JP4098837B2 - 弱酸に不安定であるアミノ保護基を使用するｐｎａの合成 - Google Patents
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Description
【０００１】
ペプチドまたはポリアミド核酸（ＰＮＡｓ）は、デオキシリボースフォスフェート主鎖が、ペプチドオリゴマーにより置換されたＤＮＡ−類似化合物である。モノマーのアミノ基を一時的に保護するために、これまで文献〔Michael Egholm, Peter E. Nielsen, Ole BuchardtおよびRolf H. Berg, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 9677-9678；Ole Buchardt, Michael Egholm, Peter E. NielsenおよびRolf H. Berg. WO 92/20702〕に記載されている合成は、例えばトリフルオロ酢酸のような中程度の酸〜強酸により開裂される酸−不安定な第３ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基を使用する。オリゴマーの固相合成は、例えばMerrifield 〔B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149〕により記載されているような慣用のペプチド合成方法と同様にして実施される。ＰＮＡオリゴマーは、慣用的に強酸である液状の弗化水素を使用して、固体担体から開裂される。トリフルオロ酢酸による反復処理および弗化水素を使用する次の開裂は、ヌクレオチド結合がこれらの条件下で安定でないために、混合ＰＮＡ／ＤＮＡ配列の合成と両立しない。特に、プリンヌクレオチド、デオキシグアノシンおよびデオキシアデノシンは、Ｎ−グリコシド結合において強酸により急速に開裂される。さらに、このような分子の合成に対して、慣用のＤＮＡ合成装置を使用しそしてこの装置において使用される化学作用を大部分保持することは特に望ましい。
【０００２】
本発明の目的は、弱酸に不安定である一時的なアミノ保護基を使用してＰＮＡオリゴマーを構成する合成方法を開発せんとするものである。この方法は、オリゴヌクレオチドに対して慣用的に使用されているアルカリ性条件下でオリゴマーが固体の支持体から開裂されることを可能にする。
【０００３】
本発明は、
（ａ） はじめに、固相合成において慣用的に使用されている方法を使用して、潜在的にＱoを有するアンカー基Ｌを具備した式II
Ｌ−〔重合体〕 （II）
の重合体支持体上にアミノ酸（Ｑ′）をカップリングさせ、
（ｂ） 適当な試薬を使用して弱酸に不安定である保護基ＰＧを開裂し、
（ｃ） 工程（ａ）および（ｂ）を（ｌ−１）回反復し、
（ｄ） ペプチド化学において慣用的に使用されているカップリング試薬を使用して、中間体として形成された式III
（Ｑ′)l−Ｌ−〔重合体〕 （III）
（式中、Ｌは上述した通りであり、Ｑ′は場合によっては側鎖において保護されていてもよいアミノ酸Ｑでありそしてｌは０〜１０の整数である）の化合物上に式IV
【０００４】
【化５】
〔式中、ＰＧは、弱酸に不安定であるアミノ保護基であり、Ｂ′／Ｘは、場合によっては環外アミノまたはヒドロキシ官能基において保護されていてもよいヌクレオチド塩基を有することを条件として式Ｉにおいて定義したような単位であり、Ｂ′は、ヌクレオチド化学において慣用的に使用されている塩基、例えばアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルのような天然塩基またはプリン、２,６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ4Ｎ4−エタノシトシン、Ｎ6Ｎ6−エタノ−２,６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニル−ウラシル、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシルまたはプソイドイソシトシンのような非天然塩基（これらの塩基の環外アミノまたはヒドロキシル基は、場合によっては適当な既知の保護基、例えばベンゾイル、イソブタノイル、アセチル、フェノキシアセチル、４−（ｔ−ブチル）ベンゾイル、４−（ｔ−ブチル）フェノキシアセチル、４−（メトキシ）ベンゾイル、２−（４−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、２−（２,４−ジニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、ジフェニルカルバモイルまたはホルムアミジン基、好ましくはベンゾイル、イソブタノイル、４−（ｔ−ブチル）ベンゾイル、２−（４−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、２−（２,４−ジニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、２−フルオレニルメトキシカルボニル基によって、そしてグアニンの場合においては、６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル基と２−Ｎ−アセチルとの組み合わせにより保護されていてもよい）であるかまたはさもなければ例えばイミダゾール、ニトロイミダゾールおよびトリアゾールのような塩基代替化合物である〕の化合物をカップリングさせるか、または式IIの重合体支持体上に直接式IVの化合物をカップリングさせ、
【０００５】
（ｅ） 適当な試薬によって弱酸に不安定である一時的保護基ＰＧを開裂し、
（ｆ） 工程（ｄ）および（ｅ）を（ｎ−１）回反復し、
（ｇ） 固相合成において慣用的に使用されている方法を使用して、さらにアミノ酸（Ａ′）をカップリングさせ、
（ｈ） 適当な試薬を使用して、弱酸に不安定である保護基ＰＧを開裂し、
（ｉ） 工程（ｇ）および（ｈ）を（ｋ−１）回反復し、
（ｊ） Ｒoが水素でない場合においては、慣用の方法によって基Ｒoを導入し、そして
（ｋ） 開裂試薬を使用して、中間体として得られた式Ｉａ
【０００６】
【化６】
（式中、Ｒo、ｋ、Ｂ′／Ｘ、ｎ、Ｑ′およびｌは上述した通りであり、Ａ′は、場合によっては側鎖において保護されていてもよいアミノ酸ＡでありそしてＬはアンカー基である）の化合物の重合体支持体から式Ｉの化合物を開裂し、そしてこの方法中に、場合によってはヌクレオチド塩基の環外アミノまたはヒドロキシル官能基上におよびアミノ酸の側鎖上に存在していてもよい保護基を同時にまたは引き続き開裂することからなる式Ｉ
【化７】
〔式中、
Ｂ／Ｘは、
【０００７】
【化８】
好ましくは
【０００８】
【化９】
（式中、ｆは１〜４、好ましくは１または２でありそしてｇは０〜３、好ましくは０〜２である）であり；
Ｒoは、水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルカノイル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシカルボニル、Ｃ3〜Ｃ8−シクロアルカノイル、Ｃ7〜Ｃ15−アロイル、Ｃ3〜Ｃ13−ヘテロアロイルまたはオリゴマーの細胞内取込みを有利にするかまたはハイブリダゼーション中に標的核酸と相互作用する基であり；
Ａは、好ましくはグリシン、ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システィン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸およびＮ−（２−アミノエチル）グリシンからなる系からのアミノ酸基であり；
【０００９】
ｋは、０〜１０、好ましくは０〜６の整数であり；
Ｑは、好ましくはグリシン、ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システィン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸およびＮ−（２−アミノエチル）グリシンからなる系からのアミノ酸基であり；
ｌは、０〜１０、好ましくは０〜６の整数であり；
Ｂは、ヌクレオチド化学において慣用のヌクレオチド塩基、例えば天然のヌクレオチド塩基、例えばアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルまたは非天然のヌクレオチド塩基、例えばプリン、２,６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ4Ｎ4−エタノシトシン、Ｎ6,Ｎ6−エタノ−２,６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルウラシル、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシルまたはプソイドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジンまたはこれらのプロドラッグ形態または塩基代替化合物、例えばイミダゾール、ニトロイミダゾールおよびトリアゾールであり；
【００１０】
Ｑ°は、ヒドロキシル、ＮＨ2またはＮＨＲ″（式中、Ｒ″はＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ2〜Ｃ18−アミノアルキルまたはＣ2〜Ｃ18−ヒドロキシアルキルである）であり；そして
ｎは、１〜５０、好ましくは４〜３５の整数である〕のＰＮＡオリゴマーの製法に関するものである。
【００１１】
以下に示されたＰＮＡに対する合成スキームは、本発明の方法のコースを示す。
【００１２】
【化１０】
【００１３】
オリゴマーの細胞内取込みを有利にする基は、例えば−(ＣＨ2)x−ＣＨ3（式中、ｘは６〜１８の整数である）、−(ＣＨ2)n−ＣＨ＝ＣＨ−(ＣＨ2)m−ＣＨ3（式中、ｎおよびｍは、相互に独立して６〜１２の整数である）、−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)4−(ＣＨ2)9−ＣＨ3、−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)8−(ＣＨ2)13−ＣＨ3および−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)7−(ＣＨ2)15−ＣＨ3のような種々な親油性基を有するアルカノイルまたはアルコキシカルボニル化合物、そしてまたステロイド、例えばコレステリルまたはビタミン、例えばビタミンＥ、ビタミンＡまたはビタミンＤおよび天然のキャリア（carrier）系、例えば胆汁酸、葉酸、２−（Ｎ−アルキル、Ｎ−アルコキシ）アミノアントラキノンを利用する他のコンジュゲートおよびＥＧＦ（上皮成長因子）、ブラジキニンおよびＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）のようなオリゴマーの受容体−仲介エンドサイト−シスを生ずる相当する受容体のペプチドとマンノースのコンジュゲートである。
【００１４】
標識基は、例えばダンシル（Ｎ−ジメチル−１−アミノナフチル−５−スルホニル）、フルオレセインまたはクマリン誘導体の蛍光基または例えばアクリジン誘導体の化学蛍光基（Chemiluminescent group）、ならびに、ＥＬＩＳＡを経て検出できるジゴキシゲニン系、ビオチン／マビジン系を経て検出できるビオチン基またはさもなければ、ときによっては後の点において検出可能なリポーター基による誘導化を可能にする官能基を有するリンカーアーム（linker arms）、例えばアクリジニウム活性エステルと反応して化学蛍光プローブを与えるアミノアルキルリンカーを意味するものとして理解されるべきである。典型的な標識基は、次の通りである。
【００１５】
【化１１】
【００１６】
標的核酸とオリゴマーとのバイブリダゼーションによって、結合、架橋形成または開裂により標的核酸を攻撃する基は、例えばアクリジン、プソラレン、フェナントリジン、ナフトキノン、ダウノマイシンまたはクロロエチルアミノアリールコンジュゲートである。典型的な介在（intercalating radical）および架橋形成ラジカルは、次の通りである。
【００１７】
【化１２】
【００１８】
【化１３】
潜在的に官能基Ｑoを含有するアンカー基Ｌは、例えばGeorge Barany, Nancy Kneib-CordonierおよびDaniel G. Mullen., Int. J. Peptide Protein Res., 1987, 30, 705-739により記載されている。
【００１９】
アンカー基を具備しそして潜在的に基Ｑoを含有する重合体支持体は、例えばｐ−ニトロベンゾフェノンオキシム／ポリスチレン樹脂（E.T. Kaiser, S.H. Nakagawa, J. Org. Chem. 1983, 48, 678-685）、４−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）ベンゾイル樹脂または第一アミノ基により官能化されそしてこれに対して、例えば４−ヒドロキシメチル安息香酸〔E. Atherton, C.J. Logan, R.C. Sheppard, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 538-546 (1981)〕、９−ヒドロキシメチルフルオレン−４−カルボン酸〔M. Mullen, D. Bellof, Helv. Chim. Acta 67, 2009-2016 (1984)〕、４−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）安息香酸〔R. Schwyzer, E. Felder, P. Failli, Helv. Chim. Acter 67, 1316-1327 (1984)〕、（９−（ヒドロキシメチル）−２−フルオレニル酢酸〔Y.Z. Liu, S.H. Ding, J.Y. Chu, A.M. Felix, Int. J. Peptide Protein Res. 25, 95-98 (1990)〕、Ｎ−〔９−（ヒドロキシメチル）−２−フルオレニル〕コハク酸モノアミド、４−（２−ヒドロキシエチル）−３−ニトロ安息香酸〔F. Albericio, E. Giralt, R. Eritja, Tetrahedron Lett. 1991, 1515-1518)、モノ（アミノ−Ｃ2〜Ｃ16）アルキルサクシネート、モノ（アミノ−Ｃ2〜Ｃ16）アルキルオキザレートなどのような潜在的に基Ｑoを含有するアンカー基の一つがカップリングされている例えば Rpoly HIPE、RTentagel、RControlled Pore Glass、ポリスチレンのような重合体支持体である。
【００２０】
好ましくは、以下のアンカー基またはすでに重合体支持体に結合されているアンカー基が使用される。
ｐ−ニトロベンゾフェノンオキシム／ポリスチレン樹脂、４−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）ベンゾイル樹脂または潜在的に基Ｑoを含有しそして第一アミノ基で官能化されたTentagel、Controlled Pore Glassまたはポリスチレン型担体にカップリングされるアンカー基、例えば４−ヒドロキシメチル安息香酸、４−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）安息香酸、Ｎ−〔９−（ヒドロキシメチル）−２−フルオレニル〕コハク酸モノアミド、モノ（アミノ−Ｃ2〜Ｃ16）アルキルサクシネートまたはモノ（アミノ−Ｃ2〜Ｃ16）アルキルオキザレート。
【００２１】
弱酸に不安定である保護基ＰＧの例は、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエトキシカルボニル（Adpoc）、１−（３,５−ジ−第３ブチルフェニル）−１−メチルエトキシカルボニル（ｔ−Bumeoc）、１−メチル−１−（４−ビフェニル）エチルオキシカルボニル（Bpoc）、３,５−ジメトキシフェニル−２−プロピル−２−オキシカルボニル（Ddz）またはトリチル型のもの、例えばトリフェニルメチル（Trt）、（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル（Ｍｍｔ）、（４−メチルフェニル）ジフェニルメチル（Mtt）、ジ−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル（Dmt）および９−（９−フェニル）キサンテニル（pixyl）などである。Trt、MmtおよびDmtのようなトリチル型保護基が特に好ましく使用されるそしてMmt保護基が非常に好ましく使用される。
【００２２】
上記合成方法の工程ａにおいて使用されるペプチド合成において慣用的に使用されている活性化法は、例えばHouben-Weyl, Methoden der organischem Chemie〔Methods in Organic Chemistry〕、Volume 15/2, Georg Thieme Verlag Stuttgart 1974に記載されている、そしてさらに他の試薬、例えばBOP（B. Castro, J.R. Dormoy, G. EvinおよびC. Selve, Tetrahedron Lett. 1975, 1219-1222）、DYBOP（J. Coste, D. Le-NguyenおよびB. Castrs, Tetrahedron Lett. 1990, 205-208）、BroP（J. Coste, M.-N. Dufour, A. PantaloniおよびB. Castro, Tetrahedron Lett. 1990, 669-672）、PYBroP（J. Coste, E. Frerot, P. JouinおよびB. Castro, Tetrahedron Lett. 1991, 1967-1970）およびウロニウム試薬、例えばHBTU（V. Dourtoglou, B. Gross, V. Lambropoulou, C. Zioudrou, Synthesis 1984, 572-574）、TBTU、TPTU、TSTU、TNTU（R. Knorr, A. Trzeciak, W. BannwarthおよびD. Gillessen, Tetrahedron Letters 1989, 1927-1930）、TOTU（EP-A-0 460 446)、HATU（L.A. Carpino, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4397-4398）、HAPYU、TAPiPU（A. Ehrlich, S. Rothemund, M. Brudel, M. Beyermann, L.A. CarpinoおよびM. Bienert, Tetrahedron Lett. 1993, 4781-4784）、BOI（K. Akaji, N. Kuriyama, T. Kimura, Y. FujiwaraおよびY. Kiso, Tetrahedron Lett. 1992, 3177-3180）または２,４,６−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１,２,４−トリアゾリド（ＭＳＮＴ）（B. Blankemeyer-Menge, M. NimitzおよびR. Frank, Tetrahedron Lett. 1990, 1701-1704）、２,５−ジフェニル−２,３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロチオフェンジオキシド（ＴＤＯ）（R. Kirstgen, R.C. Sheppard, W. Steglich, J. Chem. Soc. Chem. Commun, 1987, 1870-1871）または活性化エステル（D. Hudson, Peptide Res. 1990, 51-55）が問題の参考文献に記載されている。
【００２３】
カルボジイミド、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドの使用が好ましい。ホスホニウム試薬例えばＰＹＢＯＰまたはＰＹＢｒｏＰおよびウロニウム試薬、例えばＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＰＴＵ、ＴＳＴＵ、ＴＮＴＵ、ＴＯＴＵ、ＨＡＴＵまたはＢＯＩもまた好ましく使用される。
カップリングは、必要に応じて例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）〔W. Koenig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 788 (1970)〕または３−ヒドロキシ−４−オキソ−３,４−ジヒドロベンゾトリアジン（ＨＯＯｂｔ）〔W. Koenig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 2034 (1970)〕の添加剤を樹脂に添加して、アミノ酸誘導体または式IVのＰＮＡモノマーを活性化試薬との付加反応に付すことによって直接行うことができる、または、単位を別個に予備活性化して活性エステルを得そして適当な溶剤中のこの活性エステルの溶液をカップリングされることのできる重合体に加えることができる。
【００２４】
保護されたヌクレオチド塩基Ｂ′の環外アミノ官能基の保護基としては、弱酸に不安定であるアミノ保護基ＰＧと両立できる保護基が使用される。好ましくは使用される保護基は、ベンゾイル、イソブタノイル、アセチル、フェノキシアセチル、４−（ｔ−ブチル）ベンゾイル、４−（ｔ−ブチル）フェノキシアセチル、４−（メトキシ）ベンゾイル、２−（４−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、２−（２,４−ジニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、ジフェニルカルバモイルまたはホルムアミジン基である。特に、ベンゾイル、イソブタノイル、４−（ｔ−ブチル）ベンゾイル、２−（４−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、２−（２,４−ジニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、４−（メトキシ）ベンゾイルまたはパラ−（ｔ−ブチル）フェノキシアセチル、パラ−ニトロフェニル−２−エチルオキシカルボニル基、そしてグアニンの場合においては、２−Ｎ−アセチルと６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル基との組み合わせが好ましい。
【００２５】
弱酸に不安定であるアミノ保護基ＰＧに対する開裂試薬の例は、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸の１〜１０％溶液、ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸の１〜１０％溶液、ジクロロメタン中のジクロロ酢酸の２〜１５％溶液またはジクロロメタン中のｐ−トルエンスルホン酸の１〜５％溶液である。他の適当な開裂試薬は、ルイス酸、例えばジクロロメタン／イソプロパノール中の三弗化硼素エーテレートまたは臭化亜鉛である。
【００２６】
式Ｉａのアミノ酸Ｑ′またはＡ′は、好ましくは式IVの化合物に対しても使用された同じアミノ保護基ＰＧを有するアミノ酸誘導体を使用してカップリングされる。アミノ酸に存在する何れの側鎖官能基も、例えば９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）または９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような塩基またはアルカリ金属水酸化物溶液に不安定である保護基を有している。好ましいアミノ酸誘導体は、例えばPG-Gly-OH, PG-Tic-OH, PG-Pro-OH, PG-Phe-OH, PG-Oic-OH, PG-Lys(Fmoc)-OH, PG-Arg(Fmoc)-OH, PG-Cys(Fm)-OH, PG-Asp(OFm)-OH, PG-Glu(OFm)-OHおよびPG-Aeg(Fmoc)-OH, PG-His(Trb)-OH（式中、ＰＧは上述した通りである）である。非常に特に好ましいアミノ酸誘導体は、Mmt-Gly-OH, Mmt-Tic-OH, Mmt-Pro-OH, Mmt-Phe-OH, Mmt-Oic-OH, Mmt-Lys(Fmoc)-OH, Mmt-Arg(Fmoc)-OH, Mmt-Cys(Fm)-OH, Mmt-Asp(OFm)-OH, Mmt-Glu(OFm)-OHおよびMmt-Aeg(Fmoc)-OH, Mmt-His(Fmoc)-OHである。
【００２７】
上述した合成方法において使用される式IV
【化１４】
の化合物、特に
【化１５】
の化合物の製造は、“塩基−不安定なアミノ保護基を使用するＰＮＡ合成”の発明の名称の同日付で出願された特許出願（ＨＯＥ ９４／ＦＯ５９，ＤＥ−Ｐ ４４ ０８ ５３５.８）に記載されている。
【００２８】
上述したＰＮＡｓは、潜在的に基Ｑoを含有するアンカー基Ｌを具備する適当な支持物質（例えばポリスチレン、ポリオキシエチレン−変性ポリスチレン、例えば RTentagel、RControlled Pore Glass）上における固相合成によって構成される。固相合成は、酸−不安定性の保護基により保護されたモノマーまたは場合によっては側鎖官能基において保護されたアミノ酸を適当な樹脂にカップリングすることによってＰＮＡのＣ−末端において開始する。
樹脂上にカップリングした単位の保護基を、上述したような適当な試薬を使用して開裂した後、次の保護された単位（ＰＮＡモノマーおよびアミノ酸誘導体）を、所望の順序で交互にカップリングさせる。中間体として形成された酸−不安定の保護基によりＮ−末端で保護されたＰＮＡ樹脂は、これらが次のＰＮＡモノマーと結合される前に上述した試薬により脱保護する。
【００２９】
上述した活性化試薬の１種によるアミノ酸誘導体のカップリングまたは活性化は、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジノン、アセトニトリルまたは塩化メチレン、または、これらの溶剤の混合物中で実施することができる。さらに上述した溶剤は、例えばピリジン、Ｎ−エチルモルホリンまたはトリエチルアミンのような補助塩基で処理することができる。活性化された誘導体は、普通１.５〜１０倍過剰で使用される。カップリングが不完全である場合においては、カップリングされた単位のアミノ基を脱保護しないでカップリング反応を反復する。
Ｒoを導入する方法は、例えばこのカルボン酸官能基を含有する場合においては、アミノ酸およびＰＮＡモノマーのカップリングについて上述した方法である。他の方法は、イソシアネート、例えばイソシアン酸フェニル、イソチオシアネート、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、クロロギ酸誘導体、例えばクロロホルミルカルバゾール、炭酸の活性エステル、例えばコレステロール−（４−ニトロフェニル）カーボネート、アクリジニウムサクシンイミジルカーボネート、スルホニルクロライド、例えばダンシルクロライドなどの反応である。
【００３０】
もし適当である場合は、式Ｉの化合物のアミノおよびカルボキシル末端は、また、さらに他の工程において、互いに結合させることもできる。この結合は、好ましくは、アミノ酸ＡまたはＱ（ＡおよびＱはＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｅｇである）の側鎖官能基の間のアミド結合を経てまたは互いに１個のアミノ酸ＡおよびＱ（ＡおよびＱはＣｙｓである）の間にジスルフィド架橋を形成することによって行われる。
【００３１】
上述した合成順序は、これまで使用されている合成プログラムを僅かに変更して、例えばペプチド合成器、マルチプルペプチド合成器およびＤＮＡ合成器のような商業的に入手できる自動合成器を使用して実施することもできる。
ＰＮＡｓが上述した方法で合成された後、ＰＮＡオリゴマーは、適当な試薬、例えば濃アンモニア溶液、エチレンジアミン、ヒドラジン、ブチルアミン、メチルアミンまたはエタノールアミンを使用して樹脂から開裂することができる。使用したリンカーおよび使用した保護基の性質によって、オリゴマーおよび核酸塩基の他の側鎖保護基が同時に開裂される。開裂試薬は、適当な溶剤、例えばアセトニトリル、エタノールまたはメタノールで希釈して使用することもできる。
【００３２】
開裂後に得られた粗製のオリゴマーの精製は、ペプチドまたはヌクレオチド化学において慣用的に使用されている方法、例えばＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィーなどによって行われる。
アミノ酸に対して使用した略号は、ペプチド化学において慣用的に使用されているEurop. J. Biochem. 138, 9 (1984)に記載されているような３文字からなるコードに相当する。使用された他の略号を以下に記載する。
【００３３】
Ａｅｇ Ｎ−（２−アミノエチル）グリシル−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−
Ａｅｇ（ＡMeOBz） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（９−（Ｎ6−４−メトキシ−ベンゾイル）−アデノシル）アセチル）グリシル
Ａｅｇ（ＣBz） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（１−（Ｎ4−ベンゾイル）シトシル）アセチル）クリシル
Ａｅｇ（ＣMeOBz） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（１−（Ｎ4−４−メトキシ−ベンゾイル）シトシル）アセチル）グリシル
Ａｅｇ（ＣtBuBz） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（１−（Ｎ4−４−第３ブチル−ベンゾイル）シトシル）アセチル）グリシル
Ａｅｇ（ＧiBu） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（９−（Ｎ2−イソブタノイル）−グアノシル）アセチル）グリシル
Ａｅｇ（Ｇ2-Ac.4-Dpc） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（９−（Ｎ2−アセチル−Ｏ4−ジフェニルカルバモイル）グアノシル）グリシル
【００３４】
Ａｅｇ（Ｔ） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（１−チミニル）アセチル）−グリシル
Ｂｎｐｅｏｃ ２,２〔ビス（４−ニトロフェニル）〕エトキシカルボニル）
Ｂｏｃ 第３ブチルオキシカルボニル
ＢＯＩ ２−（ベンゾトリアゾール−１−イル）オキシ−１,３−ジメチル−イミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート
ＢＯＰ ベンゾトリアゾリル−１−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＢｒｏＰ ブロモトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＢＳＡ Ｎ,Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド
Ｂｕｔ 第３ブチル
Ｂｚ ベンゾイル
Ｂｚｌ ベンジル
Ｃｌ−Ｚ ４−クロロベンジルオキシカルボニル
ＣＰＧ Controlled Pore Glass
ＤＢＵ １,８−ジアザビシクロ〔５.４.０〕ウンデク−７−エン(１,５−５）
ＤＣＭ ジクロロメタン
【００３５】
Ｄｄｚ ３,５−ジメトキシフェニル−２−プロピル−２−オキシカルボニル
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
Ｄｍｔ ジ−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル
Ｄｎｐｅｏｃ ２−（２,４−ジニトロフェニル）エトキシカルボニル
Ｄｐｃ ジフェニルカルバモイル
ＦＡＭ フルオレスセイン基
Ｆｍ ９−フルオレニルメチル
Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｈ−Ａｅｇ−ＯＨ Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン
ＨＡＰｙＵ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−ビス−（テトラメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＡＴＵ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＮＳｕ Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド
ＨＯＯｂｔ ３−ヒドロキシ−４−オキソ−３,４−ジヒドロベンゾトリアジン
【００３６】
ｉＢＵ イソブタノイル
ＭｅＯＢｚ ４−メトキシベンゾイル
Ｍｍｔ ４−メトキシトリフェニルメチル
Ｍｏｚ ４−メトキシベンジルオキシカルボニル
ＭＳＮＴ ２,４,６−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１,２,４−トリアゾリド
Ｍｔｔ （４−メチルフェニル）ジフェニルメチル
ＮＢＡ ニトロベンジルアルコール
ＮＭＰ Ｎ−メチルピロリジン
Ｐｉｘｙｌ ９−（９−フェニル）キサンテニル
ＰｙＢｏｐ ベンゾトリアゾリル−１−オキシ−トリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＰｙＢｒｏＰ ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＴＡＰｉｐＵ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−ビス−（ペンタメチレン）ウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＢＴＵ Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
【００３７】
ｔＢｕ 第３ブチル
ｔＢｕＢｚ ４−第３ブチルベンゾイル
ＴＤＢＴＵ Ｏ−（３,４−ジヒドロ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン−３−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＤＯ ２,５−ジフェニル−２,３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロキシ−チオフェンジオキシド
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＮＴＵ Ｏ−〔（５−ノルボネン−２,３−ジカルボキシイミド〕−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＯＴＵ Ｏ−〔（シアノ（エトキシカルボニル）メチレン）−アミノ〕−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＰＴＵ Ｏ−（１,２−ジヒドロ−２−オキソ−１−ピリジル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
Ｔｒｔ トリチル
ＴＳＴＵ Ｏ−（Ｎ−サクシンイミジル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
Ｚ ベンジルオキシカルボニル
ＭＳ（ＥＳ+） 静電吹付質量スペクトル（陽イオン）
ＭＳ（ＥＳ-） 静電吹付質量スペクトル（陰イオン）
ＭＳ（ＤＣＩ） 脱着化学イオン化質量スペクトル
ＭＳ（ＦＡＢ） 速原子衝撃質量スペクトル
【００３８】
以下の実施例は、本発明の化合物を製造する好適な方法を示す。しかしながら本発明は、これらの実施例によって限定されるものではない。
ペプチド核酸の合成
ＰＮＡｓは、例えばEcosyn D-300 ＤＮＡ合成器（Eppendorf／Biotronik, Maintal）またはＡＢＩ ３８０Ｂ ＤＮＡ合成器（Applied Biosystems, Weitersstadt）を使用して合成した。合成サイクルは以下に記載する通りである。
合成は、Mmt-hex-succ-TentagelまたはMmt-hex-succ-CPGを充填したApplied Biosystems社からの標準ＤＮＡ合成カラムにおいて行われる。３μモルまたは６μモル規模の合成に対するカラムを使用する。Ｍｍｔ保護基を開裂するために使用した試薬は、ジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸である。担体をアセトニトリルで洗浄した後、アセトニトリル中の４−エチルモルホリンの３.５Ｍ溶液を使用して中和を行う。カップリングにあたっては、アセトニトリル／ＤＭＦ、トライトンＸ−１００の１％を含有するＤＭＦ／ＮＭＰ、Ｎ−エチルモリホリンを含有するＤＭＦまたはピリジンを含有するＤＭＦ中のＭｍｔ−Ａｅｇ誘導体の０.３または０.４Ｍ溶液、ならびにアセトニトリル中のＰｙＢＯＰの０.９Ｍ溶液およびアセトニトリル中の４−エチルモリホリンの３.５Ｍ溶液またはＤＭＦ中のＨＡＴＵの０.３Ｍ溶液およびＤＭＦ中のＮＥＭの０.３溶液からなる混合物を合成カラムに導入する。次のキャッピング（Capping）は、標準ＤＮＡ合成キャッピング試薬（ＴＨＦ中の無水酢酸／ルチジン／Ｎ−メチルイミダゾール溶液）の１：１混合物を使用して行う。ＰＮＡは、合成器において、濃アンモニア溶液で処理しそして担体から開裂する。合したアンモニア性溶液を密封アンプル中で５５℃で５時間加熱して塩基保護基を除去する。適当である場合は、それから室温で８０％酢酸を使用してアミノ末端Ｍｍｔ基を開裂する。
【００３９】
ＰＮＡｓは、２０mM ＮａＯＨ中の０〜０.７５Ｍ ＮａＣｌの線状勾配を使用して、Dionex Nucleopac PA-100（４×２５０mm）カラムを具備したBeckman System Gold ＨＰＬＣ装置を使用して分析する。
精製は、溶離剤として２０mM ＮａＯＨ中の０〜０.５Ｍ ＮａＣｌの線状勾配を使用して、Pharmacia Mono Ｑ ＨＲ １０／１０カラムを具備したPharmacia Biopilot FPLC装置中で行なう。Bend Flut-C18カラム（Analytichem Int′１）によってまたは RBiogel(Biorad）を使用して塩を精製されたＰＮＡｓから除去する。
【００４０】
実施例１
１−ヒドロキシ−６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）ヘキサン（Ｍｍｔ−ｈｅｘ）
６−アミノヘキサン−１−オール（１ｇ，８.５５ミリモル）を、無水のピリジン（７ml）に溶解しそしてトリエチルアミン（０.２ml）を加える。この溶液に、４５分にわたって無水のピリジン（９ml）中の（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルクロライド（２.５ｇ，８.１２ミリモル）の溶液を加える。反応溶液の撹拌を２２℃で３０分つづけそしてメタノール（３ml）の添加によって反応停止する。溶液を回転蒸発器上で濃縮しそして得られた残留物を、トルエンとともに３回共蒸発してピリジンを除去する。得られた残留物を酢酸エチルに溶解しそしてこの溶液を、順次に飽和重炭酸ナトリウム溶液、水および飽和塩化カリウム溶液で洗浄する。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥した後、それを濾過しそして溶液を真空中で濃縮する。粗生成物は、４９.５：４９.５：１のヘプタン：酢酸エチル：トリエチルアミンを使用してシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製することができる。
収量：１.６４ｇ
ＭＳ（ＦＡＢ，ＮＢＡ／ＬｉＣｌ）３９６.３（Ｍ＋Ｌｉ)+、３９０.３（Ｍ＋Ｈ)+、２７３.２（ＭＭＴ)+
Ｒf ０.４４（ヘプタン：酢酸エチル＝１：１）
【００４１】
実施例２
６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）ヘクス−１−イルヘミサクシネート（Ｍｍｔ−ｈｅｘ−ｓｕｃｃ）
１−ヒドロキシ−６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）−ヘキサン（１.００ｇ，２.５７ミリモル）を無水のピリジン（１０ml）に溶解する。この溶液に無水コハク酸（０.２５７ｇ，２.５７ミリモル）および４−ジメチルアミノピリジン（３１.３mg，０.２５７ミリモル）を加える。混合物を２２℃で３時間撹拌した後、さらに無水コハク酸（２５.７mg，０.２５７ミリモル）および４,４−ジメチルアミノピリジン（６２.６mg，０.５６ミリモル）を加えそしてこの溶液を５０℃で６時間加熱する。さらに２２℃で１６時間後に、混合物を濃縮し、残留物を酢酸エチルにとり、そして得られた溶液を、氷冷５％水性クエン酸で洗浄する。有機相を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）した後、溶液を回転蒸発器上で濃縮する。残留物を、酢酸エチル中の５０％ＣＨ2Ｃｌ2／１％トリエチルアミンそしてそれからジクロロメタン中の５％メタノール／１％トリエチルアミンを使用してシリカゲル上でクロマトグラフィー処理することにより精製して無色の油の形態の所望の化合物を得た。
ＭＳ（ＥＳ-）９７８.０（２Ｍ−Ｈ)-、４８８.３（Ｍ＋Ｈ)-
Ｒf ０.３０（ＣＨ2Ｃｌ2：酢酸エチル＝１：１）
【００４２】
実施例３
６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）ヘクス−１−イル−サクシニルアミド−Tentagel（Ｍｍｔ−ｈｅｘ−ｓｕｃｃ−Tentagel）
アミノ形態のTentagelR (Rapp Polymere)(０.５ｇ；アミノ基の０.１１ミリモル）を、４−エチルモルホリン（０.１ml）およびＤＭＦ（５ml）中で１０分膨潤させる。それからＤＭＦ（３ml）中の６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）ヘクス−１−イルヘミサクシネート（９７.４mg，０.１６５ミリモル）、４−エチルモルホリン（１５.９mg，０.１３８ミリモル，１７.４ml）およびＴＢＴＵ（５２.９mg，０.１６５ミリモル）の溶液を加えそして懸濁液を２２℃で１６時間振盪する。誘導されたTentagel担体を濾去し、順次にＤＭＦ（３×３ml）、ＣＨ2Ｃｌ2（３×１ml）およびジエチルエーテル（３×１ml）で洗浄しそして乾燥する。未反応のアミノ官能基は、ＴＨＦ（１ml）中の無水酢酸／ルチジン／１−メチルイミダゾール（１ml）で１時間処理することにより閉鎖する。完成した担体を、ＣＨ2Ｃｌ2（３×１ml）およびジエチルエーテル（３×１ml）で洗浄しそして真空中で乾燥する。導入されたモノメトキシトリチル官能を基にした負荷は１６８μmolg-1である。
【００４３】
実施例４
６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）ヘクス−１−イルサクシニルアミドプロピル−Controlled Pore Glass（Ｍｍｔ−ｈｅｘ−ｓｕｃｃ−ＣＰＧ）
製造は、実施例３に記載された操作と同様にして、ＤＭＦ（３ml）中のアミノプロピル−ＣＰＧ（Fluka)(５５０Å，１.０ｇ）、６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）ヘクス−１−イルヘミサクシネート（４８.７mg，０.０８２ミリモル）、４−エチルモルホリン（７.６ml）およびＴＢＴＵ（２６.４mg，０.０８２ミリモル）から出発して実施する。ＭＭＴ−ｈｅｘ−ｓｕｃｃ−ＣＰＧ）の負荷は９１μmolg-1である。
【００４４】
実施例５
Ｈ−〔Ａｅｇ(Ｔ)〕3−(ｈｅｘ)
Ｈ−〔Ａｅｇ(Ｔ)〕3−(ｈｅｘ)は、上述した合成方法によって、Ｍｍｔ−Ｈｅｘ−ｓｕｃｃ−Tentagel上で３μモルの規模で合成した。使用されたモノマーは、Ｍｍｔ−Ａｅｇ(Ｔ)−ＯＨである。粗収量は、７１ＯＤ260である。２ＯＤの記録された質量スペクトルは、ｍ／ｅ ９１５.８（Ｍ＋Ｈ)+における所望の生成物およびｍ／ｅ ６５０.５における副生成物Ｈ−〔Ａｅｇ(Ｔ)〕2−(ｈｅｘ)を示す。
【００４５】
実施例６
H-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕2-(hex)
H-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕2-(hex)は、上述した合成方法によって、Ｍｍｔ−Ｈｅｘ−Ｓｕｃｃ−Tentagel上で３μモルの規模で合成した。使用したモノマーは、Ｍｍｔ−Ａｅｇ(Ｔ)−ＯＨおよびＭｍｔ−Ａｅｇ(CBz)−ＯＨである。粗収量は、９８.６ＯＤ260である。粗製生成物３５ＯＤ260を、粗製しそして塩を除去して、所望の化合物１４.５ＯＤ260を得た。粗製された生成物のスペクトロメトリー分析は、単一の主ピークとして所望の生成物ｍ／ｅ １６８５.０（Ｍ＋Ｈ)+を示す。
【００４６】
実施例７
H-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕2-(hex)
H-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕2-(hex)は、上述した合成方法によって、Ｍｍｔ−Ｈｅｘ−Ｓｕｃｃ−Tentagel上で３μモルの規模で合成した。使用したモノマーは、Ｍｍｔ−Ａｅｇ(Ｔ)−ＯＨおよびＭｍｔ−Ａｅｇ(ＣtBuBz）−ＯＨである。
【００４７】
実施例８
H-〔Aeg(A)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(A)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(A)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(G)-〔Aeg(G)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(G)〕-(hex)
このＰＮＡｓは、Ｍｍｔ−Ｈｅｘ−Ｓｕｃｃ−アミノプロピル−ＣＰＧ １３０mg（５μモル）上で、Ecosyn D-300 ＤＮＡ合成器（Eppendorf／Biotronik Maintal）を使用して合成した。
【００４８】
合成において、次の溶液を使用した。
【００４９】
(１) 活性化剤溶液：乾燥したＤＭＦ中の０.３モルＨＡＴＵ溶液
(２) 活性化に対する塩基：乾燥ＤＭＦ中のＮＥＭの０.３モル溶液
(３) Ｍｍｔの開裂：ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸の３％溶液
(４) 中和溶液：７：２：１のテトラヒドロフラン／水／ピリジン
(５) Mmt-Aeg(T)-OH：乾燥ＤＭＦ中のＮＥＭの０.３モル溶液中の０.３モル溶液
(６) Mmt-Aeg(ＡMeOBz)-OH：乾燥したＤＭＦ中のＮＥＭの０.３モル溶液中の０.３モル溶液
(７) Mmt-Aeg(CMeOBz)-OH：乾燥したＤＭＦ中のＮＥＭの０.３モル溶液中の０.３モル溶液
(８) Mmt−Aeg(GiBu)-OH：乾燥したＤＭＦ中のＮＥＭの０.３モル溶液中の０.３モル溶液
合成が終了したときに、ＰＮＡ−ＣＰＧ担体を乾燥しそして上述したように処理する。
収量：２４５ＯＤ260
ＭＳ ３３６９.６（ＥＳ+）：（Ｍ)+
ペプチドまたはポリアミド核酸（ＰＮＡｓ）は、デオキシリボースフォスフェート主鎖が、ペプチドオリゴマーにより置換されたＤＮＡ−類似化合物である。モノマーのアミノ基を一時的に保護するために、これまで文献〔Michael Egholm, Peter E. Nielsen, Ole BuchardtおよびRolf H. Berg, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 9677-9678；Ole Buchardt, Michael Egholm, Peter E. NielsenおよびRolf H. Berg. WO 92/20702〕に記載されている合成は、例えばトリフルオロ酢酸のような中程度の酸〜強酸により開裂される酸−不安定な第３ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基を使用する。オリゴマーの固相合成は、例えばMerrifield 〔B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149〕により記載されているような慣用のペプチド合成方法と同様にして実施される。ＰＮＡオリゴマーは、慣用的に強酸である液状の弗化水素を使用して、固体担体から開裂される。トリフルオロ酢酸による反復処理および弗化水素を使用する次の開裂は、ヌクレオチド結合がこれらの条件下で安定でないために、混合ＰＮＡ／ＤＮＡ配列の合成と両立しない。特に、プリンヌクレオチド、デオキシグアノシンおよびデオキシアデノシンは、Ｎ−グリコシド結合において強酸により急速に開裂される。さらに、このような分子の合成に対して、慣用のＤＮＡ合成装置を使用しそしてこの装置において使用される化学作用を大部分保持することは特に望ましい。
【０００２】
本発明の目的は、弱酸に不安定である一時的なアミノ保護基を使用してＰＮＡオリゴマーを構成する合成方法を開発せんとするものである。この方法は、オリゴヌクレオチドに対して慣用的に使用されているアルカリ性条件下でオリゴマーが固体の支持体から開裂されることを可能にする。
【０００３】
本発明は、
（ａ） はじめに、固相合成において慣用的に使用されている方法を使用して、潜在的にＱoを有するアンカー基Ｌを具備した式II
Ｌ−〔重合体〕 （II）
の重合体支持体上にアミノ酸（Ｑ′）をカップリングさせ、
（ｂ） 適当な試薬を使用して弱酸に不安定である保護基ＰＧを開裂し、
（ｃ） 工程（ａ）および（ｂ）を（ｌ−１）回反復し、
（ｄ） ペプチド化学において慣用的に使用されているカップリング試薬を使用して、中間体として形成された式III
（Ｑ′)l−Ｌ−〔重合体〕 （III）
（式中、Ｌは上述した通りであり、Ｑ′は場合によっては側鎖において保護されていてもよいアミノ酸Ｑでありそしてｌは０〜１０の整数である）の化合物上に式IV
【０００４】
【化５】
【０００５】
（ｅ） 適当な試薬によって弱酸に不安定である一時的保護基ＰＧを開裂し、
（ｆ） 工程（ｄ）および（ｅ）を（ｎ−１）回反復し、
（ｇ） 固相合成において慣用的に使用されている方法を使用して、さらにアミノ酸（Ａ′）をカップリングさせ、
（ｈ） 適当な試薬を使用して、弱酸に不安定である保護基ＰＧを開裂し、
（ｉ） 工程（ｇ）および（ｈ）を（ｋ−１）回反復し、
（ｊ） Ｒoが水素でない場合においては、慣用の方法によって基Ｒoを導入し、そして
（ｋ） 開裂試薬を使用して、中間体として得られた式Ｉａ
【０００６】
【化６】
【化７】
Ｂ／Ｘは、
【０００７】
【化８】
【０００８】
【化９】
Ｒoは、水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルカノイル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシカルボニル、Ｃ3〜Ｃ8−シクロアルカノイル、Ｃ7〜Ｃ15−アロイル、Ｃ3〜Ｃ13−ヘテロアロイルまたはオリゴマーの細胞内取込みを有利にするかまたはハイブリダゼーション中に標的核酸と相互作用する基であり；
Ａは、好ましくはグリシン、ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システィン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸およびＮ−（２−アミノエチル）グリシンからなる系からのアミノ酸基であり；
【０００９】
ｋは、０〜１０、好ましくは０〜６の整数であり；
Ｑは、好ましくはグリシン、ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システィン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸およびＮ−（２−アミノエチル）グリシンからなる系からのアミノ酸基であり；
ｌは、０〜１０、好ましくは０〜６の整数であり；
Ｂは、ヌクレオチド化学において慣用のヌクレオチド塩基、例えば天然のヌクレオチド塩基、例えばアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルまたは非天然のヌクレオチド塩基、例えばプリン、２,６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ4Ｎ4−エタノシトシン、Ｎ6,Ｎ6−エタノ−２,６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルウラシル、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシルまたはプソイドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジンまたはこれらのプロドラッグ形態または塩基代替化合物、例えばイミダゾール、ニトロイミダゾールおよびトリアゾールであり；
【００１０】
Ｑ°は、ヒドロキシル、ＮＨ2またはＮＨＲ″（式中、Ｒ″はＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ2〜Ｃ18−アミノアルキルまたはＣ2〜Ｃ18−ヒドロキシアルキルである）であり；そして
ｎは、１〜５０、好ましくは４〜３５の整数である〕のＰＮＡオリゴマーの製法に関するものである。
【００１１】
以下に示されたＰＮＡに対する合成スキームは、本発明の方法のコースを示す。
【００１２】
【化１０】
オリゴマーの細胞内取込みを有利にする基は、例えば−(ＣＨ2)x−ＣＨ3（式中、ｘは６〜１８の整数である）、−(ＣＨ2)n−ＣＨ＝ＣＨ−(ＣＨ2)m−ＣＨ3（式中、ｎおよびｍは、相互に独立して６〜１２の整数である）、−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)4−(ＣＨ2)9−ＣＨ3、−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)8−(ＣＨ2)13−ＣＨ3および−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)7−(ＣＨ2)15−ＣＨ3のような種々な親油性基を有するアルカノイルまたはアルコキシカルボニル化合物、そしてまたステロイド、例えばコレステリルまたはビタミン、例えばビタミンＥ、ビタミンＡまたはビタミンＤおよび天然のキャリア（carrier）系、例えば胆汁酸、葉酸、２−（Ｎ−アルキル、Ｎ−アルコキシ）アミノアントラキノンを利用する他のコンジュゲートおよびＥＧＦ（上皮成長因子）、ブラジキニンおよびＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）のようなオリゴマーの受容体−仲介エンドサイト−シスを生ずる相当する受容体のペプチドとマンノースのコンジュゲートである。
【００１４】
標識基は、例えばダンシル（Ｎ−ジメチル−１−アミノナフチル−５−スルホニル）、フルオレセインまたはクマリン誘導体の蛍光基または例えばアクリジン誘導体の化学蛍光基（Chemiluminescent group）、ならびに、ＥＬＩＳＡを経て検出できるジゴキシゲニン系、ビオチン／マビジン系を経て検出できるビオチン基またはさもなければ、ときによっては後の点において検出可能なリポーター基による誘導化を可能にする官能基を有するリンカーアーム（linker arms）、例えばアクリジニウム活性エステルと反応して化学蛍光プローブを与えるアミノアルキルリンカーを意味するものとして理解されるべきである。典型的な標識基は、次の通りである。
【００１５】
【化１１】
標的核酸とオリゴマーとのバイブリダゼーションによって、結合、架橋形成または開裂により標的核酸を攻撃する基は、例えばアクリジン、プソラレン、フェナントリジン、ナフトキノン、ダウノマイシンまたはクロロエチルアミノアリールコンジュゲートである。典型的な介在（intercalating radical）および架橋形成ラジカルは、次の通りである。
【００１７】
【化１２】
【化１３】
【００１９】
アンカー基を具備しそして潜在的に基Ｑoを含有する重合体支持体は、例えばｐ−ニトロベンゾフェノンオキシム／ポリスチレン樹脂（E.T. Kaiser, S.H. Nakagawa, J. Org. Chem. 1983, 48, 678-685）、４−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）ベンゾイル樹脂または第一アミノ基により官能化されそしてこれに対して、例えば４−ヒドロキシメチル安息香酸〔E. Atherton, C.J. Logan, R.C. Sheppard, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 538-546 (1981)〕、９−ヒドロキシメチルフルオレン−４−カルボン酸〔M. Mullen, D. Bellof, Helv. Chim. Acta 67, 2009-2016 (1984)〕、４−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）安息香酸〔R. Schwyzer, E. Felder, P. Failli, Helv. Chim. Acter 67, 1316-1327 (1984)〕、（９−（ヒドロキシメチル）−２−フルオレニル酢酸〔Y.Z. Liu, S.H. Ding, J.Y. Chu, A.M. Felix, Int. J. Peptide Protein Res. 25, 95-98 (1990)〕、Ｎ−〔９−（ヒドロキシメチル）−２−フルオレニル〕コハク酸モノアミド、４−（２−ヒドロキシエチル）−３−ニトロ安息香酸〔F. Albericio, E. Giralt, R. Eritja, Tetrahedron Lett. 1991, 1515-1518)、モノ（アミノ−Ｃ2〜Ｃ16）アルキルサクシネート、モノ（アミノ−Ｃ2〜Ｃ16）アルキルオキザレートなどのような潜在的に基Ｑoを含有するアンカー基の一つがカップリングされている例えば Rpoly HIPE、RTentagel、RControlled Pore Glass、ポリスチレンのような重合体支持体である。
【００２０】
好ましくは、以下のアンカー基またはすでに重合体支持体に結合されているアンカー基が使用される。
ｐ−ニトロベンゾフェノンオキシム／ポリスチレン樹脂、４−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）ベンゾイル樹脂または潜在的に基Ｑoを含有しそして第一アミノ基で官能化されたTentagel、Controlled Pore Glassまたはポリスチレン型担体にカップリングされるアンカー基、例えば４−ヒドロキシメチル安息香酸、４−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）安息香酸、Ｎ−〔９−（ヒドロキシメチル）−２−フルオレニル〕コハク酸モノアミド、モノ（アミノ−Ｃ2〜Ｃ16）アルキルサクシネートまたはモノ（アミノ−Ｃ2〜Ｃ16）アルキルオキザレート。
【００２１】
弱酸に不安定である保護基ＰＧの例は、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエトキシカルボニル（Adpoc）、１−（３,５−ジ−第３ブチルフェニル）−１−メチルエトキシカルボニル（ｔ−Bumeoc）、１−メチル−１−（４−ビフェニル）エチルオキシカルボニル（Bpoc）、３,５−ジメトキシフェニル−２−プロピル−２−オキシカルボニル（Ddz）またはトリチル型のもの、例えばトリフェニルメチル（Trt）、（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル（Ｍｍｔ）、（４−メチルフェニル）ジフェニルメチル（Mtt）、ジ−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル（Dmt）および９−（９−フェニル）キサンテニル（pixyl）などである。Trt、MmtおよびDmtのようなトリチル型保護基が特に好ましく使用されるそしてMmt保護基が非常に好ましく使用される。
【００２２】
上記合成方法の工程ａにおいて使用されるペプチド合成において慣用的に使用されている活性化法は、例えばHouben-Weyl, Methoden der organischem Chemie〔Methods in Organic Chemistry〕、Volume 15/2, Georg Thieme Verlag Stuttgart 1974に記載されている、そしてさらに他の試薬、例えばBOP（B. Castro, J.R. Dormoy, G. EvinおよびC. Selve, Tetrahedron Lett. 1975, 1219-1222）、DYBOP（J. Coste, D. Le-NguyenおよびB. Castrs, Tetrahedron Lett. 1990, 205-208）、BroP（J. Coste, M.-N. Dufour, A. PantaloniおよびB. Castro, Tetrahedron Lett. 1990, 669-672）、PYBroP（J. Coste, E. Frerot, P. JouinおよびB. Castro, Tetrahedron Lett. 1991, 1967-1970）およびウロニウム試薬、例えばHBTU（V. Dourtoglou, B. Gross, V. Lambropoulou, C. Zioudrou, Synthesis 1984, 572-574）、TBTU、TPTU、TSTU、TNTU（R. Knorr, A. Trzeciak, W. BannwarthおよびD. Gillessen, Tetrahedron Letters 1989, 1927-1930）、TOTU（EP-A-0 460 446)、HATU（L.A. Carpino, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4397-4398）、HAPYU、TAPiPU（A. Ehrlich, S. Rothemund, M. Brudel, M. Beyermann, L.A. CarpinoおよびM. Bienert, Tetrahedron Lett. 1993, 4781-4784）、BOI（K. Akaji, N. Kuriyama, T. Kimura, Y. FujiwaraおよびY. Kiso, Tetrahedron Lett. 1992, 3177-3180）または２,４,６−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１,２,４−トリアゾリド（ＭＳＮＴ）（B. Blankemeyer-Menge, M. NimitzおよびR. Frank, Tetrahedron Lett. 1990, 1701-1704）、２,５−ジフェニル−２,３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロチオフェンジオキシド（ＴＤＯ）（R. Kirstgen, R.C. Sheppard, W. Steglich, J. Chem. Soc. Chem. Commun, 1987, 1870-1871）または活性化エステル（D. Hudson, Peptide Res. 1990, 51-55）が問題の参考文献に記載されている。
【００２３】
カルボジイミド、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドの使用が好ましい。ホスホニウム試薬例えばＰＹＢＯＰまたはＰＹＢｒｏＰおよびウロニウム試薬、例えばＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＰＴＵ、ＴＳＴＵ、ＴＮＴＵ、ＴＯＴＵ、ＨＡＴＵまたはＢＯＩもまた好ましく使用される。
カップリングは、必要に応じて例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）〔W. Koenig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 788 (1970)〕または３−ヒドロキシ−４−オキソ−３,４−ジヒドロベンゾトリアジン（ＨＯＯｂｔ）〔W. Koenig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 2034 (1970)〕の添加剤を樹脂に添加して、アミノ酸誘導体または式IVのＰＮＡモノマーを活性化試薬との付加反応に付すことによって直接行うことができる、または、単位を別個に予備活性化して活性エステルを得そして適当な溶剤中のこの活性エステルの溶液をカップリングされることのできる重合体に加えることができる。
【００２４】
保護されたヌクレオチド塩基Ｂ′の環外アミノ官能基の保護基としては、弱酸に不安定であるアミノ保護基ＰＧと両立できる保護基が使用される。好ましくは使用される保護基は、ベンゾイル、イソブタノイル、アセチル、フェノキシアセチル、４−（ｔ−ブチル）ベンゾイル、４−（ｔ−ブチル）フェノキシアセチル、４−（メトキシ）ベンゾイル、２−（４−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、２−（２,４−ジニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、ジフェニルカルバモイルまたはホルムアミジン基である。特に、ベンゾイル、イソブタノイル、４−（ｔ−ブチル）ベンゾイル、２−（４−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、２−（２,４−ジニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、４−（メトキシ）ベンゾイルまたはパラ−（ｔ−ブチル）フェノキシアセチル、パラ−ニトロフェニル−２−エチルオキシカルボニル基、そしてグアニンの場合においては、２−Ｎ−アセチルと６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル基との組み合わせが好ましい。
【００２５】
弱酸に不安定であるアミノ保護基ＰＧに対する開裂試薬の例は、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸の１〜１０％溶液、ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸の１〜１０％溶液、ジクロロメタン中のジクロロ酢酸の２〜１５％溶液またはジクロロメタン中のｐ−トルエンスルホン酸の１〜５％溶液である。他の適当な開裂試薬は、ルイス酸、例えばジクロロメタン／イソプロパノール中の三弗化硼素エーテレートまたは臭化亜鉛である。
【００２６】
式Ｉａのアミノ酸Ｑ′またはＡ′は、好ましくは式IVの化合物に対しても使用された同じアミノ保護基ＰＧを有するアミノ酸誘導体を使用してカップリングされる。アミノ酸に存在する何れの側鎖官能基も、例えば９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）または９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）のような塩基またはアルカリ金属水酸化物溶液に不安定である保護基を有している。好ましいアミノ酸誘導体は、例えばPG-Gly-OH, PG-Tic-OH, PG-Pro-OH, PG-Phe-OH, PG-Oic-OH, PG-Lys(Fmoc)-OH, PG-Arg(Fmoc)-OH, PG-Cys(Fm)-OH, PG-Asp(OFm)-OH, PG-Glu(OFm)-OHおよびPG-Aeg(Fmoc)-OH, PG-His(Trb)-OH（式中、ＰＧは上述した通りである）である。非常に特に好ましいアミノ酸誘導体は、Mmt-Gly-OH, Mmt-Tic-OH, Mmt-Pro-OH, Mmt-Phe-OH, Mmt-Oic-OH, Mmt-Lys(Fmoc)-OH, Mmt-Arg(Fmoc)-OH, Mmt-Cys(Fm)-OH, Mmt-Asp(OFm)-OH, Mmt-Glu(OFm)-OHおよびMmt-Aeg(Fmoc)-OH, Mmt-His(Fmoc)-OHである。
【００２７】
上述した合成方法において使用される式IV
【化１４】
【化１５】
【００２８】
上述したＰＮＡｓは、潜在的に基Ｑoを含有するアンカー基Ｌを具備する適当な支持物質（例えばポリスチレン、ポリオキシエチレン−変性ポリスチレン、例えば RTentagel、RControlled Pore Glass）上における固相合成によって構成される。固相合成は、酸−不安定性の保護基により保護されたモノマーまたは場合によっては側鎖官能基において保護されたアミノ酸を適当な樹脂にカップリングすることによってＰＮＡのＣ−末端において開始する。
樹脂上にカップリングした単位の保護基を、上述したような適当な試薬を使用して開裂した後、次の保護された単位（ＰＮＡモノマーおよびアミノ酸誘導体）を、所望の順序で交互にカップリングさせる。中間体として形成された酸−不安定の保護基によりＮ−末端で保護されたＰＮＡ樹脂は、これらが次のＰＮＡモノマーと結合される前に上述した試薬により脱保護する。
【００２９】
上述した活性化試薬の１種によるアミノ酸誘導体のカップリングまたは活性化は、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジノン、アセトニトリルまたは塩化メチレン、または、これらの溶剤の混合物中で実施することができる。さらに上述した溶剤は、例えばピリジン、Ｎ−エチルモルホリンまたはトリエチルアミンのような補助塩基で処理することができる。活性化された誘導体は、普通１.５〜１０倍過剰で使用される。カップリングが不完全である場合においては、カップリングされた単位のアミノ基を脱保護しないでカップリング反応を反復する。
Ｒoを導入する方法は、例えばこのカルボン酸官能基を含有する場合においては、アミノ酸およびＰＮＡモノマーのカップリングについて上述した方法である。他の方法は、イソシアネート、例えばイソシアン酸フェニル、イソチオシアネート、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、クロロギ酸誘導体、例えばクロロホルミルカルバゾール、炭酸の活性エステル、例えばコレステロール−（４−ニトロフェニル）カーボネート、アクリジニウムサクシンイミジルカーボネート、スルホニルクロライド、例えばダンシルクロライドなどの反応である。
【００３０】
もし適当である場合は、式Ｉの化合物のアミノおよびカルボキシル末端は、また、さらに他の工程において、互いに結合させることもできる。この結合は、好ましくは、アミノ酸ＡまたはＱ（ＡおよびＱはＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｅｇである）の側鎖官能基の間のアミド結合を経てまたは互いに１個のアミノ酸ＡおよびＱ（ＡおよびＱはＣｙｓである）の間にジスルフィド架橋を形成することによって行われる。
【００３１】
上述した合成順序は、これまで使用されている合成プログラムを僅かに変更して、例えばペプチド合成器、マルチプルペプチド合成器およびＤＮＡ合成器のような商業的に入手できる自動合成器を使用して実施することもできる。
ＰＮＡｓが上述した方法で合成された後、ＰＮＡオリゴマーは、適当な試薬、例えば濃アンモニア溶液、エチレンジアミン、ヒドラジン、ブチルアミン、メチルアミンまたはエタノールアミンを使用して樹脂から開裂することができる。使用したリンカーおよび使用した保護基の性質によって、オリゴマーおよび核酸塩基の他の側鎖保護基が同時に開裂される。開裂試薬は、適当な溶剤、例えばアセトニトリル、エタノールまたはメタノールで希釈して使用することもできる。
【００３２】
開裂後に得られた粗製のオリゴマーの精製は、ペプチドまたはヌクレオチド化学において慣用的に使用されている方法、例えばＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィーなどによって行われる。
アミノ酸に対して使用した略号は、ペプチド化学において慣用的に使用されているEurop. J. Biochem. 138, 9 (1984)に記載されているような３文字からなるコードに相当する。使用された他の略号を以下に記載する。
【００３３】
Ａｅｇ Ｎ−（２−アミノエチル）グリシル−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−
Ａｅｇ（ＡMeOBz） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（９−（Ｎ6−４−メトキシ−ベンゾイル）−アデノシル）アセチル）グリシル
Ａｅｇ（ＣBz） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（１−（Ｎ4−ベンゾイル）シトシル）アセチル）クリシル
Ａｅｇ（ＣMeOBz） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（１−（Ｎ4−４−メトキシ−ベンゾイル）シトシル）アセチル）グリシル
Ａｅｇ（ＣtBuBz） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（１−（Ｎ4−４−第３ブチル−ベンゾイル）シトシル）アセチル）グリシル
Ａｅｇ（ＧiBu） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（９−（Ｎ2−イソブタノイル）−グアノシル）アセチル）グリシル
Ａｅｇ（Ｇ2-Ac.4-Dpc） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（９−（Ｎ2−アセチル−Ｏ4−ジフェニルカルバモイル）グアノシル）グリシル
【００３４】
Ａｅｇ（Ｔ） Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ−（（１−チミニル）アセチル）−グリシル
Ｂｎｐｅｏｃ ２,２〔ビス（４−ニトロフェニル）〕エトキシカルボニル）
Ｂｏｃ 第３ブチルオキシカルボニル
ＢＯＩ ２−（ベンゾトリアゾール−１−イル）オキシ−１,３−ジメチル−イミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート
ＢＯＰ ベンゾトリアゾリル−１−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＢｒｏＰ ブロモトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＢＳＡ Ｎ,Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド
Ｂｕｔ 第３ブチル
Ｂｚ ベンゾイル
Ｂｚｌ ベンジル
Ｃｌ−Ｚ ４−クロロベンジルオキシカルボニル
ＣＰＧ Controlled Pore Glass
ＤＢＵ １,８−ジアザビシクロ〔５.４.０〕ウンデク−７−エン(１,５−５）
ＤＣＭ ジクロロメタン
【００３５】
Ｄｄｚ ３,５−ジメトキシフェニル−２−プロピル−２−オキシカルボニル
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
Ｄｍｔ ジ−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル
Ｄｎｐｅｏｃ ２−（２,４−ジニトロフェニル）エトキシカルボニル
Ｄｐｃ ジフェニルカルバモイル
ＦＡＭ フルオレスセイン基
Ｆｍ ９−フルオレニルメチル
Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｈ−Ａｅｇ−ＯＨ Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン
ＨＡＰｙＵ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−ビス−（テトラメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＡＴＵ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＮＳｕ Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド
ＨＯＯｂｔ ３−ヒドロキシ−４−オキソ−３,４−ジヒドロベンゾトリアジン
【００３６】
ｉＢＵ イソブタノイル
ＭｅＯＢｚ ４−メトキシベンゾイル
Ｍｍｔ ４−メトキシトリフェニルメチル
Ｍｏｚ ４−メトキシベンジルオキシカルボニル
ＭＳＮＴ ２,４,６−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１,２,４−トリアゾリド
Ｍｔｔ （４−メチルフェニル）ジフェニルメチル
ＮＢＡ ニトロベンジルアルコール
ＮＭＰ Ｎ−メチルピロリジン
Ｐｉｘｙｌ ９−（９−フェニル）キサンテニル
ＰｙＢｏｐ ベンゾトリアゾリル−１−オキシ−トリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＰｙＢｒｏＰ ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＴＡＰｉｐＵ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−ビス−（ペンタメチレン）ウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＢＴＵ Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
【００３７】
ｔＢｕ 第３ブチル
ｔＢｕＢｚ ４−第３ブチルベンゾイル
ＴＤＢＴＵ Ｏ−（３,４−ジヒドロ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン−３−イル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＤＯ ２,５−ジフェニル−２,３−ジヒドロ−３−オキソ−４−ヒドロキシ−チオフェンジオキシド
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＮＴＵ Ｏ−〔（５−ノルボネン−２,３−ジカルボキシイミド〕−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＯＴＵ Ｏ−〔（シアノ（エトキシカルボニル）メチレン）−アミノ〕−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＰＴＵ Ｏ−（１,２−ジヒドロ−２−オキソ−１−ピリジル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
Ｔｒｔ トリチル
ＴＳＴＵ Ｏ−（Ｎ−サクシンイミジル）−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
Ｚ ベンジルオキシカルボニル
ＭＳ（ＥＳ+） 静電吹付質量スペクトル（陽イオン）
ＭＳ（ＥＳ-） 静電吹付質量スペクトル（陰イオン）
ＭＳ（ＤＣＩ） 脱着化学イオン化質量スペクトル
ＭＳ（ＦＡＢ） 速原子衝撃質量スペクトル
【００３８】
以下の実施例は、本発明の化合物を製造する好適な方法を示す。しかしながら本発明は、これらの実施例によって限定されるものではない。
ペプチド核酸の合成
ＰＮＡｓは、例えばEcosyn D-300 ＤＮＡ合成器（Eppendorf／Biotronik, Maintal）またはＡＢＩ ３８０Ｂ ＤＮＡ合成器（Applied Biosystems, Weitersstadt）を使用して合成した。合成サイクルは以下に記載する通りである。
合成は、Mmt-hex-succ-TentagelまたはMmt-hex-succ-CPGを充填したApplied Biosystems社からの標準ＤＮＡ合成カラムにおいて行われる。３μモルまたは６μモル規模の合成に対するカラムを使用する。Ｍｍｔ保護基を開裂するために使用した試薬は、ジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸である。担体をアセトニトリルで洗浄した後、アセトニトリル中の４−エチルモルホリンの３.５Ｍ溶液を使用して中和を行う。カップリングにあたっては、アセトニトリル／ＤＭＦ、トライトンＸ−１００の１％を含有するＤＭＦ／ＮＭＰ、Ｎ−エチルモリホリンを含有するＤＭＦまたはピリジンを含有するＤＭＦ中のＭｍｔ−Ａｅｇ誘導体の０.３または０.４Ｍ溶液、ならびにアセトニトリル中のＰｙＢＯＰの０.９Ｍ溶液およびアセトニトリル中の４−エチルモリホリンの３.５Ｍ溶液またはＤＭＦ中のＨＡＴＵの０.３Ｍ溶液およびＤＭＦ中のＮＥＭの０.３溶液からなる混合物を合成カラムに導入する。次のキャッピング（Capping）は、標準ＤＮＡ合成キャッピング試薬（ＴＨＦ中の無水酢酸／ルチジン／Ｎ−メチルイミダゾール溶液）の１：１混合物を使用して行う。ＰＮＡは、合成器において、濃アンモニア溶液で処理しそして担体から開裂する。合したアンモニア性溶液を密封アンプル中で５５℃で５時間加熱して塩基保護基を除去する。適当である場合は、それから室温で８０％酢酸を使用してアミノ末端Ｍｍｔ基を開裂する。
【００３９】
ＰＮＡｓは、２０mM ＮａＯＨ中の０〜０.７５Ｍ ＮａＣｌの線状勾配を使用して、Dionex Nucleopac PA-100（４×２５０mm）カラムを具備したBeckman System Gold ＨＰＬＣ装置を使用して分析する。
精製は、溶離剤として２０mM ＮａＯＨ中の０〜０.５Ｍ ＮａＣｌの線状勾配を使用して、Pharmacia Mono Ｑ ＨＲ １０／１０カラムを具備したPharmacia Biopilot FPLC装置中で行なう。Bend Flut-C18カラム（Analytichem Int′１）によってまたは RBiogel(Biorad）を使用して塩を精製されたＰＮＡｓから除去する。
【００４０】
実施例１
１−ヒドロキシ−６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）ヘキサン（Ｍｍｔ−ｈｅｘ）
６−アミノヘキサン−１−オール（１ｇ，８.５５ミリモル）を、無水のピリジン（７ml）に溶解しそしてトリエチルアミン（０.２ml）を加える。この溶液に、４５分にわたって無水のピリジン（９ml）中の（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルクロライド（２.５ｇ，８.１２ミリモル）の溶液を加える。反応溶液の撹拌を２２℃で３０分つづけそしてメタノール（３ml）の添加によって反応停止する。溶液を回転蒸発器上で濃縮しそして得られた残留物を、トルエンとともに３回共蒸発してピリジンを除去する。得られた残留物を酢酸エチルに溶解しそしてこの溶液を、順次に飽和重炭酸ナトリウム溶液、水および飽和塩化カリウム溶液で洗浄する。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥した後、それを濾過しそして溶液を真空中で濃縮する。粗生成物は、４９.５：４９.５：１のヘプタン：酢酸エチル：トリエチルアミンを使用してシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製することができる。
収量：１.６４ｇ
ＭＳ（ＦＡＢ，ＮＢＡ／ＬｉＣｌ）３９６.３（Ｍ＋Ｌｉ)+、３９０.３（Ｍ＋Ｈ)+、２７３.２（ＭＭＴ)+
Ｒf ０.４４（ヘプタン：酢酸エチル＝１：１）
【００４１】
実施例２
６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）ヘクス−１−イルヘミサクシネート（Ｍｍｔ−ｈｅｘ−ｓｕｃｃ）
１−ヒドロキシ−６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）−ヘキサン（１.００ｇ，２.５７ミリモル）を無水のピリジン（１０ml）に溶解する。この溶液に無水コハク酸（０.２５７ｇ，２.５７ミリモル）および４−ジメチルアミノピリジン（３１.３mg，０.２５７ミリモル）を加える。混合物を２２℃で３時間撹拌した後、さらに無水コハク酸（２５.７mg，０.２５７ミリモル）および４,４−ジメチルアミノピリジン（６２.６mg，０.５６ミリモル）を加えそしてこの溶液を５０℃で６時間加熱する。さらに２２℃で１６時間後に、混合物を濃縮し、残留物を酢酸エチルにとり、そして得られた溶液を、氷冷５％水性クエン酸で洗浄する。有機相を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）した後、溶液を回転蒸発器上で濃縮する。残留物を、酢酸エチル中の５０％ＣＨ2Ｃｌ2／１％トリエチルアミンそしてそれからジクロロメタン中の５％メタノール／１％トリエチルアミンを使用してシリカゲル上でクロマトグラフィー処理することにより精製して無色の油の形態の所望の化合物を得た。
ＭＳ（ＥＳ-）９７８.０（２Ｍ−Ｈ)-、４８８.３（Ｍ＋Ｈ)-
Ｒf ０.３０（ＣＨ2Ｃｌ2：酢酸エチル＝１：１）
【００４２】
実施例３
６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）ヘクス−１−イル−サクシニルアミド−Tentagel（Ｍｍｔ−ｈｅｘ−ｓｕｃｃ−Tentagel）
アミノ形態のTentagelR (Rapp Polymere)(０.５ｇ；アミノ基の０.１１ミリモル）を、４−エチルモルホリン（０.１ml）およびＤＭＦ（５ml）中で１０分膨潤させる。それからＤＭＦ（３ml）中の６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）ヘクス−１−イルヘミサクシネート（９７.４mg，０.１６５ミリモル）、４−エチルモルホリン（１５.９mg，０.１３８ミリモル，１７.４ml）およびＴＢＴＵ（５２.９mg，０.１６５ミリモル）の溶液を加えそして懸濁液を２２℃で１６時間振盪する。誘導されたTentagel担体を濾去し、順次にＤＭＦ（３×３ml）、ＣＨ2Ｃｌ2（３×１ml）およびジエチルエーテル（３×１ml）で洗浄しそして乾燥する。未反応のアミノ官能基は、ＴＨＦ（１ml）中の無水酢酸／ルチジン／１−メチルイミダゾール（１ml）で１時間処理することにより閉鎖する。完成した担体を、ＣＨ2Ｃｌ2（３×１ml）およびジエチルエーテル（３×１ml）で洗浄しそして真空中で乾燥する。導入されたモノメトキシトリチル官能を基にした負荷は１６８μmolg-1である。
【００４３】
実施例４
６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）ヘクス−１−イルサクシニルアミドプロピル−Controlled Pore Glass（Ｍｍｔ−ｈｅｘ−ｓｕｃｃ−ＣＰＧ）
製造は、実施例３に記載された操作と同様にして、ＤＭＦ（３ml）中のアミノプロピル−ＣＰＧ（Fluka)(５５０Å，１.０ｇ）、６−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチルアミノ）ヘクス−１−イルヘミサクシネート（４８.７mg，０.０８２ミリモル）、４−エチルモルホリン（７.６ml）およびＴＢＴＵ（２６.４mg，０.０８２ミリモル）から出発して実施する。ＭＭＴ−ｈｅｘ−ｓｕｃｃ−ＣＰＧ）の負荷は９１μmolg-1である。
【００４４】
実施例５
Ｈ−〔Ａｅｇ(Ｔ)〕3−(ｈｅｘ)
Ｈ−〔Ａｅｇ(Ｔ)〕3−(ｈｅｘ)は、上述した合成方法によって、Ｍｍｔ−Ｈｅｘ−ｓｕｃｃ−Tentagel上で３μモルの規模で合成した。使用されたモノマーは、Ｍｍｔ−Ａｅｇ(Ｔ)−ＯＨである。粗収量は、７１ＯＤ260である。２ＯＤの記録された質量スペクトルは、ｍ／ｅ ９１５.８（Ｍ＋Ｈ)+における所望の生成物およびｍ／ｅ ６５０.５における副生成物Ｈ−〔Ａｅｇ(Ｔ)〕2−(ｈｅｘ)を示す。
【００４５】
実施例６
H-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕2-(hex)
H-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕2-(hex)は、上述した合成方法によって、Ｍｍｔ−Ｈｅｘ−Ｓｕｃｃ−Tentagel上で３μモルの規模で合成した。使用したモノマーは、Ｍｍｔ−Ａｅｇ(Ｔ)−ＯＨおよびＭｍｔ−Ａｅｇ(CBz)−ＯＨである。粗収量は、９８.６ＯＤ260である。粗製生成物３５ＯＤ260を、粗製しそして塩を除去して、所望の化合物１４.５ＯＤ260を得た。粗製された生成物のスペクトロメトリー分析は、単一の主ピークとして所望の生成物ｍ／ｅ １６８５.０（Ｍ＋Ｈ)+を示す。
【００４６】
実施例７
H-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕2-(hex)
H-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(T)〕2-(hex)は、上述した合成方法によって、Ｍｍｔ−Ｈｅｘ−Ｓｕｃｃ−Tentagel上で３μモルの規模で合成した。使用したモノマーは、Ｍｍｔ−Ａｅｇ(Ｔ)−ＯＨおよびＭｍｔ−Ａｅｇ(ＣtBuBz）−ＯＨである。
【００４７】
実施例８
H-〔Aeg(A)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(A)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(A)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(G)-〔Aeg(G)〕-〔Aeg(T)〕-〔Aeg(C)〕-〔Aeg(G)〕-(hex)
このＰＮＡｓは、Ｍｍｔ−Ｈｅｘ−Ｓｕｃｃ−アミノプロピル−ＣＰＧ １３０mg（５μモル）上で、Ecosyn D-300 ＤＮＡ合成器（Eppendorf／Biotronik Maintal）を使用して合成した。
【００４８】
合成において、次の溶液を使用した。
【００４９】
(１) 活性化剤溶液：乾燥したＤＭＦ中の０.３モルＨＡＴＵ溶液
(２) 活性化に対する塩基：乾燥ＤＭＦ中のＮＥＭの０.３モル溶液
(３) Ｍｍｔの開裂：ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸の３％溶液
(４) 中和溶液：７：２：１のテトラヒドロフラン／水／ピリジン
(５) Mmt-Aeg(T)-OH：乾燥ＤＭＦ中のＮＥＭの０.３モル溶液中の０.３モル溶液
(６) Mmt-Aeg(ＡMeOBz)-OH：乾燥したＤＭＦ中のＮＥＭの０.３モル溶液中の０.３モル溶液
(７) Mmt-Aeg(CMeOBz)-OH：乾燥したＤＭＦ中のＮＥＭの０.３モル溶液中の０.３モル溶液
(８) Mmt−Aeg(GiBu)-OH：乾燥したＤＭＦ中のＮＥＭの０.３モル溶液中の０.３モル溶液
合成が終了したときに、ＰＮＡ−ＣＰＧ担体を乾燥しそして上述したように処理する。
収量：２４５ＯＤ260
ＭＳ ３３６９.６（ＥＳ+）：（Ｍ)+
Claims (2)
- 式Ｉ
Ｒoは、水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルカノイル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシカルボニル、Ｃ3〜Ｃ8−シクロアルカノイル、Ｃ7〜Ｃ15−アロイル、Ｃ3〜Ｃ13−ヘテロアロイルまたはオリゴマーの細胞内取込みを有利にする基であり；
Ａは、アミノ酸であり；
ｋは、０〜１０の整数であり；
Ｑは、アミノ酸であり；
ｌは、０〜１０の整数であり；
Ｂは、ヌクレオチド化学において慣用的に使用されている天然のヌクレオチド塩基または非天然のヌクレオチド塩基またはそれらのプロドラック形態であり；
Ｑoは、ヒドロキシル、ＮＨ2またはＮＨＲ″（式中、Ｒ″は、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ2〜Ｃ18−アミノアルキルまたはＣ2〜Ｃ18−ヒドロキシアルキルである）であり；
ｎは、１〜５０の整数である〕
のＰＮＡオリゴマーの製法であって、
（ａ）ｌが０でない場合には、Ｑoを含有するアンカー基Ｌを具備した式II
Ｌ−〔重合体〕 （II）
の重合体支持体上に、ＰＧ−（Ｑ’）−ＯＨ
（式中ＰＧは１−(１−アダマンチル)−１−メチルエトキシカルボニル（Ａｄｐｏｃ）、１−（３,５−ジ−第３級ブチルフェニル）−１−メチルエトキシカルボニル（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニル）エチルオキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、３,５−ジメトキシフェニル−２−プロピル−２−オキシカルボニル（Ｄｄｚ）、トリフェニルメチル（Ｔｒｔ）、（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル（Ｍｍｔ）、（４−メチルフェニル）ジフェニルメチル（Ｍｔｔ）、ジ−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル（Ｄｍｔ）および９−（９−フェニル）キサンテニル（ｐｉｘｙｌ）からなる群から選ばれる弱酸に不安定であるアミノ保護基であり、Ｑ’は場合により側鎖において保護されているアミノ酸Ｑである）
をカップリングさせ、
（ｂ）弱酸に不安定であるアミノ保護基ＰＧを開裂し、
（ｃ）ＰＧ−（Ｑ’）−ＯＨのカップリングおよび工程（ｂ）を（ｌ−１）回反復し、
（ｄ）ｌが０でない場合には、中間体として形成された式III
（Ｑ′)l−Ｌ−〔重合体〕 （III）
の化合物上に、ｌが０である場合には式IIの重合体支持体上に、式IV
（ｅ）弱酸に不安定であるアミノ保護基ＰＧを開裂し、
（ｆ）式ＩＶの化合物のカップリングおよび工程（ｅ）を（ｎ−１）回反復し、
（ｇ）ｋが０でない場合には、さらＰＧ−（Ａ′）−ＯＨ（式中Ａ′は場合により側鎖において保護されているアミノ酸Ａである）をカップリングさせ、
（ｈ）弱酸に不安定であるアミノ保護基ＰＧを開裂し、
（ｉ）ＰＧ−（Ａ′）−ＯＨのカップリングおよび工程（ｈ）を（ｋ−１）回反復し、
（ｊ）Ｒoが水素でない場合においては、基Ｒoを導入し、
（ｋ）中間体として得られた式Ｉａ
- Ａが、グリシン、ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システィン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸およびＮ−（２−アミノエチル）グリシンからなる群から選ばれたアミノ酸であり；
ｋが、０〜６の整数であり；
Ｑが、グリシン、ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システィン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸およびＮ−（２−アミノエチル）グリシンからなる群から選ばれたアミノ酸であり；
ｌが、０〜６の整数であり；
Ｂが、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルからなる群から選ばれる天然ヌクレオチド塩基、またはプリン、２,６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ4Ｎ4−エタノシトシン、Ｎ6,Ｎ6−エタノ−２,６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ3〜Ｃ6）アルキニルウラシル、５−（Ｃ3〜Ｃ6）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシルおよびプソイドイソシトシンから選ばれる非天然ヌクレオチド塩基、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリミジンまたはこれらのプロドラッグ形態；そして
ｎが４〜３５の整数である請求項１記載の式ＩのＰＮＡオリゴマーの製法。
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