧＬ　Ｏ，２２Ｎ、Ｄ。

平均０．２４±０．０５ ブロテイナーセＫ ｌ開化ｆ　２２　ＮＧＬ　Ｏ，１８Ｎ、Ｄ。

２３　ＮＧＬ　０．２４　Ｎ、Ｄ。

２４　ＮＧＬ　Ｏ，２２Ｎ、Ｄ。

２５　°　ＮＧＬ　Ｏ，２９Ｎ、Ｄ。

２６　ＮＧＬ　Ｏ，２７Ｎ、Ｄ。

２７　ＮＧＬ　Ｌ２２　Ｎ、Ｄ。

平均０．２４±０．０４ 注意： ａ　病気の臨床徴候はイントライミナル［Ｉｎｔｒａｉ組ｎａｌ］粘液の過剰分 泌（ＸＩ）、盲腸の萎縮（Ａｔ）、または総体的無病変（ＮＧＬ）で規定した。

最終免疫感作から２週間後にマウスを５Ｘ１０’のトレポネーマヒョーディセン テリアＢ２０４で２日間続けてチャレンジし、１０日後に殺した。

ｂ　盲腸それぞれの重さはダラムで表しである。

Ｃ盲腸内容物を暗算顕微鏡検査で観察し、スピロヘータの存在を調べ、もしスピ ロヘータが観察されたときは＋１から→−３の等級表示、全熱観察されなかった ときはＮ、　Ｄ、で示した。

ｄ　マウスにトレポネーマヒョーディセンテリアＢ２０４から調製した全細胞ラ イセードの５０μｇ（タンパク質濃度）を（２週問おきに）３回、腹腔的注射に より免疫感作させた。

ｅ　マウスをトレポネーマヒョーディセンテリアＢ２０４から調製した内毒素（ ブタノ−ル／水抽出物）の５０４ｇで３回、腹腔内注射により免疫感作した。

ｆ　マウスをブロティナーゼにで消化した全細胞ライゼート（全細胞ライゼート の５０μｇと等量）で３回、腹腔内注射により免疫感作した。

表６ チヤレンジ後にワクチン接種マウスから採取したトレポネーマヒラーディセンテ リアの数処理ｂ　数ｃ　ＣＦＵｄ 生理的食塩水ａ　７　４．１±２．２　Ｘ　１０’全細胞ライゼート　７　２． ５±１．ｌＸ１０’内毒素　７　１．１±０．５Ｘ１０’ プロテイナーゼに消化　６　５．０＋０．５Ｘ１０’注意 ａ　５Ｘ１０’のトレポネーマヒヲーディセンテリアで２日間続けてマウスにチ ャレンジし、１０日後に殺した。

ｂ　マウスは表１に記載したのと同様に免疫感作させた。

Ｃグループ中のマウス数。

ｄ　盲腸組織のダラム当たりのトレポネーマヒョーディセンテリアのコロニー形 成単位（ＣＦＵ）。

表７ 感染マウスから採取したトレポネーマ ヒョーディセンテリアのコロニー形成単位処理　番号　ＤＦｂ　培養液　ＣＦＵ ｄ生理的食塩水ａ　１　−　＋　２．ｌＸ１０４４　＋＋　＋　６．９Ｘ１０’ ５　＋＋十　＋　１．６Ｘ１０’ ５　＋　＋　７．０ｘｌＯ５ ７−＋　９．４Ｘ１０’ 全細胞ライセード　８　−　＋　１．１Ｘ１０’９　−　＋　８．３Ｘ１０’ ＩＱ　＋＋　＋　２．５Ｘ１０’ １１　−　＋　５．３Ｘ１０’ １２　＋　＋　７．７Ｘ１０’ １３　＋＋　＋　１．４ｘｌＯ’ １４　−　＋　１．０Ｘ１０６ 内毒素　１５　＋　＋　１．３Ｘ１０’１．６　−　−　Ｑ １７　−　＋　８．３Ｘ１０’ １８　−　＋　＜１．０Ｘ１０’ １９　＋　＋　４．０Ｘ１０’ ２０　−　＋　１．８Ｘ１０’ ２１　−　＋　２．０Ｘ１０’ プロテイナーセに消化　２２　−　＋　＜１．０ｘｌＯ’２３　−　十　＜１． ０ｘｌＯ’ ２４　−　＋　２．３Ｘ１０’ ２５　−　＋　＜１．０ｘｌＯ’ ２６　−　＋　３．ｌＸ１０’ ２７　−　＋　４．５ｘｌＯ’ 注意・ ａ　マウスには表１につき記載したようにワクチン接種した。

ｂ　盲腸の内容物中にスピロヘータが存在（＋）するが不在（−）かは、暗界顕 微鋺検査（ＤＦ）で判定した。

ｃＢヘモリティックスピロヘータ検出のため、盲腸の内容物を直接に血液寒天で 培養した。

ｄ　各マウスから盲腸を切開し、測量し、ホモジナイズした。そのホモジネート を連続的に希釈し、盲腸１グラム当たりのトレポネーマヒョーディセンテリアの コロニー形成単位数（ＣＦＵ）を判定した。

例３ 本発明のプロテイナーセに消化の減少化タンパク質全細胞ライセードを接種した ブタからとった血清は、Ｗａｎｎｅａ＋ｕｅｈｌｅｒらの感染と免疫［Ｉｎｆｅ ｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｉｔｙ］、５６：３０３２−３９　（１９８ ８年１２月）に記載の１６〜２０　ｋＤａのＬＰＳ抗原と免疫反応性を示すこと を発見した。しかし、フェノール／水抽出のＬＰＳでワクチン接種したブタから とった血清は全細胞ライゼートと反応しなかった。

これは精製ＬＰＳが免疫応答を誘発しないことを示唆する。

トレポネーマヒョーディセンテリアの リポ多糖［Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｅｃｈａｒｉｄｅ］　（ＬＰＳ）の調製５％の ウマ血清および１％の酵母抽出物で補助したトリブティケース大豆ブイヨン［ｔ ｒｙｐｔｉｃａｓｅ　ｓａｙ　ｂｒｏｔｈｌ（ＴＳＢ）中でトレポネーマヒョー ディセンテリアを一晩育成した。その細胞を遠心分離して採取し、リン酸緩衝液 生理的食塩水中で再懸濁し、再賀遠心分離機にかけた。この細胞ペレットをパイ ロ−ジエンの無い水２重量部［ｖｏ１／ｉｔ］と８８％フェノールの１重量部［ ｖｏｌ／ｗｔｊ中で再懸濁した。この細胞懸濁液を２時間室温にて撹拌し、次に ４°Ｃて４８時間撹拌した。フェノールと水の各層は４℃で７日間かかって分離 させた。この水の層（上側）を採取し０．５％ＮａＣ１で透析した。その溶液を ＲＮアーゼ（１ｈｇ／Ｉ＋１）で２時間消化し、その後プロティナーゼＫ　（ｌ ｈｇ／ｌ１１）で２時間消化した。

この溶液を６８℃にまで温め、等量の温がい８８％フェノールを加えた。この物 質を６８℃で１５分間撹拌した。その溶液を冷やし、各層を遠心分離（５００ｘ 　ｇ）　Ｌ、た。その水を回収し０．５％ＮａＣ１で透析した。沈殿物を遠心分 離（７，５００ｘ　ｇ）で集め、冷却エタノールで１度洗浄した。その沈殿物を パイロ−ジエンのない最小限量の水中に溶がし急速冷凍しくドライアイスとアル コール浴で）、凍結乾燥し、マイナス２０’Ｃで貯蔵した。

プロテイナーゼにで消化した物質と ＬＰＳをブタにワクチン接種 ６週間齢の（特定病原菌のない、つまりＳＰＦの）交配槽ブタをトレポネーマＬ ＰＳまたはプロティナーゼに消化の全細胞ライセード（ＰＫ消化）ノイずれかを １００　ｕｇ／ｍｌ、　１　ｘ　１０　’°細胞の等置版用で筋肉内注射でワク チン接種した。１２日後、これらのブタを同一調製品で再接種した。各抗原服用 を殺菌生理食塩水０．５ｍｌ中に混ぜ合わせ、０．５ｍｌのフロイント不完全ア ジュバント（ＦＩＡ）とブタ１順当たり全部で１．０Ｉ１１の接種物で混合した 。

ウェスタンプロット分析に使用するため第２回目の免疫感作後、血清を１０日間 採集した。

ウェスタンプロットの説明 トレポネーマヒョーディセンテリア細胞を音波処理、急速冷凍、および凍結乾燥 により溶解した。全細胞ライゼート（ｗｃＬ）を１〜２　ｍｇ／ｍｌ　（ｗｔ／ ｖｏｌ）の殺菌生理食塩水中で再懸濁した。このＷＣＬをラエムリの処理緩衝液 と混合し、５分間沸騰させた後、同物質を電気泳動法で分離した。タンパク質２ ５０μｇ含有のｗｅＬ１服を、予備の各ポリアクリルアミドゲル（１２％）に添 加し、分離後、抗原をナイロン膜に電気泳動で移した。これらの膜は５％スキム ミルクでブロックし、トリス緩衝生理食塩水で洗浄し、特異的抗体サンプルで反 応させた。ブタ抗血清でインキュベーション後、このナイロン膜を洗浄し、アル カリホスファターゼ結合のヤギの対ブタ免疫グロブリン（μ特異的、またはＣ特 異的）と反応させた。基質溶液はトリス緩衝液（ｐＨ８，０）中のファーストレ ッドとナフトールＡＳ−ＭＸフォスフェートとで構成した。

ウェスタンプロット分析結果は次のことを示した。すなわち、プロテイナーゼに 消化でワクチン接種したブタ（図１において列Ａ、Ｄ及びＥ）はＩｃＬのＬＰＳ 成分に対する免疫グロブリンＭ抗体を発生［ｄｅｖｅｌｏｐｌさせるか、ＬＰＳ 接種したブタ（列Ｂ、Ｃ）はＬＰＳ特異的抗体を発生することはできなかったと いうことである。

免疫グロブリンＧの免疫応答を調べたとき、抗体はプロテイナーゼに消化中に発 見された処女タンパク質に対しては勿論、ＬＰＳ成分に対しても検出された。こ こでも、ＬＰＳワクチン接種したブタはトリポネーマ特異的抗体を発生させなか った。

引例した参考文献 ａ、　Ｇｌｏｃｋら、米国特許第４．１００．２７２号す、　Ｇｏｏｄｎｏｗ、 米国特許第４．１５２．４１３号ｃ、　Ｈａｒｒｉｓ、米国特許第４．１５２． ４１４号ｄ、　Ｈａｒｒｉｓ及びＧｏｏｄｎｏｗ、米国特許第４．１５２．４１ ５ｅ、５ｅｔｓｕｏ、米国特許第４．７９４．１０５号ｆ、　Ｐａｒｉｚｅｋ、 米国特許第４．７５８．５１７号ｇ、　Ｌｙｓｏｎｓ、米国特許第４．７４８． ０１９号り、　Ｇｌｏｃｋ、米国特許第４．２０３．９６８号ｉ、Ｇａｂｅ、欧 州特許第２８２．９６５号ｊ、　Ｃｏ１ｏｅ、　ＷＰ８８１０４５５５に、　Ｐ ａｒｉｚｅｋ、欧州特許第２０１．９７６号１、　Ｈａｒｒｉｓ、　Ｄ、Ｌ、、 　Ｇｌｏｃｋ、　Ｒ，Ｄ、、　Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ、　Ｃ，Ｒ，及びＫｉ ｎｙｏｎ、　Ｊ、　Ｍ、獣医学　小動物診療所　６７：６１　（１９７２年）２ 、　Ｊｏｅｎｓ、　Ｌ、Ａ、、　Ｗｂｉｐｐ、　Ｓ、Ｃ，、Ｇｌｏｃｋ、　Ｒ， Ｄ、、及びＭ、　Ｅ、　Ｎｅｕｓｓｅｎ感染と免疫３９（１）：４６０　（１９ ８３年）３、　Ｆｅｒｎｉｅ、　Ｄ、Ｓ、、　Ｒｉｐｌｅｙ、　Ｐ、Ｈ，、及び Ｗａｌｋｅｒ、　Ｐ、Ｄ、学術獣医科学３５−２１７　（１９８３年） ４、　Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｔ、Ｊ、Ｌ、、　Ｌｙｓｏｎｓ、　Ｒ，Ｊ 、及びＷｅｌｌｓｔｅａｄ、　Ｐ。

Ｄ、英国獣医学　１３０（２）　：　（１９７４年）５、　Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｍ 、Ｊ、、　Ｔ、Ｊ、Ｌ、、　Ｌｙｓｏｎｓ、　Ｒ，Ｊ、及びＰｒｅｓｃｏｔｔ、 　Ｊ。

Ｆ、学術獣医科学２１：３６６　（１９７６年）６、　Ｌｙｓｏｎｓ、　Ｒ，Ｊ 、国際特許番号１０８５１０３８７５　（１９８５年３月）７、　Ｐａｒｉｚｅ ｋ、　Ｒ，、Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｒ，、Ｂｒｏｗｎ、　Ｋ、及びＢｌｅｖｉｎｓ 、　Ｄ。

獣医学　１９８５年７月：８０　（１９８５年）８、０１ｓｏｎ、　Ｌ、Ｄ、、 及びＤａｙａｌｕ、　Ｋ、１．、　Ｇ、Ａ、若年ブタ会議１９８７：１２２　（ １９８７年） ９、　Ｇｒｅｅｒ、　Ｊ、Ｍ、及びＷａｎｎｅ＋ｎｕｅｈｌｅｒ、　Ｍ、　Ｊ、 感染と免疫５７（３）ニア１７　（１９８８年） １０、　Ｊｅｎｋｉ、ｎ５ｏｎ、　Ｓ、Ｒ，及びＷｉｎｇａｒ、　Ｃ，Ｒ，Ｖｅ ｔ、Ｒｅｃ、　１０９：３８４（１９８１年） １１、　Ｋｉｎｙｏｎ、　Ｊ、Ｍ、及びＨａｒｒｉｓ、　Ｄ、Ｌ、　Ｖｅｔ、Ｒ ｅｃ、　９５：２１９　（１９７４年） １２、　Ｈｏｌｄｅｍａｎ、　Ｌ、Ｖ、、　Ｃａｔｏ、　Ｅ、Ｐ、及びＭｏｏｒ ｅ、　Ｗ、Ｅ、Ｃ，嫌気性生物研究所マニュアル第四板バージニアポリテクニッ ク　インスティチュート　（１９７７年）１３、５ｔａｎｔｏｎ、　Ｔ、Ｂ　及 びＬｅｂｏ、　Ｄ、Ｆ、獣医微生物１８：１．７７（１，９８８年） １４、　Ｈａｌｔｅｒ及びＪｏｎｅｓ　感染と免疫　５６：３１５２−５６　（ １９８８年１２月） １５、　Ｗａｎｎｅｒｎｕｈｌｅｒ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｈｕｂｂａｒｄ、　Ｒ，Ｄ 、及びＧｒｅｅｒ、　Ｊ、Ｍ。

感染と免疫　５６：３０３２−３９　（１９８８年１２月）１６、　Ｊｏｅｎｓ 、　Ｌ、Ａ、、　Ｎｏｒｄ、　Ｌ、Ａ、、　Ｋｉｎｙｏｎ、　Ｊ、Ｍ、及びＥｇ ａｎ、　Ｉ。

Ｔ、、Ｊ、臨床微生物学　１５：２４９−５２　（１９８２年）国際調査報告 一四一−１−−−ＰｃＴ／ＵｓＱｎ／品船１フロントページの続き （７２）発明者　ワンネミューラー、マイケル　ジエイアメリカ合衆国、５００ １０　アイオワ州、エームズ、シュウエル　ドライブ　６１２

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．トレポネーマヒョーディセンテリア細胞ライゼートの不溶性成分から調整し た免疫原的調整品であって、同細胞ライゼートの不溶性成分に比し実質的に減少 されたタンパク質濃度をなす薬学許容のキャリヤ含有のワクチン。
2. ２．感染前にブタをワクチンで免疫させることによりトレポネーマヒョーディセ ンテリア感染に起因する罹患率を統計的有意に減少させる請求項１のワクチン。
3. ３．殺した全細胞トレポネーマヒョーディセンテリアワクチンが示す減少した罹 患率よりも一層減少した罹患率を示すことを特徴とする請求項２のワクチン。
4. ４．３０，０００〜４０，０００ドルトンの見かけ分子量をもつタンパク質以外 の１０，０００ドルトン以上の見かけ分子量タンパク質は、通常の荷電による銀 染色法では上記調整品中に検出できないことを特徴とする請求項１のワクチン。
5. ５．タンパク質濃度が酵素で減少されている請求項１のワクチン。
6. ６．酵素がプロテイナーゼＫの特徴的な基質特異性をもつものである請求項５の ワクチン。
7. ７．上記調整品がトレポネーマヒョーディセンテリア細胞の外層膜抽出物から調 整されている請求項１のワクチン。
8. ８．トレポネーマヒョーディセンテリア細胞または細胞下膜成分のタンパク質濃 度を酵素で減少することを特徴とする請求項１のワクチンの調整方法。
9. ９．タンパク質濃度をプロテイナーゼＫの特徴的な基質特異性をもつ酵素で減少 する請求項８の方法。
10. １０．免疫学的に有効な量の請求項１〜７のいずれかのワクチンを敏感なブタに 投与することを特徴とするトレポネーマヒョーディセンテリアに対するブタの抵 抗力を強化する方法。
11. １１．トレポネーマヒョーディセンテリア細胞から作る抗原調整品であって、ト レポネーマヒョーディセンテリアに対するブタの抵抗力を強化する混合物の製造 における上記トレポネーマヒョーディセンテリア細胞に比し実質的に減少したタ ンパク質濃度のものの使用法。
12. １２．精製リポ多糖トレポネーマヒョーディセンテリアワクチンによる減少した 罹患率より一層減少した罹患率を示すことを特徴とする請求項２のワクチン。