FI120262B - PNA-synteesi käyttämällä emästen suhteen labiilia aminonsuojaryhmää - Google Patents

Description

PNA-synteesi käyttämällä emästen suhteen labiilia aminon-suojaryhmää

Peptidinukleiinihapot (PNA) ovat DNA-analogiyhdis-5 teitä, joissa deoksiriboosifosfaattirunko on korvattu peptidioligomeerillä. Tähän mennessä kirjallisuudessa [Michael Egholm, Peter E. Nielsen, Ole Buchardt ja Rolf H. Berg, J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 9677 - 9678; Ole

Buchardt, Michael Egholm, Peter E. Nielsen ja Rolf H. 10 Berg, W0 92/20702] kuvatuissa synteeseissä käytetään mo-nomeerin aminoryhmän tilapäiseksi suojaamiseksi happola-biilia tert-butoksikarbonyyli- (Boc-) suojaryhmää, joka lohkotaan pois keskivahvoilla hapoilla, kuten esim. tri-fluorietikkahappo. Oligomeerien kiinteäfaasisynteesi nou-15 dattaa tällöin tavanomaista peptidisynteesimenetelmää esim. Merrifieldin [B, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963) 2149] kuvaaman mukaisesti. PNA-oligomeerin lohkaiseminen kiinteästä kantajasta tapahtuu tällöin voimakkaalla hapolla, tavallisesti nestemäisellä fluorivedyllä. 20 Nämä reaktio-olosuhteet, erityisesti toistuva käsittely trifluorietikkahapolla, ei tällöin salli reaktiota avoimissa reaktioastioissa, kuten esimerkiksi on asianlaita käytettäessä monipeptidisyntetlsaattoreita [katsaus: G.

Jung ja A. Beck-Sickinger, Anqew. Chem. 104 (1992) 375 -25 391].

Keksinnön päämäärä on kehittää synteesimenetelmä, jossa käytetään emästen suhteen labiilia tilapäistä ami-nonsuojaryhmää PNA-oligomeerien rakentamiseksi, joka menetelmä tekee mahdolliseksi pilkkomisen kiinteästä kan-30 tajasta käyttämällä heikkoja tai keskivahvoja happoja.

Seuraava keksintö kuvaa menetelmää PNA-oligomeerien valmistamiseksi, joiden kaava on I: 2

B

CH, f- ! 5 R°-( A )k-[N-CH2-CH2-N-CH2-C]n-(Q),-0°

H

jossa R° on vety, C1.18-alkanoyyli, C^18-alkoksikarbonyyli, C3_8-sykloalkanoyyli, C7.15-aroyyli, C3_13-heteroaroyyli tai 10 ryhmä, joka suosii oligomeerin solunsisäistä ottoa, tai joka hybridisaation yhteydessä on vuorovaikutuksessa koh-deaminohapon kanssa; A on aminohappotähde, edullisesti ryhmästä glysii-ni, leusiini, fenyylialaniini, kysteiini, lyslini, argi-15 niini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, proliini, tetra-hydrokinoliini-3-karboksyylihappo, oktahydroindoli-2-kar-boksyylihappo ja N-(2-aminoetyyli)glysiini; k on kokonaisluku 0-20, edullisesti 0 - 10; Q on aminohappotähde, edullisesti ryhmästä glysii-20 ni, leusiini, histidiini, fenyylialaniini, kysteiini, ly-siini, arginiini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, proliini, tetrahydrokinoliini-3-karboksyylihappo, oktahydro-indoli-2-karboksyylihappo ja N-(2-aminoetyyli)glysiini; 1 on kokonaisluku 0 - 20, edullisesti 0 - 10; 25 B on nukleotidikemiassa tavallinen nukleoemäs, esimerkiksi luonnollinen nukleoemäs, kuten adeniini, syto-siini, guaniini, tyrniini ja urasiili, tai ei-luonnollinen nukleoemäs, kuten puriini, 2,6-diaminopuriini, 7-deatsa-adeniini, 7-deatsaguaniini, NV-etanosytosiini, N6N6-eta-30 no-2,6-diaminopuriini, 5-metyylisytosiini, 5-C3„6-alkinyy- liurasiili, 5-C3_6-alkinyylisytosiini, 5-fluoriurasiili tai pseudoisosytosiini, 2-hydroksi-5-metyyli-4-triatsolopyri-midiini tai niiden esilääkemuoto; Q° on hydroksi, NH2 tai NHR", jossa R" on C^^-alkyy-35 li, C2„18-aminoalkyyli tai C2.18-hydroksialkyyli; ja 3 n on kokonaisluku 1-50, edullisesti 4 - 35; jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että poly-meerikantajaan, jonka kaava on II: 5 L-[polymeeri] (II) joka on varustettu ankkurlryhmällä L, joka sisältää latenttina tähteen Q°, kytketään joko ensin kiinteä-faasisynteesille tavanomaisella menetelmällä aminohappoja 10 (Q1 ) ja sitten tällöin sivutuotteena muodostavaan yhdis teeseen, jonka kaava on III: (Q ’ ^-L-[polymeeri] (III) 15 jossa L määritellään kuten edellä, Q' on aminohap po Q, jonka sivuketju on mahdollisesti suojattu, ja 1 on kokonaisluku 0-20, tai suoraan polymeerikantajaan, jonka kaava on II: a) yhdiste, jonka kaava on IV: 20

B ' IV

V o

PG—N—^ Nn A

H ^ X0H

25 jossa PG on emäslabiili aminonsuojaryhmä ja B' on eksosyklisessä aminofunktiossa suojattu nuk-leoemäs, käyttämällä peptidikemiassa tavanomaisia kytken-täreagenssej a;

30 b) lohkaistaan tilapäinen emäslabiili suojaryhmä PG

sopivalla reagenssilla, c) toistetaan vaiheet ajab(n- 1) kertaa, d) kytketään kiinteäfaasisynteesille tavanomaisilla menetelmillä lisää aminohappoja A', jotka määritellään 35 kuten A, jolloin niiden sivuketju on kuitenkin mahdolli- 4 sesti suojattu, ja sitten siinä tapauksessa, että R° ei ole vety, lisätään tähde R° tavanomaisella menetelmällä, e) välituotteena saadusta yhdisteestä, jonka kaava on Ia: 5 B ' CHZ (la), ?’° 0 i . Il R°”(A · )^-i N-CHj-CH2-N-CH2-CTn-(0' ) ,-L-l Polymeeri!

H

10 jossa R°, A', k, B’, n, Q1 ja 1 määritellään kuten edellä ja L on ankkuriryhmä, kaavan I mukainen yhdiste lohkaistaan polymeerikantajasta käyttämällä lohkaisurea-genssia, jolloin samanaikaisesti tai myös seuraavaksi 15 nukleoemästen eksosyklisessä aminofunktiossa ja aminohappojen sivuketjuissa mahdollisesti esiintyvät suojaryhmät lohkaistaan pois.

Ryhmiä, jotka suosivat oligomeerin solunsisäistä ottoa, ovat esimerkiksi alkanoyyli- ja alkoksikarbonyyli-20 yhdisteet, joissa on erilaisia lipofiilisiä tähteitä, kuten -(CH2)x-CH3, jossa x on kokonaisluku 6 - 18, -(CH2)nCH=CH-(CH2)m-CH3, jossa n ja m toisistaan riippumatta ovat kokonaisluku 6-12, -(CH2CH20)4-(CH2)9-CH3, -(CH2CH20)8-{CH2)13-CH3 ja -(CH2CH20)7-(CH2) 15-CH3, mutta myös steroidi-25 tähteet, kuten kolesteryyli tai vitamiinitähteet, kuten vitamiini E, vitamiini A tai vitamiini D, ja muut konju-gaatit, jotka käyttävät luonnollisia kantajasysteemejä, kuten sappihapot, foolihapot, 2-(N-alkyyli,N-alkoksi)-ami-noantrakinoni, ja mannoosikonjugaatit ja vastaavien resep-30 torien peptidit, jotka johtavat oligomeerien reseptorivä-litteiseen endosytoosiin, kuten EGF (orvaskeden kasvutekijä), bradykiniini ja PDGF (verihiutaleperäinen kasvutekijä). Merkkiryhmiä ovat fluoresoivat ryhmät esimerkiksi dansyyli-( N-dimetyyli-l-aminonaftyyli-5-sulfonyyli-), 35 fluoreseiini- tai kumariinijohdannaisista tai kemilumi- 5 noivat ryhmät esimerkiksi akridiinijohdannaisista, kuten ELISA;11a osoitettava digoksigeniinisysteemi, joka sisältää biotiini/avidiini-systeemillä osoitettavan biotiini-ryhmän, tai myös funktionaalisia ryhmiä käsittävät liit-5 tovarret, jotka sallivat jälkeen päin tapahtuvan johdan-naismuodostuksen osoitettavilla reportteriryhmillä, esimerkiksi aminoalkyyliliittäjä, joka akridiniumaktiivieste-rillä muuttuu kemiluminointikoettimeksi. Tyypillisiä merkkiryhmiä ovat; 10 ch3 Λ m(+)_

o- O

15 ό akridiniumesteri 20 R = H tai aminonsuojaryhmä o n

R - N 'ϊΊ H

25

s II

o biotiinikonjugaatti ( = "biotiini" R = Boc:lle) 30 C*0 i 35 karbatsolijohdannainen 6 ryhmät, jotka oligomeerin hybridisoituessa kohde-nukleiinihappoon käyvät näiden kimppuun sitoutumisen, ris-tikytkemisen tai lohkaisun tapahtuessa, ovat esimerkiksi akridiini-, psoraleeni-, fenantridiini-, naftokinoni-, 5 daunomysiini- tai kloorietyyliaminoaryylikonjugaatit. Tyypillisä väliin meneviä tai ristikytkeviä tähteitä ovat: /ΓΛ ° \—/ ίο /~~Λ akridiinijohdannainen, x = 2 - 12, edullisesti 4

0<vL

i5 0 r Λ

-0-(0Η2)χ-ΝΗ--/~ N

20 c 1 x = 2 - 12, edullisesti 4 9hj n I /CHiX“(CH2)2-NH-C- 25 -/ s X -NH tai -0- CHj trimetyylipsoraleenikonjugaatti (= "psoraleeni" X:n 30 ollessa O) 0 35 fenantroliinikonjugaatti 7

Cl - CH^CH, . , „ 0 2 2 \ f, 11 N V(CH2 )x-o -C-

V7 T

X

5

x = 1 - 18, X = alkyyli, halogeeni, N02, CN, -C-R

rt o

Cl CH.CH, v °

2 2 //’ λ II

^CH2)x'°-C- 10 ci-ch2ch/

X

jt = 1 - 18, X = alkyyli, halogeeni, N02, CN, -C-R

!t 0

Ankkuriryhmiä L, jotka sisältävät latenttina funk-15 tion Q°, kuvaavat esimerkiksi George Barany, Nancy Kneib-Cordonier ja Daniel G. Mullen, Int. J. Peptide Protein Re- s. 30 (1987) 705 - 739; Gregg B. Fields ja Richard L.

Noble, Int. J. Peptide Protein Res. 35 (1990) 161 - 214; K. Barlos, D. Gatos, J. Hondrelis, J. Matsoukas, G. J. 20 Moore, W. Schäfer ja P. Sotiriou, Liebigs Ann. Chem. 1989 951 - 955; H. Rink, Tetrahedron Lett. 1987 3787 - 3790; G. Breipohl, J. Knolle ja R. Geiger, Tetrahedron Lett. 1987 5647 - 5650; G. Breipohl, J. Knolle ja W. Stiiber, Int» J. Peptide Protein Res. 34 (1989) 262 - 267; W. Stuber, J. 25 Knolle ja G. Breipohl, Int. J. Peptide Protein Res. 34 (1989) 215 - 220 tai kuvataan julkaisuissa EP-A-0 264 802 (HOE 86/F259), EP-A-0 287 882 (HOE 86/F101), EP-A-0 322 348 (HOE 87/F386K).

Polymeerikantajia, jotka on varustettu ankkuriryh-30 mällä, joka sisältää latentisti ryhmän Q°, ovat esimerkiksi 4-alkoksibentsyylialkoholihartsi, 2-metoksi-4-al-koksibentsyylialkoholihartsi, 2-klooritrifenyylimetyyli-hartsi, 2,4-dimetoksibentshydryyliamiinihartsi, 4-(2',4'-dimetoksifenyyliaminometyyli)fenoksimetyylihartsi, tai 35 primaarisella amlnoryhmällä funktionaaliseksi tehty poly- 8 meerikantaja, kuten esim. polyHIPER, TentagelE, Controlled Pore Glass'1, polystyreeni, johon on kytketty latentisti ryhmän Q° sisältävä ankkuriryhmä, kuten esim. 4-(4'-me-toksibentshydryyli)fenoksietikkahappo, 4-(4' -metoksibents-5 hydryyli)fenoksivoihappo, 4-hydroksimetyylifenoksietikka- happo, 2-metoksi-4-hydroksimetyylifenoksietikkahappo, 5~ ( 4-aminometyyli-3,5-dimetoksifenoksi)valeriaanahappo, 3- (amino-4-metoksibentsyyli)-4-metoksifenyylipropionihap-po, 5-(amino-4-metoksibentsyyli)-2,4-dimetoksifenyylipro- 10 pionihappo, 4-(amino-C2_8-alkyyliaminokarbonyylioksimetyy- li ) fenoksietikkahappo, oksaalihappomono( amino-C2,16-alkyy-li)esteri, rneripihkahappomono( amino-C2_16-alkyyli)esteri.

Edullisesti käytetään seuraavia ankkuriryhmiä tai jo polymeerikantajaan sidottuja ankkuriryhmiä: 15 4-alkoksibentsyylialkoholihartsi, metoksi-4-alkok- sibentsyylialkoholihartsi, 2-klooritrifenyylimetyylihart-si, tai primaarisella aminoryhmällä funktionaaliseksi tehtyjä kantajia tyyppiä Tentagel®, Controlled Pore GlassR, polystyreeni, latentisti ryhmän Q° sisältäviä kytkettyjä 20 ankkuriryhmiä 4-(4'-metoksibentshydryyli)fenoksivoihappo, 4- hydroksimetyylifenoksietikkahappo, 2-metoksi-4-hydroksi-metyylifenoksietikkahappo, 5-(amino-4-metoksibentsyyli)-2,4-dimetoksif enyylipropionihappo, 4- (amino-C2.8-alkyyli-aminokarbonyylioksimetyyli)fenoksietikkahappo, oksaalihap- 25 pomono( amino-C2_16-alkyyli )esteri, meripihkahappomono( ami- no-C2_16-alkyyli )esteri.

Emäslabiileja aminonsuojaryhmiä PG ovat esim. 9-fluorenyylimetoksikarbonyyli (Fmoc) ja 2,2-[bis(4-nitro-fenyyli) ] etoksikarbonyyli (Bnpeoc) [W. König, D. Biicher, 30 R. Knuttel, K. Lindner ja A. volk, "Proceedings of the

Akabori Conference", Grainau-Eibsee/Baijeri, 12. - 13. kesäkuuta 1985, s. 32; ja R. Ramage, A. J. Blake, M. R. Florence, Th. Gray, G. Raphy ja P. L. Roach, Tetrahedron 37 (1991) 8001 - 8024], 2-(2,4-dinitrofenyyli)etoksikar-35 bonyyli (Dnpeoc) [M. Acedo, F. Albericio, R. Eritja, Tet- 9 rahedron Lett. 1992 4989 - 4992], 2-metyylisulfonyylietyy-lioksikarbonyyii (Msc), 1-( 4, 4-dime tyyli-2,6-dioksosyklo-heksylideeni)etyyli (Dde) (B. W. Bycroft, W. C. Chan, S. R. Chhabra ja N, D. Home, J. Chem. Soc,. Chem. Commun. 5 1993 778 - 779), edullisesti käytetään ryhmiä Fmoc, Bnpeoc ja Dnpeoc, aivan erityisen edullisesti käytetään Fmoc-suojaryhmää.

Edeltävän synteesimenetelmän vaiheessa a) käytettyjä peptidisynteesissä tavallisia aktivointimenetelmiä ku-10 vataan esim. kirjassa Houben-Weyl, "Methoden der organisc-hen Chemie", osa 15/2, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1974, ja muita reagensseja kuvataan kulloisessakin kirjallisuusviitteessä, kuten esim. BOP (B. Castro, J. R. Dor-moy, G. Evin ja C. Selve, Tetrahedron Lett. 1975 1219 -15 1222), PyBOP (J. Coste, D. Le-Nguyen ja B. Castro, Tetra hedron Lett. 1990 205 - 208), BroP (J. Coste, M. N. Dufour, A. Pantaloni ja B. Castro, Tetrahedron Lett. 1990 669 - 672), FyBroP (J. Coste, E. Frerot, P. Jouin ja B. Castro, Tetrahedron Lett. 1991 1967 - 1970) ja uroniumrea-20 gensseja, kuten esim. HBTU (V. Dourtoglou, B. Gross, V.

Lambropoulou, C. Zioudrou, Synthesis 1984 572 - 574), TBTU, TPTU, TSTU, TNTU (R. Knorr, A. Trzeciak, W. Bann-warth ja D. Gillessen, Tetrahedron Lett. 1989 1927 - 1930), TOTU (EP-A-0 460 446), HATU [L. A. Carpino, J. Am. 25 Chem. Soc. 115 (1993) 4397 - 4398], HAPyU, TAPipU (A.

Ehrlich, S. Rothemund, M. Brudel, M. Beyermann, L. A. Carpino ja M. Bienert, Tetrahedron Lett. 1993 4781 - 4784), BOI (K. Akaji, N. Kuriyama, T. Kimura, Y. Fijuwara ja Y. Kiso, Tetrahedron Lett. 1992 3177 - 3180), tai happoklo-30 rideja tai happofluorideja [L. A. Carpino, H. G. Chao, M. Beyermann ja M. Bienert, J. Ora, Chem. 56 (1991) 2635; J. N. Bertho, A. Loffet, C. Pinel, F. Reuther ja G. Sen-nyey kirjassa E. Giralt ja D, Andreu (toim.), "Peptides 1990", Escom Science Publishers B. V., 1991, ss. 53 - 54; 35 J. Green ja K, Bradley, Tetrahedron 1993 4141 - 4146], 10 2,4, 6-mesityleenisulfonyyli-3-nitro-l, 2,4-tr iät solidi (MSNT) (B. Blankemeyer-Menge, M. Nimitz ja R. Frank, Tetrahedron Lett. 1990 1701 - 1704), 2,5-di£enyyli-2,3-dihyd-ro-3-okso-4-hydroksitiofendioksidi (TDO) (R. Kirstgen, 5 R. C. Sheppard, W. Steglich, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1987 1870 - 1871) tai aktivoituja estereitä (D. Hudson, Peptide Res. 1990 51 - 55).

Edullisesti käytetään karbodi-imidejä, esim. di-sykloheksyylikarbodi-imidiä tai di-isopropyylikarbodi-10 imidiä. Edullisesti käytetään samoin fosfoniumreagensse-ja, kuten esim. PyBOP tai PyBroP, uroniumreagensseja, kuten esim. HBTU, TBTU, TPTU, TSTU, TNTU, TOTU tai HATU, Β0Ι tai happoklorideja tai happofluorideja.

Kytkentä voidaan tällöin suorittaa suoraan lisää-15 mällä aminohappojohdannainen tai PNA-monomeeri, jonka kaava on IV, aktivointireagenssin kanssa ja mahdollisesti lisäten lisäaineita, kuten esim. 1-hydroksibentsotriatsoli (HOBt) [W. König, R. Geiger, Chem. Ber. 103 (1970) 788] tai 3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydrobentsotriatsiini (HOObt) 20 [W. König, R. Geiger, Chem. Ber. 103 (1970) 2034] hartsiin tai myös rakenneosan esiaktivointi aktivoiduksi esteriksi voidaan suorittaa erikseen ja aktivoidun lajin liuos lisätä sopivassa liuottimessa kyktkemiskelpoiseen polymeeriin.

Eksosyklisessä aminofunktiossa suojatuilla nukleo-25 emäksillä B' käytetään eksosyklisen aminofunktion suojaamiseksi emäslabiileilla aminonsuojaryhmillä PG yhteensopivia suojaryhmiä, kuten esim. heikkojen tai keskivahvojen happojen suhteen labiilit suojaryhmät, jotka ovat uretaa-nityyppiä, kuten tert-butyylioksikarbonyyli (Boc), 4-me- 30 toksibentsyylioksikarbonyyli (Moz), 3,5-dimetoksifenyyli- 2-propyyli-2-oksikarbonyyli (Ddz), tai jotka ovat trityy-lityyppiä, kuten trifenyylimetyyli (Trt), (4-metoksifenyy-li)difenyylimetyyli) (Mmt) (4-metyylifenyyli)difenyylime-tyyli (Mtt), di(4-metoksifenyyli)fenyylimetyyli (Dmt), 35 9-(9-fenyyli)ksantenyyli (Pixyl). Erityisen edullisesti 11 käytetään butyylioksikarbonyyliä (Boc), trifenyylimetyy-liä (Trt), (4-metoksifenyyli)difenyylimetyyliä (Mint), (4-metyylifenyyli)difenyylimetyyliä (Mtt), di-(4-metoksi-fenyyli)fenyylimetyyliä (Dmt), jolloin Trt, Mtt, Mmt ja 5 Dmt yllättäen parantavat monomeerien liukoisuutta selvästi. Aivan erityisen edullisesti käytetään (4-metoksifenyyli ) di fenyylimetyyliä (Mmt).

Lohkaisureagensseja emäslabiilille aminonsuojaryh-mälle PG ovat esimerkiksi piperidiinin, morfoliinin, hyd-10 ratsiinin tai l,8-diatsabisyklo[5.4.0]undes-7-eenin (DBU) liuokset dimetyyliformamidissa, N-metyylipyrrolidinonissa (NMP), asetonitriilissä (ACN) tai dikloorimetaanissa (DCM), edullisesti erityisesti Fmoc-, Dnpeoc- ja Bnpeoc-suojaryhmille käytetään piperidiinin 20-%:ista liuosta 15 DMF:ssä tai N-metyylipyrrolidinonissa, kuten myös seosta, jossa on 2 % DBU:ta ja 2 % piperidiiniä DMF:ssä, tai 0,1 M DBU:ta DMF:ssä tai 0,1 M DBU:ta dikloorimetaanissa.

Kaavan Ia mukaisten aminohappotähteiden Q' tai Af kytkeminen tapahtuu aminohappojohdannaisilla, jotka edul-20 lisesti käsittävät saman aminonsuojaryhmän PG kuin jota käytetään myös kaavan IV mukaisille yhdisteille. Aminohappojen mahdollisesti läsnä olevat sivuketjufunktiot on varustettu heikoista keskivahvoihin happojen suhteen labiileilla suojaryhmillä, kuten esim. Boc, Moz, OtBu, tBu, 25 Trt, Mtr, Pmc. Edullisia ovat tällöin aminohappojohdannaiset, kuten PG-Gly-OH, PG-Lys(Boc)-OH, PG-Arg(Mtr)-0H, PG-Arg(Pmc)-0H, PG-Arg(Trt)-OH, PG-Cys(Trt)-OH, PG-Asp(OtBu)-0H, PG-Glu(OtBu)-OH, PG-Aeg(Boc)-OH, PG-His(Trt)-0H, jossa PG:llä on edeltävä merkitys. Aivan erityisen edullisia 30 ovat tässä seuraavat aminohappojohdannaiset: Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Mtr)-0H, Fmoc-Arg(Pmc)-OH,

Fmoc-Arg(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH,

Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Aeg(8oc)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH.

Edellä kuvatussa synteesimenetelmässä käytetyt yh-35 disteet, joiden kaava on IV: 12 8 '

O

PG—N—x .N Jk {IV)'

H x·^ OH

5 jossa PG on emäslabiili aminonsuojaryhmä ja B* on eksosyklisessä aminofunktiossa suojattu nuk-leoemäs, ovat uusia.

10 Yhdisteet, joiden kaava on IV: B ’ v ° PG—N—v M Jk (IV)

H ^ OH

15 saadaan siten, että yhdiste, jonka kaava on V: H 0 P G—H—v .N A. Λ 1 H 0 (V) 20 '' jossa PG on emäslabiilisuojaryhmä ja R1 on esterisuojaryhmä, kuten esim. metyyli, etyyli, butyyli, 2-{metoksietoksi)etyyli, bentsyyli, edulli-25 sesti metyyli, (2-metoksietoksi)etyyli, erityisen edullisesti metyyli, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jonka kaava on VI: B *

30 k^O

T <vo,

OH

jossa B' on nukleoemäs, jolloin nukleoemäksen eksosykli-35 nen aminofunktio on suojattu emäslabiilin aminonsuojaryh- 13 män kanssa yhteensopivalla suojaryhmällä, kuten esim. heikkojen happojen suhteen labiililla suojaryhmällä, joka on uretaanityyppiä, kuten Boc, Moz, tai trityylityyppiä, kuten Trt, Mmt, Dmt, Pixyl, 5 0-45 °C:ssa edullisesti huoneenlämpötilassa sopi vassa liuottimessa, kuten esimerkiksi DMF, asetonitriili, dikloorimetaani tai näiden liuottimien seos käyttäen pep-tidikemiassa tavallista kytkentäreagenssia, kuten esim. karbodi-imidit, fosfoniumreagenssit, uroniumreagenssit, 10 happohalogenidit, aktivoidut esterit, jolloin saadaan yhdiste, jonka kaava on VII: V o (VI"' 15 PC-Nh^/NX/\/' jossa PG, B' ja R1 määritellään kuten edellä, minkä jälkeen esterisuojaryhmä R1 lohkaistaan pois 20 alkalilipeällä tai myös entsymaattisesti esteraasien tai lipaasien avulla 0-50 °C:ssa sopivassa liuottimessa, kuten esim. dioksaani, vesi, tetrahydrofuraani, metanoll, vesi tai näiden liuottimien seokset.

Toinen mahdollisuus kaavan IV mukaisen yhdisteen 25 syntetisoimiseksi on, että yhdiste, jonka kaava on V: fC-^vA0/8' <v>· 30 jossa PG on emäslabiili aminonsuojaryhmä edeltävässä merkityksessä ja R1 on vety tai tilapäinen sllyylisuojaryhmä, kuten esim. trimetyylisilyyli, 14 saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jonka kaava on Vili: B' - CH2 - CO - R2 (VIII) 5 jossa BT määritellään kuten kaavassa VI ja R2 on halogeeni, kuten esim, fluori, kloori tai bromi, tai aktiiviesteritähde, kuten esim. OBt, OObt, OPfp, ONSu, 10 0-40 °C:ssa, edullisesti 20 - 30 °C:ssa, sopivas sa liuottimessa, kuten esimerkiksi DMF, NMP, asetonitrii-li, dikloorimetaani tai näiden liuottimien seokset. Happo-funktion kaavan v mukaisissa yhdisteissä tilapäinen suojaaminen voi tällöin tapahtua saattamalla reagoimaan ta-15 vallisten silylointireagenssien, kuten esim. bis-trime- tyylisilyyliasetamidin kanssa. Tämä tilapäinen suojaryhmä lohkaistaan pois reagoimaan saattamisen kaavan VIII mukaisen yhdisteen kanssa jälkeen lisäämällä vettä tai alkoholeja reaktloseokseen.

20 Kaavan V mukaisten yhdisteiden syntetisoimiseksi aminoetyyliglysiini tai vastaava aminoetyyliglysiinieste-ri varustetaan vastaavalla emäslabiililla suojaryhmällä. Emäslabiilin suojaryhmän liittäminen tapahtuu tällöin kirjallisuudesta tutuilla, osittain modifioiduilla mene-25 telmillä. Sopivia reagensseja ovat esim. Fmoc-Cl, Fmoc- ONSu, Bnpeoc-ONSu, Dnpeoc-ONSu, Msc-Cl, 2-asetyylidimedo-ni (Dde). Tässä konversiossa voidaan aminoetyyliglysiinin liukoisuutta happofunktio samanaikaisesti suojattessa parantaa suorittamalla reaktio tavallisten silylointirea-30 genssien, kuten esim. bis-trimetyylisilyyliasetamidin kanssa. Tämän tilapäisen suojaryhmän lohkaiseminen suoritetaan reaktion suojaryhmäreagenssien kanssa jälkeen lisäämällä vettä tai alkoholeja reaktioseokseen. Lähtömateriaalina käytetty aminoetyyliglysiini tai vastaava amlno-35 etyyliglysiiniesteri valmistetaan kirjallisuudesta tutuil- 15 la menetelmillä [E. P. Heimer, H. E. Gallo-Torres, A. M. Felix, M. Ahmad, T, J. Lambros, F. Scheidl ja J. Meienho-fer, Int. J. Peptide Protein Res. 23 (1984) 203 - 211] 2-aminoetyyliglysiinistä (H-Aeg-OH).

5 Toinen menetelmä aminoetyyliglysiinin valmistami seksi on glyoksyylihapon pelkistävä aminointi etyleenidi-amiinilla, ja sitä kuvataan samanaikaisesti jätetyssä patenttihakemuksessa, jonka otsikko on "Menetelmiä amino-etyyliglysiinin valmistamiseksi" (HOE 94/F 071, DE-P 4 408 10 530.3).

Kaavan VI mukaiset nukleoemäs-etikkahappojohdan-naiset saadaan alkyloimalla vastaavia nukleoemäksiä tai eksosyklisessä aminofunktiossa suojattuja nukleoemäksiä kloorietikkahapolla, bromietikkahapolla, jodietikkahapol-15 la tai niiden estereillä. Mahdollisesti tällöin nukleo- emäkseen liitetään selektiivistä alkylointia silmällä pitäen lisäksi tilapäisiä suojaryhmiä. Suojaryhminä nukleo-emäksille voidaan käyttää kaikkia emäslabiilin suojaryh-män PG kanssa yhteensopivia suojaryhmiä. Eksosykliselle 20 aminofunktiolle käytetään edullisesti heikkojen happojen suhteen labiileja suojaryhmiä, jotka ovat uretaanityyppiä, kuten Boc, Moz, Ddz, tai trityylityyppiä, kuten Trt, Mmt, Dmt, Pixyl. Erityisen edullisia ovat heikkojen happojen suhteen labiilit suojaryhmät, jotka ovat trityylityyppiä, 25 kuten Trt, Mmt, Dmt, jolloin erityisen edullinen on Mmt, jolloin viimemainitut parantavat yllättäen monomeerirakenneosien liukoisuutta selvästi, jolloin voidaan valmistaa liuoksia käytettäväksi automaattisissa synteesilaitteissa, kuten esim. monipeptidisyntetisaattorit.

30 Kaavan V mukaisten yhdisteiden valmistuksessa käy tetyt, eksosyklisessä aminofunktiossa suojatut nukleoemäk-set B' valmistetaan sinänsä kirjallisuudesta tutuilla menetelmillä vastaavista nukleoemäksistä käyttämällä sopivaa suojaryhmäreagenssia, kuten esim. Boc20, Moz-atsidi, Trt-35 Cl, Mtt-Cl, Mmt-Cl, Dmt-Cl, Pixyl-Cl. Mahdollisesti täi- 16 löin nukleoemäkseen liitetään selektiivistä alkylointia silmällä pitäen lisäksi tilapäisiä suojaryhmiä.

Kaavan VI mukaisten nukleoemäs-etikkahappojen kytkeminen kaavan V mukaisiin emäslabiililla suojaryhmällä 5 suojattuihin aminoetyyliglysiinijohdannaisiin suoritetaan käyttämällä peptidisynteesissä tavallisia aktivointimene-telmiä edellä kuvatun mukaisesti. Edullisesti käytetään karbodi-imidejä, esim. disykloheksyylikarbodi-imidiä tai di-isopropyylikarbodi-imidiä. Edullisesti käytetään samoin 10 fosfoniumreagensseja, kuten esim. BOP (B. Castro, J. R. Dormoy, G. Evin ja C. Selve, Tetrahedron Lett. 1975 1219 -1222) ja uroniumreagensseja, kuten esim. HBTU (V. Dourtog-lou, B. Gross, V. Lambropoulou, C. Zioudrou, Synthesis 1984 572 - 574); TBTU, TPTU, TSTU, TNTU (R. Knorr, A. 15 Trzeaiak, W, Bannwarth ja D. Gillesen, Tetrahedron Lett. 1989 1927 - 1930); TOTU (EP-A-0 460 446) tai happokloride-ja tai happofluorideja [L.A. Carpino, H. G. Chao, M. Beyermann ja M. Bienert, J. Qrq. Chem. 56 (1991) 2635; J. N. Bertho, A. Loffet, C. Pinel, F. Reuther ja G. Sennyey 20 kirjassa E. Giralt ja D. Andreu (toim.), "Peptides 1990", Escom Science Publishers B. V., 1991, ss. 53 - 54].

Edellä kuvatut PNA:t rakennetaan kiinteäfaasisyn-teesillä sopivaan kantomateriaaliin (esim. polystyroli, polyoksietyleenimodifioitu polystyroli, kuten esim. Ten-25 tagelR, Controlled Pore GlassR), joka on varustettu ankku-riryhmällä L, joka sisältää latentisti tähteen Q°. Kiinteä-faasisyntteesi alkaa PNA;n C-päästä kytkemällä emäslabiililla suojaryhmällä suojattu monomeerl tai aminohappo, jonka sivuketjufunktio on mahdollisesti suojattu, vastaa-30 vaan hartsiin.

Hartsiin kytketyn rakenneosan emäslabiilin suoja-ryhmän pois lohkomisen jälkeen sopivalla reagenssilla edellä kuvatun mukaisesti seuraavat suojatut rakenneosat (PNA-monorneerit ja aminohappojohdannaiset) kytketään toi-35 nen toisensa perään halutussa järjestyksessä. Välituottee- 17 na syntyvät, emäslabiililla suojaryhmällä N-päässä suojatuista PNA-hartseista poistetaan suojaryhraä ennen kytkemistä seuraaviin PNA-monomeereihin edellä kuvatuilla rea-gensseilla.

5 Aminohappojohdannaisten kytkeminen tai aktivointi jollain edellä mainituista aktivointireagensseista voidaan suorittaa dimetyyliformamidissa, N-metyylipyrrolidinonis-sa, asetonitriilissä tai metyleenikloridissa tai mainittujen liuottimien seoksessa. Aktivoitua johdannaista käyte-10 tään tavallisesti 1,5 - 10-kertaisena ylimääränä. Tapauksissa, joissa ei tapahdu täydellistä kytkeytymistä, kyt-kentäreaktio toistetaan ilman, että jo kytketyn rakenneosan aminoryhmästä poistetaan suojaryhmä.

Menetelmiä tähteen R° lisäämiseksi ovat esimerkik-15 si tapauksessa, jossa tämä tähde sisältää karboksyylihap-pofunktion, edellä aminohappojen ja PNA-monomeerien kytkemiseksi kuvatut menetelmät. Muiden menetelmien mukaan reaktiossa käytetään isosyanaatteja, kuten esim. fenyyli-isosyanaatti, isotiosynaatteja, kuten esim. fluoreseiini-20 isotiosyanaatti, kloorimuurahaishappojohdannaisia, kuten esim. klooriformyylikarbatsoli, hiilihappoaktiiviesterei-tä, kuten esim. kolesteroli-(4-nitrofenyyli)karbonaatti, akridiniumsukkinimidyylikarbonaatti, sulfoklorideja, kuten esim. dansyylikloridi jne.

25 Edellä kuvattu synteesikulku voidaan myös suorittaa kaupallisesti saatavilla synteesiautomaateilla, kuten esim. peptidisyntetisaattorit, monipeptidisyntetisaatto-rit, DNA-syntetisaattorit suorittaen kevyitä tavallisesti käytettyjen synteesiohjelmien modifikaatioita.

30 PNA:n synteesin jälkeen edellä kuvatulla tavalla voidaan PNA-oligomeeri lohkaista hartsista sopivilla rea-gensseilla, kuten esim, trifluorietikkahappo heikkojen tai keskivahvojen happojen suhteen labiilien ankkuriryhmien kohdalla. Aina käytetyn liittäjän ja käytettyjen suojaryh-35 mien luonteen mukaan oligomeeri ja muut nukleiinlemästen 18 sivuketjusuojaryhmät lohkaistaan samanaikaisesti. Lohkai-sureagenssia voidaan tällöin käyttää myös sopivilla liuottimilla, kuten esim. metyleenikloridi, laimennettuna. Mahdollisesti voidaan sivureaktioiden välttämiseksi lisätä 5 muita lisäaineita tähän pilkkomisreagenssiin. Kationin-sieppaajiksi sopivat tässä aineet, kuten fenoli, kresoli, tiokresoli, anisoli, tioanisoli, etaaniditioli, dimetyyli-sulfidi, etyylimetyylisulfidi, trietyylisilaani, tri-iso-propyylisilaani tai muuta samankaltaiset, kiinteafaasipep-10 tidisynteesissä tavalliset lisäaineet, joita voidaan lisätä yksittäin tai kahden tai useamman näistä apuaineista seoksena.

Lohkaisun jälkeen saadun raakaoligomeerin puhdistaminen tapahtuu peptidi- tai nukleotidikemiassa tavallisil-15 la menetelmillä, kuten esim. HPLC, ioninvaihtokromatogra- fia jne.

Aminohapoista käytetyt lyhenteet vastaavat peptidi-kemiassa tavallista kolmikirjainkoodia kuten kuvataan julkaisussa Europ. J. Biochem. 138 (1984) 9. Muut käytetyt 20 lyhenteet luetellaan alla.

ACN asetonitriili

Aeg N-(2-aminoetyyli )glysyyli, -NH-CH2-CH2-NH- ch2-co-

Aeg(AMmt) N- ( 2-aminoetyyli) -N- ((9-(N6-4-metoksifenyy-25 lidifenyyli)adenosyyli)asetyyli)glysyyli

Aeg(CMmt) N-(2-aminoetyyli)-N-((l-(N4-4-metoksi- fenyylidifenyyli)sytosyyli)asetyyli)glysyyli

Aeg(T) N- ( 2-aminoetyyli)-N-((1-tyminyyli)asetyy li )glysyyli 30 Aeg(TBom) N-(2-aminoetyyli)-N-((l-(N3-bentsyylioksi- metyyli)tyminyyli)asetyyli Jglysyyli

Aeg( Ttriatsol°) N- ( 2-aminoetyyli ) -N- (( 2-hydroksi-5-me-tyyli-4-trlatsolopyrimidin-l-yyli)asetyyli)glysyyli

Bnpeoc 2,2-[bis( 4-nitrofenyyli)]etoksikarbonyy- 35 li) 19

Boc tert-butoksikarbonyyli BO I 2-(bentsotriatsol-l-yyli )oksi-l,3-dimetyy- li-imidatsolidiniumheksafluorifosfaatti Bom bentsyylioksimetyyli 5 BOP bentsotriatsolyyli-l-oksi-tris(dimetyyli- amino)fosfoniumheksafluorifosfaatti

BroP bromi-tris(dimetyyliamino)fosfoniumheksa- fluorlfosfaatti BSA N,0-bis(trimetyylisilyyli)asetamidi 10 But tert-butyyli

Bzl bentsyyli

Cl-Z 4-klooribentsyylioksikarbonyyli CPG Controlled Pore Glass (kontrolloitu huokos- lasi) 15 DBU 1,8-diatsabisyklo[5.4.0]undes-7-eeni DCM dikloorimetaani

Dde l-(4,4-dimetyyli-2,6-dioksosykloheksylidee- ni)etyyli

Ddz 3,5-dimetoksifenyyli-2-propyyli-2-oksikar- 20 bonyyli DMF dimetyyliformamidi DMT 4,4'-dimetoksitrifenyylimetyyli

Dmt di-(4-metoksifenyyli)fenyylimetyyli

Dnpeoc 2-(2,4-dinitrofenyyli)etoksikarbonyyli 25 FAM fluoreseiinitähde

Fmoc 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli H-Aeg-OH N- ( 2-arainoetyyli Jglysiini HAPyU O-(7-atsabentsotriatsol-l-yyli)-1,1,3,3- bis(tetranunetyleeni)uroniumheksafluorifosfaatti 30 HATU 0-(7-atsabentsotriatsol-l-yyli)-1,1,3,3- tetrametyy1iuroniuraheksafluorifosfaatti HBTU 0-(bentsotriatsol-l-yyli)-1,1,3,3-tetra- metyyliuroniumheksafluorifosfaatti HOBt 1-hydroksibentsotriatsoli 35 HONSu N-hydroksisukkinimidi 20 HOObt 3-hydroksi~4-okso-3,4-dihydrobentsotriat- siini

MeOBz 4-metoksibentsoyyli

Mmt 4-metoksitrifenyylimetyyli 5 Moz 4-metoksibentsyylioksikarbonyyli MSNT 2,4, 6-mesityleen.isulfonyyli-3-nitro-l, 2, - 4-triatsolidi

Mtt 4-(metyylifenyyli)difenyylimetyyli NBA nitrobentsyylialkoholi 10 NMP N-metyylipyrrolidiini

Pixyl 9-(9-fenyyli)ksantenyyli

PyBOP bentsotriatsolyyli-l-oksitripyrrolidinofos- foniumheksafluorifosfaatti

PyBroP bromitripyrrolidinofosfoniumheksafluorifos- 15 faatti TAPipU 0- (7-atsabentsotriatsol-l-yyli)-1,1,3,3- bis(pentametyleeni)uroniumtetrafluoriboraatti TBTU 0-(bentsotriatsol-l~yyli )-1,1,3,3-tetrame- tyyliuroniumtetrafluoriboraatti 20 tBu tert-butyyli tBuBz 4-tert-butyylibentsoyyli TDBTU 0-(3,4-dihydro-4-okso-l,2,3-bentsotriatsin- 3-yyli)-1,1,3,3-tetrametyyliuroniumtetrafluoriboraatti TD0 2,5-difenyyli~2,3-dihydro-3-okso-4-hydrok- 25 sitiofendioksidl TFA trifluorietikkahappo THF tetrahydrofuraani TNTU 0-[(5-norborneeni-2,3-dikarboksimido]-1,- 1,3,3-tetrametyyliuroniumtetrafluoriboraatti 30 TOTU 0-[(syaani(etoksikarbonyyli )metyleeni)ami no] -1,1,3,3-tetrametyyliuroniumtetrafluoriboraatti TPTU 0-(1,2-dihydro-2-okso-l-pyridyyli)-1,1,- 3,3'-tetrametyyliuroniumtetrafluoriboraatti Trt trityyli 21 TSTU 0-(N-sukkinimidyyli )-l, 1,3, 3-tetrametyyli-uroniumtetrafluoriboraatti Z bentsyylioksikarbonyyli MS(ES+) elektronisuihkumassaspektri (positiivinen 5 ioni) MS(ES") elektronisuihkumassaspektri (negatiivinen ioni) MS(DCI) desorptio-kemiallinen ionisaatiomassa- spektri 10 MS(FAB) nopea atomipommitusmassaspektri

Seuraavien esimerkkien on tarkoituksena selventää edullisia menetelmiä keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi ilman, että keksintö rajoittuisi niihin.

Esimerkki 1 15 N- (Fmoc-aminoetyyli)glysiinimetyyliesteri-hydro- kloridi (Fmoc-Aeg-OMe·HC1) 8,2 g aminoetyyliglysiinimetyyliesteri-dihydroklo-ridia liuotetaan 100 ml:aan vettä ja samalla voimakkaasti sekoittaen lisätään 13,48 g Fmoc-ONSu:ta 400 ml:ssa diok-20 saania. Sitten lisätään tipoittain 10,08 g natriumvetykar-bonaattia 150 ml:ssa vettä 15 minuutissa. Seosta sekoitetaan vielä 15 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen se haihdutetaan tyhjössä noin 100 ml:ksi. Seosta uutetaan 600 ml:11a etyyliasetaattia ja orgaaninen faasi 25 pestään 3 kertaan 50 ml:11a vettä. Orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan sitten noin 50 ml:n tilavuuteen. Lisätään 100 ml dikloorimetaania ja 20 ml 2 N kloorivetyhappoliuosta metanolissa, jolloin tuote saostuu heti. Tuotteen annetaan vielä seistä yön yli 30 suljetussa kolvissa 4 °C:ssa. Sakka suodatetaan eroon imulla ja kuivataan.

Saanto: 9,8 g

Rf: o, 50 (n-butanoli/etikkahappo/vesi, 3:1:1) MS (FAB/LiCl): 361,2 [M + Li]*.

22

Esimerkki 2 N-(Fmoc-aminoetyyli)glysiini-hydrokloridi (Fmoc-

Aeg-OH.HCl) 11,21 g aminoetyyliglysiiniä suspendoidaan 5 250 ml:aan DMF:ää ja samalla sekoittaen lisätään 98,8 ml bis(trimetyylisilyyli)asetamidia. 15 minuutin sekoituksen jälkeen saadaan kirkas liuos. Siihen lisätään tipoittain 15 minuutissa liuos, jossa on 33,7 g Fmoc-ONSu:ta 200 ml:ssa DMF:ää. Reaktioseosta sekoitetaan vielä 1 tunnin 10 ajan, minkä jälkeen siihen lisätään 100 ml sekä metanolia että vettä. 10 minuutin kuluttua lisätään vielä 16,6 ml 6 N kloorivetyhappoa ja sekoitetaan edelleen 10 minuutin ajan. Sitten seos haihdutetaan pyöröhaihduttimessa tyhjössä kuiviin ja jäännökseen lisätään 250 ml dikloorimetaania 15 ja sekoitetaan. Ensin saadaan kirkas liuos, josta sitten noin 5 minuutin kuluttua tuote hitaasti saostuu. Vähitellen lisätään vielä 250 ml dikloorimetaania ja sekoitetaan kaikkiaan 1,5 tunnin ajan. Saostunut tuote suodatetaan tarkasti imulla eroon, minkä jälkeen se sekoitetaan imu-20 suodattimena kahdesti 150 mitään dikloorimetaania ja suo datetaan imulla eroon. Sitten sakka siirretään kolviin ja se sekoitetaan noin 300 ml:aan etyyliasetaattia 45 °C:ssa, suodatetaan lämpimänä eroon ja pestään pienellä määrällä lämmintä etyyliasetaattia. Sakka kuivataan hyvin tyhjöek-25 sikaattorissa.

Saanto: 34,4 g

Esimerkki 3

Fmoc-aminoetyyliglysiinin vapauttaminen (Fmoc-Aeg- OH) 30 23 g edellä saatua Fmoc-aminoetyyliglysiini-hydro- kloridia liuotetaan 400 ml:aan metanolia kuumassa. Liuos jäähdytetään huoneenlämpötilaan, minkä jälkeen siihen lisätään tipoittain samalla hyvin sekoittaen liuos, jossa on 2,2 g NaOH:ta 80 ml:ssa metanolia. Tällöin tuote saostuu 35 heti. Liuokseen lisätään vielä 40 ml vettä ja kuumennetaan 23 tätä seosta, jolloin saadaan kirkas liuos, jonka annetaan hitaasti jäähtyä huoneenlämpötilaan ja joka sitten jätetään vielä 1 tunniksi 0 °C:seen seisomaan. Sakka suodatetaan imulla eroon, se pestään kolmeen kertaan kulloinkin 5 70 ml:11a metanolin 90-%:ista vesiliuosta ja kuivataan sitten hyvin tyhjöseksikaattorissa.

Saanto: 15,0 g

Rf: 0,55 (n-butanoli/etikkhappo/vesi, 2:1:2) MS (FAB, NBA): 341,2 [M + H]+.

10 Esimerkki 4 2 - amino - 6 - k 1 oor i pur i n-9-yy 1 ie t ikkahappometyy 1 i es te-ri

Hyvin kuivattuun lasilaitteistoon mitataan argon-suo j akaasussa 1,43 g natriumhydridiä (95-%:ista), jonka 15 päälle kaadetaan 200 ml hyvin kuivattua N,N-dimetyylifor-mamidia. Sitten lisätään 10,0 g 2-amino-6-klooripuriinia, jolloin tapahtuu kaasunkehitystä ja lämpenemistä ja muodostuu keltainen liuos. Tunnin kuluttua lisätään tipoit-taln samalla hyvin sekoittaen liuos, jossa on 10,8 g bro-20 mietikkahappometyyliesteriä 40 ml:ssa DMF:ää. Sekoitetaan vielä 2 tunnin ajan, minkä jälkeen reaktioseos haihdutetaan pyöröhaihduttimessa öljypumpputyhjössä kuiviin. Jäännökseen lisätään vettä, minkä jälkeen uutetaan etyyliasetaatilla. Orgaaninen faasi haihdutetaan kuiviin ja raaka-25 tuotetta puhdistetaan paisuntakromatografisesti kieselgee-Iissä dikloorimetaani/metanolilla (95:5) eluoiden.

Saanto: 11 g tuotetta

Rf: 0,44 (dikloorimetaani/metanoli, 9:1) MS(CI): 242 (M + H)+ 30 Esimerkki 5 2- (4-metoksifenyylidifenyylimetyyliamino) -6-kloori-purin-9-yylietikkahappometyyliesteri 11 g 2-amino-6-klooripurin-9-yylietikkahappometyy-liesteriä suspendoidaan seokseen, jossa on 75 ml pyridii-35 niä ja 9,5 ml trietyyliamiinia, argon-suojakaasussa, min- 24 kä jälkeen lisätään 15 g 4-metoksifenyylidifenyylimetyy-likloridia 4 erässä tunnin aikana. Seoksen annetaaan reagoida yön yli, minkä jälkeen se haihdutetaan kuiviin, haihdutetaan kerran pienen määrän tolueenia kanssa kui-5 viin ja puhdistetaan raakatuotetta paisuntakromatografi- sesti kieselgeelissä dikloorimetaani/metanolilla (98:2) eluoiden.

Saanto: 15,5 g

Rf: 0,60 (dikloorimetaani/metanoli, 97:3) 10 MS( ES+) : 514,2 (M + H)\

Esimerkki 6 2- (4-metoksifenyylidifenyylimetyyliamino) -6-hydrok-sipurin-9-yylietikkahappo 0,5 g 2-(4-metoksifenyylidifenyylimetyyliamino)-6-15 klooripurin-9-yylietikkahappometyyliesteriä keitetään 3 tunnin ajan 12 ml:ssa 10-%:ista natriumlipeää palautus-jäähdyttäen. Sitten seoksen annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan ja se neutraloidaan varovaisesti 10-%:isella HCl:llä. Saostunut tuote suodatetaan imulla eroon, se pes-20 tään useaan kertaan vedellä ja kuivataan hyvin.

Saanto: 400 mg

Rf: 0,1 (dikloorimetaani/metanoli, 7:3) MS (FAB, NBA/LiCl): 488,2 (M + Li)*.

Esimerkki 7 25 6-(4-metoksifenyylidifenyylimetyyliamino)puriini 13,5 g 6-aminopuriinia ja 46,2 g 4-metoksifenyyli-difenyylimetyylikloridia suspendoidaan 500 ml:aan kuivaa dimetyyliformamidia, minkä jälkeen lisätään 13,9 ml tri-etyyliamiinia ja kuumenetaan vähäksi aikaa 60 °C:seen. 30 Lähes kirkkaan, vihertävän liuoksen annetaan seistä yön yli. Sitten seos haihdutetaan kuiviin pyöröhaihduttimessa tyhjössä, minkä jälkeen lisätään 50 ml metanolia ja haihdutetaan jälleen kuiviin. Jäännöstä puhdistetaan kromato-grafisesti kieselgeelissä eluoiden dikloorimetaani/metano-35 lilla (95:5), johon on lisätty 0,1 % trietyyliamiinia.

25

Saanto: 9,8 g vaahtoa

Rf: 0,35 (dikloorimetään!/metanoii, 9:1) MS (FAB, MeOH/NBA): 408,2 (M + H)\

Esimerkki 8 5 6-(4-metoksifenyylidifenyylimetyyliamino)puriini 20,25 g 6-aminopuriinia ja 69,3 g 4-metoksifenyyli-difenyylimetyylikloridia suspendoidaan 500 ml:aan kuivaa pyridiiniä, minkä jälkeen lisätään 19,1 ml 4-etyylimorfo-liinia ja kuumenetaan vähäksi aikaa noin 40 °C:seen. Seos 10 jätetään yöksi seisomaan. Sitten suspensioon sekoitetaan vettä ja dikloorimetaania ja sakka suodatetaan imulla eroon. DIkloorimetaanifaasi haihdutetaan tyhjössä kuiviin, sitä trituroidaan pienessä määrässä dikloorimetaania, sakka suodatetaan imulla eroon ja yhdistetään ensin saatuun. 15 Kuivauksen jälkeen saadaan 47,3 g tuotetta.

Rf: 0,53 (etyyliasetaatti) MS (FAB, MeOH/NBA): 408,2 (M + H)+.

Esimerkki 9 6- (4-metoksifenyylidifenyylimetyyliamino)purin-9-20 yylietikkahappometyyliesteri

Mitataan 6,2 g 6-(4-metoksifenyylidifenyylimetyyli-amino)puriinia 75 ml:aan kuivaa dimetyyliformamidia, ja lisätään sitten 0,36 g natriumhydridiä. Seosta sekoitetaan vielä tunnin ajan, minkä jälkeen siihen lisätään 2,52 g 25 bromietikkahappometyyliesteriä ja sekoitetaan vielä 2 tunnin ajan. sitten reaktioseokseen lisätään 2 ml metanolia, sekoitetaan 10 minuutin ajan ja haihdutetaan sitten kuiviin tyhjössä pyöröhaihduttimessa. Jäännöstä puhdistetaan kromatografisesti kieselgeelissä eluoiden etyyliasetaatil-30 la, johon on lisätty 0,5 % trietyyliamiinia.

Saanto: 4,0 g vaahtoa

Rf: 0,68 (etyyliasetaatti/metanoli, 3:1) MS (FAB, NBA/LiCl); 480,2 (M + H) + ; 485,2 (M + Li)\ 26

Esimerkki 10 6- (4-metroksi f enyylidif enyy lime tyyli amino) purin-9-yylietikkahappo 3,0 g 6-(4-metoksifenyylidifenyylimetyyliarnino)pu-5 rin-9-yylietikkahappometyyliesteriä liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia ja lisätään samalla sekoittaen 0,25 g NaOH:ta 5 ml:ssa vettä, 10 minuutin kuluttua saippuoitumi-nen on päättynyt ja reaktioseoksen pH säädetään laimealla etikkahapolla 6:ksi. Seosta laimennetaan vielä 100 ml:11a 10 vettä, minkä jälkeen se haihdutetaan pyöröhaihduttimessa kuiviin. Sitten jäännös tislataan vielä kahdesti kuiviin pienen määrän tolueenia kanssa, minkä jälkeen jäännökseen lisätään dietyylieetteriä, jolloin tuote kiteytyy. Saostunut tuote suodatetaan imulla eroon, se pestään pienellä 15 määrällä dietyylieetteriä ja kuivataan.

Saanto: 3,2 g

Sulamispiste: 157 - 160 °C (haj.).

Rf: 0,15 (etyyliasetaatti/metanoli, 3:1) MS (FAB, NBA/LiCl): 465,1 (M + H)*; 472,1 (M + Li)*; 20 478,2 (M + 2Li )*.

Esimerkki 11 1-asetyy1i-2,4-dihydroksi-5-metyy1ipyrimidi ini 1-asetyylityrniini 75 g tymiiniä suspendoidaan 375 ml:aan asetanhydri-25 diä ja keitetään palautusjäähdyttäen 45 minuutin ajan. Sitten seos jäähdytetään 0 °C:seen, jolloin tuote saostuu. Sakka suodatetaan imulla eroon ja sekoitetaan 375 ml:aan etyyliasetaattia. Sakka suodatetaan imulla eroon, se pestään pienellä määrällä dietyylieetteriä ja kuivataan.

30 Saanto; 89,1 g

Sulamispiste: 187 - 189 °C

Rf: 0,67 (dikloorimetaani/metanoli, 95:5).

27

Esimerkki 12 3-bentsyy1ioksimetyy1i-2Λ 4-dihydroksi-5-metyy1ipy-rimidiini 3-bentsyylioksimetyylityrniini 5 52,0 g l-asetyyli-2,4-dihydroksi-5-metyylipyrimi- diiniä suspendoidaan 300 mliaan DMF:ää, minkä jälkeen lisätään 47,5 ml trietyyliamiinia ja jäähdytetään 0 °C:seen. Hyvin sekoitettuun seokseen lisätään hitaasti tipoittaln 100 ml bentsyylikloorimetyylieetteriä 50 ml:ssa DMF:ää 10 tässä lämpötilassa. Seosta ekoitetaan vielä 1 tunnin ajan ja se jätetään yöksi huoneenlämpötilaan seisomaan. Sitten reaktioseos haihdutetaan tyhjössä pyöröhaihduttimessa kuiviin, jäännös lietetään 450 ml:aan metanolia ja 300 ml:aan metyyliamiinin 40-%:ista vesiliuosta ja keitetään 1,5 tun-15 nin ajan palautusjäähdyttäen. Sitten liuos haihdutetaan kuiviin ja jäännös sekoitetaan 10,8 g:aan natriumvetykar-bonaattia 600 ml:ssa vettä. Saostunut tuote suodatetaan imulla eroon, se pestään vedellä ja etanolilla ja uudel-leenkiteytetään etanolista.

20 Saanto: 46,66 g

Sulamispiste: 119 - 120 °C

Rf: 0,38 (dikloorimetaani/metanoli, 95:5).

Esimerkki 13 3-bentsyylioksimetyyli-2,4-dihydroksi-5-metyylipy-25 rimidiinietikkahappoetyyliesteri 3-bentsyylioksimetyylityminyylietikkahappoetyylies- teri 4,97 g natriumhydridiä mitataan 150 ml:aan THF:ää ja seokseen lisätään tipoittain N2-suojakaasussa 0 °C:ssa 30 liuos, jossa on 45,04 g 3-bentsyylioksimetyyli-2,4-dihyd-roksi-5-metyylipyrimidiiniä 550 ml:ssa THF:ää, ja sitten lisätään 21,42 ml bromietikkahappoetyyliesteriä 700 ml:ssa THF:ää tässä lämpötilassa. Sitten seosta sekoitetaan vielä 5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen siihen 35 lisätään varovaisesti vettä. Orgaaninen faasi erotetaan ja 28 vesifaasia uutetaan vielä neljään kertaan dikloorimetaa-nllla. Yhdistetyt orgaaniset faasit kuivataan magnesium-sulfaatilla, haihdutetaan kuiviin ja jäännöstä sekoitetaan heptaanissa.

5 Saanto: 52,4 g

Rf: 0,15 (dikloorimetaani/metanoli, 95:5) MS (FAB, NBA): 319,1 (M + H)+.

Esimerkki 14 2,4-dihydroksi-5-metyylipyrimidiinietikkahappoetyy~ 10 liesteri

Tyminyylietikkahappoetyyliesteri 25 g 3-bentsyylioksimetyyli-2,4-dihydroksi-5-inetyy-lipyrimidiinietikkahappoetyyliesteriä liuotetaan 1 000 ml:aan dikloorimetaania, seos jäähdytetään -70 °C:seen ja 15 tässä lämpötilassa samalla hyvin sekoittaen lisätään tipoittaan 375 ml booritrikloridin 1 M liuosta dikloorime-taanissa. Seoksen annetaan reagoida vielä 3 tunnin ajan tässä lämpötilassa, minkä jälkeen lisätään tipoittain -70 - -60 °C:ssa 320 ml metanolia. 1 tunnin kuluttua seok-20 seen lisätään 197,05 ml trietyyliamiinia ja seoksen anne taan lämmetä huoneenlämpötilaan. Sitten lisätään vielä vähän vettä ja haihdutetaan seos pyöröhaihduttimessa kuiviin. Jäännös lietetään etyyliasetaattiin ja pestään vedellä. Orgaaninen faasi kuivataan magnesiumsulfaatilla ja 25 haihdutetaan sitten kuiviin.

Saanto: 12 g

Rf: 0,45 (dikloorimetaani/metanoli, 9:1) MS (DCI): 199 (M + H)\

Esimerkki 15 30 2,4-dihydroksi-5-metyylipyrimidiinietikkahppo

Tyminyylietikkahappo 10 g 2,4-dihydroksi-5-metyylipyrimidiinietikkahap-poetyyliesteriä liuotetaan 130 ml:aan dioksaani/vettä (1:1), minkä jälkeen lisätään 60 ml 1 N LiOH-liuosta ja 35 sekoitetaan yön yli huoneenlämpötilassa. Sitten seos 29 haihdutetaan pieneksi tilavuudeksi, vesifaasi pestään eetterillä, minkä jälkeen sen pH säädetään 2,5:ksi. Tällöin tuote saostuu. Se suodatetaan imulla eroon, jolloin saadaan 4,9 g tuotetta. Emäliuoksesta voidaan saada penta-5 nolilla uuttamalla ja heptaani/eetterillä seostamalla vielä 1,5 g tuotetta.

Saanto: 6,4 g

Rf: 0,30 (dikloorimetaani/metanoli, 3:2) MS (DCI): 185 (M + H)\ 10 Esimerkki 16 N-1-kloorikarboksimetyylityrniini

Tyminyylietikkahappokloridi

Esimerkki 16a 2 g 2,4-dihydroksi-5-metyylipyrimidiinietikkahappoa 15 sekoitetaan 3 tunnin ajan 15 ml:n tionyylikloridia kanssa 60 °C:ssa, kunnes ei enää tapahdu kaasunkehitystä. Sittten tionyylikloridiylimäärä haihdutetaan pyöröhaihduttimessa tyhjössä pois, minkä jälkeen jäännös tislataan vielä kolmasti pienen määrän tolueenia kanssa. Näin saatua tuotetta 20 käytetään sellaisenaan seuraavassa reaktiossa.

Saanto: 2,4 g MS (DCI): 203 (M + H) + .

Esimerkki 16b N-l-karboksimetyylitymiiniä (3,0 g; 16,3 mmol) 25 suspendoidaan tionyylikloridiin (90 ml). Suspensiota kuumennetaan 1,5 tunnin ajan 70 °C:ssa, minkä jälkeen sen annetaan seistä 16 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Tionyylikloridiylimäärä poistetaan tyhjössä ja jäännös haihdutetaan kolmasti tolueenin kanssa kuiviin. Saatua tuotet-30 ta trituroidaan kahdesti n-heksaanissa, minkä jälkeen se kuivataan tyhjössä. Yhdiste saadaan kirkkaan oranssina jauheena.

Saanto: 3,30 g.

MS (Cl; dikloorimetaani): 203 (M + H)+ 35 Rf: 0,10 (dikloorimetaani/metanoli, 7:3).

30

Esimerkki 17 2-hydroksi-4-(4-metoksifenyy1idi fenyy1imetyy1iami-no)pyramidiini N4-Mmt - sy tos i ini 5 11,6 g 4-amino-2“hydroksipyrimidiiniä ja 46,2 g 4-metoksifenyylidifenyylimetyyliklor.ldia suspendoidaan 500 ml:aan kuivaa pyridiiniä ja lisätään 12,8 ml 4-etyyli-morfoliinia, minkä jälkeen seos lämmitetään vähäksi aikaa 40 °C:seen. Seos jätetään yöksi seisomaan. Sitten suspen-10 sioon sekoitetaan vettä ja dikloorimetaania ja sakka suodatetaan imulla eroon. Dikloorimetaanifaasi haihdutetaan tyhjössä kuiviin, jäännöstä trituroidaan pienessä määrässä dikloorimetaania, sakka suodatetaan imulla eroon ja yhdistetään ensin saatuun. Kuivauksen jälkeen saadaan 15 16,8 g tuotetta.

Rf: 0,45 (dikloorimetaani/metanoli, 9:1) MS (FAB, MeOH/NBA): 384,2 (M + H)+.

Esimerkki 18 2-hydroksi-4-(4-metoksifenyylidifenyylimetyyliami-20 no)pyrimidin-1-yylietikkahappometyy1iesteri N4-Mmt-sytosyylietikkahappometyyliesteri Mitataan 11,5 g 2“hydroksi-4-(4-metoksifenyylidife-nyylimetyyliaminoJpyrimidiiniä 120 ml:aan kuivaa dimetyy-liformamidia ja lisätään sitten 0,72 g natriumhydridiä. 25 Seosta sekoitetana vielä tunnin ajan, minkä jälkeen siihen lisätään 5,05 g bromietikkahappometyyliesteriä ja sekoitetaan edelleen 2 tunnin ajan. Sitten reaktioseokseen lisätään 2 ml metanolia, sekoitetaan 10 minuutin ajan ja haihdutetaan sitten tyhjössä pyöröhaihduttimessa kuiviin.

30 Jäännöstä trituroidaan vedessä, se suodatetaan imulla eroon ja kuivataan.

Saanto: 10,7 g

Rf: 0,39 (etyyliasetaatti) MS (FAB, NBA/LiCl): 462,2 (M + Li)\ 31

Esimerkki 19 2-hydroksi-4-(4-metoks i fenyy1idifenyy1imetyy1iami-no)pyrimidin-1-yylietikkahappo N4-Mmt-sytosyylietikkahappo 5 10,5 g 2-hydroksi-4-(4-metoksifenyylidifenyylime- tyyliamino)pyrimidin-l-yylietikkahappometyyliesteriä liuotetaan 100 ml:aan dimetyyliformamidia ja lisätään samalla sekoittaen 0,94 g NaOH:ta 5 ml:ssa vettä. 10 minuutin kuluttua saippuoituminen on päättynyt ja reaktioseok-10 sen pH säädetään laimealla etikkahapolla 6:ksi. Seosta laimennetaan vielä 100 ml:11a vettä, minkä jälkeen se haihdutetaan tyhössä pyöröhaihduttimessa kuiviin. Sitten jäännös tislataan vielä kahdesti pienen määrän tolueenia kanssa ja jäännökseen lisätään dietyylieetteriä, jolloin 15 tuote saostuu. Saostunut tuote suodatetaan imulla eroon, se pestään pienellä määrällä dietyylieetteriä ja kuivataan .

Saanto: 8,55 g

Rf: 0,27 (etyyliasetaatti) 20 MS (FAB, NBA/LiCl) : 448 (M + Li) + .

Esimerkki 20 N4- (tert-butyylioksikarbonyyli) -N^-karboksimetyyli-sytosiini N4-Boc-sytosyylietikkahappo 25 Esimerkki 20a N4-(tert-butyylioksikarbonyyli)sytosiini N4-Boc-sytosiini

Sytosiinia (11,1 g) suspendoidaan kuivaan pyridii-niin (250 ml). Sitten lisätään di-tert-butyylidikarbonaat-30 tia (21,8 g) ja spaattelin kärjeilinen 4-dimetyyliaminopy- ridiiniä. Seosta sekoitetaan 6 tunnin ajan 60 °C:ssa, jolloin muodostuu paksu sakka. Reaktioliuos jäähdytetään ja sakka suodatetaan imulla eroon. Sakkaa sekoitetaan lämpimässä veden kanssa, se suodatetaan eroon ja kuivataan tyh-35 jössä.

32

Saanto: 10,26 g MS (DCI): 212 (M + H)*

Rf: 0,6 (dikloorimetaani/metanoli, 6:4).

Esimerkki 20b 5 N4- (tert-butyylioksikarbonyyli) -N^metoksikarbonyy- limetyylisytosiini N4-Boc-sytosyylietikkahappometyyliesteri N4-(tert-butyylioskikarbonyyli)sytosiinia (1,6 g) suspendoidaan kuivaan DMF:ään (30 ml), lisätään natrium-10 hydridiä (0,19 g) pieninä erinä ja seosta sekoitetaan 1,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, kunnes vedynkehitys on päättynyt. Sitten lisätään huoneenlämpötilassa ruiskulli-nen bromietikkahappometyyliesteriä (0,84 ml) tipoittain. Seosta sekoitetaan vielä 5 tunnin ajan huoneenlämpötilas-15 sa, minkä jälkeen siihen lisätään metanolia (1 ml). Liuotin haihdutetaan tyhjössä eroon ja saatua jäännöstä puhdistetaan käyttäen kolonnikromatografiaa kieselgeelissä ja eluointiaineena dikloorimetaania. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistetään ja haihdutetaan tyhjössä kuiviin.

20 Saanto: 1,1 g MS (DCI): 284 (M + H) +

Rf: 0,5 (dikloorimetaani/metanoli, 95:5).

Esimerkki 20c N4- (tert-butyylioksikarbonyyli) -I^-karboksimetyyli-25 sytosiini N4-Boc-sytosyylietikkahappo N4— (tert-butyylioksikarbonyyli ) -Nx-metoksikarbonyy-limetyylisytosiinia (4,2 g) suspendoidaan veteen (30 ml) ja 0 °C:ssa lisätään tipoittain natronlipeän 2 N vesiliuos-30 ta kontrolloiden pH:ta (pH 12), kunnes metyyliesteri on saippuoitunut. Reaktion etenemistä seurataan TLC:n avulla. Sitten reaktioliuoksen pH säädetään etikkahapolla 3:ksi ja liuotin tislataan eroon tyhjössä. Raakatuotetta puhdistetaan kolonnikromatografisesti kieselgeelissä käyttäen 35 eluointiaineenadikloorimetaani/metanoli/trietyyliamiinia, 33 8:1:1. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistetään ja haihdutetaan tyhjössä kuiviin.

Saanto: 3,5 g

Sulamispiste: 95 - 98 °C, haj.

5 MS (FAB, NBA) : 270,2 (M + H) +

Rf: 0,35 (dikloorimetaani/metanoli/trietyyliamii- ni, 8:1:1).

Esimerkki 21 N-[2-(4-metoksifenyylidifenyylimetyyliamino)-6-10 hydroksipurin-9-yyliasetyyli] -N-2- (9-fluorenyylimetyyli-oksikarbonyyliamino) etyyliglysiini (Fmoc-Äeg (g””*) -OH) 1 g 2-(4-metoksifenyylidifenyylimetyyliamino)-6-hydroksipurin-9-yylietikkahappoa liuotetaan DMF:ään ja 0 °C:seen jäähdytettyyn liuokseen lisätään peräkkäin 682 mg 15 TOTU:ta ja 239 mg N-etyylimorfoliinia. Seosta sekoitetaan vielä 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Erillisessä kolvissa valmistetaan liuos, jossa on 1,06 g Fmoc-amino-etyyliglysiiniä 4 ml:ssa dimetyyliformamidia ja 1,5 g bis-trimetyylisilyyliasetamidia. Tämä liuos lisätään sitten 20 2- (4-metoksif enyylidif enyylimetyyliamino) -6-hydroksipurin- 9-yylietikkahapon esiaktivoituun liuokseen. Seosta sekoitetaan edelleen 2 tunnin ajan, minkä jälkeen se haihdutetaan kuiviin. Sitten jäännös lietetään 30 ml:aan etyyliasetaattia ja uutetaan kolmasti kulloinkin 15 ml:11a vet-25 tä. Orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla ja sitä puhdistetaan kromatografisesti kieselgeelissä eluoiden metanoli/dikloorimetaani/vesi/jääetikalla (1,5:10:0,25:-0,075).

Saanto: 600 mg 30 Rf: 0,35 (metyleenikloridi/metanoli, 7:3) MS (FAB, DMSO/NBA/LiCl): 810,3 (M + Li)\ 34

Esimerkki 22 N-[6-(4-metoksi fenyy1idi fenyy1imetyy1iamino)purin-9-yyliasetyyli ] -N-2-(9-f luorenyy 1 imetyy1 i oks ikarbonyy 1 i -amino) etyy 1 iglysi inimetyyliesteri (Fmoc-Aeg (ÄM"t) -OMe) 5 Seos, jossa on 848 mg (2,6 mmol) Fmoc-Aeg-

Ome*HCl:ää ja 407 mg (2,5 mmol) HOOBtrtä, liuotetaan 5 ml:aan DMF:ää, minkä jälkeen lisätään 640 μΐ (5 mmol) NEM:ää ja 1,2 g (2,5 mmol) 6-(4-metoksifenyylidifenyyli-metyyliamino)purin-9-yylietikkahappoa liuotettuna 5 ml:aan 10 DMF:ää. Sitten lisätään 471 μΐ (3 mmol) di-isopropyylikar-bodi-imidiä ja seosta sekoitetaan 4 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten seos suodatetaan ja suodos haihdutetaan pyöröhaihduttimessa tyhjössä kuiviin. Amorfinen jäännös lietetään dikloorimetaaniin, lietettä uutetaan vedellä 15 ja natriumvetykarbonaattiliuoksella, orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan sitten tyhjössä kuiviin. Jäännös liuotetaan 4,5 ml:aan etyyliasetaattia ja seostetaan lisäämällä 20 ml di-isopropyylieetteriä. Tällöin saatu puolikiinteä sakka liuotetaan 20 ml:aan metano-20 lia, saostetaan lisäämällä 30 ml vettä ja kuivataan sitten tyhjössä.

Saanto: 1,05 g

Rf: 0,85 (n-butanoli/etikkahappo/vesi, 3:1:1) MS (FAB, DMSO/NBA): 802,4 (M + H)+.

25 Esimerkki 23 N-[6-(4-metoksifenyy1idifenyylimetyy1iamino)purin-9-yyli)asetyyli]-N-2-(9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli-amino)etyyliglysiinin synteesi (Fmoc-Aeg (A14"*1)-OH) 900 mg (1,125 mmol) Fmoc-Aeg (AKmt) -OMe: tä liuote-30 taan 5 ml:n dioksaania ja 2,5 ml:n vettä seokseen, minkä jälkeen jäävedellä jäähdyttäen saippuoidaan lisäämällä pieninä erinä seos, jossa on 2,4 ml 1 n NaOH-liuosta ja 2,5 ml dioksaania. Reaktion päätyttyä puskuroidaan lisäämällä pieni määrä kiinteää hiilidioksidia ja pienessä 35 määrässä tapahtunut Fmoc-pilkkominen tehdään palautuvaksi 35 lisäämällä Fmoc-ONSU:ta. Sitten dioksaani tislataan valtaosin tyhjössä eroon, liuosta laimennetaan vedellä ja sille sijoitetaan kerrokseksi etyyliasetaatti/n-butanolia (1:1). Seos tehdään happamaksi pH:sta 5 pH:hon 6 lisäämäl-5 lä kaliumvetysulfaattiliuosta samalla jäävedellä jäähdyttäen. Orgaaninen faasi erotetaan ja vesifaasia uutetaan vielä kahdesti etyyliasetaatti/butanolilla (1:1). Yhdistetyt orgaaniset faasit kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan pyöröhaihduttimessa tyhjössä kuiviin. Jäännös 10 liuotetaan 5 ml:aan etyyliasetaattia ja saostetaan lisäämällä 20 ml metyylibutyylieetteriä.

Saanto: 1,02 g

Rf: 0,73 (n-butanoli/etikkahappo/vesi, 3:1:1) MS (FAB, DMSO/NBA): 787 (M + H) + ; 794 (M + Li)+.

15 Esimerkki 24 N-(2,4-dihydroksi-5-metyylipyrimidin-l-yyliasetyy-li) -N-2- (9-f luorenyylimetyylioksikarbonyyliamino) etyyli-glysiini (Fmoc-Aeg(T)-OH) 4,03 g Fmoc-Aeg-0H:ta suspendoidaan 80 ml:aan 20 DMF:ää, lisätään 4,39 ml N,O-bistrimetyylisilyyliasetami- dia ja sekoitetaan 40 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten kirkkaaseen liuokseen lisätään 0 °C:ssa 2,4 g 2,4-dihydroksi-5-metyylipyrimidiinietikkahappokloridia samalla hyvin sekoittaen. Seoksen annetaan vielä reagoida 25 3 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen liuotin tislataan pyöröhaihduttimessa pois. Näin saatuun raaka-tuotteeseen lisätään vettä ja se jätetään yöksi 0 °C:seen seisomaan. Sitten vesi dekantoidaan pois, jäännös kuivataan tehokkaassa tyhjössä ja sitä puhdistetaan kromatogra-30 fisesti kieselgeelissä dikloorimetaani/metanoli/jääetik-ka/vedellä (500:100:25:2) eluoiden. Yhdistetyt tuotefrak-tiot haihdutetaan kuiviin ja tislataan vielä kolmasti pienen määrän tolueenia kanssa.

Saanto: 3,8 g 36

Rf: 0,42 (dikloorimetaani/metanoli/etikkahappo, 100:20:5) MS (FAB, DMSO/NBA): 507,3 (M + H)+.

Esimerkki 25 5 N-(2,4-dihydroksi-5-metyylipyrimidin-l-yyliasetyy- li) -N-2- (9-£Xuorenyylimetyylioksikarbonyyliamino) etyyli-glysiini (Fmoc-Aeg(T)-OH)

Seos, jossa on 386 mg (2 mmol) 2,4-dihydroksi-5-metyylipyrimidiinletikkahappoa ja 652 mg (4 mmol) 10 HOOBt:tä, lämmitetään 6 ml:ssa kuivaa DMF:ää vähäksi aikaa 70 - 80 °C:seen. Huoneenlämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen lisätään 314 μΐ (2 mmol) di-isopropyylikarbodi-imidiä ja seosta sekoitetaan 30 minuutin ajan. Sitten siihen lisätään 680 mg (2 mmol) Fmoc-Aeg-OH:ta. 30 minuu-15 tin välein seos lämmitetään kolmasti vähäksi aikaa noin 70 °C:seen, Sitten liuotin haihdutetaan tyhjössä pyöröhaih-duttimessa eroon ja saatua jäännöstä trituroidaan vedessä ja näin saatu raakatuote ositetaan n-butanoliin ja veteen. Orgaanista faasia uutetaan kaliumvetysulfaattiliuoksella, 20 natrlumvetykarbonaattiliuoksella ja vedellä. Sitten orgaaninen faasi haihdutetaan tyhjössä pyöröhaihduttimessa kuiviin, jolloin tuote saostuu.

Saanto: 260 mg

Rf: 0,40 (n-butanoli/etikkahappo/vesi, 3:1:1) 25 MS (FAB, DMSO/NBA: 507,3 (M + H)\

Esimerkki 26 N-[2-hydroksi-4-(4-metoksifenyylidifenyylimetyyli-amino) pyr imidin-1 -yy liasetyy 1 i ]-N-2-(9-f luorenyy 1 imetyy-lioksikarbonyyliamino)etyyliglysiinimetyyliesteri (Fmoc-30 AegiC^-OMe)

Seos, jossa on 1,7 g (5 mmol) Fmoc-Aeg-OMe·HC1:ää ja 675 mg (5 mmol) HOOBt:tä, liuotetaan 10 ml:aan kuivaa DMF:Ää ja 1,28 ml (10 mmol) NEM:ää lisätään. Sitten seos jäähdytetään 0 °C:seen, siihen lisätään 2,21 g (5 mmol) 35 2-hydroksi-4-(4-metokslfenyylidifenyylimetyyliamino)pyri- 37 midin-1-yylietikkahappoa ja sitten 5 mmol di-isopropyyli-karbodi-imidiä ja tätä seosta sekoitetaan vielä 30 minuutin ajan 0 °C:ssa. Sitten seosta sekoitetaan 4,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen liuotin tislataan 5 eroon pyöröhaihduttimessa tyhjössä. Jäännös ositetaan di-kloorimetaaniin ja veteen, orgaaninen faasi pestään nat-riumvetykarbonaattiliuoksella ja vedellä, se kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan kuiviin pyöröhaihduttimessa tyhjössä. Jäännös liuotetaan 10 ml:aan metanolia ja 10 saostetaan lisäämällä 15 ml vettä. Saatua tuotetta tritu-roidaan pienessä määrässä vettä ja se kuivataan tyhjöeksi-kaattorissa kaliumhydroksidilla.

Saanto: 3,19 g

Rf: 0,79 (n-butanoli/pyridiini/vesi/etikkahappo, 15 8:2:2:10) MS (FAB, DMS0/NBA): 778,4 (M) + .

Esimerkki 27 N-[2-hydroksi-4-(4-metoksi fenyylidifenyylimetyyli-amino)pyrimidin-l-yyliasetyyli] -N-2- (9-f luorenyylimetyy-20 lioksikarbonyyliamino)etyyliglysiini (Fmoc-AegiC”0*) -OH) 3,0 g (3,86 mmol) Fmoc-Aeg(CMmt)-OMe: tä liuotetaan seokseen, jossa on 15 ml dioksaania ja 10 ml vettä, ja saippuoidaan jäähdyttäen jäävedellä lisäämällä pieninä erinä 10,2 ml seosta, jossa on 1 N NaOH-liuosta ja diok-25 saania (1:1). Reaktion päätyttyä puskuroidaan lisäämällä pieni määrä kiinteää hiilidioksidia ja pienessä määrässä tapahtunut Fmoc-pilkkominen tehdään lisäämällä 0,5 g Fmoc-0NSU:ta ja sitten 45 minuuttia sekoittamalla palautuvaksi. Sitten seoksen pH säädetään 6,5:ksi lisäämällä 0,5 ml 2 M 30 kaliumvetysulfaattiliuosta. Sitten dioksaani tislataan valtaosin tyhjössä eroon, liuosta laimennetaan vedellä ja se päällystetään etyyliasetaatilla. Seos tehdään happamaksi pH 5:een lisäämällä kalumvetysulfaattiliuosta samalla jäävedellä jäähdyttäen. Orgaaninen faasi erotetaan ja ve-35 sifaasia uutetaan vielä kahdesti etyyliasetaatilla. Yhdis- 38 tetyt orgaaniset faasit kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan pyöröhaihduttimessa tyhjössä kuiviin. Jäännös liuotetaan seokseen, jossa on 5 ml metanolia ja 15 ml etyyliasetaattia ja saostetaan lisäämällä 80 ml metyylibu-5 tyylieetteriä. Tuote suodatetaan eroon ja kuivataan tyhjössä.

Saanto: 1,95 g

Rf: 0,80 (n-butanoli/etikkahappo/vesi, 3:1:1) MS (FAB, DMSO/NBA/LiCl): 770,3 (M + Li)\ 10 Esimerkki 28 N-[2-hydroksi-4-(tert-butyylioksikarbonyyliamino)-pyrimidin-l-yyliasetyyli ] -N-2- (9-fluorenyylimetyylioksi-karbonyyliamino)etyyliglysiinimetyyliesteri (Fmoc-Aeg-(CBoc) -OMe) 15 Seos, jossa on 0,85 g (3 mmol) N4-( tert-butyylioksi- karbonyyli)-t^-karboksimetyylisytosiinia ja 0,49 g (3 mmol) H00Bt:tä, liuotetaan 5 ml:aan kuivaa DMF:ää ja lisätään 786 μΐ (6 mmol) NEM:ää ja sitten 1,02 g (3 mmol) Fmoc-Aeg-0Me'HCl:ää. Sitten seos jäähdytetään 0 °C:seen, 564 μΐ 20 (3,6 mmol) dl-isopropyylikarbodi-imidä lisätään ja seosta sekoitetaan 30 minuutin ajan 0 °C:ssa ja 4 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten liuotin tislataan eroon tyhjössä pyöröhaihduttimessa. Jäännös ositetaan dikloorimetaaniin ja veteen, orgaaninen faasi pestään natriumvetykarbonaat-25 tiliuoksella ja vedellä, se kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan kuiviin tyhjössä pyöröhaihduttimessa. Jäännös uudelleenkiteytetään 20 mlrsta etyyliasetaattia.

Saanto: 1,19 g

Rf: 0,88 (n-butanoli/etikkahappo/vesi, 3:1:1) 30 MS (FAB, DMS0/NBA): 606,3 (M+).

Esimerkki 29

Fmoc-Aeg (C®00) -OMe

Seos, jossa on 2,87 g (8,47 mmol) Fmoc-Aeg-OMe*-HCl:ää ja 1,38 g (8,47 mmol) H00Bt:tä, liuotetaan 15 35 ml:aan kuivaa DMF:ää, 1,08 ml (8,47 mmol) NEM:ää lisätään 39 ja sitten 2,4 g (8,47 mmol) N4-(tert-butyylioksikarbonyy-li ) -I^-karboksimetyylisytosiinia. Sitten seos jäähdytetään 0 °C:seen, lisätään 1,33 ml (8,47 mmol) di-isopropyylikar-bodi-imidiä ja seosta sekoitetaan 30 minuutin ajan 0 °C;ssa 5 ja 3 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten liuotin tislataan eroon pyöröhaihduttimessa tyhjössä. Jäännös liete-tään 100 ml:aan dikloorimetaania, orgaaninen faaso pestään peräkkäin vedellä, natriumvetykarbonaattiliuoksella ja vedellä, se kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan 10 kuiviin tyhjössä pyöröhaihduttimessa. Jäännöstä trituroi-daan metyyli-tert-butyylieetterissä.

Saanto: 4,5 g

Rf: 0,88 (n-butanoli/etikkahappo/vesi, 3:1:1) Esimerkki 30 15 N-[2-hydroksi-4-(tert-butyylioksikarbonyyliamino)- pyrimidin-l-yyliasetyyli] -N-2- (9-f luorenyylimetyylioksi-karbonyyliamino)etyyliglysiini (Fmoc-Äeg(CDoc) -OH) 700 mg (1,15 mmol) Fmoc-Aeg( CBoc)-OMe: tä liuotetaan seokseen, jossa on 6 ml dioksaania ja 3 ml vettä, ja 20 liuokseen lisätään 0 °C:ssa pieninä erinä kaikkiaan 0,95 ml 2 N NaOH-liuosta 2 tunnissa. Reaktion päätyttyä seos puskuroidaan lisäämällä pieni määrä kiinteää hiilidioksidia ja pienessä määrässä tapahtunut Fmoc-pilkkominen tehdään palautuvaksi lisäämällä 50 mg Fmoc-ONSU:ta ja sekoittamat-25 la sitten 45 minuutin ajan. Sitten seoksen pH säädetään 0,5 ml:11a 2 M kaliumvetysulfaattiliuosta 6,5:ksi. Sitten dioksaani tislataan valtaosin tyhjössä eroon, liuosta laimennetaan vedellä ja sille asetetaan kerrokseksi etyyliasetaattia. Seos tehdään happamaksi pH 5:een lisäämällä 30 kaliumvetysulfaattiliuosta samalla jäävedellä jäähdyttäen.

Orgaaninen faasi erotetaan ja vesifaasia uutetaan vielä kahdesti etyyliasetaatilla. Yhdistetyt orgaaniset faasit kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan pyöröhaihduttimessa tyhjössä kuiviin, jolloin tuote saostuu. Tuote 35 suodatetaan eroon ja kuivataan tyhjössä.

40

Saanto: 485 mg

Rf: 0,55 (n-butanoli/pyridiini/etikkahappo/vesi, 8:2:2:10) MS (FAB, DMSO/NBA): 592 (M+).

5 Esimerkki 31

Fmoc-Äeg(T)-OMe 11,73 g Fmoc-Aeg-OMe·HC1:ää liuotetaan yhdessä 5,52 g:n tyminyylietikkahappoa kanssa 100 ml:aan kuivaa DMF:ää, minkä jälkeen lisätään peräkkäin 9,84 g T0TU:ta ja 10 20,4 ml di-isopropyylietyyliamiinia. Seosta sekoitetaan 3 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen se haihdu-tetaan tyhjössä pyöröhaihduttimessa kuiviin. Jäännös lie-tetään etyyliasetaattiin ja uutetaan kolmasti sekä nat-riumvetykarbonaatti- että kaliumvetysulfaattiliuoksella. 15 Orgaaninen faasi haihdutetaan kuiviin, jäännös liuotetaan pieneen määrään etyyliasetaattia ja lisätään eetteriä, jolloin tuote saostuu.

Saanto: 12,3 g

Rf: 0,53 (n-butanoli/etikkahappo/vesi, 3:1:1) 20 MS (ES+) : 521,4 (M + H)\

Esimerkki 32

Fmoc-Aeg(T)-OH

12,0 g Fmoc-Aeg(T)-OMe:tä suspendoidaan seokseen, jossa on 100 ml dioksaania ja 50 ml vettä, ja saippuoi-25 daan lisäämällä pieninä erinä 32 ml 2 N NaOH-liuosta. Reaktion päätyttyä seos puskuroidaan lisäämällä pieni määrä kiinteää hiilidioksidia ja osittain tapahtunut Fmoc-pilkkominen tehdään palautuvaksi lisäämällä 2,7 g Fmoc-ONSU:ta. Sitten seos suodatetaan ja suodosta uutetaan 30 etyyliasetaatilla. Vesifaasi säädetään 1 N HCl:ää lisäämällä pH 2:een, jolloin tuote saostuu. Sakka suodatetaan imulla eroon ja kuivataan tyhjössä (raakatuote 11,6 g). Suolojen poistamiseksi raakatuote lietetään 70 ml:aan DMF:ää kevyesti lämmittäen, ei-liukoinen aines suodatetaan 35 eroon ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännös lietetään 41 etyyliasetaattiin ja saostetaan lisäämällä di-isopropyyli-eetteriä. Tuote suodatetaan eroon ja kuivataan tyhjössä.

Saanto: 10,4 g

Rf: 0,40 (n-butanoli/etikkahappo/vesi, 3:1:1) 5 MS (ES*) : 507,3 (M + H)*.

Esimerkki 33 3-bentsyy1ioksimetyy1i-2,4-dihydroksi-5-metyy1ipy-rimidiinietikkahappo 3-bentsyylioksimetyylityminyylietikkahappo 10 13,65 g 3-bentsyylioksimetyyli-2,4-dihydroksi-5- metyylipyrimidiinietikkahappoetyyliesteriä liuotetaan seokseen, jossa on 400 ml dioksaania, 200 ml vettä, 100 ml metanolia ja 40 ml 1 N NaOH-liuosta. 2 tunnin sekoituksen huoneenlämpötilassa jälkeen saippuoituminen on päättynyt. 15 Seos haihdutetaan tyhjössä pyöröhaihduttimessa noin 200 ml:n tilavuuteen, siihen lisätään 200 ml vettä ja uutetaan kerran 100 ml:11a etyyliasetaattia (heitetään pois). Vesi-faasin pH säädetään 1 N HCl:llä l,5:een ja uutetaan kolmasti 100 ml:11a etyyliasetaattia. Etyyliasetaattifaasit 20 yhdistetään ja kuivataan natriumsulfaatilla. Kuivausaine suodatetaan eroon, minkä jälkeen suodos haihdutetaan kuiviin. Jäljelle jää sitkeä öljy, jota käytetään sellaisenaan seuraavassa reaktiossa. Pitkän seisotusajan kuluessa öljy kiinteytyy, 25 Saanto: 11,35 g

Rf: 0,64 (2-butanoni/pyrldiini/vesi/etikkahappo, 70:15:15:2) MS (ES*): 305,2 (M + H)*.

Esimerkki 34 30 N- (3-bentsyylioksimetyyli-2,4-dihydroksi-5-metyyli- pyrimidin-l-yyliasetyyli) -N-2- (9-fluorenyylimetyylioksi-karbonyyliamino)etyyliglysiinimetyyliesteri (Fmoc-Äeg(TBo“) -OMe) 3,04 g 3-bentsyylioksimetyyli-2,4-dihydroksi-5-me-35 tyylipyrimidiinietikkahappoa liuotetaan 100 ml:aan kuivaa 42 DMF:ää ja lisätään toisiaan seuraten 3,9 g Fmoc-Aeg-OMe·-HCl:ää, 3,28 g TOTU:a sekä 5,1 ml di-isopropyylietyyli-amiinia. Seosta sekoitetaan 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen se haihdutetaan tyhjössä pyöröhaih-5 duttimessa kuiviin. Jäännös lietetään etyyliasetaattiin ja uutetaan kolmasti sekä natriumvetykarbonaatti- että ka-liumvetysulfaattiliuoksella. Orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatilla, minkä jälkeen kuivausaine suodatetaan eroon ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäljelle jäänyttä 10 vaahtoista jäännöstä trituroidaan petrolieetterissä, se suodatetaan imulla eroon ja kuivataan tyhjössä.

Saanto: 4,68 g

Rf: 0,75 (n-butanoli/etikkahappo/vesi, 3:1:1) MS (ES+): 641,4 (M + H)\ 15 Esimerkki 35 N- (3-bentsyylioksimetyyli-2,4-dihydroksi-5-metyyli-pyrimidin-l-yyliasetyyli ) -N-2- (9-fluorenyylimetyylioksi-karbonyyliamino)etyyliglysiini (Fmoc-Äeg(TBo“) -OH) 2,3 g Fmoc-Aeg( ΤΒθ!")-0Μβ: tä liuotetaan seokseen, 20 jossa on 30 ml dioksaania ja 15 ml vettä, ja saippuoidaan lisäämällä pieninä erinä 7,36 ml 1 N NaOH-liuosta. Reaktion päätyttyä puskuroidaan lisäämällä pinei määrä kiinteää hiilidioksidia ja osittain tapahtunut Fmoc-pilkkomi-nen tehdään palautuvaksi lisäämällä 0,41 g Fmoc-ONSU:ta. 25 Sitten seos suodatetaan, dioksaani tislataan tyhjössä pyöröhaihduttimessa eroon, jäännöstä laimennetaan 30 ml:11a vettä ja uutetaan vielä alkalista liuosta kerran etyyliasetaatilla. Vesifaasin pH säädetään 1 N HCl:llä 3:ksi, jolloin tuote saostuu. Seisotuksen yön yli kylmä-30 tilassa 4 °C:ssa jälkeen sakka suodatetaan imulla eroon ja kuivataan tyhjössä. Suodoksesta saostuu haihdutuksessa pieneen tilavuuteen lisää tuotetta.

Saanto: 1,47 g

Rf: 0,37 (n-butanoli/etikkahappo/vesi, 3:1:1) 35 MS (ES*): 627,2 (M + H)\ 43 PNä-synteesit

Esimerkki 36 H- (Aeg(T) )8-Lys-NH2 (C4gH127N35033, FG 2275,26)

Synteesi tapahtuu aminometyylipolystyreenihartsil-5 la käyttäen ankkuriryhmänä 5-(Fmoc-amino-4-metoksibentsyy-li)-2,4-dimetoksifenyylipropionihappoa yrityksen fa.

Abimed monipeptidisyntetisaattorissa.

14,7 mg (10 pmol) Fmoc-amidiankkurihartsia turvotetaan DMF:ssä ja panostetaan monipeptidisyntetisaattorin 10 reaktioastiaan. Synteesissä käytetään seuraavia reaktio- liuoksia: 1) aktivaattoriliuos: 0,876 molaarinen PyBOP-liuos kuivatussa DMF:ssä 2) aktivointiemäs: 3,95 molaarinen NEM-liuos kuiva- 15 tussa DMF:ssä 3) Fmoc-Lys(Boc)-OH: 0,65 molaarinen liuos kuivatussa DMF:ssä 4) Fmoc-Aeg(T)-0H: 250 mg 1 ml:ssa kuivattua DMF:ää 5) piperidiini: 20-%:inen liuos DMF:ssä.

20 Fmoc-pilkkomisen piperidiiniliuoksella ja pesun DMF:llä jälkeen aktivaattoriliuos, Fmoc-johdannainen ja emäs lisätään reaktioastiaan hartsiin, josta on suojaryh-mä poistettu. Kytkentäaika on 40 minuuttia. 28 minuutin reaktioajan jälkeen lisätään 100 μΐ dikloorimetaania. 25 Sitten hartsi pestään 5 kertaan DMF:llä ja on valmis seu-raavaan piperidiinikäsittelyyn. Viimeisen Fmoc-pilkkomisen jälkeen hartsi kuivataan ja sitä käsitellään pieninä erinä kaikkiaan 4 ml:11a 95-%:ista TFA:ta (noin 2,5 tuntia). TFA-liuos haihdutetaan tyhjössä eroon ja jäännös liuote-30 taan 250 pl:aan TFA:ta. Tämä liuos jaetaan 5 Eppendorf-astiaan ja saostetaan kulloinkin 600 pl;lla metyyli-tertbu-tyylieetteriä. Sakka sedimentoidaan sentrifugoimalla, minkä jälkeen supernatantti dekantoidaan eroon. Sakka suspen-doidaan pieneen määrään metyyli-tert-butyylieetteriä ja 35 sedimentoidaan toistamiseen sentrifugoimalla, minkä jäi- 44 keen jälleen supernatantti dekantoidaan eroon. Tämä käsittely toistetaan vielä kerran, minkä jälkeen tuote kuivataan tyhjössä. Puhdistaminen tapahtuu kromatografisesti Mono Qh -kolonnissa (Fa. Pharmacia, Munzingen) käyttäen 5 0,17 - 0,44 M natriumkloridigradienttia 10 mM NaOH-liuok- sessa (pH 12) ja poistamalla suolat ultrasuodatuksella. Saanto: 198 O.D.260 MS (FAB, AcOH/NBA): 2298 (M + Na)\

Esimerkki 37 10 H- (Aeg(TtriatBOl°) )8-Lys-NH2 (C110H134NS8026, FG 2682,65)

Synteesi tapahtuu aminometyylipolystyreenihartsil-la käyttäen 5-(Fmoc-amino-4-metoksibentsyyli)-2,4-dimetok-sifenyylipropionihappoa ankkuriryhmänä ja ABI-DNA-syntetisaattoria 380B. Suoritetaan 14,7 mg:n (10 pmmol) Fmoc-15 amidiankkurihartsia konversio synteesikolonneissa lisää mällä seuraavia liuoksia ohjelmaohjatusti: asema 1: Fmoc-Lys(Boc)-0H: 0,66 molaarinen liuos DMF:ssä asema 2: Fmoc-Aeg(TtriatEOl°)-0H: 735 mg 2 ml:ssa kui-20 vattua DMF:ää asema 5: seos, jossa on 1,35 ml NEM:ää ja 1,7 ml DMF:ää (3,46 molaarinen) asema 6: PyBOP: 0,91 molaarinen liuos kuiv. DMF:ssä asema 14: 20 % piperidiiniä DMF:ssä 25 asema 16: DMF:ää hartsin pesua varten asema 17: DMF:ää (kuivattua) reaktiota varten Lähtömäärät säädetään virtausnopeudella 5-kertai-seksi ylimääräksi lysiini- tai aminoetyyliglysiinijohdannaisen suhteen. Kytkentä tapahtuu kulloinkin kahdesti. 30 Yhdisteen lohkaisemiseksi hartsista painetaan kaikkiaan noin 5 ml 90-%:ista TFA:ta 2 tunnissa manuaalisesti kolonnin läpi. TFA haihdutetaan tyhjössä eroon, jäännös liuotetaan 300 pl:aan TFA:ta ja tämä liuos jaetaan 6 Eppendorf-putkeen. Tuote saostetaan lisäämällä kulloinkin 1 ml me-35 tyyli-tert-butyylieetteriä. Sakka sedimentoidaan sentrifu- 45 goimalla, minkä jälkeen supernatantti dekantoidaan eroon. Sakka suspendoidaan pieneen määrään metyyli-tert-butyyli-eetteriä, minkä jälkeen se sedimentoidaan sentrifugoimalla toistamiseen ja dekantoidaan jälleen supernatantti eroon.

5 Tämä menettely toistetaan vielä kerran, minkä jälkeen tuote kuivataan tyhjössä. Lopuksi sakka suspendoidaan vielä kerran metyyli-tert-butyylieetteriin, sentrifugoidaan eroon ja kuivataan.

Saanto: 270 O.D.260 10 MS (FAB, TFA/NBA): 2684 (M+).

Esimerkki 38 H- (Aeg(C) )7-Lys-NH2 {C76H106N38022, FG 1903,92)

Synteesi suoritetaan kuten kuvataan esimerkissä 36, jolloin kuitenkin käytetään 750 mg Fmoc-Aeg(CMmt)-OH:ta, 15 jota käytetään 1,5 ml:aan kuivattua DMF:ää liuotettuna.

Lohkaiseminen ja säestäminen tapahtuvat kuten edellä kuvataan.

Saanto: 16 mg tai 218 O.D.260 MS (FAB, TFA/NBA): 1905 (M + H) + .

20 Esimerkki 39

Ac-Äeg(A) -Aeg(C) -Aeg(A) - Aeg(T) -Aeg (C) -Aeg(A) - Aeg-(T) - Aeg(G) - Aeg(G) - Aeg(T) - Aeg(C) - Aeg(G) -Lys-NH2 (C137H176N72-03e, FG 3439,39) PNA-synteesi tapahtuu Ecosyn D-300 -DNA-synteti- 25 saattorissa (Fa. Eppendorf/Biotronik, Maintail) käyttäen 100 mg (5 pmmol) 5-(Fmoc-amino-4-metoksibentsyyli)-2,4-dimetoksifenyylipropionihapolla ankkuriryhmänä kuormattua aminopropyyli-CPG:tä.

Synteesiin käytetään seuraavia liuoksia: 30 1) aktivaattoriliuos: 0,3 molaarinen HATU-liuos kuivatussa DMF:ssä 2) aktivointiemäs: 0,3 molaarinen NEM-liuos kuivatussa DMF:ssä 3) Fmoc-Lys(Boc)-OH: 0,3 molaarinen liuos DMF:ssä 46 4) Fraoc:n pilkkominen: 20~%:inen piperidiiniliuos DMF:ssä 5) Fmoc-Aeg(T)-OH: 0,3 molaarinen liuos kuivatussa DMF:ssä 5 6) Fmoc-Aeg( AMmt)-OH: 0,3 molaarinen liuos kuivatus sa DMF:ssä 7) Fmoc-Aeg(CMrat)-OH: 0,3 molaarinen liuos kuivatussa DMF:ssä 8) Fmoc-Aeg(GMmt)-OH: 0,3 molaarinen liuos kuivatus-10 sa DMF:ssä

Fmoc-pilkkomisen piperidiiniliuoksella ja pesun DMF:llä jälkeen aktivaattoriliuos, Fmoc-johdannainen ja emäs lisätään reaktioastiassa kantajaan, josta on suoja-ryhmä poistettu. Kytkentäaika on 20 minuuttia. Sitten CPG 15 pestään 5 kertaan DMF:llä ja on valmis seuraavaan piperi-diinikäsittelyyn. Synteesin päättämisen jälkeen PNA-CPG-kantaja kuivataan ja sitä jatkotyöstetään kuten edellä kuvataan.

Saanto: 210 O. D. 260 20 MS 3439,4 (ES*): (M) +

Esimerkki 40 H-Asp-Aeg(C)-Aeg(C)-Aeg(A)-Aeg(T)-Aeg(G)-Aeg(G)-Aeg (T) -Aeg(C) -Aeg (C) -Aeg (C) -Asp-NH2- (CH2) 6-0H (C119H157N57038, FG 2993,94) 25 PNA-synteesi tapahtuu Ecosyn D-300 -DNA-synteti- saattorissa (Fa. Eppendorf/Biotronik, Maintail) käyttäen 133 mg (5 pmmol) 6-metyyliaminoheks-l-yylihemisukkinaatil-la kuormattua aminopropyyli-CPG:ta.

Synteesiin käytetään seuraavia liuoksia: 30 1) aktivaattoriliuos: 0,3 molaarinen HATU-liuos kuivatussa DMF:ssä 2) aktivointiemäs: 0,3 molaarinen NEM-liuos kuivatussa DMF:ssä 3) Fmoc-Asp(0tBu)-0H: 0,3 molaarinen liuos DMF:ssä 47 4} Fmoc:n pilkkominen: 20-%:inen piperidiiniliuos DMF:ssä 5) Fmoc-Aeg(T)-0H: 0,3 molaarinen liuos kuivatussa DMF:SSä 5 6) Fmoc-Aeg(AMmt)-OH; 0,3 molaarinen liuos kuivatus sa DMF:ssä 7) Ftnoc-Aeg(CMrat)-0H: 0,3 molaarinen liuos kuivatussa DMF:ssä 8) Fmoc-Aeg(GMt"t)-OH: 0,3 molaarinen liuos kuivatus- 10 sa DMF:ssä

Fmoc-pilkkomisen piperidiiniliuoksella ja pesun DMF:llä jälkeen aktivaattoriliuos, Fmoc-johdannainen ja emäs lisätään reaktioastiassa kantajaan, josta on suoja-ryhmä poistettu, Kytkentäaika on 20 minuuttia. Sitten CPG 15 pestään 5 kertaan DMF:llä ja on valmis seuraavaan piperi-diinikäsittelyyn. Synteesin päättämisen jälkeen PNA-CFG-kantaja kuivataan, minkä jälkeen sitä käsitellään ensin 3-%:isella trikloorietikkahapolla emästen Mmt-suojaryhmien ja sitten 60-%:isella TFArlla dikloorimetaanissa aspara-20 giinihappojen tert-butyyliryhmien poistamiseksi. Käsitte lemällä kons. ammoniakkiliuoksella 65 °C:ssa PNA lohkaistaan sitten kantajasta ja jatkotyöstetään edellä kuvatun mukaisesti.

Saanto: 100 O.D.260 25 MS 2994,4 (ES+): (M + H)\

Claims (18)

48

1 II

10 R°-( A)k-i N-CH2-CH2-N-CH2-CJn-(Q),-Q° H j ossa R° on vety, Ci-i8-alkanoyyli, Ci-i8-alkoksikarbonyyli, C3-8-sykloalkanoyyli, C7-i5-aroyyli, C3-i3-heteroaroyyli tai 15 ryhmä, joka suosii oligomeerin solunsisäistä ottoa, tai joka hybridisaation yhteydessä on vuorovaikutuksessa koh-deaminohapon kanssa; A on aminohappotähde; k on kokonaisluku 0 - 20; 20. on aminohappotähde; 1 on kokonaisluku 0 - 20; B on nukleotidikemiassa tavallinen nukleoemäs tai sen esilääkemuoto; Q° on hydroksi, MH2 tai NHR", jossa R" on Ci-i8-25 alkyyli, C2-i8-aminoalkyyli tai C2-i8-hydroksialkyyli; ja n on kokonaisluku 1 - 50; tunnettu siitä, että a) i) polymeerikantajaan, jonka kaava on II: 30 L-[polymeeri] (II) joka on varustettu ankkuriryhmällä L, joka sisältää latenttina tähteen Q°, kytketään kiinteätaasisynteesille 35 tavanomaisella menetelmällä aminohappoja (Q1) ja näin välituotteena muodostuvaan yhdisteeseen, jonka kaava on III: 49 (Q1) i-L-[polymeeri} (III) jossa L määritellään kuten edellä, Q' on aminohappo 5 Q, jonka mahdollisesti läsnäolevat sivuketjufunktiot on suojattu, ja 1 on kokonaisluku 0 - 20, tai suoraan polymeerikantajaan, jonka kaava on II, ii) kytketään yhdiste, jonka kaava on IV: 10 j* ' V 0 (IV), PG—n·—v n H X0H jossa

15 PG on emäslabiili aminon suojaryhmä ja B1 on nukleoemäs, jonka eksosyklinen aminofunktio on suojattu suojaryhmällä, joka on yhteensopiva emäslabii-lin aminon suojaryhmän kanssa, käyttämällä peptidikemiassa tavanomaisia kytkentäreagensseja; 20 b) lohkaistaan tilapäinen emäslabiili suojaryhmä PG sopivalla reagenssilla, c) toistetaan vaiheet a ii ja b {n - 1) kertaa, d) kytketään kiinteätaasisynteesille tavanomaisilla menetelmillä lisää aminohappoja A', jotka määritellään ku- 25 ten A, jolloin niiden sivuketju on kuitenkin mahdollisesti suojattu, ja sitten, siinä tapauksessa, että R° ei ole vety, lisätään tähde R° tavanomaisella menetelmällä, e) välituotteena saadusta yhdisteestä, jonka kaava on Ia: B ' 30 ! C H j (la), f'0 0 l ii R°-(Al)k-iH-CH2-CH2-H-CH2-C)tt“(0,),-L- [polymeeri] H 35 jossa R°, A', k, B1, n, Q1 ja 1 määritellään kuten edellä ja L on ankkuriryhmä, 50 lohkaistaan kaavan I mukainen yhdiste polymeerikan-tajasta käyttämällä lohkaisureagenssia, jolloin samanaikai-sesti tai myös seuraavaksi nukleoemästen eksosyklisessä aminofunktiossa ja aminohappojen sivuketjuissa mahdollises-5 ti läsnäolevat suojaryhmät lohkaistaan pois.

1. Menetelmä PNA-oligomeerien valmistamiseksi, joiden kaava on I: 5 8 C H 2 I (!), f'0 0

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä PNA-oligomeerien valmistamiseksi, joiden kaava on I, tunnettu siitä, että kaavassa I A on aminohappotähde ryhmästä glysiini, leusiini, 10 histidiini, fenyylialaniini, kysteiini, lysiini, arginiini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, proliini, tetrahydro-kinoliini-3-karboksyy1ihappo, okt ahydroi ndoli-2 -karboksyy-lihappo ja N- (2-aminoetyyli)glysiini; k on kokonaisluku 0 - 10; 15. on aminohappotähde ryhmästä glysiini, leusiini, histidiini, fenyylialaniini, kysteiini, lysiini, arginiini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, proliini, tetrahydro-kinoliini-3-karboksyylihappo, oktahydroindoli-2-karboksyy-lihappo ja N-(2-aminoetyyli)glysiini; 20. on kokonaisluku 0 - 10; B on luonnollinen nukleoemäs ryhmästä adeniini, sy-tosiini, guaniini, tyrniini ja urasiili, tai ei-luonnollinen nukleoemäs ryhmästä puriini, 2,6-diaminopuriini, 7-deatsa-adeniini, 7-deatsaguaniini, N4N4-etanosytosiini, N6N6~etano-25 2,6-diaminopuriini, 5-metyylisytosiini, 5-C3-<>-alkinyyliura- siili, 5-C3-6-alkinyylisytosiini, 5-fluoriurasiili, pseu-doisosytosiini ja 2-hydroksi-5-metyyli-4-triatsolopyrimi-diini tai niiden esilääkemuoto,- ja n on kokonaisluku 4 - 35.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että käytetään kaavan IV mukaista yhdistettä, jossa PG ja B' merkitsevät samaa kuin patenttivaatimuksessa 1 ja joka valmistetaan siten, että yhdiste, jonka kaava on V: 35 51 p°-r^^0/R' n,, 5 jossa PG on emäslabiili aminon suojaryhmä ja R1 on esterisuojaryhmä, saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jonka kaava on VI:

10 B· (VI), OH j ossa

15 B1 on nukleoemäs, jonka eksosyklinen aminofunktio on suojattu emäslabiilin aminon suojaryhmän kanssa yhteensopivalla suojaryhmällä, 0-45 °C:ssa sopivassa liuottimessa tai tällaisten liuottimien seoksessa käyttäen peptidikemiassa tavallista 20 kytkentäreagenssia, jolloin saadaan yhdiste, jonka kaava on VII: V o IVI"'

25. U jossa PG, B' ja R1 määritellään kuten edellä, minkä jälkeen esterisuojaryhmä R1 lohkaistaan pois käyttäen alkalilipeää tai myös entsymaattisesti esteraasien 30 tai lipaasien avulla 0-50 °C:ssa sopivassa liuottimessa tai tällaisten liuottimien seoksessa.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdiste, jonka kaava on V, jossa

35 PG on emäslabiili aminon suojaryhmä ja 52 R1 on esterisuojaryhmä ryhmästä metyyli, etyyli, butyyli, 2-(metoksietoksi)etyyli ja bentsyyli, saatetaan reagoimaan kaavan VI mukaisen yhdisteen kanssa, jossa

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään kaavan IV mukaista yhdistettä, jossa PG ja B' merkitsevät samaa kuin patenttivaatimuksessa 1 ja joka valmistetaan siten, että yhdiste, 25 jonka kaava on V: H 0 PG—N x /H X. X (V), H 0 30 jossa PG on emäslabiili aminon suojaryhmä ja R1 on vety tai tilapäinen silyylisuojaryhmä, 35 saatetaan reagoimaan yhdisteen kanssa, jonka kaava on VIII: 53 B' - CH2 - CO - R2 (VIII) jossa B1 määritellään kuten edellä ja 5 R2 on halogeeni tai aktiiviesteritähde, 0-40 °C:ssa sopivassa liuottimessa tai tällaisten liuottimien seoksessa.

5 B' on nukleoemäs, jonka eksosyklinen aminofunktio on suojattu heikkojen tai keskivahvojen happojen suhteen labiililla suojaryhmällä, joka on uretaanityyppiä tai tri-tyylityyppiä, huoneenlämpötilassa liuottimessa ryhmästä DMF, ase-10 tonitriili ja dikloorimetaani tai näiden liuottimien seoksessa käyttäen karbodi-imidejä, fosfoniumreagensseja, uroniumreagensseja, happohalogenideja tai aktivoituja este-reitä, jolloin saadaan kaavan VII mukainen yhdiste, jossa

15 PG, B' ja R1 määritellään kuten edellä, minkä jälkeen esterisuojaryhmä R1 lohkaistaan pois käyttäen alkalilipeää tai myös entsymaattisesti esteraasien tai lipaasien avulla 0-50 °C:ssa liuottimessa ryhmästä dioksaani, vesi, tetrahydrofuraani, metanoli ja vesi tai 20 näiden liuottimien seoksissa.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 10 yhdiste, jonka kaava on V, jossa PG on emäslabiili aminon suojaryhmä edeltävässä merkityksessä ja R1 on vety tai trimetyylisilyyli, saatetaan reagoimaan kaavan VIII mukaisen yhdisteen 15 kanssa, jossa B' määritellään kuten edellä ja R2 on fluori, kloori, bromi tai aktiiviesteritähde ryhmästä OBt, OObt, OPfp ja ONSu, 20 - 30 °C:ssa liuottimessa ryhmästä DMF, NMP, ase-20 tonitriili ja dikloorimetaani tai näiden liuottimien seoksissa .

7. Yhdisteet, tunnetut siitä, että niiden kaava on IV: B '

25 V 0 PG—N—v N Λ. V^' H OH jossa PG on emäslabiili aminon suojaryhmä ja 30 B' on nukleoemäs, jonka eksosyklinen aminofunktio on suojattu emäslabiilin aminon suojaryhmän kanssa yhteensopivalla suojaryhmallä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen yhdiste, jonka kaava on IV, tunnettu siitä, että

35 PG on Fmoc-, Bnpeoc- tai Dnpeoc-suojaryhmä ja 54 B1 on nukleoemäs, jonka eksosyklinen aminofunktio on suojattu heikkojen tai keskivahvojen happojen suhteen labiililla suojaryhmällä, joka on uretaanityyppiä tai tri-tyylityyppiä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen yhdiste, jonka kaava on IV, tunnettu siitä, että PG on Fmoc-suojaryhmä ja B' on nukleoemäs, jonka eksosyklinen aminofunktio on suojattu heikkojen tai keskivahvojen happojen suhteen 10 labiililla suojaryhmällä, joka on uretaanityyppiä tai tri-tyylityyppiä, 55