FI61886C - Foerfarande foer framstaellning av i tumoerterapi anvaendbara 1-alkylkarbamoyl-5-fluoruraciler - Google Patents

Description

Ir , KUULUTUSJULKAISU s * n n s jSjft (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT OlOOO

C ^ Pentti myönnetty 11 10 1932 (51) tD 239/54 SUOM 1 —FI N LAN D (21) P»t«nttlh»k«mu» — Ptt«nun*eknlng Τ6ΐ853 (22) Htk*ml*pftivt — An*öknlng*d»g 24.06.T6 (23) Alkupllvl — Glltlghuudag 24.06. T 6

(41) Tullut julkisiksi — Bllvlt offsntlig 06.05 · TT

Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nlhttvlkslpsnon j* kuuUjulksIsun pvm. - . , „

Patent» och registerstyrelgen Anstksn utlsgd och uti.skrift«n pubiicarad ju. Ob. od (32)(33)(31) Pyydetty ptuolkeui—Begird priorltet 05*11.75 USA(US) 62897^ Toteennäytetty-Styrkt (71) Mitsui Toatsu Chemicals, Inc., No. 2-5, 3-chome, Kasumigaseki,

Chiyoda-ku, Tokyo, Japani-Japan(JP) (72) Shoichiro Ozaki, Kamakura-shi, Kanagawa-ken, Haruki Mori, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japani-Japan(jP) (74) Leitzinger Oy (54) Menetelmä kasvainterapiassa käytettävien l-alkyylikarbamoyyli-5--fluoriurasiilien valmistamiseksi - Förfarande för framstalining av i tumörterapi användbara l-alkylkarbamoyl-5-fluoruraciler

Oheisen keksinnön kohteena on menetelmä kasvainterapiassa käytettävien l-alkyylikarbamoyyli-5-fluoriurasiilien valmistamiseksi, joiden kaava on

ArF

n/

CONHR

jossa R tarkoittaa 3-8-hiiliatomista alkyyliä.

Tällä hetkellä tunnetaan suhteellisen suuri joukko kemiallisia yhdisteitä, joita voidaan käyttää kliinisessä terapiassa ihmisten kasvainten hoidossa. Nämä kasvaintenvastaiset aineet voidaan luokitella alkyloiviin aineisiin, anti-metaboliitteihin, antibioottisiin kasvainten vastaisiin aineisiin, hormooneihin jne. Niiden kliininen käyttö riippuu kyseisten kasvainten laadusta, mutta useimpia niistä käytetään akuutissa tai kroonisessa leukemiassa ja pahanlaatuisessa imukudoskasvaimessa, ja vain muutamat niistä ovat tehokkaita kiinteitä kasvaimia, kuten rauhassyöpää vastaan.

2 618 8 6

Esimerkkejä jälkimmäisestä tyypistä ovat 5-fluoriurasiili ja sen vähätoksinen johdannainen 5-fluori-l-(2-tetrahydrofuryyli)-urasiili, joiden tiedetään olevan tehokkaita rauhassyöpää vastaan. 5-fluoriurasiilin tiedetään siten olevan tehokas antimetaboliitti käytettäessä ihmisillä rauhassyövän tai gastrointestinaalisen syövän hoidossa. Suuresta toksisuudestaan johtuen 5-fluoriurasiilia ei kuitenkaan pidetä toivottavana syövänvastaisena aineena ja parannuksen katsotaan tässä suhteessa olevan välttämätön. Toisaalta 5-fluori-l-(2-tetrahydrofuryyli)urasiili, vaikkakin se ei ole niin toksinen/ on kasvaimenvastäiseltä aktiviteetiltaan oleellisesti huonompi kuin 5-fluoriurasiili, ja siten on toivottavaa kehittää 5-fluoriurasiilijohdannaisia, jotka ovat yhtä toksittomia kuin 5-fluori-l-(2-tetrahydrofuryyli)urasiili/ mutta jotka ovat oleellisesti tehokkaampia antimetaboliitteja.

Saksalaisen hakemusjulkaisun 2455423 selityksessä on kuvattu joitakin 5-fluoriurasiilijohdannaisia, joiden toksisuus on yhtä pieni kuin 5-fluori-l-(2-tetrahydrofuryyli)-urasiilin, mutta joilla kuitenkin on korkeampi kasvainten vastainen teho.

Tässä julkaisussa mainitaan ainoana esimerkkinä 1-alkyylikarbamoyyli-urasiileista l-metyylikarbamoyyli-5-fluoriurasiili. Yllättäen on nyt havaittu, että 1-alkyylikarbamoyyli-urasiilin alkyyliryhmän hiiliatomien luku on kriittinen. Niinpä metyyliyhdisteiden terapeuttinen indeksi on 1,9 kun taas yhdisteillä, joiden vastaavassa alkyyliryhmässä on 3-8 hiiliatomia terapeuttinen indeksi on oleellisesti korkeampi (kts. jäljempänä esitetty selvitys) ja ne ovat näin ollen huomattavasti turvallisempia käyttää. On myöskin yllättäen osoittautunut, että alkyyliryhmän hiiliatomien lukumäärän lisääntyessä yhdisteiden pysyvyys lämmön vaikutusta ja pH-arvon muutoksia vastaan yleensä kasvaa.

Oheisen keksinnön mukaan valmistetut l-alkyylikarbamoyyli-5-fluori-urasiilit, joiden alkyyliryhmässä on 3-8 hiiliatomia, ovat yleisesti huomattavasti sopivampia kliiniseen käyttöön kuin aikaisemmin tunnetut 5-fluoriurasiilijohdannaiset kasvaintenvastaisen aktiviteetin, veritason, retentioajan ja toksisuuden suhteen.

3 61886

Suositeltuja esimerkkejä alkyyliradikaaleista R ovat n-propyyli, isopropyyli, n-butyyli, tert.-butyyli, n-pentyyli, n-heksyyli, n-heptyyli ja n-oktyyli.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että 5-fluoriurasiili karbamoyloidaan isosyanaatin kanssa, jonka kaava on

R-NCO

jossa R on edellä määritelty.

Reaktio suoritetaan tavallisesti orgaanisessa liuottimessa. Tähän tarkoitukseen ovat sopivia' orgaaniset liuottimet, kuten dimetyyli-sulfoksidi, dimetyyliformamidi, dimetyyliasetamidi, asetonitriili ja vastaavat. 5-fluoriurasiili liuotetaan valittuun orgaaniseen liuottimeen, liuokseen lisätään yhtä edellä mainittua isosyanaattia ja reaktioseosta sekoitetaan lämpötilassa, joka on huoneen lämpötilan ja reaktioseoksen refluksointilämpötilan välillä.

Reaktioseos parhaiten suodatetaan tai väkevöidään alipaineessa ja saatu raaka tuote puhdistetaan, esimerkiksi pesemällä, kiteyttämällä uudelleen ja saman tapaisilla menetelmillä. Näin saadut 1-karbamoyyli-5-fluoriurasiilit ovat valkoisia kiteisiä lehtiä tai rakeita ja ne ovat erinomaisia oraalisia kasvaintenvastaisia aineita.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat oheisen keksinnön mukaisten 1-karbamoyy1i-5-fluoriurasi ilien vaImi s tusmene telmää.

Esimerkki 1 13,0 g (0,10 moolia) 5-fluoriurasiilia liuotettiin 80 mitään dimetyy-liasetamidia, sen jälkeen lisättiin huoneen lämpötilassa 9,4 g (0,11 moolia) n-propyyli-isosyanaattia ja sekoitettiin 8 tuntia 55°C:ssa.

Reaktioseos väkevöitiin 50 mltksi poistamalla dimetyyliasetamidi ja ylimääräinen n-propyyli-isosyanaatti alipaineessa. Jäähdyttämisen jälkeen jäännös kaadettiin 300 mitään vettä ja saatu sakka erotettiin suodattamalla. Sakka pestiin vedellä ja eetterillä ja kuivattiin. Saatiin 17,2 g (saanto 80,1 %) 5-fluori-1-(n-propyylikarbamoyyli)-urasiilia.

Tuote kiteytettiin uudelleen etanolista, jolloin saatiin valkoisia kiteitä, jotka sulivat 285°C:ssa (hajoten) ja joilla oli seuraavat luonteenomaiset absorptiopiikit spektrin IR-alueella seuraavilla,

senttimetrien käänteisarvoilla ilmaistuilla taajuuksilla:3400, 330CW

4 61886 3180, 3080(M), 2970, 2870, 2810, 1720(VS), 1680(S), 1525(S), 1455, 1330, 1270(S), 1213, 1090, 1035, 1005, 935, 845, 785 ja 755.

Alkuaineanalyysin tulokset vastasivat hyvin laskettuja arvoja:

C H F N

Saatu (%) 44,61 4,76 8,67 19,81

Laskettu (%) 44,65 4,65 8,84 19,53 {C8H10PN303)

Esimerkki 2 13.0 g (0,1 moolia) 5-fluoriurasiilia liuotettiin 100 ml:aan dimetyyli-sulfoksidia, sen jälkeen lisättiin huoneen lämpötilassa 9,4 g (0,11 moolia) isopropyyli-isosyanaattia ja sekoitettiin samassa lämpötilassa 15 tuntia. Reaktioseos kaadettiin 800 mliaan vettä. Saatu sakka erotettiin suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivattiin, jolloin saatiin 14,7 g (saanto 68,5 %) 5-fluori-1-(iso-propyylikarbamoyyli)-urasiilia, sulamispiste 275 - 285°C (hajoaa).

Saadulla tuotteella oli luonteenomaiset absorptiopiikit spektrin IR-alueella seuraavilla, senttimetrien käänteisarvoilla ilmaistuilla taajuuksilla: 3300, 3200, 3040, 1740, 1705, 1535, 1465, 1340, 1270, 1165, 1070, 940, 840, 790 ja 760.

Alkuaineanalyysin tulokset vastasivat hyvin laskettuja arvoja.

C H F N

Saatu (%) 44,54 4,60 9,11 19,12

Laskettu (%) 44,65 4,68 8,83 19,53 <C8H10FN3°3>

Esimerkki 3 13.0 g (0,10 moolia) 5-fluoriurasiilia liuotettiin 70 ml:aan dimetyyli-formamidia, minkä jälkeen tähän lisättiin huoneen lämpötilassa 11,9 g (0,12 moolia) n-butyyli-isosyanaattia ja sekoitettiin samassa lämpötilassa 24 tuntia. Reaktioseos väkevöitiin 40 ml:ksi poistamalla dimetyyliformamidi ja ylimääräinen n-butyyli-isosyanaatti alipaineessa. Jäännös kaadettiin 300 ml:aan vettä ja saatu sakka erotettiin suodat- s 61886 tamalla. Sakka pestiin ja kuivattiin, jolloin saatiin 16,6 g (saanto 72,3 %) 1-(n-butyylikarbamoyyli)-5-fluoriurasiilia.

Tuote kiteytettiin uudelleen etanolista, jolloin saatiin valkoisia kiteitä, jotka sulivat 283°C:ssa (hajoten) ja joilla oli luonteenomaiset absorptiopiikit spektrin IR-alueella seuraavilla, senttimetrien käänteisarvoilla ilmaistuilla taajuuksilla: 3270, 3080, 2950, 2810, 2780, 1715^1740(S), 1685, 1660, 1500—1540, 1480, 1332, 1270, 1205, 1090, 1085, 900, 770 ja 750.

Tämän tuotteen alkuaineanalyysin tulokset vastasivat hyvin laskettuja arvoja:

C H F N

Saatu (%) 47,29 5,32 8,18 18,80

Laskettu (%) 47,16 5,24 8,30 18,34 (C9H12™3°3)

Esimerkki 4 4,73 g (0,0506 moolia) n-pentyyli-isosyanaattia, 6,59 g (0,0506 moolia) 5-fluoriurasiilia ja 20 ml N,N-dimetyyliasetamidia sekoitettiin yhteen ja sekoitettiin 12 tuntia 60°C:ssa. Reaktioseoksen annettiin seistä yön yli, minkä jälkeen liuotin poistettiin ja jäännös liuotettiin 120 ml:aan kloroformia. Liukenematon aines erotettiin suodattamalla. Liukenen»ton aines (4,13 g) oli reagoimatonta 5-fluoriurasiilia. Saatu kloroformiliuos pestiin kaksi kertaa 100 ml:11a vettä ja kuivattiin natriumsulfaatilla. Liuotin poistettiin ja jäännös kiteytettiin uudelleen 30 ml:sta etanolia. Näin saatiin 2,47 g (20,1 % laskettuna n-pentyyli-isosyanaatista tai 53,7 % laskettuna muuntuneesta 5-fluori-urasiilista) 1-(N-n-pentyylikarbamoyyli)-5-fluoriurasiilia valkoisina kiteinä, sp. 117,3 - 118,0°C.

Alkuaineanalyysin tulokset vastasivat hyvin laskettuja arvoja: 6 61886

C H N F

Saatu (%) 49,56 5,81 16,59 7,67

Laskettu (%) 49,38 5,80 17,28 7,81 (C10H14N3°3F) NMR (CDC13) δ: 0,94 (3H, tripletti, -CH3); 1,49 (6H, multipletti -CH2~) ; 3,45 (2H, kvartetti, -CH2NHC0) ; 8,63 (1H, dupletti, CH 5-fluoriurasiilirenkaassa); ja 9,20 (1H, leveä, NH 5-fluoriura-siilirenkaassa).

Esimerkki 5 13.0 g (0,10 moolia) 5-fluoriurasiilia suspendoitiin 60 ml:aan di-metyyliasetamidia, minkä jälkeen lisättiin huoneen lämpötilassa 14.0 g (0,11 moolia) n-heksyyli-isosyanaattia ja sekoitettiin 50°C:ssa 8 tuntia. Reaktioseos väkevöitiin alipaineessa, minkä jälkeen jäännös kaadettiin 400 ml:aan vettä ja saatu sakka erotettiin suodattamalla. Sakka pestiin ja kuivattiin, jolloin saatiin 19,3 g (saanto 75,0 %) 5-fluori-l-(n-heksyylikarbamoyyli)urasiilia.

Tuote kiteytettiin uudelleen eetteristä, jolloin saatiin valkoisia kiteitä, jotka sulivat 283°C:ssa (hajoten) ja joilla oli tunnusomaiset absorptiopiikit spektrin IR-alueella seuraavilla, senttimetrien käänteisarvoilla ilmaistuilla taajuuksilla: 3320, 3230, 3080, 2920, 2850, 1720NL740, 1680, 1660, 1510, 1445, 1340, 1272, 1200, 1090, 1042, 802, 770 ja 750.

Alkuaineanalyysin tulokset vastasivat hyvin laskettuja arvoja:

C H F N

Saatu (%) 51,19 6,37 7,27 16,60

Laskettu (%) 51,36 6,23 7,39 16,34 (C11H16FN3°3)

Esimerkki 6 8,53 g (0,066 moolia) 5-fluoriurasiilia, 12,0 g (0,085 moolia) n-heptyyli-isosyanaattia ja 30 ml N,N-dimetyyliasetamidia sekoitettiin yhteen ja sekoitettiin 8 tuntia 60°C:ssa. Reaktioseoksen annettiin seistä yön yli, jonka jälkeen liuotin poistettiin alipaineessa ja 7 61886 jäännös liuotettiin 150 ml:aan kloroformia. Liukenematon aines erotettiin suodattamalla. Liukenemattomana aineksena saatiin talteen 2,10 g reagoimatonta 5-fluoriurasiilia. Saatu kloroformiliuos pestiin 2 x lOO ml:11a vettä ja kuivattiin natriumsulfaatilla. Liuotin puristettiin ja jäännös kiteytettiin uudelleen 120 ml:sta etanolia, jolloin saatiin 7,83 g (43,7 % laskettuna n-heptyyli-isosyanaatista tai 58,4 % laskettuna muuntuneesta 5-fluoriurasiilista) 1-(N-n-heptyylikarbamoyyli)-5-fluoriurasiilia valkoisina kiteinä, sp.

102,8 - 104,0°C.

Alkuaineanalyysin tulokset vastasivat hyvin laskettuja arvoja:

C H N F

Saatu (%) 53,37 7,22 15,36 7,18

Laskettu (%) 53,13 6,69 15,49 7,00 (C12H18li303F) NMR(CDClg)δ: 0,90 (3H, tripletti, -CH3)\ 1,35 (10H, multipletti, -CH2-) , 3,43 (2H, kvartetti, NH-CH2-); 8,62 (1H, dupletti, CH 5-fluoriurasiilirenkaassa)> ja 9,15 (1H, leveä, NH 5-fluoriurasiili-renkaassa.

Esimerkki 7 40 ml dimetyyliasetamidia lisättiin seokseen, joka sisälsi 10,01 g 5-f luoriurasiilia ja 11,95 g n-oktyyli-'-isosyanaattia. Reaktion annettiin tapahtua tunnin ajan 60°C:ssa, minkä jälkeen reaktioseoksen annettiin seistä yön yli huoneen lämpötilassa. Liuotin tislattiin pois ja jäännökseen lisättiin uuttamista varten 200 ml kloroformia ja 300 ml vettä. Kloroformikerros kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla. Kloroformin haihduttamisen jälkeen saostuneet kiteet kiteytettiin uudelleen etanolista, jolloin saatiin 9,49 g 1-(N-n-oktyyli-karbamoyyli)-5-fluoriurasiilia, sp. 98 - 100°C.

Alkuaineanalyysin tulokset vastasivat hyvin laskettuja arvoja:

C H N

Saatu (%) 55,60 7,42 14,04

Laskettu (%) 54,72 7,07 14,73 (C13H20N3°3F) 8 61886 NMH (CDC13), 6 0,89 (3H, tripletti, -CH3) ·, 1,32 (12H multipletti, -CH2-)ϊ 3,32 (2H, multipletti, NHCH2)j 8,48 (1H, dupletti, Cg-H)j 9,28 (1H, tripletti, NH)j ja 12,43 (1H, leveä signeltti, NH).

Oheisen keksinnön mukaisten l-karbamoyyli-5-fluoriurasiilien kas-vaintenvastaiset aktiviteetit määritettiin hiirillä seuraavassa esitetyn menettelyn mukaisesti ja niitä verrattiin 5-fluoriurasiilin (5-FU), 5-fluori-l-(2-tetrahydrofuryyli)urasiilin (FT-207) ja eräiden muiden analogien aktiivisuuksiin.

1x10^ kudos leukemian L-1210 kasvainsolua (Natural Cancer Institute) siirrostettiin intraperitoneaalisesti BDF^-hiiriin. Siirrostamisesta 24 tunnin kuluttua kauden, näin siirrostetun BDF^-hiiren muodostamalle ryhmälle annettiin kerran päivässä oraalisesti 0,1 ml kunkin testattavan yhdisteen suspensiota 0,5-prosenttisessa karboksimetyy-liselluloosassa 5 päivän ajan käyttämällä mahaputkea. L-1210-kanta on USA:ssa kaikkein useimmin käytetty kanta, joka on hyvin herkkä antimetaboliiteille. Sillä siirrostettujen eläinten elinajassa tapahtuu vain hyvin vähän vaihtelua, ja solujen lukumäärän ja elinpäivien välillä on selvä korrelaatio. (Tässä tapauksessa vertailuryhmä kuoli 9 päivän kuluttua siirrostamisesta).

Kasvaintenvastäinen aktiviteetti arvioidaan annoksena, joka tarvitaan lisäämään tietyn verran elinaikaa (ILS) verrattuna vertailuryhmään. Laskeminen tapahtuu seuraavan kaavan avulla: ILS % (eliniän kasvu, %) = (T/C x 100-100) % jossa T: Päivien lukumäärä lääkkeen antamisen ensimmäisestä päivästä käsitellyn ryhmän hiirien kuolemaan, C: Päivien lukumäärä lääkkeen antamisen ensimmäisestä päivästä vertailuryhmän hiirien kuolemaan.

"Kasvaintenvastäistä aktiviteettia" verrataan ottamalla pienimmäksi tehokkaaksi annokseksi ILS^q (so. annos, joka tarvitaan eliniän pidentämiseen 30 %:lla). Tietyn aineen "toksisuus" voidaan ilmaista sen optimaalisena annoksena (so. annoksena, jossa ILS-arvo saavuttaa maksiminsa, jonka merkki tässä on ILS max), ja "kasvaintenvastaisen aktiviteetin" ja "toksisuuden" välinen suhde voidaan ilmaista "terapeuttisena indeksinä" (T.I.), joka on "optimaalinen annos (ILS max arvo)/pienin tehokas annos (so. ILS3Q-arvo)". "Terapeuttinen indeksi" 9 61886 ilmoittaa kvantitatiivisen hajonnan pienimmän ja optimiannoksen välillä ja on siten osoitus suhteellisesta turvallisuudesta, jolla ainetta voidaan käyttää.

Tämän testin tulokset on koottu seuraaviin taulukoihin I ja II.

61 886 ίο Γ-"

Ο ro νο ή in O

<Ν rH rH ro Η O

I r—I ·—ί Γ—J I—) J—I

E-<

Cu

4J

3___—---------- +> o

<u O

cc *—I

3 C D m vo ro C 3 fc h in ro +

•H (H I rH i—li—I

3 in dP

-4-> en

W--------J

3 ----·— —-—--” —1 —--—— —h

> C

CO ·· 3

O :0 C

4J -H MO

e ι-n λ: m

Ή rO Ή *H

3 >i 10 -H

> M M 3 in -h >« 3 <Ό Π3 n-' p λ; ro -u 3 i—I e

C co S O CO lO oor-t <D

id co io in ro ro tn

-PC O O H iH rH ,—i,—| Q

tn 3 -n | p •h 3 e a 3 Ή K ___ _____ _____ _____ ,, e e -h ' e e O r-1 <J\ :nj

3 M -H 33 -H

Ό3·Η n* o oo no C

-C 3 en , U tNin ro cn -h

O Ή 3 I i—li—I iHrH r—I

-Γ-l -H M fl (D

Ό 3~

C Ή -H---- C

H O O P ro 3 -P Ή O 3 O -P E 3 ro m *3· oo ro -p M -r\ >Λ H ® H in ro ro cn

Ai l3 Ή 4-1 O iH iH ,Η ,_| H

3 P | "- 3

H Φ O un O E

3 Ή | | ,Η

3 3 <N -H -H

E-H -ro H r-l ...............-"· ...............- -

I >1 (N -H

C V3 >1 r< 4J

-H O ro -P

H \ g ® O en, «P ΙΟ σι 3 •h <h 3 OrHo^cn cn 30

•H | J3 '— <H iH rH I—I H -PO

CO ·Η P s -H |H

3 +J 3 u > p -p a: i -h +

3 3 -H -P

•H 3 H —————— P -p >1 3 r-

0 -H >i r-» O

P > M X C \ »H-HiH ro lO O O co tl ^ Ή -P 3 ΟσιΗΐο ro C'-'

1 M I I H H H H CO

in 3 H e 3 P!

_ __________ . -P H

m 3

> O

o cm e 3

-H -P

rtj ——— 3

> -H C

a 33 \ > > en o O O O O O mm iflAiOOOn-tnro 33 O \ ro CN rH Ai C tn e e \ 1 5w 1 h 1 61886 11

Kuten taulukosta I havaitaan, 5-FU:n ja FT-207:n kasvaintenvastainen aktiviteetti, ilmaistuna ILS% + 100-arvona, on vastaavasti 133 ja 100 annoksen ollessa 30 mg/kg/päivä, ja niiden optimiannokset (ILS/max) ovat vastaavasti 50 ja 100 mg/kg/päivä; kun taas keksinnön mukaisten yhdisteiden elinajan suurimmat prosentuaaliset kasvut ovat 1,5-2 kertaa korkeampia kuin FT-207:n ja vähintään verrattavissa 5-FU:n arvoihin.

12 61 886

f t ~h t ' t T fO

Ms - t Oi φ \ I Ο Ο Ή o 0)

ΉI ^ Eh O O oo - +J

rl 3 r-l rH rH rH tO

4J 4J 3

C Φ----i----U

o g &

•H 3D

> Eh fa t"- Ο ιο c

Vl I <N ID LD - -H

3 LTO rH rH y) --------x c ---------—— .........· ’— Φ

VC XI

C O C

'Ί -H

P -H

P rH C

3 >1 <D

QJ >1 to

CU X -H

3 rH 4J

H <e P

0) c p <0 m , φ 10 <—I Q« c to a ora V 0^000 - Vi -P -ro u <"0 O 1/1 Ο Φ

10 I 00 rH r-H -P

-rl >· C

CO -H------p

CP -H

C -r| -H

3 :3 -H a +)

3 in tn t m o <r <n rH

,3 to 3 0^ O m ·. φ

Ο -rl V-l t I—I rH PH 4J

P g 3 C -r|

3 ‘3 ___________....... .... ______ X

C CD U 0 O) P O ro 3

Ό tO 3 r-N rH

•rl >. rH 00 VO O ^ 00

:3 to <+H a CM o in r -H

Vi 3 1 O rH rH ro -P

φ -rl UO "r C

ε I υ -π H 3 Φ ·Ή I o Η TO M rH_____-r| 3 >, > 0 G Φ >, oh u r^ Ή rH I 0 ---- 3 -X fa -H g 00

3 H 3 3 a Ο Ο lO oo G

fa fa fa ,Q ζ_) 00 t^lD «* φ 3 to 0 Vi — rH oh c

3 3 Mh 3 a -H

e-ι v ε λ: u 4j

3 >i -rl I P

Ή rH rH 11 I, -- _____ _____ I 3 >H >1 Φ 0 o >1 Γ" cu 3 rH Λί a 3 I—I (N rH OO ^ Cl UH rH GUO- OO Φ 1 I III rH O p - p lOJrH C rH rH in .-.

--------- C o φ 00 Φ w p a

— (OH

<#> -rH \ -Τ' Ό to

> G O

CU O C >1 c \ o <u c tT> to rH C C 3 Λί O -rH Φ fa \ C > + 4J\ tn g O' C CU -PcmI -H -rl

ε 3\ X 3-ri G P

-H cn 3 Φ in M 0* o B μ ε onn* o o Φ 3 H\ 3 Φ VJ •'r C W p tr> CO Vl T3 fa G) CU g D Φ G \\ : < M Q t M E-ι -H rH} fS|( 13 61 886

Kuten taulukosta II voidaan havaita, kaikki tämän keksinnön mukaiset yhdisteet saavuttavat iLS^Q-arvon annoksella 17-35 mg/kg/päivä (joka tulos on myöskin sama kuin yhdisteillä 5-FU ja ILS^^-arvon (optimiannos) annoksen ollessa noin 100 mg/kg/päivä. Ennen kaikkea yhdisteellä 1-(N-n-heksyylikarbamoyyli)-5-fluoriurasiililla on kasvaintenvastainen aktiviteetti huomattavan laajalla annosalueella 30-300 mg/kg/päivä verrattuna yhdisteisiin 5-FU ja FT-207. Lisäksi kaikkien tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden terapeuttiset indeksit ovat paljon parempia kuin yhdisteiden 5-FU (T.1.=1,9) ja FT-207 (T.I.= 1,0). Erityisesti 1-(N-n-heksyylikarbamoyyli)-5-fluoriurasiililla on erityisen korkea T.I.-arvo, so. 10-kertainen FT-207 ja 5-kertainen 5-FU:n armoon nähden, mikä on tae suuremmasta turvallisuudesta.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden määrä ajan funktiona veressä mitattiin seuraavassa esitetyllä menettelyllä ja sitä verrattiin FT-207 ja 5-FU:n arvoihin.

Koiraspuolisia Wister-rottia, jotka painoivat 180 - 210 g, paastotettiin 17 tuntia ja rotille annettiin kunkin koeyhdisteen suspensiota 0,2 % CMC:tä sisältävässä suolaliuoksessa oraalisesti mahaputken avulla annoksena 100 mg/kg. Lääkkeen antamisen jälkeen katkaistiin tietyin välein rotan kaulavaltimo koko veren talteenottamiseksi. Koaguloimisen jälkeen veri sentrifugoitiin seerumin poistamiseksi. Lääkkeen konsentraatio jokaisessa seerumissa mitattiin 5-FU ekvivalenttina ohutkerrosmenetelmällä käyttämällä standardibakteerina Staphylococcus aureus 209P-kantaa. Ohutkerrosmenetelmä suoritettiin seuraavasti: Sydäninfuusio-agar-maljalla kasvatettua standardibak-teeria suspendoitiin soijaliemeen siten, että optiseksi tiheydeksi °*D'560 saati;*-n °'3 3a suspensiota pidettiin 4°C:ssa 1 tunti. Suspensio lisättiin ja sekoitettiin Meuller Hinton-kasvualustaan siten, että konsentraatioksi saatiin 2 %. Tästä seoksesta kaadettiin 5 ml:n eriä petrimaljaan niin, että saatiin ohutkerroksinen malja. Maljaan asetettiin ruostumattomasta teräksestä oleva rengas, johon laitettiin seeruminäyte. Annettiin diffundoitua 4 tuntia 4°C:ssa, minkä jälkeen bakteeria inkuboitiin 18 ttintia 37°C:ssa ja mitattiin ehkäisyvyöhyk-keen halkaisija. Kunkin lääkkeen konsentraatio määritettiin II standardikäyrämenetelmällä, Potency Test of Minimum Requirements of Antibiotic Products (Japanese Standards for Antibiotic Medical Supplies).

Tämä testin tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon III.

14 61 886 *

IK

Ο «Τι vo r-ι ro

tn O σ> ή O

° O O, O, O, O, co ro σι r~ σι

O «n vo m ro -H

iH ^ O o o o o

1K

σν ^ 'T m ro cg 00 VO VO «N Ή o

« S ^ » «k V

O. O. O. O o o G +! +! + i + ! +1 +| d) O «n o «n r·' rsi tn σν σν «N ro cm H VO·***»** v

Ή <N O Ή CN O O

<TJ

(0 ... 1.,..1. ----------------------- I ........- M.·. » —

G

O r~- m o «JO Γ" cm ro m (N co oo o G » ' - - -

Φ CN Ή Ή Ή O O

P +1 + 1 +1 +1 +| +| tn n o m oo o n

•h O O «n VO CN (N

·«. * «* V *.

C m^rr^oocM «HO

£ Ή fl3 ^ «0 Λ Ί ή

G ·— O n 00 CN ro CN

0 n p n ro o G

•ro d)

1 λ; VO CM ro o O QJ

G p + 1+1+1 +1 +|+| Ai

Cu <l> <c co cn o ^ (n n i-i I -H CM 00 o 00 CN :<ts n i—i i—i» «· « » * ·» -ro H -H CO CM 00 roo

M \ P ro fH (N C

H i—I} O -H

P G ----------- C

O o G

X tn G i G

y β ¢) n vo cm p <j\ ·& p P P φ «. o p vo σνθ »H -h a; o ^ - - - - c2 P £ Ή CM CM >+ CN roo «Ö «t3 3 :«0 +I+1+! +1 +1+1 to E-t G -π oo cm «a* vo o p Ai

<U -HO'iVOf'-OtN <D

<U G »s kk v v tnd) 1 p p cm n voo xl tn co i—I (N oo ro G -G------------ * ·· e

D <β rO

Cu P > -n I G &

n «t5 \ O O O O OO fö G

tntTOOO O O O: G d) O 1 ί !“l rH f—I r-H r—i ·· *713

C \ H *H

5 φ ε -h ί s \ > - -.1 * <*·«» »~»··-' - «-- I. il— !I— —« ....... .— — • : g +j P o JG P >

• O · P P G

Ό -ro p JZ P (ti x: i x: o d)

0 (N O ·η P II

•ro ^ -ro ( -H

1 n I oo O * r- K σ, p r~ ε *

32 O CC tE O P

d) ro ·— P vo O «N -Hfö C O 32 O U Cm l -n •A I O E I I I ^ \

<_G l[ G te_n fa i—1| X

is 618 8 6

Taulukosta III havaitaan, että FT-207:llä on melkein vakiona pysyvät alhaiset seerumitasot välillä 0,2 - 0,25 mg/ml 30 minuutista 10 tuntiin asti antamisen jälkeen. Yhdisteillä 5-FU seerumitasot tulevat epätavallisen korkeiksi 30 minuutin kuluttua sen antamisen jälkeen ja ne laskevat nopeasti tunnin kuluessa tasoon, joka on noin 1/25 puolen tunnin tasosta, mikä osoittaa suurempaa metaboloitumisastetta. Sen sijaan tämän keksinnön mukaiset yhdisteet säilyttävät seerumi-tasoina yli noin 1 mg/ml (so. pienin seerumitaso, joka tarvitaan oleellisen kasvaintenvastaisen aktiviteetin osoittamiseen) lo tuntiin asti antamisen jälkeen. Erityisesti 1-(N-n-heksyylikarbamoyyli)-5-fluoriurasiililla seerumitasot säilyvät 10 - 20 kertaa niin korkeina kuin FT-207:llä 10 tunnin aikana, ja sillä on siten erinomaiset farmakologiset ominaisuudet kliinisen käytön kannalta.

Näistä kokeista voidaan havaita, että oheisen keksinnön mukaiset yhdisteet ovat selvästi parempia kuin FT-207 ja 5-FU kasvaintenvas-taisen aktiviteetin, terapeuttisen indeksin (so. turvallisuus), veritason ja retentioajan suhteen.