FI60701B - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbar dihydrocyklosporin c - Google Patents

Description

Ε35^Π ΓβΊ rt-.KUULUTOejULKAUU ,λπλ,

J®Ta w (11)utläggningsskrift6U/UI

• C (45) Γ2tontti i.y inn, lly 13 03 1932

Patent medöelst * (51) Kv.ik.Vci.3 c 0? C 103/52 // C 07 D 259/00 SUOMI—FINLAND (21) p»t**ittih«k«mu*-p»t*ot*»ökntnt 76301+9 (22) H»k«ml«pllvt — AiwBknlngsdtg 26.10.76 * * (23) Alkupilvt—Glltigh«t*d*g 26.10.76 (41) Tullut (ulklMkil — Bllvlt off«ntllg γγ

Patentti· ja rekisterihallitus NStoMttpa*. j. kuuLjuitah-n p-. -

Patent· och registerstyrelsen ' ' Antöktn utl»*d och utl.*krift*n pubikarad 30.11.81 (32)(33)(31) ^yy4#«y «uelkaui—BajIrd prloriut Olt.11.75

Sveitsi-Schweiz(CH) 11+195/75 (71) Sandoz A.G., Basel, Sveitsi-Schveiz(CH) (72) Artur Ruegger, Bottmingen, Max Kuhn, Basel, Sveitsi-Schveiz(CH) (7I+) Oy Kolster Ab

(51+) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen dihydrosyklosporiinin C valmistamiseksi - Förfarande för framställning av terapeutiskt an-vändbar dihydrocyklosporin C

Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoi-Sen dihydrosyklosporiinin C valmistamiseksi, jonka kaava on ch3x^ CHj H,c.

xh2

CH3 ^CH3 I

CM HO. /CH CH]

I CH3,. ^cm3 CH * xh3 I

CMj CHj CH CHj CH-OH CH3 CH3-N-CH-CO-J1-4m C N —CM CO N—CH—C N CHj h 1 ä 1 1 1 s co : ; : * I i ! !

Cm-cmj-ch l : : : I

CH3/ I I I i N-CHj chj-n : : ·.

I m 9 V

I O t I l II u I ,-rH

OC-CM-N-CO-CH—N-CO—'CH-N-C—CH-N-CO y"

I I I I I I

CHj H CHj CMj CHj CH , I c£ CHj Im /Cv. c£l ^CH3 CM3 CH3 CM3 2 60701

Dihydrosylkosporiinilla C on mielenkiintoisia kemoterapeut-tisia ja farmakologisia ominaisuuksia ja siten sitä voidaan käyttää lääkkeenä; erityisesti dihydrosylkosporiini C sopii niveltulehduksen ja immunologisten reaktioiden hoitoon.

Keksinnön mukaisesti päädytään yhdisteeseen dihydrosyklospo-riini C hydraamalla yhdistettä syklosporiini C, jonka kaava on

ch3^ /H

c

| II

*N:h2

CH3- CH3 I

CH HO /CH CH3 | ch3 CH3 CM « nch3 | CM2 CH3 CH CH3 CH-OH CHj

III I I I I

CH.-N-CH-CO-N-CH-C-N-CM-CO-N—CH-C-N —CHj

| 1 1 S 1 i 1 S I

co : : ; I

CH\ I i ! i Γ

ch-chj-ch u : ; : I

cho^ | : : j n-ch3 ch,-n : : !

I h ° H

I O L I L II L | L

OC-CH-N-CO-CH — N-CO-CH-N-C-CH-N-CO-CH

CH3 H CH3 CH2 CH3 CH CHj

i ci; cmj I

CH

CH3 ^CHs CH3 CH3

Keksinnön mukainen menetelmä on toteutettavissa tunnetuin menetelmin esim. hydraamalla katalyyttisesti.

Liuottimina tulevat kysymykseen erityisesti etyyliasetaatti tai alemmat alifaattiset alkoholit, esim. metanoli, etanoli tai iso-propanoli. Hydraus tapahtuu sopivimmin neutraalissa liuoksessa lämpötilassa 20° - 30° ja normaalipaineessa tai hieman kohotetussa paineessa. Katalyytteinä tulevat kysymykseen platina ja erityisesti palladium, esim. palladium-hiili. Syklosporiinin C näin saatua hydraustuotetta puhdistetaan tunnettuun tapaan esim. kromatografoi-malla.

Lähtöaineena käytetty syklosporiini C valmistetaan viljelemällä sienilajin Trichoderma polysporum (Link ex Pers.). Rifai tai Cylindrocarpon lucidum Booth syklosporiinia C tuottavaa kantaa ja 60701 eristämällä syklospor.iini C ravinnealustasta. Viljely tapahtuu tunnettuun tapaan käyttäen mieluiten kantaa NRRL 5760 tai kantaa NRRL 8044 (ks. saksalaista patenttijulkistusta 2 455 859). Molempien kantojen viljelmät on talletettu United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, 111., USA, Syklosporiini C voidaan eristää kromatografisesti Aspergillus niger.in suhteen aktiivisena tuotteena, jolla on polaarisempi vaikutus kuin syklosporiinilla A ja B (saksalaisessa patenttijulkistuksessa syklosporiinista A ja B käytetään nimityksiä S 7481/F-1 ja S 7481/F-2).

Dihydrosyklosporiinilla C on seuraavat tunnusarvot:

Sp. 160°-162°C(amorfinen); lievästi hygroskooppinen aine.

= -242° (c = 0,5 kloroformissa) ja -174,5° (c = metanol.issa). UV-spektrin mukaan (metanol.i) yhdisteellä on pääteabsorpt io. IR-spektri Cl^Cl^ssa ilmenee kuvasta 1 ja NMR-spektri. CDClgissa, 90 MHz, tetrametyylis.ilaan.i sisäisenä standardina, kuvasta 2 (signaalit 7,23 ppm ja 7,33 ppm johtuvat hyvin pienistä määristä CHCl^ ja CgHg).

Bruttokaava CgjH^gN^O^g

Laskettu; C 61,0 H 9,3 N 12,6 0 17,0 %

Saatu: C 61,1 H 9,6 N 12,4 0 17,3 %,

Huoneen lämpötilassa dihydrosyklosporiini C liukenee helposti bentseeniin, dikloorimetaani.in, kloroformiin, etyyliasetaattiin, asetoniin, etanoliin ja metanoliin. Se on erittäin niukkaliukoinen veteen.

Dihydrosyklosporiin.in C ohutkerroskromatogrammin R^-arvot ilmenevät alla olevasta taulukosta: R^-arvot kloroformi-metanol.i (94:6) 0,4 0 asetoni 0,66 asetoni-heksaani (1:1) 0,38 asetoni-kloroformi (1:1) 0,42

Ohutkerroskromatograf iavalm.islevy silikageeli 6 0 F-2 54 (valmistaja Merck), Täplät saadaan näkyviin tavalliseen tapaan esim. jodilla. Suomalaisesta kuulutusjulkaisusta 52 851 tunnetaan menetelmä syklosporiinin A ja syklosporiinin B valmistamiseksi. Keksinnön 4 60701 mukaisesti valmistettu yhdiste, dihydrosyklosporiini C, eroaa tunnetusta yhdisteestä, syklospori.in.ista A, vaikutuksessa nesteimmuni-teettiin (eli vasta-aineiden muodostumiseen). Dihydrosyklosporiini C vaikuttaa vasta-aineiden muodostumiseen vasta suurissa pitoisuuksissa (eli toksisissa pitoisuuksissa), ja vaikutus on hidas ja sangen lievä - vasta-aineiden muodostuminen ei siis ole estetty.

Kun esimerkiksi hemagglut.inaat.iokokeessa (HAT) annettiin Rhesus-apinoille 5 x 250 mg/kg dihydrosyklospori.inia C, ei voitu todeta tilastollisesti merkitsevää hemagglutini.in.iti.itterin vähenemistä.

Sama annos syklospor.iinia A aikaansai käytännöllisesti katsoen täydellisen eston. Dihydrosyklosporiinilla C on siten huomattava etu hoidettaessa kroonisia tulehduksia, koska sillä on voimakas solunvastainen, mutta vain heikko vasta-aineiden vastainen vaikutus.

Seuraava esimerkki valaisee keksintöä. Lämpötilat ovat Cels ius-asteinä.

Esimerkki

Esihydratti.in 7 5 minuuttia 4 20 mg palladium-hiiltä (10 % palladiumia) 4 0 ml:ssa etanolia. Tähän pallad.iumkatalyytt isuspensioon lisättiin liuos, jossa oli 8,53 g syklosporiinia C 110 ml:ssa etanolia ja hydrattiin lämpötilassa 20°C ja paineessa 736 mm Hg, kunnes vedynsitoutuminen päättyi, Sitten katalyytti poistettiin suodattamalla ja suodos haihdutettiin kuiviin vakuumissa ja lämpötilassa 20°-40°C. Jäännös kromatograf oiti.in kolonnissa, jossa oli 1 kg silikageeliä (valmistaja Merck, raekoko 0,06-0,2 mm). Eluoitiin kloroformi-metanolilla (97,5:2,5), ja yhdistettiin puhtaat fraktiot, jolloin saatiin valkoista, amorfista dihydrosyklosporiinia C, joka kuivattiin 6 tuntia korkeavakuum.issa lämpötilassa 30°-50°C. Veden poistamiseksi valmistetta käsiteltiin kolmasti bentseenillä ja haihdutettiin korkeavakuum.issa lämpötilassa 30°-50°C, Sitten kuivattiin 2 tuntia 55°C:ssa ja 2 tuntia korkeavakuumissa 80°C:ssa.

Lähtöaineena käytetty syklosporiini C valmistettiin seuraavasti :

Sekoitettiin 400 1 Trichoderma polysporumin (Link ex Pers.) Rifai (NRRL 8044) aerobista, pinnanalaista viljelmää (ks. saksalaisen patenttijulkistuksen 2 455 859 esimerkkiä 3) ja 400 1 n-butyyli-asetaattia, Erotettiin Westfalia-erottimessa orgaaninen faasi ja se konsentroitiin vakuumissa, ja rasva poistettiin epäpuhtaasta uutteesta 5 60701 antamalla kolmivaiheisesta jakaantua petrolieetteriin ja metanoli-veteen (9:1), Sakka liuotettiin kloroformiin ja kromatografoitiin 4,5 kg:11a silikageeliä "60", (valmistaja Merck, hiukkaskoko 0,2-0,5 mm), jolloin eluointiaineena käytettiin kasvavaa määrää metanol.ia sisältävää kloroformia. Fraktiot, jotka saatiin kloroformilla ja 1,5-% metanol.illa, sisälsivät pääasiallisesti syklosporiinia A ja B, ja niiden jälkeen kloroformilla ja 3-% metanolilla eluoitavat fraktiot sisälsivät pääasiallisesti syklosporiinia C. Toteaminen eluaat-tifraktioissa tapahtui ohutkerroskromatograaf isest.i , jolloi n iälk.im-mäisillä fraktioilla oli huomattavasti pienempi R^-arvo kuin ensiksi mainituilla fraktioilla es.im, silikageelivalmiskalvoilla "Polygram", kloroformi-metanoli (95:5) eluointiaineena (R^ syklospori.ini C = 0,26, syklosporiin.i A = 0,44 ja syklospori.ini B = 0,37), Yhdistettiin eluaattifraktiot ja haihdutettiin ne kuiviin; fraktiot olivat ohutkerroskromatografiän mukaan kokonaan tai pääasiallisesti syklo-sporiinista C. Kromatografinen puhdistus toistettiin, tutkittiin eluaattifraktioiden koostumus ohutkerroskromatografisesti, yhdistettiin pelkästä syklospor.iinista C muodostuvat fraktiot ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa lämpötilassa 20°-40°C. Jäännös liuotettiin kymmenkertaiseen määrään alkoholia, käsiteltiin 5 paino-%:lla aktiivihiiltä, hiili poistettiin 20°-40°C:ssa ja jäännös kuivattiin korkeavakuumissa lämpötilassa 55°C,

Viimeisessä puhdistusvaiheessa jäännös liuotettiin viisinkertaiseen määrään eetteriä, saostettiin kiintoaine lisäämällä hitaasti kolmikymmenkertainen määrä heksaania ravistellen, eristettiin suodattamalla seoksen 0°-5°C:een jäähdyttämisen jälkeen, pestiin kylmällä heksaan.illa ja kuivattiin korkeavakuumissa lämpötilassa 55°C, Kiteytettiin 2 1/2-kertaisesta määrästä asetonia, jolloin saatiin -15°C;ssa kiteisen syklospor.i.in.in C värittömiä, prismamai-sia neulasia,

Sp, 1 52-1 5 5°C

= ~2 5 5° (kloroformi, c = 0,5) γλ( 720 o *- •'d = "182° (metanoli, c = 0,5),

Claims (1)

1. 6 60701 Patenttivaatimus Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen dihydrosyklosporiinin C valmistamiseksi, jonka kaava on ch3s CHj HJcv I XH2 CH3v ^CH3 | CH HO /CH CH I CH3\ /c”3 CM R ^CH3 I CH2 CHj CH CH3 £ CH-OH CH3 I I I I l| CHj-N-CH-CO-N-CH-C-N-CH-CO-N—CH-C N-CH, Il l II «. I l II I O HO co : : : CH\ I i i I co ch-chj-ch l : : : CB>/ I 1 il N —CM, CHj-N : ::3 I H OH I “ L I «· Il L I L OC-CH-N-CO-CH — N-CO-CH-N-C-CH-N-CO-CH I 1 1 III I ch3 H CH3 CHj CHj CH CHj I / \ I I CHj CH3 I CH ja CH / S / \ CH3 CH3 CHj CHj tunnettu siitä, että hydrataan syklosporiini C, jonka kaava on CH3S /H C II Ν:η2 11 CH3^ ^,CH3 I CH HO /CH CHj | CH3^ /CHj ^CH « ^CH3 I CH2 CH3 CH CH3 CH-OH CHj CH,-N-CH-CO-N-A H-C-N-CH-CO-N —CH-C-il-CH, Il l II l I t II | O HO co I : ch\ l ! i i f ch-chj-ch l : : : e***'' ( : : : n-chj chj-n : : : | I H OH I O L I L (I L I L I OC-CH-N CO-CH — N CO CH-N C CH N-CO CH III lii l CH3 H CH3 CHj CHj CH CHj l CH3 CHj I CH CH / \ / \ CHj CHj CHj CHj 7 60701 Förfarande för framställning av dihydrocyklosporin C, som har formeln CHjs CH j • h2c I CH3^ ^CH3 I CH HO >CH CH3 | CH\ CH R SCH3 | CH2 CH3 CH CH3 CH-OH CH3 i i l i I ii CH-,- N — CH — CO —N-CH-C-N-CH-CO-N —CH-C-N-CH, I L L l| L I L II I O HO C° : : : ch3 : : : co ch-ch,-ch l : : : / I : : i CH3 I : : : n-ch, ch3-n : : : H OH I ° L | L II C l c OC-CH-N-CO-CH — N-CO-CH-N-C-CH-N-CO-CM III III I CH3 H CH3 CH, CH, CM CH, I / N | I CH3 CH] I CH CH / \ / s ch3 ch3 ch3 ch3 kännetecknat därav, att man hydrerar cyklosporin C, som har formeln CH3S /H C I II VsCH2 CH3 CH] | CH HO /CH c„ | CH3^ /CH] ^CH R ^CH3 | CH2 CH] CH CH] CH-OH CH3 CH-,-N — CH-CO-N-1h-C-il-CM-CO-N —CH-C-il-CH, | L L l| L I L II I O HO CO : : : CH\ I I i I co CH-CHj-CH U : ; ; ch3 J : : i n-cH] ch,-n : i : | I H OH I O «- | L |j L | L I OC-CH-N CO-CH — N CO CH-N C CH N-CO CH III III I CH] H CH3 CHj CH] CH CH] I CH3 ^CH] I CH CH / \ / V- ch3 ch3 ch3 ch3