KR20120058699A - 올리고머 및 그 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 천연 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 핵산을 대체할 수 있는 올리고머 및 그 제조 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 하기 화학식으로 표시될 수 있으며 용액 상태 및 고체상 합성법으로 합성이 가능하고, 올리고머의 생체내 안정성이 우수하여 치료용 제제나 약학적 용도로 사용하기에 적합하다.
Description
본 발명은 올리고머 및 그 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 DNA 또는 PNA의 유사 물질로 사용할 수 있으면서 생체내 안정성이 우수한 올리고머 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
천연 올리고머(DNA, RNA)는 치료제로서 개발하는데 한계가 있는데, 주된 이유는 주쇄 중 포스포디에스테르 부분이 세포 뉴클리아제에 의해 쉽게 효소 분해되는 취약성으로 인해 생체내 안정성이 낮다는 데 기인한다. 안티센스 분야에서 이러한 일반적인 문제를 극복하기 위하여, 천연 뉴클레오티드의 약리적 특성을 향상시킨 구조적 특징을 갖는 유사물질의 발견과 발전에 상당한 진보가 있었다((Chemistry & Biology 2009, 16, 265).
대표적인 것이 펩티드 핵산(PNAs)인데, 이 물질은 N-(2-아미노에틸) 글리신 유닛을 포함하면서 천연 핵산의 당-포스페이트 주쇄를 갖는 DNA/RNA 유사물질이다.
PNA(peptide nucleic acid)는 DNA 또는 RNA와 상보적 결합력이 탁월하며, 물리화학적으로 매우 안정한 인공핵산(artificial nucleotide)이다. PNA는 자연계 핵산의 골격구조가 폴리아미드(polyamide)로 대체된 핵산으로서, PNA의 화학구조가 자연계 핵산과는 달리 전기적 중성이기 때문에, 상보적인 핵산과 결합할 때 전기적 반발력이 줄어들어 DNA 또는 RNA와 상보적 결합력이 우수한 것으로 알려져 있다.
또한 이때, 상보적인 핵산과의 결합반응의 속도도 빠르게 일어나는데, 염기 개수 및 서열에 따라 정도의 차이는 있지만, PNA-DNA 결합의 경우 DNA-DNA 결합보다 100~5,000배 정도 결합 반응 시간이 빠른 것으로 알려져 있다.
전기적으로 중성인 PNA의 특성은 PNA oligomer를 이용하여 SNP(single nucleotide polymorphism)의 검출을 가능하게 한다. 즉, 상보적인 염기가 서로 맞지 않는 경우의 Tm 값은 상호 완벽하게 맞는 PNA-DNA의 Tm 값보다 크게 낮기 때문에, 온도를 높여 서로 구분할 수가 있다.
또한 PNA 올리고머는 화학적, 물리학적 및 생물학적 안정성이 우수하다. 이는 골격구조가 polyamide 결합으로 이루어져 중성이기 때문에 다른 화학물질과 쉽게 반응이 일어나지 않으며, 또한, 골격구조의 변형으로 핵산분해효소나 단백질 분해효소에 의해 인지되지 않기 때문에 가능하다. 이러한 안정성은 생물세포 안에서 효과를 오래 동안 지속시킬 수 있고, 제품의 유효기간을 대폭 연장할 수 있는 장점을 가져오게 된다.
그러나 PNA 또한 아미드 가수분해(물 첨가에 의한)에 의해 펩티드 결합이 끊어질 수 있다는 문제가 있으며, 그 합성 방법이 복잡하기 때문에 보다 안정적인 DNA 대체 물질의 개발이 요구되고 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 생체내 안정성이 우수한 올리고머 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 또 다른 과제는 상기 올리고머를 제조하기 위한 모노머 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 하기 화학식 (1)로 표시되는 올리고머를 제공한다.
상기 식에서,
A는 -NHR'R 또는 -NR'C(O)R로서, 여기서 R' 및 R은 각각 수소, 알킬, 아미노보호기, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드로 이루어진 군 중에서 선택되고,
B는 각각 독립적으로 천연 핵산염기, 비-천연 핵산염기, DNA 삽입제, 또는 핵산염기-결합기로 이루어진 군 중에서 선택되며,
C는 CO2H-, -CONR'R-, -SO3H 또는 SO2NR'R 또는 -CO2H 또는 -SO3H의 활성화된 유도체이고, 여기서 R' 및 R은 각각 수소, 알킬, 아미노보호기, 리포터 리간드, 킬레이터, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드로 이루어진 군 중에서 선택되고,
n은 1 내지 20의 정수이다.
또한 본 발명은 상기 화학식 (1)의 올리고머를 용액상에서 제조하는 방법 및 고체상에서 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 올리고머를 용액상에서 제조하는 방법은
1) N-말단에 해당하는 모노머와 삼중결합 말단이 보호되어 있고 아지드기를 갖는 모노머를 1,3-다이폴라 고리화 첨가반응시켜 하나의 트리아졸기를 포함하는 1차화합물을 합성하는 단계;
2) 상기 화합물에서 삼중결합 말단을 탈보호시켜 디실릴화된 화합물을 얻는 단계;
3) 상기 디실릴화된 화합물에 삼중결합 말단이 보호되어 있고 아지드기를 갖는 모노머를 1,3-다이폴라 고리화 첨가반응을 통해 추가하는 단계;
4) 2)단계 내지 3)단계를 반복하여 사슬을 연장하는 단계;
5) C-말단에 해당하는 모노머를 첨가반응시켜 올리고머의 합성을 완료하는 단계;를 포함하는 것이 특징이다.
또한 본 발명에 따른 올리고머를 고체상에서 제조하는 방법은
1) 고체지지체에 삼중결합을 도입하는 단계:
2) 삼중결합의 말단이 보호되어 있고 아지드기를 갖는 모노머를 1,3-다이폴라 고리화 첨가반응(Click chemistry)으로 상기 고체지지체에 도입하는 단계:
3) 상기 삼중결합 말단을 탈보호시키는 단계;
4) 상기 2)단계 내지 3)단계를 반복하여 사슬을 연장하는 단계;
5) 상기 올리고머를 고체지치체에서 유리하는 단계;를 포함하는 것이 특징이다.
또한 본 발명은 상기 화학식 (1)의 올리고머를 제조하기 위하여 하기 화학식 (2)로 표시되는 모노머를 제공한다.
상기 식에서,
R1은 N3 또는 N3로 치환 가능한 작용기이며,
R2는 치환 또는 비치환된 알킨기이며,
R3는 수소, 또는 
중에서 선택된다.
이때, 상기 N3로 치환 가능한 작용기는 NH2, OH, Cl, Br로 이루어진 군 중에서 선택되는 것이 바람직하며, R2는 트리알킬실릴아세틸렌, 트리메틸실릴에테르, 트리에틸실릴, t-부틸디메틸실릴, 디메틸데실실릴, 바이페닐디메틸실릴, 트리이소프로필실릴, 바이페틸디이소프로필실릴알킨, 하이드로메틸알킨으로 이루어진 군중에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 올리고머를 제조하기 위한 모노머는 구체적으로 하기 화합물 중 하나일 수 있다.
또한 본 발명은 하기 화학식 (3)로 표시되는 것을 특징으로 하는 올리고머 합성용 아세트산 유도체를 제공한다:
상기 식에서,
B는 각각 독립적으로 천연 핵산염기, 비천연 핵산염기, DNA 삽입제, 또는 핵산염기-결합기로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 구체적인 화합물의 예시로는 하기 화학식 (8) 내지 (11)을 들 수 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티의 합성 과정에서는 상기 화학식 (12) 내지 (15)의 화합물은 상기 화학식 (4) 내지 (7) 중 어느 하나의 화합물과 상기 화학식 (8) 내지 (11)의 화합물을 반응시켜 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 올리고머는 천연 올리고뉴클레오티드(DNA 또는 RNA) 및 그 대체물질로 이용되고 있는 펩티드 핵산(PNA)에 비해 생체 내 안정성이 더욱 우수하기 때문에 치료제 용도나 여러 가지 약리학적, 약학적 용도로 적용하기에 적합하다.
도 1은 DNA, PNA 및 본 발명에 따른 올리고머(1)의 화학구조를 나타내는 도면이다.
도 2은 본 발명에 따른 올리고머의 주쇄 부분의 합성 과정을 나타내는 도면이다.
도 3는 본 발명에 따른 올리고머 Boc 보호된 핵산 염기 아세트산의 합성 과정을 나타내는 도면이다.
도 4는 용액상에서 본 발명에 따른 올리고머를 합성하는 순환 과정을 보여주는 도면이다.
도 5는 용액상 합성법에 따라 본 발명에 따른 올리고머를 합성하는 과정을 보여주는 화학 반응식이다.
도 6은 본 발명의 고체상 합성법에 사용되는 폴리스타이렌계 수지와 핵산 염기를 보여주는 도면이다.
도 7은 고체상 합성법에 따라 본 발명에 따른 올리고머를 합성하는 순환 과정을 보여주는 흐름도이다.
도 8은 고체상 합성법에 따라 본 발명의 올리고머를 합성하는 과정을 보여주는 화학 반응식이다.
도 9은 본 발명의 실시예에 따라 합성된 화합물의 MALDI-TOF 데이터를 보여주는 그래프이다.
도 2은 본 발명에 따른 올리고머의 주쇄 부분의 합성 과정을 나타내는 도면이다.
도 3는 본 발명에 따른 올리고머 Boc 보호된 핵산 염기 아세트산의 합성 과정을 나타내는 도면이다.
도 4는 용액상에서 본 발명에 따른 올리고머를 합성하는 순환 과정을 보여주는 도면이다.
도 5는 용액상 합성법에 따라 본 발명에 따른 올리고머를 합성하는 과정을 보여주는 화학 반응식이다.
도 6은 본 발명의 고체상 합성법에 사용되는 폴리스타이렌계 수지와 핵산 염기를 보여주는 도면이다.
도 7은 고체상 합성법에 따라 본 발명에 따른 올리고머를 합성하는 순환 과정을 보여주는 흐름도이다.
도 8은 고체상 합성법에 따라 본 발명의 올리고머를 합성하는 과정을 보여주는 화학 반응식이다.
도 9은 본 발명의 실시예에 따라 합성된 화합물의 MALDI-TOF 데이터를 보여주는 그래프이다.
이하 실시예 및 도면을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 올리고머는 하기 화학식 (1)로 표시되는 것이 특징이다:
상기 식에서,
A는 -NHR'R 또는 -NR'C(O)R로서, 여기서 R' 및 R은 각각 수소, 알킬, 아미노보호기, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드로 이루어진 군 중에서 선택되고,
B는 각각 독립적으로 천연 핵산염기, 비-천연 핵산염기, DNA 삽입제, 또는 핵산염기-결합기로 이루어진 군 중에서 선택되며,
C는 -CO2H, -CONR'R-, -SO3H 또는 SO2NR'R 또는 -CO2H 또는 -SO3H의 활성화된 유도체이고, 여기서 R' 및 R은 각각 수소, 알킬, 아미노보호기, 리포터 리간드, 킬레이터, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드로 이루어진 군 중에서 선택되고,
n은 1 내지 20의 정수이다.
본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 B는 아데닌 시토신, 티민, 아데닌 및 이들의 유도체 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 또한 상기 B가 핵산염기이고, 상기 핵산염기가 엑소사이클릭 아미노 작용기를 가질 때, 그 아미노 작용기는 산성 조건 하에서 제거할 수 있고 염기 조건에서 안정한 보호기로 보호되는 것이 바람직하다. 이때 상기 보호기로는 t-부틸옥시가르보닐, 아다만틸옥시카르보닐, 벤질옥시카르보닐 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 올리고머를 용액상에서 제조하는 방법은 도 4와 도 5에 상세히 도시되어 있다. 도 4는 용액상에서 본 발명에 따른 올리고머를 합성하는 순환 과정을 보여주는 도면이며, 도 5는 용액상 합성법에 따라 본 발명에 따른 올리고머를 합성하는 과정을 보여주는 구체적인 화학 반응식이 순차적으로 나타나있다.
본 발명에 따른 올리고머를 용액상 합성법을 이용하여 제조하는 방법은
1) N-말단에 해당하는 모노머와 삼중결합 말단이 보호되어 있고 아지드기를 갖는 모노머를 1,3-다이폴라 고리화 첨가반응시켜 하나의 트리아졸기를 포함하는 1차 화합물을 합성하는 단계;
2) 상기 화합물에서 삼중결합 말단을 탈보호시켜 디실릴화된 화합물을 얻는 단계;
3) 상기 디실릴화된 화합물에 삼중결합 말단이 보호되어 있고 아지드기를 갖는 모노머를 1,3-다이폴라 고리화 첨가반응을 통해 추가하는 단계;
4) 2)단계 내지 3)단계를 반복하여 사슬을 연장하는 단계;
5) C-말단에 해당하는 모노머를 첨가반응시켜 올리고머의 합성을 완료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 1)단계에서 트리아졸기를 포함하는 1차 화합물은 하기 화학식(16)으로 표시되는 화합물일 수 있다.
또한 본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 삼중결합의 말단이 보호되어 있고 아지드기를 갖는 모노머는 하기 화학식(13)의 TIPS(트리이소프로필실릴) 보호된 모노머인 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 1)단계 및 3)단계의 1,3-다이폴라 고리화 첨가반응(Click chemistry)은 적절한 용매하에서 촉매, 유기 염기 및 환원제를 사용하여 수행되는 것이 바람직하다.
사용가능한 용매로는 아세토니트릴, 1,4-다이옥산, 디메틸포름아마이드, 디클로로메탄, 디클로로에탄, DMSO, 테트라하이드로퓨란, 톨루엔, 헥사메틸포스포아미드, 부틸 알코올, 이소프로필 알콜, 에틸 알콜, 물 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 이 중에서 디메틸포름아마이드 또는 테트라 하이드로퓨란을 사용하는 것이 바람직하다. 1,3 다이폴라 고리화 반응의 반응 속도는 사용하는 용매에 의존한다.
사용가능한 촉매로는 Cu(O), Cu(Ⅰ)Br, Cu(Ⅰ)Cl, Cu(Ⅰ)I, Cu(Ⅱ)Br, CuSO4, Cu2O, Cu(OAc)2, CuBF4, [Cu(CH3CN)4]PF6, CuBr?SMe2, Cu(CH3CN)4OTf 를 들 수 있으며, 이 중에서 Cu(Ⅰ)I 또는 CuSO4 또는 CuBr?SMe2를 사용하는 것이 바람직하다.
사용가능한 유기 염기로는 1,8-디아자바이씨클로[5,4,0]운테크-7-온(DBU), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA), 트리에틸아민, 탄산칼륨, 탄산나트륨 등을 들 수 있으며, 이 중에서 N,N-다이아이소프로필에틸아민을 사용하는 것이 바람직하다.
또한 사용가능한 환원제로는 L-아스코르빈산 나트륨을 들 수 있다.
본 발명의 일실시예에 의하면 상기 3)단계의 삼중결합 말단을 탈보호하는 단계는 용매의 존재하에서 유기 촉매를 사용하여 수행되는 것이 바람직하다.
사용가능한 유기 촉매로는 예를 들어 플루오르화 칼륨, 질산은, Bu4NF, 탄산 칼륨 등이 있다.
한편 반응 온도는 실온 내지 용매의 비점 범위가 바람직하며, 실온을 유지하는 것이 더욱 바람직하다. 반응 시간은 1 내지 24시간이 적절하고, 8 시간내지 24시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다.
한편 본 발명에 따른 올리고머는 고체상 합성법을 이용하여 제조할 수도 있으며 전체적인 과정은 도 7과 도 8에 도시되어 있다. 도 7은 고체상 합성법에 따라 본 발명에 따른 올리고머를 합성하는 순환 과정을 보여주는 흐름도이며, 도 8은 고체상 합성법에 따라 본 발명의 올리고머를 합성하는 과정을 보여주는 화학 반응식이 나타나있다.
본 발명에 따른 올리고머를 고체상 합성법을 이용하여 제조하는 방법은
1) 고체지지체에 삼중결합을 도입하는 단계:
2) 삼중결합의 말단이 보호되어 있고 아지드기를 갖는 모노머를 1,3-다이폴라 고리화 첨가반응(Click chemistry)으로 상기 고체지지체에 도입하는 단계:
3) 상기 삼중결합 말단을 탈보호시키는 단계;
4) 상기 2)단계 내지 3)단계를 반복하여 사슬을 연장하는 단계;
5) 상기 올리고머를 고체지치체에서 유리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 의하면 상기 2)단계와 3)단계 사이 또는 3)단계와 4) 단계 사이에 세척 단계 및 수지 프리스웰(Preswell) 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용가능한 고체지지체는 아민, 클로라이드, 하이드록시 작용기를 포함하는 고분자 중합체인 것이 바람직하며, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리옥시에틸렌 변형된 폴리스티렌 또는 CPG (controlled pore glass), 폴리스티렌-디비닐벤젠, 메타아크릴산-디메틸아크릴아미드 및 히드록실 메타아크릴산 중에서 선택될 수 있다. 그 중에서 하기 화학식의 메틸벤즈하이드릴아민(MBHA, methylbenzylhydrylamine) 수지인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 1)단계는 고체지지체에 하기 화학식 (22)로 표시되는 모노머를 반응시켜 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 삼중결합의 말단이 보호되어 있고 아지드기를 갖는 모노머는 하기 화학식의 TIPS 보호된 모노머인 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 일실시예에 의하면, 고체상 합성법 중 상기 2)단계의 1,3-다이폴라 고리화 첨가반응(Click chemistry)은 용매하에서 촉매, 유기 염기 및 환원제를 사용하여 수행되는 것이 바람직하다.
사용가능한 용매로는 아세토니트릴, 1,4-다이옥산, 디메틸포름아마이드, 디클로로메탄, 디클로로에탄, DMSO, 테트라하이드로퓨란, 톨루엔, 헥사메틸포스포아미드, 부틸 알코올, 이소프로필 알콜, 에틸 알콜, 물 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 이 중에서 디메틸포름아마이드 또는 테트라 하이드로퓨란을 사용하는 것이 바람직하다. 1,3 다이폴라 고리화 반응의 반응 속도는 사용하는 용매에 의존한다.
사용가능한 촉매로는 Cu(O), Cu(Ⅰ)Br, Cu(Ⅰ)Cl, Cu(Ⅰ)I, Cu(Ⅱ)Br, CuSO4, Cu2O, Cu(OAc)2, CuBF4, [Cu(CH3CN)4]PF6, CuBr?SMe2, Cu(CH3CN)4OTf 를 들 수 있으며, 이 중에서 Cu(Ⅰ)I 또는 CuSO4 또는 CuBr?SMe2를 사용하는 것이 바람직하다.
사용가능한 유기 염기로는 1,8-디아자바이씨클로[5,4,0]운테크-7-온(DBU), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA), 트리에틸아민, 탄산칼륨, 탄산나트륨 등을 들 수 있으며, 이 중에서 N,N-다이아이소프로필에틸아민을 사용하는 것이 바람직하다.
또한 사용가능한 환원제로는 L-아스코르빈산 나트륨을 들 수 있다.
본 발명에 따른 고체상 합성법을 이용한 올리고머 제조 방법에서, 상기 3)단계의 삼중결합 말단을 탈보호하는 단계는 용매의 존재하에서 유기 촉매를 사용하여 수행되는 것이 바람직하다.
사용가능한 유기 촉매로는 예를 들어 플루오르화 칼륨, 질산은, Bu4NF, 탄산 칼륨 등이 있다.
본 발명에 따른 고체상 합성법을 이용한 올리고머 제조 방법에서, 5)단계는 양이온 포착제로 m-크레졸을 포함하는 TFA를 사용하여 수행될 수 있다.
한편 반응 온도는 실온 내지 용매의 비점 범위가 바람직하며, 실온을 유지하는 것이 더욱 바람직하다. 반응 시간은 1 내지 24시간이 적절하고, 8 시간내지 24시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 올리고머는 하기 화학식 (3)로 표시되는 모노머를 사용하여 제조할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 화학식 (1)의 올리고머를 제조하기 위하여 하기 화학식 (2)로 표시되는 모노머를 제공한다.
상기 식에서,
R1은 N3 또는 N3로 치환 가능한 작용기이며,
R2는 치환 또는 비치환된 알킨기이며,
R3는 수소, 또는 
중에서 선택된다.
이때, 상기 N3로 치환 가능한 작용기는 NH2, OH, Cl, Br로 이루어진 군 중에서 선택되는 것이 바람직하며, R2는 트리알킬실릴아세틸렌, 트리메틸실릴에테르, 트리에틸실릴, t-부틸디메틸실릴, 디메틸데실실릴, 바이페닐디메틸실릴, 트리이소프로필실릴, 바이페틸디이소프로필실릴알킨, 하이드로메틸알킨 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 올리고머를 제조하기 위한 모노머는 구체적으로 하기 화합물 중 하나일 수 있다.
또한 본 발명은 하기 화학식 (3)로 표시되는 것을 특징으로 하는 올리고머 합성용 아세트산 유도체를 제공한다:
상기 식에서,
B는 각각 독립적으로 천연 핵산염기, 비천연 핵산염기, DNA 삽입제, 또는 핵산염기-결합기로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 구체적인 화합물의 예시로는 하기 화학식 (8) 내지 (11)을 들 수 있다.
구체적인 B의 예시로는 하기 구조를 갖는 핵산 염기 및 그 유도체를 들 수 있으며, 티민류는 다음과 같다.
시토신류는 다음과 같다.
아데닌류는 다음과 같다.
구아닌류는 다음과 같다.
그 밖에 다음과 같은 유도체도 가능하다.
또한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티의 합성 과정에서는 하기 화학식 (12) 내지 (15)로 표시되는 것을 특징으로 하는 모노머를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 화학식 (12) 내지 (15)의 화합물은 하기 화학식 (4) 내지 (7) 중 어느 하나의 화합물과 하기 화학식 (8) 내지 (11)의 화합물을 반응시켜 제조할 수 있다.
이하에서 실시예를 들어 본 발명을 보다 쉽게 설명하고자 하지만, 이는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
1.
올리고머
주쇄의
합성
실시예
1:
터트
-부틸 2-(
프롭
-2-
이닐아미노
)
에틸카바메이트
(
tert
-
butyl
2-(prop-2-ynylamino)ethylcarbamate)의 제조 [화합물 4]
알려진 방법 (J. Med . Chem. 1990, 33, 97)으로 얻은 터트-부틸 2-아미노에틸카바메이트 (1.35 g, 16.8 mmol)을 THF (50 ml)에 녹인 다음, TEA (2.9 ml, 21 mmol), NaI (126 mg, 0.84 mmol)와 프로파질 브로마이드(0.75 ml, 8.4 mmol)를 첨가하고 가열하여 환류시켰다. 5시간 후, 반응 혼합물을 실온으로 식히고, 용매를 감압 증발시킨 다음, 실리카겔 관 크로마토그래피 (에틸아세테이트:메탄올, 2:1 v/v)로 정제하여 상기 목적화합물 (4, 69%)을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ1.41 (s, 9H), 2.20 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 2.79 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.21 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 3.40 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 4.91 (br s, 1H)
실시예
2:
N
-(2-
아지도에틸
)3-(
트라이아이소프로필실릴
)
프롭
-2-인-1-아민
(
N
-(2-
azidoethyl
)-3-(
triisopropylsilyl
)
prop
-2-
yn
-1-
amine
)의 제조 [화합물 5]
(2)-1:
터트
-부틸 2-
아지도카바메이트의
합성
알려진 방법 (Org . Biomol . Chem. 2007, 5, 636.)으로 얻은 2-아지도-1-에틸아민 (3.75 g, 43.6 mmol)을 THF (100 ml)에 녹인 다음, 0 ?로 냉각시킨 뒤, THF (40 ml)에 용해 된 다이-터트-부틸 다이카보네이트 (9.51 g, 43.6 mmol)를 30분 동안 천천히 첨가하였다. 첨가 후, 30분간 0 oC에서 교반 후, 18시간 동안 상온에서 더 교반하였다. 그 후, 이 반응 혼합물을 감압 증발시키고, 에틸아세테이트로 희석한 뒤, 염화나트륨 수용액으로 세척하였다. 유기층을 마그네슘설페이트를 통해 건조시키고 농축시켜 상기 목적화합물, 터트-부틸 2-아지도카바메이트를 수득 (72%)하였다.
(2)-2:
터트
-부틸 2-
아지도에틸(프롭-2-이닐)카바메이트의
합성
얻어진 터트-부틸 2-아지도카바메이트 (3.26 g, 17.5 mmol)을 DMF (35 ml)에 녹인 다음, 0?로 냉각시킨 뒤 60% NaH (2.1 g, 52.5 mmol)을 첨가하였다. 0?에서 20분 동안 교반한 뒤, 프로파질 브로마이드 (80 wt% in toluene, 3.9 ml, 35.0 mmol)를 천천히 첨가하고 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 그 후, 이 반응 혼합물을 물로 희석하고, 에틸아세테이트로 추출하고 유기층을 염화나트륨 수용액으로 세척했다. 유기층을 마그네슘설페이트를 통해 건조하고 감압 증발한 후 실리카겔 관 크로마토그래피 (n-헥산:에틸아세테이트, 8:1 V/V)로 정제하여 상기 목적화합물, 터트-부틸 2-아지도에틸(프롭-2-이닐)카바메이트를 수득 (77%)하였다.
(2)-3:
터트
-부틸 2-
아지도에틸
(3-(
트라이아이소프로필실릴
)
프롭
-2-
이닐
)
카바메이
트의
합성
얻어진 터트-부틸 2-아지도에틸(프롭-2-이닐)카바메이트 (4.39 g, 19.5 mmol)을 THF (48 ml)에 녹인 다음, -78℃로 냉각시킨 뒤 LHMDS (1M in THF, 21.5 ml, 21.5 mmol)을 첨가하였다. -78℃에서 20분 동안 교반한 뒤, 트리아이소프로필실릴 클로라이드 (4.6 ml, 21.5 mmol)를 천천히 첨가하고 -78℃에서 상온으로 천천히 온도를 올리면서 2시간 동안 교반하였다. 그 후, 이 반응 혼합물을 염화암모늄 포화수용액을 첨가하여, 에틸아세테이트로 추출하고 유기층을 염화나트륨 수용액으로 세척시켰다. 유기층을 마그네슘 설페이트를 통해 건조하고 감압 증발시켜, 실리카겔 관 크로마토그래피 (n-헥산:에틸아세테이트, 15:1 v/v)로 정제하여 상기 목적화합물, 터트-부틸 2-아지도에틸(3-(트라이아이소프로필실릴)프롭-2-이닐)카바메이트를 수득 (55%)하였다.
(2)-4:
N
-(2-
아지도에틸
)3-(
트라이아이소프로필실릴
)
프롭
-2-인-1-
아민의
합성
얻어진 터트-부틸 2-아지도에틸(3-(트라이아이소프로필실릴)프롭-2-이닐) 카바메이트 (2.59 g, 6.8 mmol)는 디클로로메탄 (10 ml)에 녹인 다음, 0℃로 냉각시킨 뒤 TFA (40% in 디클로로메탄, 4 mL)을 첨가하였다. 상온에서 2시간 동안 교반한 뒤, 디클로로메탄으로 희석하여, 염화나트륨 수용액으로 세척하고, 중탄산나트륨 수용액으로 중화하여, 유기층을 마그네슘 설페이트로 건조하고, 감압 증발시킨 뒤, 실리카겔 관 크로마토그래피 (디클로로메탄:메탄올, 20:1 v/v)로 정제하여 상기 목적화합물, N-(2-아지도에틸)3-(트라이아이소프로필실릴)프롭-2-인-1-아민을 수득 (90%)하였다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ1.05 (s, 18H), 2.91 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.43 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.50 (s, 2H)
실시예
3:
메틸
2-(2-
아지도에틸아미노
)아세테이트의 제조 [화합물 6]
알려진 방법 (Org . Biomol . Chem. 2007, 5, 636)으로 얻은 2-아지도-1-에틸아민 (3.85 g, 44.8 mmol)을 디클로로메탄 (100 ml)에 녹인 다음, TEA (7.5 ml, 44.8 mmol)을 첨가하고, 메틸 브로모아세테이트 (4.1 ml, 44.8 mmol)를 10분간 천천히 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 상온에서 24시간 동안 교반한 뒤, 디클로로메탄으로 희석하여, 염화나트륨 수용액으로 세척시켰다. 유기층을 마그네슘 설페이트를 통해 건조시키고 농축시킨 뒤, 실리카겔 관 크로마토그래피 (디클로로메탄:메탄올, 10:1 v/v)로 정제하여 상기 목적화합물, 메틸 2-(2-아지도에틸아미노)아세테이트를 수득 (60%)하였다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ1.70 (br s, 1H), 2.80 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.40 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.43 (s, 2H), 3.71 (s, 3H)
실시예
4:
터트
-부틸-2-(2-
아지도에틸아미노
)
에틸카바메이트의
제조 [화합물 7]
2.
다이
-
터트
-
부틸카바메이트기
보호된
뉴클레오베이스의
합성
실시예
5:
다이
-
터트
-
부틸카바메이트기
보호된 염기를 갖는 아세트산[화합물 8, 9, 10, 11]의 제조
이하 반응식에 따라 화학식 8, 9, 10, 11의 화합물을 합성하였다. 뉴클레오베이스의 터트-부틸카바메이트기(Boc)를 탈보호화 시킴과 동시에 고체상 지지체에서 목적 화합물의 탈리반응을 동시에 수행하기 위해, 본 발명자는 2개의 Boc (bis-Boc)를 보호기를 사용하였다. 또한, 엑소사이클릭 아민 작용기로 완전히 보호하면 염기의 친유성이 증가되는데 이는 유기합성에 가장 보편적인 용매에 용해가 가능하도록 하고, 고체상 지지체의 탈리반응의 조건과 같은 산성 조건에 의해 탈보호화된다.
3.
올리고머
제조용
모노머의
합성
이하에서는 상기 실시예에서 제조된 화학식 4, 5, 6, 7의 모노머와 화학식 8, 9, 10, 11의 뉴클레오베이스 모노머 화합물을 하기 반응식에 따라 반응시켜 화학식 12, 13, 14, 15의 모노머를 합성하였다.
본 발명자는 2-아지도-N-에틸에탄아민 주쇄와 bis-N-Boc 보호된 뉴클레오베이스 아세트산 유닛을 여러 가지 커플링제를 이용하여 연결하고자 했다. 이러한 커플링은 2가지 방법으로 수행될 수 있었다. 퓨린(A, G) 염기는 커플링제로서 Bop(벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 를 사용하고, 피리미딘(C, T) 염기는 결합제로서 EDCI (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드)를 사용하여 반응시켰다.
화학식 12, 13, 14, 15의 염기로는 핵산 염기가 포함되며, 예를 들어 대표적인 천연 염기 G, A, C, T, U 및 그 합성 유도체들이 포함될 수 있다.
실시예
6: 화학식 12의
모노머
제조
12a; base = G (8), 12b; base = A (9), 12c; base = C (10), 12d; base = T (11)
12a, 12b: 화합물 1인 터트-부틸 2-(프롭-2-이닐아미노)에틸카바메이트 (1.3 mmol)을 디클로로메탄에 녹인 다음, 화합물 8 혹은 9 (1.0 mmol), BOP (1.1 mmol), DIPEA (3.0 mmol)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 상온에서 18시간 동안 교반한 뒤, 디클로로메탄으로 희석한 뒤, 0?에서 포화 중탄산나트륨으로 염기화시키고, 1M 시트릭산으로 중화시킨 다음 염화나트륨 수용액으로 세척시켰다. 수층을 디클로로메탄으로 3번 재추출하여 모아진 유기층을 마그네슘 설페이트를 통해 건조시키고 농축시킨 뒤, 실리카겔 관 크로마토그래피 (n-헥산:에틸 아세테이트, 1:4 v/v)로 정제하여 상기 목적화합물을 수득 (12a; 48%, 12b; 60%)하였다.
12c, 12d: 화합물 4인 터트-부틸 2-(프롭-2-이닐아미노)에틸카바메이트 (1.3 mmol)을 디클로로메탄에 녹인 후, 화합물 10 혹은 11 (1.0 mmol), EDCI (1.3 mmol), DMAP (0.1 mmol)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 상온에서 12시간 동안 교반한 뒤, 농축하고 실리카겔 관 크로마토그래피 (n-헥산:에틸아세테이트, 3:1 v/v)로 정제하여 상기 목적화합물을 수득 (12c; 62%, 12d; 65%)하였다.
실시예
7: 화학식 13의
뉴클레오베이스
모노머
제조
13a; base = G (8), 13b; base = A (9), 13c; base = C (10), 13d; base = T (11)
화학식 12과 같은 방법으로 합성하나 화합물 4 대신 화합물 5를 사용한다.
실시예
8: 화학식 14의
모노머
제조
14a; base = G (8), 14b; base = A (9), 14c; base = C (10), 14d; base = T (11)
화학식 12과 같은 방법으로 합성하나 화합물 4 대신 화합물 6을 사용한다.
실시예
9: 화학식 15의
모노머
제조
15a; base = G (8), 15b; base = A (9), 15c; base = C (10), 15d; base = T (11)
화학식 12과 같은 방법으로 합성하나 화합물 4 대신 화합물 7을 사용한다.
4.
용액상
합성법을 이용한
올리고머의
제조
도 5에는 용액상에서 본 발명에 따른 올리고머를 합성하는 화학 반응식이 순차적으로 도시되어 있다. 이하 실시예에서 화학식 번호와 화합물은 도 5를 참조한다. 화학식 16, 17, 18, 19의 염기에는 핵산 염기가 포함되며, 예를 들어 대표적인 천연 염기 G, A, C, T, U 및 그 합성 유도체들이 포함될 수 있다.
실시예
10: 티민 염기로 이루어진 화학식 16의
뉴클레오타이드
모노머의
제조
염기부분에 티민을 포함하는 화학식 13 (1.0 mmol)을 THF에 녹인 다음, DIPEA (1.3 mmol), CuI (1.3 mmol), L-아스코르빈산 나트륨 (1.3 mmol)를 첨가하고, 염기부분에 티민을 포함하는 화학식 12 (1.2 mmol)를 첨가하였다 (click 합성법). 이 반응 혼합물을 상온에서 2시간 동안 교반한 뒤, 디클로로메탄으로 희석하고 암모니아수로 세척시켰다. 유기층은 물, 염화나트륨 수용액 순으로 세척하고, 마그네슘 설페이트를 통해 건조시키고, 유기층을 감압증발 시킨 뒤, 실리카겔 관 크로마토그래피 (디클로로메탄:메탄올, 20:1, v/v)로 정제하여 상기 목적화합물을 수득 (92%)하였다. 상기 합성법 이외에도 CuI 대신 CuBr?SMe2나 CuSO4를 사용가능하고, 용매는 THF 대신 DMF나 CH3CN도 사용할 수 있으며, 반응조건에 따라 염기나 L-아스코르빈산 나트륨을 가감할 수 있다.
MS (ESI) m/z 833.3 ([M+Na]+, 100), 811.0 (12), 733.3 (10), 711.3 (16), 693.3 (3)
실시예
11: 티민 염기로 이루어진 화학식 17의 제조
실시예 8의 화학식 16 (1.0 mmol)을 THF에 녹인 다음, TBAF (1.2 mmol)를 첨가하여 상온에서 3시간 동안 교반하였다 (탈실릴화반응). 이 반응 혼합물을 농축시킨 다음 실리카겔 관 크로마토그래피 (에틸아세테이트:메탄올, 20:1, v/v)로 정제하여 탈실릴화 된 화합물 (말단 아세틸렌 화합물)을 수득 (99%)하였다. 얻어진 말단 아세틸렌 화합물은 실시예 8과 동일한 제조방법(click 합성법)을 이용하여 티민 염기를 갖는 화학식 13와 반응시켜 상기 목적화합물을 수득 (86%)하였다.
MS (ESI) m/z 1023.4 ([M+Na]+, 100), 1024.4 (7), 1023.5 (7), 1002.3 (10), 1001.3 (21)
실시예
12: 티민 염기로 이루어진 화학식 18 및 화학식 19의 제조
화학식 18의 화합물은 실시예 11과 같은 방법 (화학식 17와 같은 방법)으로 합성하고, 화학식 19의 화합물은 화학식 13 대신 티민 염기를 포함하는 화학식 14를 사용하여 말단을 메틸에스터로 종결시킨다.
MS (ESI) m/z 1413.5 ([M+Na]+, 100), 1313.5 (3), 1292.5 (6), 1291.5 (8), 1123.4 (3)
5.1 고체상 합성법을 이용한
올리고머의
제조 방법
본 발명에 따른 올리고머는 고체상 합성법(solid-phase synthesis)을 이용하여 제조할 수 있다. 메리필드에 의해 고안된 고체상 합성법을 이용하면 한 번에 한 아미노산을 연속적으로 첨가하여 거대한 펩티드 사슬을 합성할 수 있으며, 각 단계의 수율이 높고, 상당 부분 자동화가 가능하다는 장점이 있다. 최근 다양한 고체지지체 수지가 개발되면서 널리 이용되고 있다.
본 발명에서는 이미 보고된 여러 가지 조합 합성 방법과 1,3-다이폴라 고리화 첨가 반응을 본 발명의 모노머를 이용한 TNA 올리고머의 합성에 적용하였다. 앞서 서술한 바와 같이 TNA 모노머를 제조한 후, 폴리스티렌, CLEAR®, Tantagel® 같은 폴리옥시에틸렌 변형된 폴리스티렌 또는 CPG (controlled pore glass)등의 적당한 고체상 지지체에서 고체상 합성을 통하여 TNA 올리고머를 제조한다. 고체상 지지체는 이와 같은 예로서 제한되는 것은 아니며, TNA올리고머를 고정할 수 있고 잠재적으로 유리 가능한 아민, 클로라이드, 하이드록시 작용기를 포함한다.
실시예
13: 고체상 지지체에
TNA
모노머
도입
단계 1: 에틸 3-(
프로프
-2-
이닐아미노
)
프로파노에이트의
합성[화합물 20]
에틸 3-아미노프로파노에이트 (10.0 g, 65.1 mmol)를 THF (100 ml)에 용해 후 상온에서 TEA (22.7 ml, 163 mmol)을 가하였다. 충분히 교반 시킨 후, 프로파질 브로마이드 (9.29 g, 78.1 mmol)와 촉매량의 NaI를 첨가하여 상온에서 여섯 시간 교반하였다. 반응 종료 후 반응 혼합물에 물을 더한 후, 에틸아세테이트로 추출하고 마그네슘 설페이트로 건조한 다음 유기 용매를 감압 증발하였다. 잔류물을 실리카겔 관 크로마토그래피 (n-헥산:에틸 아세테이트, 2:1 v/v)로 정제하여 상기 목적 화합물 (4.04 g, 40%)을 얻었다.
단계 2: 에틸 3-(2-5-
메틸
-2,4-
다이옥소
-3,4-
다이하이드로피리미딘
-1(2H)-일)-N-(
프로프
-2-
이닐
)
아세타마이도
)
프로파노에이트의
합성 [화합물 21]
에틸 3-(프로프-2-이닐아미노)프로파노에이트 (4.04 g, 26.0 mmol)를 실온에서 다이클로로메탄 (50 ml)에 녹인 후, EDCI (7.49 g, 39.0 mmol), 촉매량의 DMAP, 2-(5-메틸-2,6-다이옥소-3,4-다이하이드로피리미딘-1(2H)-일)아세틱에시드 (5.75 g, 31.2 mmol)를 더하고 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 반응 혼합물에 물을 더한 후, 디클로로메탄으로 추출하고 마그네슘 설페이트로 건조한 다음 용매를 감압 증발하였다. 잔류물을 실리카겔 관 크로마토그래피 (에틸아세테이트)로 정제하여 상기 목적화합물 (7.20 g, 90%)을 얻었다.
단계 3: 3-(2-(5-
메틸
-2,4-
다이옥소
-3,4-
다이하이드로피리미딘
-1(2H)-일)-N-(프
로프
-2-
이닐
)
아세타마이드
)
프로파놀릭
에시드의
합성 [화합물 22]
에틸 3-(2-5-메틸-2,4-다이옥소-3,4-다이하이드로피리미딘-1(2H)-일)-N-
(프로프-2-이닐)아세타마이도)프로파노에이트 (7.20 g, 23.4 mmol)를 THF (50ml)에 용해한 뒤, 0 oC로 냉각시켜, 1N 수산화리튬 수용액 (46.8 ml, 46.8 mmol)을 더하여 상온에서 한 시간 교반하였다. 반응 종료 후 반응 혼합물에 물을 더한 후, 2N 염산 수용액으로 산성화시켜 에틸아세테이트로 추출한다. 추출된 유기층을 마그네슘 설페이트로 건조한 다음 용매를 감압 증발시켜 상기 목적화합물 (5.88 g, 90% )을 얻었다.
단계 4: 에틸 3-(2-5-
메틸
-2,4-
다이옥소
-3,4-
다이하이드로피리미딘
-1(2H)-일)-N-(
프로프
-2-
이닐
)
아세타마이도
)
프로파노에이트이
도입 된
메틸벤즈하이드릴아
민 레진의 합성 [화합물 P-1]
메틸벤즈하이드릴아민 (MBHA)형태의 레진 (200 mg, 0.16 mmol)을 상온에서 DMF (5 ml)에 넣어 10분간 흔들고, 화학식 22으로 표지 되는 3-(2-(5-메틸-2,4-다이옥소-3,4-다이하이드로피리미딘-1(2H)-일)-N-(프로프-2-이닐)아세타마이드)프로파놀릭 에시드 (141 mg, 0.48 mmol)을 첨가한 후, 같은 온도에서 10분 간 더 흔들어 혼합하였다. 이후, EDCI (92.0 mg, 0.48 mmol), HBOT (64.9 mg, 0.48 mmol), NMM (52.8 ul, 0.48 mmol)을 첨가하여 상온에서 12시간 흔들어 혼합하였다. 반응 종료 후, 상기의 반응 혼합물을 여과하여 디메틸포름아마이드, 디클로로메탄, 디클로로메탄/메탄올 및 메탄올로 반복 세척하여 연갈색 고체상의 레진 (화학식 P-1, 235.7 mg)을 얻었다.
5.2
올리고머
서열
NH
2
-
TCAG
-H의 합성
본 발명에 따른 올리고머 합성은 아민 작용기를 갖는 교차 결합된 폴리스티렌 레진인 메틸벤즈하이드릴아민 레진 (MBHA, methylbenzylhydrylamine resin)에서 수동으로 합성되었다. 레진을 디메틸포름아마이드 용매 하에서 커플링 제제로 EDCI와 HOBT를 사용하여 에틸 3-(2-5-메틸-2,4-다이옥소-3,4-다이하이드로피리미딘 -1(2H)-일)-N-프로프-2-이닐) 아세타마이도)프로파노에이트와 반응시켜 티민 단량체가 도입된 레진을 합성하였다.
실시예
14:
TNA
올리고머
서열
NH
2
-
TCAG
-H의 합성
단계 1:
TNA
올리고머의
1,3-
다이폴라
고리화 첨가반응
상기 화학식 P-1로 표시되는 레진 (235.7 mg, 0.16 mmol)을 DMF (5 ml)에 넣고 상온에서 10분간 흔들어, DIPEA (101 ul, 0.48 mmol), CuSO4 (76.6 mg, 0.48 mmol), L-아스코르빈산 나트륨 (95.1 mg, 0.48 mmol)을 첨가하여 10분간 더 흔들어 준다. 마지막으로 화학식 13으로 표시되는 모노머 (0.32 mmol)를 가한 뒤, 상온에서 24시간 동안 흔들어 혼합하였다. 반응 종료 후, 반응 혼합물을 여과하고 다이메틸포름아마이드, 물, 디클로로메탄, 디클로로메탄/메탄올 및 메탄올로 반복 세척하여 연갈색 고체인 레진 (화학식 P-2, 254.1 mg)을 얻었다.
단계 2:
TNA
올리고머의
삼중결합
탈보호화반응
상기 화학식 P-2로 표시되는 레진 (254.1 mg, 0.16 mmol)을 상온에서 THF (5 ml)에 놓고 흔들고 TBAF (480 ul, 0.48 mmol)을 첨가한 후, 4시간 흔들었다. 반응 종료 후, 상기 반응 혼합물을 여과하고 얻어진 여과물을 디클로로메탄 및 메탄올의 혼합용매로 반복 세척하여 연갈색 고체인 레진 (화학식 P-3, 226.8 mg)을 얻었다.
단계 3:
TNA
올리고머의
탈리반응
상기 화학식 P-6로 표시되는 레진 (226.8 mg, 0.16 mmol)을 25%의 m-크레졸이 혼합된 TFA (5ml)에 넣고 상온에서 3시간 흔들어 혼합하여 핵산염기의 엑소사이클릭아민의 보호기제거와 탈레진 반응으로 동시에 수행하였다. 반응 종료 후, 상기 반응 혼합물을 여과하고 TFA로 반복 세척하여 여과액을 모아 감압 증발시켰다. 잔여액을 에틸에테르에 분산시키고 원심분리하여 상층액을 경사하여 제거하였다. 분리된 고체를 다시 한번 에틸 에테르에 분산시키고 원심분리와 상층액 제거의 과정으로 세척하고 건조하여 TNA 올리고머 (109.5 mg)를 얻었다. 얻어진 TNA 올리고머를 HPLC로 분석하고 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight)로 분자량을 확인하였다.
도 9에는 화학식 23으로 표시되는 올리고머의 MALDI-TOF 그래프가 도시되어 있다.
실시예
15:
TNA
올리고머
서열
NH
2
-
TCACTA
-H의 합성
실시예 14와 동일한 방법으로 수행하되, 메틸벤즈하이드릴아민 (MBHA)형태의 레진 대신, 2-클로로트리틸클로라이드 레진(0.86 mmol/g)을 이용하여 상기의 올리고머를 합성하였다.
Claims (44)
- 하기 화학식 (1)로 표시되는 것을 특징으로 하는 올리고머;
(1)
상기 식에서,
A는 -NHR'R 또는 -NR'C(O)R로서, 여기서 R' 및 R은 각각 수소, 알킬, 아미노보호기, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드로 이루어진 군 중에서 선택되고,
B는 각각 독립적으로 천연 핵산염기, 비-천연 핵산염기, DNA 삽입제, 또는 핵산염기-결합기로 이루어진 군 중에서 선택되며,
C는 -CO2H, -CONR'R-, -SO3H 또는 SO2NR'R 또는 -CO2H 또는 -SO3H의 활성화된 유도체이고, 여기서 R' 및 R은 각각 수소, 알킬, 아미노보호기, 리포터 리간드, 킬레이터, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드로 이루어진 군 중에서 선택되고,
n은 1 내지 20의 정수이다. - 제1항에 있어서,
상기 B는 아데닌 시토신, 티민, 아데닌 및 이들의 유도체 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고머. - 제1항에 있어서,
상기 B가 핵산염기이고, 상기 핵산염기가 엑소사이클릭 아미노 작용기를 가질 때, 그 아미노 작용기는 산성 조건 하에서 제거할 수 있고 염기 조건에서 안정한 보호기로 보호되는 것을 특징으로 하는 올리고머. - 제5항에 있어서,
상기 보호기는 t-부틸옥시가르보닐, 아다만틸옥시카르보닐, 벤질옥시카르보닐 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고머. - 1) N-말단에 해당하는 모노머와 삼중결합 말단이 보호되어 있고 아지드기를 갖는 모노머를 1,3-다이폴라 고리화 첨가반응시켜 하나의 트리아졸기를 포함하는 1차 화합물을 합성하는 단계;
2) 상기 화합물에서 삼중결합 말단을 탈보호시켜 디실릴화된 화합물을 얻는 단계;
3) 상기 디실릴화된 화합물에 삼중결합 말단이 보호되어 있고 아지드기를 갖는 모노머를 1,3-다이폴라 고리화 첨가반응을 통해 추가하는 단계;
4) 2)단계 내지 3)단계를 반복하여 사슬을 연장하는 단계;
5) C-말단에 해당하는 모노머를 첨가반응시켜 올리고머를 합성하는 단계를 포함하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 1)단계에서 1차 화합물은 하기 화학식(16)으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법.
(16)
- 제5항에 있어서,
상기 삼중결합의 말단이 보호되어 있고 아지드기를 갖는 모노머는 하기 화학식 (13)의 트리이소프로필실릴(TIPS)기 보호된 모노머인 것을 특징으로 하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법.
(13)
- 제5항에 있어서,
상기 1)단계 및 3)단계의 1,3-다이폴라 고리화 첨가반응(Click chemistry)은 용매하에서 촉매, 유기 염기 및 환원제를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 용매는 아세토니트릴, 1,4-다이옥산, 디메틸포름아마이드, 디클로로메탄, 디클로로에탄, DMSO, 테트라하이드로퓨란, 톨루엔, 헥사메틸포스포아미드, 부틸 알코올, 이소프로필 알콜, 에틸 알콜, 물 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 용매는 디메틸포름아마이드 또는 테트라하이드로퓨란인 것을 특징으로 하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 촉매는 Cu(O), Cu(Ⅰ)Br, Cu(Ⅰ)Cl, Cu(Ⅰ)I, Cu(Ⅱ)Br, CuSO4, Cu2O, Cu(OAc)2, CuBF4, [Cu(CH3CN)4]PF6, CuBr?SMe2, Cu(CH3CN)4OTf 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 촉매는 Cu(Ⅰ)I 또는 CuSO4 또는 CuBr?SMe2인 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 유기 염기는 1,8-디아자바이씨클로[5,4,0]운테크-7-온(DBU), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA), 트리에틸아민, 탄산칼륨, 탄산나트륨 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 유기 염기는 N,N-다이아이소프로필에틸아민인 것을 특징으로 하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 환원제는 L-아스코르빈산 나트륨인 것을 특징으로 하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 2)단계의 삼중결합 말단을 탈보호하는 단계는 용매의 존재하에서 유기 촉매를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 유기 촉매는 플루오르화 칼륨, 질산은, Bu4NF, 탄산 칼륨 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제5항에 있어서,
반응 온도는 실온 내지 용매의 비점 범위인 것을 특징으로 하는 용액상에서 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 1) 고체지지체에 삼중결합을 도입하는 단계:
2) 삼중결합의 말단이 보호되어 있고 아지드기를 갖는 모노머를 1,3-다이폴라 고리화 첨가반응(Click chemistry)으로 상기 고체지지체에 도입하는 단계:
3) 상기 삼중결합 말단을 탈보호시키는 단계;
4) 상기 2)단계 내지 3)단계를 반복하여 사슬을 연장하는 단계;
5) 상기 올리고머를 고체지치체에서 유리하는 단계를 포함하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제19항에 있어서,
상기 2)단계와 3)단계 사이 또는 3)단계와 4) 단계 사이에 세척 단계 및 수지 프리스웰(Preswell) 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제19항에 있어서,
상기 고체지지체는 아민, 클로라이드, 하이드록시 작용기를 포함하는 고분자 중합체인 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제21항에 있어서,
상기 고체지지체는 폴리스티렌, 폴리옥시에틸렌 변형된 폴리스티렌 또는 CPG (controlled pore glass), 폴리스티렌-디비닐벤젠, 메타아크릴산-디메틸아크릴아미드 및 히드록실 메타아크릴산으로 이루어진 군에서 선택된 고분자 중합체인 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제22항에 있어서,
상기 고체지지체는 하기 화학식의 메틸벤즈하이드릴아민(MBHA, methylbenzylhydrylamine) 수지인 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법.
- 제19항에 있어서,
상기 1)단계는 고체지지체에 하기 화학식 (22)로 표시되는 화합물을 반응시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법.
(22)
- 제19항에 있어서,
상기 삼중결합의 말단이 보호되어 있고 아지드기를 갖는 모노머는 하기 화학식의 TIPS 보호된 모노머인 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법.
(13)
- 제19항에 있어서,
상기 2)단계의 1,3-다이폴라 고리화 첨가반응(Click chemistry)은 용매하에서, 촉매, 유기 염기 및 환원제를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제26항에 있어서,
상기 용매는 아세토니트릴, 1,4-다이옥산, 디메틸포름아마이드, 디클로로메탄, 디클로로에탄, DMSO, 테트라하이드로퓨란, 톨루엔, 헥사메틸포스포아미드, 부틸 알코올, 이소프로필 알콜, 에틸 알콜, 물 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제26항에 있어서,
상기 용매는 디메틸포름아마이드 또는 테트라 하이드로퓨란인 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제26항에 있어서,
상기 촉매는 Cu(O), Cu(Ⅰ)Br, Cu(Ⅰ)Cl, Cu(Ⅰ)I, Cu(Ⅱ)Br, CuSO4, Cu2O, Cu(OAc)2, CuBF4, [Cu(CH3CN)4]PF6, CuBr?SMe2, Cu(CH3CN)4OTf 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제29항에 있어서,
상기 촉매는 Cu(Ⅰ)I 또는 CuSO4 또는 CuBr?SMe2인 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제26항에 있어서,
상기 유기 염기는 1,8-디아자바이씨클로[5,4,0]운테크-7-온(DBU), N,N-다이아이소프로필에틸아민(DIPEA), 트리에틸아민, 탄산칼륨, 탄산나트륨 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제31항에 있어서,
상기 유기 염기는 N,N-다이아이소프로필에틸아민인 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제26항에 있어서,
상기 환원제는 L-아스코르빈산 나트륨인 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제19항에 있어서,
상기 3)단계의 삼중결합 말단을 탈보호하는 단계는 용매의 존재하에서 유기 촉매를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제34항에 있어서,
상기 유기 촉매는 플루오르화 칼륨, 질산은, Bu4NF, 탄산 칼륨 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제19항에 있어서,
상기 5)단계는 양이온 포착제로 m-크레졸을 포함하는 TFA를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 제19항에 있어서,
반응 온도는 실온 내지 용매의 비점 범위인 것을 특징으로 하는 고체상 합성법을 이용하여 제1항에 따른 올리고머를 제조하는 방법. - 하기 화학식 (2)로 표시되는 모노머:
(2)
상기 식에서,
R1은 N3 또는 N3로 치환 가능한 작용기이며,
R2는 치환 또는 비치환된 알킨기이며,
R3는 수소, 또는중에서 선택된다.
- 제38항에 있어서,
상기 N3로 치환 가능한 작용기는 NH2, OH, Cl, Br로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 모노머: - 제38항에 있어서,
상기 R2는 트리알킬실릴아세틸렌, 트리메틸실릴에테르, 트리에틸실릴, t-부틸디메틸실릴, 디메틸데실실릴, 바이페닐디메틸실릴, 트리이소프로필실릴, 바이페틸디이소프로필실릴알킨, 하이드로메틸알킨으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 모노머. - 제38항에 있어서, 하기 화학식으로 표시되는 모노머:
- 하기 화학식 (3)으로 표시되는 것을 특징으로 하는 올리고머 합성용 아세트산 유도체:
(3)
상기 식에서,
B는 각각 독립적으로 천연 핵산염기, 비천연 핵산염기, DNA 삽입제, 또는 핵산염기-결합기로 이루어진 군 중에서 선택된다. - 제41항에 있어서,
상기 B는 아데닌 시토신, 티민, 아데닌 및 이들의 유도체 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고머 합성용 아세트산 유도체. - 하기 화학식 (4) 내지 (7) 중 어느 하나의 화합물과
하기 화학식 (8) 내지 (11)의 화합물을 반응시켜
하기 화학식 (12) 내지 (15)의 모노머를 제조하는 방법:
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