FI68079C - Foerfarande foer framstaellning av en terapeutiskt anvaendbar odlingsprodukt eller ett odlingsproduktpreparat av en trichosporon kashiwayama stam - Google Patents

Description

ran ... KUULUTUSJULKAISU ^ 11 UTLÄGGNINGSSKRIFT OOU/9 C (45) [ - ‘ V'S ^ (51) Kv.lk.*/lnt.a.4 C 12 P 1/02, C 12 N 1 /16 // C 12 R 1/645 (21) P»tenttlh»kemu* — Patentansökning 802690 (22) Hakemispäivä — Anjökningsdag 26.08.80 (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 26.08.80 (41) Tullut julkiseksi — Bllvit offer.tlig Q2 g-|

Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. —

Patent- och registerstyrelsen v ’ Ansökan utlagd och utl.skriften publleerad 29.03.85 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 01.09.79 Japani-Japan(JP) 112294/79 (71)(72) Shinei Kashiwayama, 553 Iwasaki. Kamitonda-cho, Nishimuro-gun,

Wakayama-ken, Japani-Japan(JP) (74) Oy Koister Ab (54) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen Trichosporon kashiwayama- -kannan vi1jelytuotteen tai vi1jelytuoteva1 mis teen valmistamiseksi -Förfarande för framstä11 ning av en terapeutiskt användbar odlings-produkt eller ett odlingsproduktpreparat av en Trichosporon kashi-wayama stam

Keksinnön kohteena on menetelmä uuden Trichosporon kashiwayama-kannan (tallennettu FRI:hin talletusnumerolla 4821), joka on tunnistettavissa sukuun Geotricum tai Endomucopsis kuuluvaksi kannaksi, viljelytuotteen tai -nesteen, mainitun viljelytuot-teen tai -nesteen steriilin tuotteen, steriilin suodoksen tai steriilin supernatantin, joista solut on poistettu, tai niiden konsentraatin tai kuivatuotteen valmistamiseksi, jotka ovat terapeuttisesti käyttökelpoisia esimerkiksi iholääkkeenä.

Menetelmällä saatua viljelytuotetta tai viljelytuotevalmis-tetta voidaan käyttää tehoaineena iholääkkeessä sekoittamalla sitä kantajaan kuten tavanomaiseen ihovoiteeseen tai voideperusaineeseen. Käsiteltävänä olevassa keksinnössä käytetty mikro-organismi 2 68079 eli Trichosporan kashiwayama katsotaan kuuluvaksi hiivoihin, mutta joskus tämä kanta luokitellaan fungi imperfectiksi. Näkemys, että kanta on tunnistettavissa sukuun Geotricum tai Endomycopis kuuluvaksi kannaksi, perustuu alan asiantuntijoiden tieteelliseen käsitykseen .

Kuten oheisista piirustuksista (valokuvista) ilmenee, käsiteltävänä olevassa keksinnössä käytettävä kanta tunnetaan siitä, että sillä on helmimäisiä artrosporeja ja pseudomyseelejä. Lisäksi kanta tunnetaan siitä, että kannan fermetointituotteella, so. kannan viljelynesteen supernatantilla on sellaisenaan erinomainen lääkevaikutus ihmisen ihoon. Lääkevaikutuksen omaavaa tehoainetta ei toistaiseksi tunneta. Mutta käytettäessä ihoon kannan viljely-nesteen steriiliä supernatanttia tai konsentraattia tai kuivatuotetta sellaisenaan tai sekoitettuna asianmukaiseen kantajaan ihmisen iholle sopivan valmisteen kuten voiteen muodossa, seuraavat lääkevaikutukset ovat saavutettavissa.

1. Fermentointineste on lievästi hapan (pH-arvo 4,5-5,0) ja myrkytön iholle sekä edistää rasvakelmun ihoa suojaavaa vaikutusta, erityisesti rasvakelmun luontaista bakteereja torjuvaa vaikutusta .

2. Keratiinin liiallinen kuoriutuminen sarveiskerroksesta estyy ja samalla sarveiskerroksen vesipitoisuus säilyy normaalina. Siten ihon luontaiset ominaisuudet kuten kosteus ja kimmoisuus säilyvät hyvinä.

3. Voidaan vaikuttaa orvaskeden lipidimetaboliaan keratiinin säännöllistä muodostumista parantavasti ja orvaskesisolujen lisääntymistä ja erilaistumista tasoittavasti.

4. Erityisesti rasvaisella iholla voidaan talin liikaeritystä säännöstellä ja estää rasvakelmun paksuuden kasvu. Niinpä talin erittyminen karvantupesta ihon pinnalle paranee ja pystytään ennalta ehkäisemään rasvaisuuden aiheuttamia ihotulehduksia, esim. aknea .

5. Koska verkkokerroksen kollageenisäikeet vahvistuvat tai turpoavat ylläpitämään normaalia vesipitoisuutta ylemmissä kerroksissa, ihon kovuus ja kimmoisuus säilyvät hyvinä ja normaaleina.

6. Verenkierron paraneminen edistää ihon metaboliaa ja sen kuona-aineiden kulkeutumista laskimoon ja tätä kautta poistumista.

ti 3 68079

Vastaavasti melaniiniväriaineen poistuminen kehon ulkopuolelle nopeutuu.

7. Valokemiallisen säteilyn hapettamalla aiheuttamissa ihosairauksissa fermentointineste tai sen steriili supernatantti toimii rasvakelmun antioksidanttina ja vaikuttaa iholäiskiin ja vastaaviin kohtiin epänormaalisti kertynyttä melaniiniväriä alentavasti. Käytettäessä fermentointinestettä tai sen steriiliä superna-tanttia yhdistettynä infrapunakäsittelyyn tai E-vitamiinin antoon suun kautta voidaan kosketusihottuman, iholäiskien ja auringon-valoherkistyksen aiheuttaman epänormaalin pigmentoitumisen yhteydessä saavuttaa ennalta ehkäisevä tai parantava synergistinen vaikutus.

Piirustusten kuvaus

Oheisista piirustuksista (valokuvista) näkyy käsiteltävänä olevassa keksinnössä käytettävän Trichosporon kashiwayama-kannan kasvu perunauute-agarielatusalustalla viljeltäessä vinopinnalla kolme vuorokautta 25°C:ssa. Kuva 1 on mikroskooppivalokuva (suurennus 75 x) ja esittää artrosporien takertumistapaa hyyfisolui-hin aerobisissa olosuhteissa. Kuvasta 1 nähdään, että artrosporit eivät takerru konidioforeihin, vaan leviävät sivusuunnassa ketjuina hyyfisolujen väliseinäkohdista. Kuva 2 on suurennettu mikroskooppivalokuva (suurennus 300 x) ja esittää artrosporeja. Kuva 3 on mikroskooppivalokuva (suurennus 300 x) ja esittää soluja ja niiden kuroutumista anaerobisissa olosuhteissa.

Seuraavassa kuvataan käsiteltävänä olevassa keksinnössä käytetyn Trichosporon kashiwayama-kannan (talletettu FRI:hin tal-letusnumerolla 4821) mykologisia ominaisuuksia.

(1) Morfologiset ominaisuudet 1) Muoto ja koko (mallasuute-MY-neste-elatusalusta):

Kun oli viljelty kolme vuorokautta 25°C:ssa havaittiin soluja, jotka olivat suorakaiteen tai soikion muotoisia ja kooltaan (3-4 μ) x (3-20 μ). Jatkettaessa viljelyä viisi vuorokautta tai enemmän solujen muoto tuli säännöttämämmäksi ja lopuksi solut tulivat myseelimäisiksi.

2) Pseudomyseelien muodostuminen (vinopintaviljelmä peruna-uuteagarielatusalustalla): 4 68079

Solut olivat pseudohyyfisiä tai pseudomyseelisiä ja niissä on tunnusomaisia murkittelevia artrosporeja, mutta ei konidioita.

3) Ascosporit:

Soluissa ei ascosporeja.

4) Ballistosporit:

Soluissa ei ballistosporeja.

(2) Elatusalustojen tunnusomainen ulkonäkö 1) Pesäke agaripintalevitysalustalla (mallasuute-MY-agari-elatusalusta).

Himmeä, valkoinen, ripsekäs, karhea pinta, hyvin pehmeä, ei koholla, vaan litteä, periferiassa kilioita.

2) Kalvo neste-elatusalustalla (mallasuute-MY-neste-elatus-alusta):

Muodostuu valkoinen, ripsekäs, flokkuloiva ja sitkeä kalvo.

(3) Fysiologiset ominaisuudet 1) Sakkaridifermentointi:

Kanta ei fermentoi glukoosia, galaktoosia, sakkaroosia, laktoosia, trehaloosia, raffinoosia tai inuliinia.

2) Sakkaridien käyttö (yhteyttäminen): D-glukoosi +, D-galaktoosi +, maltoosi -, raffinoosi -, sakkaroosi -, laktoosi -, natriumlaktaatti +, D-ksyloosi +, ery-tritoli -, D-mannitoli +, L-sorboosi +, inositoli -, trehaloosi -, D-arabinoosi L-arabinoosi natriumsukkinaatti +, natriumsit-raatti +, natriumasetaatti +, inuliini -, liukeneva tärkkelys -, etanoli +, glyseroli +, sellobioosi

Huom. + = käytetään, - = ei käytetä 3) Nitraattien käyttö: Ei käytetä 4) Nitriittien käyttö: Ei käytetä 5) Etyyliamiinihydrokloridin käyttö: Ei käytetä 6) Glukosidin (arbutiinin) hajotus: Hajoaa 7) Tärkkelysanalogien muodostus: Eivät muodostu 8) Pigmentin muodostus: Ei muodostu 9) Esterien muodostus: Muodostuvat 10) Lakmus-maitoreaktio: Ei koaguloidu 11) Vitamiinien tarve: Ei tarvetta 12) Suolankestävyys: Kriittinen konsentraatio 6-8 p/t-%.

Il 5 68079

13) Optimilämpötila: 25°C

14) Optimaalinen pH-arvo: 5,0 15) Urean hajotus: Ei hajoa 16) Kasvu 50 p/p-%:lla glukoosi-agari- tai 50 p/p-%:lla hiivauute-agarielatusalustalla: Ei kasvua 17) Kasvu 37°C:ssa: Ei kasvua 18) Hapon muodostus glukoosista: Ei muodostu 19) Sykloheksamidin kestävyys: Kestää 20) Öljyn ja rasvan hajotus: Hajoavat (4) Muut mykologiset ominaisuudet 1) Tuoksun muodostus: Käsiteltävänä oleva kanta tunnetaan siitä, että se muodostaa tuoksukomponentin. Kaasukromatografisesti todettiin, että tuok-sukomponentti koostui pääasiassa etanolista, etyyliasetaatista, isopropyylialkoholista, isopropyyliasetaatista, isobutyylialkoho-lista, isobutyyliasetaatista, isoamyylialkoholista ja isoamyyli-asetaatista. Tuoksu on ns. omenantuoksu. Tunnettuihin hiivoihin verrattuna käsiteltävänä oleva kanta tunnetaan siitä, että tuoksun muodostuksessa ei vain korkeimpien alkoholien osuus vaan myös niiden esterien osuus on suuri.

Näiden neutraalien tuoksuaineosien muodostumisen optimi-olosuhteet ovat seuraavat.

a) alussa pH-arvo on 4,0-5,0 ja matala pH-arvo ylläpidetään fermentoinnin aikana.

b) elatusalustan kokonaistyppipitoisuus on 400-500 mg/1.

Epäorgaanisen typen lähteenä käytetään mieluiten ammonium- sulfaattia, ammoniumnitraattia ja ammoniumkloridia ja orgaanisen typen lähteenä käytetään mieluiten hiivauutetta, kasaminohappoa ja peptonia. Lisäksi saavutetaan hyviä tuloksia lisäämällä aminohappoja kuten leusiinia, isoleusiinia, valiinia ja fenyylialanii-nia.

c) Hiililähteiden valinta:

Sopivia ovat glukoosi, galaktoosi, etanoli ja glyseroli. Suositeltava sakkaridikonsentraatio on 5 %.

d) Solujen ymppäysmäärä on 1-2 %.

e) Viljelylämpötila on 25-30°C.

6 68079

Stationaarinen viljelmä on suositeltava.

2) Orgaanisten happojen muodostus:

Glukoosista muodostuu muurahaishappoa, propionihappoa, n-voihappoa, meripihkahappoa ja sitruunahappoa.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että viljellään Trichosporon kashiwayama-kantaa (FRI 4821) elatusalustan pinnalla tai elatusalustassa pH-arvossa 4,0-6,0 ja lämpötilassa 20-30°C viljelytuotteen tai viljelynesteen saamiseksi; valinnaisesti viljelynesteestä poistetaan solut soluttoman, steriilin nesteen, steriilin suodoksen tai steriilin supernatantin saamiseksi; ja valinnaisesti steriili neste, steriili suodos tai steriili supernatantti, joista solut on poistettu, konsentroidaan tai kuivataan.

Iholääkkeen valmistuksessa käytettään Trichosporon kashi-v/ayama-kannan viljelyssä voidaan käyttää tavanomaisia hiivaelatus-alustoja. Erään suositeltavan toteuttamismuodon mukaan ravistelu-tai stationaarinen viljely suoritetaan 20-30°C:ssa n. 24 tunnissa kiinteässä tai nestemäisessä elatusalustassa, jossa on 0,3 p/t-% glukoosia, 0,5 p/t-% kuorittua maitoa ja 0,05 p/t-% hiiva-uutetta, ja jonka pH-arvo on 4,0-6,0. Sama elatusalusta ympätään muodostuneella viljelytuotteella ja stationaarinen viljely tai ravisteluviljely suoritetaan 3-7 vuorokautta 20-30°C:ssa.

Käyttäen tavanomaisia menetelmiä viljelyneste suodatetaan ja solut poistetaan esim. membraanisuodattimella ja soluton supernatantti konsentroidaan esim. vakuumissa konsentraatiokertoimen ollessa mieluiten 4-25. Muodostunut konsentraatti steriloidaan tavanomaisin menetelmin ja varastoidaan huoneenlämpötilassa tai jääkaapissa.

Käsiteltävänä olevan keksinnön mukaan valmistetun soluttoman supernatantin näytteellä oli taulukossa 1 esitetyt ominaisuudet .

Taulukko 1 Käsiteltävänä olevan kannan viljelytuotteen supernatantin soluton, puhdistettu suodos sisältää pieniä määriä aminohappoja, sakkar.ideja ja lipidejä. Suodoksen kvantitatiivisen määrityksen mukaan kokonaistyppipitoisuus on 0,005 - 0,0015 % ja kokonais-fosforipitoisuus 0,004 - 0,014 %.

i 7 68079 1. Ulkonäkö ja olotila:

Suodos on väritön ja hieman kellertävä, läpinäkyvä neste ja tuoksuu heikosti.

2. Toteamiskokeet: 1) Haihdutetaan vesihauteella 20 ml suodosta tilavuuteen n. 5 ml. Sitten konsentraattiin lisätään 1 ml ninhydriinireagens-siliuosta. Kuumennettaessa seosta 30 minuuttia neste värjäytyy violetiksi.

2) Konsentraattiin, joka saadaan haihduttamalla samalla tavoin kuin yllä kohdassa 1), lisätään 5 ml typpihappoa ja seosta keitetään 20 minuuttia. Seoksen jäähdyttämisen jälkeen se neutraloidaan 10 %:lla natriumhydroksidiliuoksella. Sitten seokseen lisätään 2 ml ammoniummolybdaattireagenssiliuosta. Seosta kuumennettaessa neste muuttuu kellertäväksi. Lisättäessä nesteeseen 10 t-.sta natriumhydroksidiliuosta se muuttuu värittömäksi.

3) Suodokseen lisätään 10 mg indolia ja 2 ml kloorivety-happoa ja seosta ravistellaan riittävästi. Kuumennettaessa sitten seosta 10 minuuttia neste muuttuu punaiseksi.

3. Fysikaaliset ominaisuudet: 1) Tiheys d^: 1,000-1,015 2) Taitekerroin : 1,330-1,340 3) pH 25°C:ssa: 4,5-5,5 4. Haihdutusjäännös: 0,5-2,0 %.

Käsiteltävänä olevan keksinnön mukaisen soluttoman super-natantin konsentraatin (kaksinkertainen konsentraatio) näytteen analyysiarvot ilmenevät taulukosta 2.

Taulukko 2

Vesipitoisuus (normaalipaineessa kuivauksen jälkeen): 98,7 % Proteiinipitoisuus (kerroin 6,25): jälkiä Lipidipitoisuus (soxhlet-uuton jälkeen): 0,2 %

Kuitupitoisuus: 0 %

Tuhkapitoisuus: 0,1 %

Sokeripitoisuus: 1,0 %

Kokonaiskiintoainepitoisuus: : 1,3 %

Aminomuotoisen typen pitoisuus: 10 mg-% \ IF' e 68079

Titrattu happamuus ++^: 0,6

Haihtuvan emäksen muotoisen typen pitoisuus: 1 mg-% Arseenipitoisuus (AS20:na): ei todettu (toteamisraja 0,1 ppm) Raskasmetallipitoisuus (Pb:nä): ei todettu (toteamisraja 1 ppm) Kokonaiselohopeapitoisuus: ei todettu (toteamisraja 0,01 ppm) Kadmiumpitoisuus: ei todettu (toteamisraja 0,01 ppm) Kalsiumpitoisuus: 14,7 mg-%

Fosforipitoisuus: 9,8 mg-%

Muurahaishappopitoisuus: ei todettu (toteamisraja 0,1 %) Etikkahappopitoisuus: ei todettu (toteamisraja 0,01 %) Voihappopitoisuus: ei todettu (toteamisraja 0,01 %) Maitohappopitoisuuss 0,06 %

Sitruunahappopitoisuus: 0,02 %

Elävien solujen määrä: alle 30 solua/ml E.coli: (-)

Staphylococcus aureus: (-)

Sienien määrä: (-)/ml

Hiivojen määrä: (-)/ml

Propionihappopitoisuus: ei todettu (toteamisraja 0,02 mg/kg) Sorbiinihappopitoisuus: ei todettu (toteamisraja 0,005 g/kg) Bentsoehappopitoisuus: 0,42 g/kg p-hydroksibentsohappoesteripitoisuus: ei todettu (toteamisraja 0/005 g/kg) B^-vitamiinipitoisuus: ei todettu (toteamisraja 0,01 mg-%) B2~vitamiinipitoisuus: 0,02 mg-% C-vitamiinin kokonaispitoisuus: ei todettu (toteamisraja 2 mg-%) Bg-vitamiinipitoisuus: ei todettu (toteamisraja 5 /ug-%) B^2~vitamiinipitoisuus: ei todettu (toteamisraja 0,05 yug-%) Pantoteenihappopitoisuus: 0,09 mg-%

Koliinipitoisuus: ei todettu (toteamisraja 0,03 %) Foolihappopitoisuus: ei todettu (toteamisraja 1 /ug-%) Niasiinihappopitoisuus: ei todettu (toteamisraja 0,03 mg-%) Kokonaiskaroteenipitoisuus: ei todettu (toteamisraja 0,02 mg-%) pH-arvo: 4,9 + + + )

Aminohappokoostumus :

Arginiini: alle 0,01 Lysiini: alle 0,01 9 68079

Histidiini: alle 0,01 Fenyylialaniini: alle 0,01 Tyrosiini: alle 0,01 Leusiini: alle 0,01 Isoleusiini: alle 0,01 Metioniini: alle 0,01 Väliini: alle 0,01 Alaniini: alle 0,01 Glysiini: alle 0,01 Proliini: alle 0,01 Glutamiinihappo: 0,01 Seriini: alle 0,01 Treoniinis alle 0,01 Asparagiinihappo: alle 0,01 Tryptofaani: alle 0,01 Kystiini: alle 0,01 Huom.

+) = prosenttiarvo laskettu vedestä ++) = ml 1-n alkaliliuosta neutraloitaessa titraamalla 100 g näytettä +++) = g aminohappoa/100 g näytettä (kystiini: permuurahaishappo-hapetusmenetelmä, tryptofaani: mikro-organismimääritys) Solutonta, steriiliä supernatanttia voidaan tietenkin kon-sentroimattomanakin käyttää iholääkkeenä. Mutta varastoinnin jne. kannalta on suositeltavaa konsentroida soluton, steriili superna-tantti. Lisäksi voidaan käyttää voimakkaasti väkevöityä (yli 25-kertainen konsentraatio) konsentraattia tai kuivatuotetta. Tällaista konsentraattia, voimakkaasti väkevöityä konsentraattia tai kuivatuotetta voidaan käyttää sellaisinaan iholääkkeinä.Lisäksi voidaan valmistaa käsiteltävänä olevan keksinnön mukainen iholääke sekoittamalla konsentraattia, voimakkaasti väkevöityä konsentraattia tai kuivatuotetta sekä voidetta, voideperusainetta tai muuta kantajaa.

Analysoitaessa konsentraattia, joka on saatu konsentroimalla nelinkertaisesti yllä kuvattua solutonta, steriiliä supernatanttia, voidaan havaita sen sisältävän erilaisia aminohappoja ja vitamiineja. Mutta koska analyysi on yleisluonteinen, on helposti ymmärrettävissä, että sekoittamalla ko, komponentit saatujen 10 68079 analyysiarvojen perusteella ei voida valmistaa käsiteltävänä olevan keksinnön mukaista iholääkettä. Toisin sanoen uskotaan, että käsiteltävänä olevan keksinnön mukaisen iholääkkeen teho johtuu analyysin ulkopuolelle jäävistä tuntemattomista komponenteista.

Tulokset kananpojan sikiöllä suoritetusta myrkyllisyysko-keesta osoittavat, että yllä mainittu soluton, steriili konsentraat-ti (nelinkertainen konsentraatio) on myrkytön. Lisäksi tulokset ihmiskehon laastarikokeesta ja ihmisihon jatkuvasta ärsytyskokees-ta osoittavat, että konsentraatti ei vähimmässäkään määrin ole myrkyllinen ihmisen iholle. Lisäksi tulokset kanin silmän ärsytys-kokeesta osoittavat, että konsentraatti ei vähimmässäkään määrin ärsytä. Ja lopuksi tulokset antibioottikokeesta osoittavat, että konsentraatti ei sisällä antibioottista ainetta.

On voitu osoittaa, että käsiteltävänä olevan keksinnön mukainen iholääke vaikuttaa parantavasti iholäiskiin, sierettyneeseen ihoon, kosketusihottumaan ja ihon palovammoihin. Tätä parantavaa vaikutusta kuvataan nyt viitaten seuraaviin kokeisiin.

Kokeeseen valittiin 50 naista, ikä 23-44 vuotta, jotka jonkun ihosairauden vuoksi olivat hakeutuneet ihotautisairaaloihin. Kiinnelaastareita, joiden koko oli 4 cm x 4 cm ja jotka sisälsivät n. 0,2 g käsiteltävänä olevan keksinnön mukaista konsentraat-tia (kaksinkertainen konsentraatio), kiinnitettiin vasemman olkavarren sisäpinnalle ja selässä selkärangan vierialueelle. Neljän-kymmenenkahden tunnin kuluttua laastarit poistettiin ja käsiteltyjä alueita tutkittiin. Yhdenkään potilaan vasemman olkavarren sisäpinta tai selkärangan vierialue ei ollut vahingoittunut.

2

Steriloituja harsotyynyjä, pinta-ala 10 cm , kyllästettiin n. 5 ml:11a käsiteltävänä olevan keksinnön konsentraattia (kaksinkertainen konsentraatio) ja ne asetettiin 15 minuutiksi 45 naisen, ikä 23-45 vuotta, oikean posken alueelle (35 naista poti jotakin ihotautia, jota lääkittiin ihotautisairaalassa, ja loput 10 naista kuuluivat tämän sairaalan henkilökuntaan). Tätä käsittelyä jatkettiin 40 päivää. Kenessäkään näistä naista ei voitu havaita mitään reaktiota eikä häiriötä kuten punoitusta ei esiintynyt lainkaan.

Koe-eläiminä käytettiin kolmea valkoista kania. Ennalta varmistuttiin siitä, että silmissä ei ollut mitään poikkeavaa.

il n 68079

Kunkin kanin oikeaan silmään tiputettiin 0,1 ml käsiteltävänä olevan keksinnön konsentraattia (kaksinkertainen konsentraatio) ja vasempaan silmään tiputettiin 0,1 ml tehotonta nestettä. Välittömästi ja 3, 6, 24, 48 ja 72 tuntia tiputuksen jälkeen molemmat silmät tutkittiin rakolampulla. Mitään poikkeavaa kuten verentungosta sarveiskalvossa, värikalvossa tai sidekalvossa ei voitu havaita.

Valittiin 621 näistä, jotka kasvoissa olevien iholäiskien vuoksi olivat hakeutuneet hoitoon ihotautisairaaloihin. Mukaan ei kelpuutettu maksa- tai naistentauteja sairastavia potilaita eikä raskaana olevia naisia. Kasvojen pesun jälkeen ihohuokoset avattiin otsonilla ja höyryttämällä ja käsiteltävänä olevan keksinnön soluttoman supernatantin konsentraatilla (kaksinkertainen konsentraatio) kyllästetty harsotyyny asetettiin läiskäiselle alueelle. Sitten tämä harso peitettiin Sara-Wrap teipillä ja säteilytettiin infrapunavalolla 15-20 minuuttia konsentraatin imeyttämiseksi ihoon. Tämä käsittely suoritettiin kerran viikossa ja sitä jatkettiin kolme kuukautta. Havaittiin, että tila oli suuresti parantunut 363 naisella (58,4 %), tila oli suhteellisesti parantunut 122 naisella (19,8 %), mitään parannusta ei havaittu 133 naisella (0,01 %) ja kosketusihottumaa oli havaittavissa lopulla kahdella naisella (0,03 %) (pääteltiin, että kosketusihottuma johtui tähän hoitoon liittymättömistä syistä). Potilaiden, joiden tila oli parantunut suuresti tai suhteellisen paljon, osuus oli niinkin suuri kuin 80 %. Lisäksi ryhmässä, jossa 365 naisen tila parani suuresti, 60 %:lla iholäiskät hävisivät täysin.

Tavallisesti 25-30 vuotta täyttäneet naiset pelkäävät ihon sierettymistä ja hienoja ryppyjä ja erityisen silmiinpistävää tämä on 35-40 vuotiailla naisilla, joskin 40 vuotta täyttäneet naisetkin pelkäävät yhtä lailla ihon sierettymistä ja hienoja ryppyjä. Tähän kokeeseen valittiin 962 ihotautisairaaloihin hakeutunutta naista (150 naista ikä 25-30 vuotta, 218 naista ikä 30-35 vuotta, 248 naista ikä 35-40 vuotta, 172 naista ikä 40-45 vuotta ja 174 45 vuotta täyttänyttä naista). Kasvojen pesun jälkeen ihohuokoset avattiin otsonilla ja höyryttämällä ja käsiteltävänä olevan keksinnön soluttoman supernatantin konsentraatilla (kaksinkertainen konsentraatio) kyllästetty harsotyynyt asentettiin tiiviisti 12 68079 kasvojen iholle ja harso peitettiin Saran-Wrap teipillä. Säteily-tettiin infrapunavalolla 15-20 minuuttia konsentraatin imeyttämi-seksi ihoon. Havaittiin, että yhden hoitokerran jälkeen sierettynyt iho oli suuresti parantunut 698 naisella (73 %), sierettynyt iho oli suhteellisesti parantunut 156 naisella (16 %), tila oli muuttumaton 72 naisella (7 %) ja tila ei ollut huonontunut yhdelläkään testatulla naisella lopun muodostuessa 36 naisesta (4 %). Koska sierettynyt iho johtaa hienoihin ryppyihin on pääteltävissä, että käsiteltävänä olevan keksinnön konsentraatti, joka lääkitsee sierettynyttä ihoa, estää ennalta hienojen ryppyjen muodostumista .

Valittiin 21-vuotias nainen, joka vaihdettuaan valmistajan A luomivärin valmistajan B luomiväriin sai vaihtoa seuranneesta päivästä lähtien molempien silmien luomiin ihottuman ja kutinaa. Diagnoosi oli kosketusihottuma. Ihotautilääkäri asetti tulehtuneille kohdille harsoa, joka oli kyllästetty käsiteltävänä olevan keksinnön soluttoman supernatantin konsentraatilla (kaksinkertainen konsentraatio). Ei käytetty lainkaan steroidilääkettä, tulehduksen vastaista ainetta eikä antihistamiinia. Potilaalle annettiin mukaan n. 20 ml konsentraattia, jolla haudottiin tai siveltiin kahdesti päivässä, so. aamulla ja illalla. Neljänkymme-nenkahdeksan tunnin kuluttua hoidon aloittamisesta kutina oli hävinnyt ja 96 tunnin kuluttua hoidon aloittamisesta ihottuma oli hävinnyt lähes täysin. Viikon kuluttua ihottumaa ei voitu havaita lainkaan.

Neljäkymmentäseitsemän vuotias nainen, jolle kuuma vesi oli aiheuttanut kyynärvarren ulkosivun alueelle luumunkokoiseksi turvonneen, punoittavan ja pienien rakkuloiden peittämän palovamman (toisen asteen palovamman), hakeutui ihotautilääkäriin n. tunti tapaturman jälkeen. Vammautunutta aluetta jäähdytettiin välittömästi juoksevalla vedellä ja sille asetettiin käsiteltävänä olevan keksinnön soluttoman, steriilin superanatantin konsentraatilla (kaksinkertainen konsentraatio) kyllästetty harso, joka peitettiin öljypaperilla. Tämän jälkeen vamma-alueella asetettiin sidos. Kahdekymmenenneljän tunnin kuluttua havaittiin, että pienet rakkulat olivat hävinneet täysin, joskin punoitus ja turvotus olivat vielä jäljellä. Potilas ei valittanut kipua.

i3 6807 9

Kolmikymmenvuotiasta miestä, jolle kuuma vesi oli aiheuttanut oikean jalan takapuolen alueelle kananmunan kokoisen punoittava ja turvonneen palovamman (toisen asteen palovamma), hoidettiin yllä kuvatulla tavalla käsiteltävänä olevan keksinnön so-luttoman, steriilin superanatantin konsentraatilla (kaksinkertainen konsentraatio). Kahdenkymmenenneljän tunnin kuluttua turvotus oli hävinnyt, joskin punoitus jatkui. Potilas ei valittanut kipua.

Siten voitiin osoittaa, että käsiteltävänä olevan keksinnön konsentraatilla oli erittäin hyvä parantava vaikutus palovammoihin.

Käsiteltävänä olevan keksinnön mukaisesti saatavaa iholää-kettä kuvataan seuraavien esimerkkien avulla.

Esimerkki 1 1000 litran ilmastettuun ja sekoitettuun fermetointitank-kiin panostettiin 800 1 elatusalustaa, jonka koostumus on kuvattu yllä, ja lämpösteriloinnin ja itsestään jäähtymisen jälkeen tämä elatusalusta ympättiin viljelmällä, joka oli aikaisemmin saatu viljelemällä 28°C:ssa n. 30 tuntia 10 litrassa samaa elatusalustaa pienessä ilmastetussa ja sekoitetussa fermentointitankissa. Fermentoinnin päätyttyä viljelyneste valutettiin suodatuskoneen malli MP 293-16, valmistaja Naigai Shokuhin Kogyo Kaisha (suodatinpaperi GL-90, 0,5 yum, valmistaja Toyo Roshi) läpi ja suodatus-koneen malli MP 293-4, valmistaja sama yhtiö (membraanisuodatin TM-2, 0,45/um, valmistaja Toyo Roshi) läpi kiintohiukkasten ja solujen poistamiseksi. Saatu suodos konsentroitiin käänteisosmoosi-membraanimenetelmän mukaan käyttäen käänteisosmoosilaitetta Rö-TlO, valmistaja Bioengineering Co, jolloin tilavuus väheni 200 litraksi. Saatu konsentraatti steriloitiin levylämmönvaihtimessa (valmistaja Iwai Kikai Kogyo Kabushiki Kaisha), pakattiin steriilistä lasiastioihin ja varastoitiin jääkaapissa (5°C).

Esimerkki 2

Esimerkissä 1 saatu steriloitu konsentraatti pakkaskuivat-tiin ja saatu jauhe sekoitettiin steriiliin voideperusaineeseen ihovoiteen saamiseksi.

Claims (2)

14 6 8079

1. Menetelmä uuden Trichosporon kashiwayama-kannan (tallennettu FRI:hin talletusnumerolla 4821), joka on tunnistettavissa sukuun Geotricum tai Endomycopsis kuuluvaksi kannaksi, viljelytuotteen tai -nesteen, mainitun viljelytuotteen tai -nesteen steriilin nesteen, steriilin suodoksen tai steriilin superanatantin, joista solut on poistettu, tai niiden konsentraatin tai kuivatuotteen valmistamiseksi, jotka ovat terapeuttisesti käyttökelpoisia esimerkiksi iholääkkeenä, tunnettu siitä, että viljellään Trichosporon kashiwayama-kantaa (FRI 4821) elatusalustan pinnalla tai elatusalustassa pH-arvossa 4,0-6,0 ja lämpötilassa 20-30°C viljelytuotteen tai viljelynesteen saamiseksi; valinnaisesti viljelynesteestä poistetaan solut soluttoman, steriilin nesteen, steriilin suodoksen tai steriilin supernatan-tin saamiseksi; ja valinnaisesti steriili neste, steriili suodos tai steriili supernatantti, joista solut on poistettu, konsentroidaan tai kuivataan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että elatusalusta muodostuu glukoosista, kuoritusta maidosta ja hiivauutteestä ja että kantaa viljellään aerobisissa olosuhteissa. I!