FI110612B

FI110612B - Alkalisia proteaaseja, niitä tuottavia bakteereja, menetelmä näiden alkalisten proteaasien tuottamiseksi, näiden alkalisten proteaasien käyttö ja niitä sisältäviä pesuainekoostumuksia

Info

Publication number: FI110612B
Application number: FI932255A
Authority: FI
Inventors: Graham S Byng; Ernest W Boyer
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 1992-05-18
Filing date: 1993-05-18
Publication date: 2003-02-28
Also published as: EP0571014A1; JPH0678768A; FI932255A; US5385837A; FI932255A0; EP0571014B1; MX9302836A; US5565348A; DE69333463D1; US5518917A

Description

1 110612

Aikalisiä proteaaseja, niitä tuottavia bakteereja, menetelmä näiden alkalisten proteaasien tuottamiseksi, näiden alkalisten proteaasien käyttö ja niitä sisältäviä pesuai-nekooetumuksia 5

Keksintö koskee uusia aikalisiä proteaaseja, jotka ovat peräisin Bacillus-suvun uudelta lajilta, ja niiden johdannaisia. Keksintö koskee myös uutta bakteeria, joka tuottaa tätä alkalista proteaasia, ja myös tämän bakteerin 10 johdannaisia. Keksintö koskee myös menetelmää tämän alka-lisen proteaasin tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää uuden bakteerin viljelyn. Keksintö koskee tämän alkalisen proteaasin käyttöä, pesuainekoostumusta, joka sisältää mainittua alkalista proteaasia, ja menetelmää proteiini-15 tahrojen poistamiseksi kankaasta.

Bakteeriproteaaseja, joilla on kyky hajottaa proteiineja pH-arvoissa, jotka ovat yli 9 ja suurempia, on tunnettu jonkin aikaa. Nämä proteaasit sopivat sisällytettäväksi pesuainekoostumukseen niiden proteiinia hajottavan 20 toiminnan vuoksi, joka toiminta säilyttää aktiivisuutensa i suhteellisen korkeissa pH-arvoissa, jollaisia tyypillises- :: ti käytetään pesuaineilla suoritetuissa pesuissa.

Tunnettujen korkea-alkalisten proteaasien joukossa ovat Takashin julkaistussa EP-patenttihakemuksessa 25 0 204 342 esittelemät, jonka patenttihakemuksen patentti vaatimuksiin sisältyvät alkalinen proteaasi, jonka on tuottanut sukuun Bacillus kuuluva tiettyjä ominaisuuksia osoittava mikro-organismi, ja sen avulla tuotettu alkalinen proteaasi.

30 Julkaisussa The Journal of Biological Chemistry 243, nro 9 (1968) 2184 kuvataan subtilisiini Carlsbergin täydellinen aminohapposekvenssi.

... · Horikoshin et ai. US-patentin 4 052 262 patentti- _ · vaatimuksiin sisältyy menetelmä alkalisen proteaasin val- . . 35 mistamiseksi, joka menetelmä sisältää lajiksi Bacillus sp.

2 110612 nro 221 (ATCC 21522) identifioidun bakteerin viljely sopivassa elatusaineessa.

Ichishima et ai. ovat sisällyttäneet patenttivaatimuksiin alkalisen proteaasin, joka on identifioitu API-5 21:ksi ja karakterisoitu tiettyjen fysikaaliskemiallisten ominaisuuksien avulla, US-patentissa 4 480 037. Tämä pro-teaasi saadaan viljelemällä bakteeria, jonka patentin haltijat karakterisoivat Bacillus sp. nro NKS-21:ksi.

US-patentissa 3 723 250 Aunstrup et ai. esittelevät 10 menetelmän korkea-alkalisten proteaasien, erityisesti sellaisten, joilla on optimaalinen proteolyyttinen aktiivisuus yli noin 9 olevassa pH-arvossa ja joilla säilyy vähintään 80 % niiden maksimaalisesta proteolyyttisestä aktiivisuudesta pH-arvossa 12, valmistamiseksi viljelemällä 15 määrättyjä sukuun Bacillus kuuluvia bakteereja.

US-patentissa 4 002 572 Nijenhuis esittelee Bacil-lus-kannan "PB 92" ja on sisällyttänyt patenttivaatimuksiin tämän kannan käytön sellaisen entsyymin tuottamisessa, jolla on suuri proteolyyttinen aktiivisuus aikalisissä 20 väliaineissa.

jj Aunstrup et ai. ovat sisällyttäneet patenttivaati- :muksiin menetelmän alkalisen proteolyyttisen entsyymin tuottamiseksi, johon menetelmään sisältyy mikro-organis-,·. min, jolle on annettu nimitys B. firmus, kanta NRS 783, 25 vedenalainen viljely, US-patentissa 3 827 938.

. i Aunstrupille et ai. kuuluvassa US-patentissa 3 674 643 sisältyy patenttivaatimuksiin menetelmä proteolyyttisen entsyymin valmistamiseksi viljelemällä bakteeria B. alcalophilus Vedder sopivassa elatusaineessa pH-30 arvossa, joka on väliltä 7,5 - 11.

Tämä keksintö koskee uusia aikalisiä proteaaseja, :tt joilla on suurentunut stabiilius ja jotka osoittavat pa- ...· rantunutta pesukykyä sekoitettuna yleisiin pesuaineisiin.

Keksintö tarjoaa entsyymejä, joilla on erinomainen stabii-. . 35 lius erittäin aikalisissä olosuhteissa ja pesuaineiden 3 110612 läsnä ollessa. Keksintö tarjoaa entsyymejä, joilla on suurempi entsymaattinen aktiivisuus pH-arvon 8,5 yläpuolella kuin tunnetuilla aikalisillä proteaaseilla, ja tämä ero on huomattavin erittäin aikalisissä olosuhteissa.

5 Tämä keksintö koskee aikalisiä proteaaseja, jotka ovat peräisin Bacillus-laj ista, niiden molekyylipaino on 28 kilodaltonia ja niillä on isolelektrinen piste välillä 10 - 11,5 ja että proteaaseilla lisäksi on proteolyyttisen aktii-10 visuuden optimaalinen pH pH-arvossa, joka on väliltä 8,5 - 11,5 ja että ne ovat saatavissa Bacillus proteolyticus -bakteerikannasta NRRL B-18963, NRRL B-18964 tai NRRL B-18965.

15 Keksinnön mukaisten alkalisten proteaasien iso- elektrinen piste on noin 11,1, jossa sen aktiivisuus on maksimaalinen.

Keksinnön mukaiset entsyymit ovat solunulkopuoli-sia korkea-alkalisia proteaaseja.

;,· 20 Tämän keksinnön mukaisilla aikalisillä prote- • · 1". aaseilla proteolyyttisen aktiivisuuden pH-optimi on tavallisesti pH-arvossa 10 tai suurempi.

• ’· Tämän keksinnön mukaisten alkalisten proteaasien

'· ‘ aminopäätteen 20 ensimmäisen aminohapon sekvenssi (SEQ ID

i \ 25 nro 1) on seuraavanlainen:

Ala-Gln-Ser-Val-Pro-Trp-Gly-Ile-Ser-Arg-Val-Gln-Ala-Pro-Ala-Ala-His-Asn-Arg-Gly-Tämän keksinnön mukaisilla aikalisillä proteaaseilla on jäljellä vähintään 70 % niiden alkuperäisestä .·. 30 aktiivisuudesta sen jälkeen, kun niitä on pidetty pH- ..· arvossa 8,0 lämpötilassa 43 °C 11 päivän ajan kaupallises- ‘I. sa nestemäisessä suurtehopesuaineessa. Näillä aikalisillä proteaaseilla on jäljellä vähintään 50 % niiden alkuperäi-*.'*'· sestä aktiivisuudesta sen jälkeen, kun niitä on pidetty 35 pH-arvossa 8,0 tai pH-arvossa 9,6 43 °C:ssa 11 päivän ajan.

4 110612 Tämän keksinnön mukaiset alkaliset proteaasit ovat peräisin Bacillus-bakteerista. Edullisesti ne ovat peräisin alkalofiilisestä Bacillus-bakteerista. Edullisemmin ne ovat peräisin lajin Bacillus proteolyticus -bakteerista 5 tai niiden johdannaisista, jotka on tuottanut luonnollinen modifiointi tai geneettinen muuntaminen.

Tämä keksintö koskee myös lajin Bacillus proteolyticus uusia bakteereja.

Tämä keksintö koskee myös lajin Bacillus proteoly-10 ticus uusia bakteereja, jotka tuottavat keksinnön mukaisia aikalisiä proteaaseja. Nämä Bacillus proteolyticus -bakteerit on talletettu kokoelmaan the Agricultural Research Culture Collection (Peoria, Illinois, USA) Budapestin sopimuksen mukaan. Talletusnumerot ovat seuraavat: Ba-15 cillus proteolyticus -kanta 11-12: NRRL B-18964, Bacillus proteolyticus -kanta 11-13: NRRL B-18963, Bacillus proteo-lyticus -kanta 21-23: NRRL B-18965.

Tämä keksintö koskee myös lajin Bacillus proteolyticus bakteerien luonnollisia tai keinotekoisia mutantteja : ,· 20 ja johdannaisia.

* · Tämän keksinnön mukaiset bakteerit kuuluvat suvun • · '1' , Bacillus uuteen lajiin ja erittävät proteaasia, jolla on I i > ’ erinomainen stabiilius erittäin aikalisissä olosuhteissa •' ja joka proteaasi myötävaikuttaa pesuainekomponenttien 25 läsnä ollessa parantuneeseen pesuvaikutukseen.

Bakteerien, jotka me olemme karakterisoineet la jiksi Bacillus proteolyticus, mikrobiologiset ominaisuudet määritetään teosten R. E. Gordon, W. C. Haynes ja C. H. N. Pang (1973) (The genus Bacillus. Handbook No. 427. U.S.

,·, 30 dept, of Agriculture, Washington, D.C.) ja Bergey's Manual of Systematic Bacteriology vol. 2 (1986) mukaan. Elatusai- t M . neita, joiden pH-arvo on 9,7, valmistetaan lisäämällä 0,9 % kaksiemäksistä natriumfosfaattia ja 1,0 % natriumbi-karbonaattia (pH-arvo säädetään natriumhydroksidin avul- . 35 la) .

» i t 5 110612

Seuraavat morfologiset ominaisuudet on havaittu sen jälkeen, kun on viljelty 34 °C:ssa 2 päivän ajan agar-kasvualustalla, jonka muodosti 0,5 %:sta TRYPTONEA (Dif-co) , 0,5 %:sta hiivauutetta (Difco), 1,0 %:sta glukoosia 5 ja yllä mainitut puskurisuolat. Siten on määritetty, että kantojen, jotka käsittävät uuden lajin Bacillus proteoly-ticus, kaikki solut ovat sauvan muotoisia. Kannan 21-23 koko on noin 0,94 μπι/2,35 pm. Lisäksi kaikilla kannoilla on peritrikkisiä värekarvoja, ne osoittavat liikkuvuutta, 10 ja ne kaikki muodostivat itiöitä, jotka ovat ellipsoidin muotoisia (noin 0,59 pm/1,18 pm kannalla 21-23) turvonneissa itiöpesäkkeissä ja sijaitsevat subterminaalisesti. Kaikkien kantojen todettiin olevan gram-positiivisia.

Seuraavat fysiologiset ominaisuudet, joista on yh-15 teenveto taulukossa 1, koskevat lajin B. proteolyticus eri kantoj a:

Taulukko 1

Fysiologisia ominaisuuksia VP-testi negatiivinen ; ,· 20 indolin tuottaminen negatiivinen t * tärkkelyksen hydrolyysi positiivinen Ί’ sitruunahapon käyttö käytti vähän Koserin elatu- ’ aineessa • * pigmentin tuottaminen ei muodostu solun ulkopuo- 25 lista pigmenttiä katalaasi positiivinen kasvun lämpötila-alue lämpötila väliltä 20 - 57 °C, erityisesti 33 - 35 °C, on hyvä ,·, 30 kasvun pH-alue pH-arvo 7,0 - 12,0, erityi- sesti noin 10,0, on hyvä i ’! . suhtautuminen happeen aerobinen happojen tuottaminen sakka-’d rideista, jotka on annettu V 35 alla olevassa taulukossa: !!! (+ tuotti; - ei tuottanut) > > * 6 110612

Substraatti Kanta Kanta Kanta 11-12 11-13 21-23 erytritoli - - D-arabinoosi - - 5 L-arabinoosi - - riboosi + + + D-ksyloosi - L-ksyloosi - - adonitoli - - 10 l-O-metyyli-p-D- ksylosidi - D-galaktoosi + + + D-glukoosi + + + D-fruktoosi + + + 15 L-sorboosi - - L-ramnoosi - - dulsitoli - inositoli - - D-mannitoli + + + 20 D-sorbitoli - - a-metyyli-D-mannosidi - - - a-metyyli-D-glukosidi + + + N-asetyyliglukosamiini + + + amygdaliini + + + 25 eskuliini - - salisiini + + D-sellobioosi + + + D-maltoosi + + + laktoosi - - 30 melibioosi - - sakkaroosi + + + ; trehaloosi + + + inuliini - - - meletsitoosi - - . 35 raffinoosi - - tärkkelys + + + glykogeeni + + + ksylitoli - - β-gentiobioosi + + + 40 D-lyksoosi - - D-fukoosi - - D-arabitoli - - L-arabitoli - - glukonaatti - - 45 2-ketoglukonaatti - - 5-ketoglukonaatti - - 7 110612 Näiden bakteerien lisäominaisuuksia ovat niiden kestävyys natriumkloridin suhteen (kaikki kannat kasvavat 5-%:ssa NaCl:ssa, mutteivät 7-%:ssa tai 10-%:ssa NaCl:ssa); niiden kyky tuottaa aikalisiä proteaaseja, joi-5 den optimaalinen pH-arvo on 9 tai suurempi ja jotka osoittavat erinomaista stabiiliutta aikalisissä olosuhteissa, kun ne on yhdistetty pesuainekomponenttien kanssa, ja jotka myötävaikuttavat sen vuoksi parantuneeseen pesukykyyn.

Kun tehdään yhteenveto edellä esitetyistä ominai-10 suuksista, tämän keksinnön mukaiset bakteerit ovat gram- positiivisia sauvoja, jotka ovat katalaasin suhteen positiivisia, aerobisia ja tuottavat lämpöä kestäviä sisäiti-öitä. Ne kuuluvat siten sukuun Bacillus. Kantojen on myös todettu olevan sauvoja, joilla on peritrikkisiä värekarvo-15 ja, kasvavan lämpötila-alueella 20 - 57 °C ja omaavan op timaalisen kasvulämpötilan välillä 33 - 35 °C. Nämä kannat ovat alkalofiilejä, jotka kykenevät kasvamaan pH-arvossa 10.

Tunnettuja Bacillus-laj ei a, joilla on samankaltai-: 20 siä ominaisuuksia kuin kysymyksessä olevilla kannoilla, : .· ovat B. pasteurii ja B. alcalophilus. Keksinnön mukaiset . kannat eroavat lajista B. pasteurii siten, että keksinnön ! mukaiset kannat hydrolysoivat tärkkelystä, kun sen sijaan ; _ Bacillus pasteurii ei hydrolysoi, ja keksinnön mukaiset 25 kannat eivät vaadi ammoniumsuoloja lisääntyäkseen alkali- ' ' sessa elatusaineessa, kun taas B. pasteurii vaatii. Lisäk si keksinnön mukaiset kannat eivät kasva 10-%:isen NaCl:n läsnä ollessa, kun taas B. pasteurii kasvaa. Vielä eräs ero on, että yllä kuvatut B. proteolyticus -kannat kykene-: 30 vät kasvamaan lämpötiloissa, jotka yltävät 55 - 57 °C: seen .··· saakka, kun sen sijaan B. pasteurii ei kasva 50 °C:ssa tai •· sen yläpuolella. Lisäksi koska kysymyksessä olevat kannat ovat alkalofiilisiä basilleja, niitä verrataan lajiin Ba-cillus alcalophilus (ATCC 27647). Nämä kannat eroavat . ,* 35 ATCC 27647 -kannasta siten, että keksinnön mukaiset kannat β 110612 eivät tuota happoa L-arabinoosista eivätkä D-ksyloosista, kun taas Bacillus alcalophilus tuottaa. Kanta ATCC 27647 ei kasva 5-%risen NaCl:n läsnä ollessa eikä lämpötiloissa, jotka ovat 50 °C tai korkeampia, joissa olosuhteissa nyt 5 kysymyksessä olevat kannat kasvavat. Koska ainoastaan kahdelle Bacillus-lajille, jotka kykenevät kasvamaan aikalisissä olosuhteissa, on annettu nimet, nyt kysymyksessä olevia kantoja verrataan saatavissa oleviin nimeämättömiin alkalofiilisiin lajeihin Bacillus sp. nro 221 (ATCC 10 21522), nro Y-76 (ATCC 21537 - US-patentti 4 052 262), nro 0-4 (ATCC 21536 - US-patentti 4 052 262), nro A-40 (ATCC 21592), PB-92 (ATCC 31408 - US-patentti 4 002 572) ja kantoihin Y, P, K ja X (EP-patenttihakemus 0 204 342).

Kaikki yllä mainitut kannat ovat alkalofiilisiä 15 bakteereja ja niillä on yhteisenä ominaisuutena kasvu al-kalisessa elatusaineessa (pH 10). Päinvastoin kuin nyt kysymyksessä olevat kannat, Bacillus-isolaatit Y, P, K ja X kasvavat 10-%:isen NaCl:n läsnä ollessa, eivät kasva 47 °C:n yläpuolella, eivät tuota happoa galaktoosista ja 20 tuottavat sitruunan muotoisia sisäitiöitä. Toisin kuin nyt kysymyksessä olevat kannat, Bacillus-kanta PB-92 (ATCC 31408) tuotti happoa ainoastaan riboosista, happoa ei muodostunut muista testatuista substraateista (katso taulukko 2), Bacillus-kannalla PB-92 oli kasvun maksimilämpötila 25 50 °C. Nyt kysyyksessä olevien lajin B. proteolyticus kantojen täydellinen vertailu Bacillus-lajien nro 0-4, A-40 ja 221 kanssa kaikkien muiden mainittujen ATCC-kan-tojen lisäksi on annettu seuraavassa taulukossa 2: 9 110612 •flj

+J

to

H

to

H

•H --------r-----—--—-------—---

•H I

^ r-s. q q o Suo + I I I I I I I I I I 1 I I i I I I vt 2 2 H l H -+

m CQ < rH

y Cl vrl _ ___________ H o 10 ~T ' ~ ^ p ^ «J +I++I + I + + I + I + + + + + I -<f + g pj Ί-1 · H m 2 W 04H ro •_i g ^ <n 4-> 3________ jj s I o ή in p 3 52 N U oi II++I++ I + + I + + + + I I I U"> + 2 Ί-1 3 E-H m α o < -π Z wo) (1) μ________________

>1 ιο I II

iH ^

n I ur^ vo p I

<D ^^ίίη I 1+ + + + + + + + i + + + + ι ι i m + g +> o < r-t

0 z w ^ -H

μ----------------------- a I -μ

ιο a O

55 oun +1++( I I I ++1 + (+ +111 <n +g 3

3 H in -P

rH O C >H

H z ______________

*H

Ur- + m W m ir cm * 1 C ow-c^ II++III I +(((+ + + + +1 m + + :: .2 rH c ο,ό u \

» » . „ iTJ rH W O O H

, , n U -rt Λ H h Q)

. . fl · IrH JC 3 Π1 < JJ

;.; r-| « I 3 Qj M -C ^___________ ^ jj I I μ ' 7" o M :(0

<0 r+ 3 Ο Γ- ^ ;(Q

• j1 o ^+ H vO II++III I +I + I+ + + + +I-3· I I g • ·Ρ pg m oJ^ rsi ,

:.· S -^tt---------------------------S

“ I » 1 1 1 ’ 1 1 1 + 1 1 1 1 1 4 1 1 1 3 1 ' " Π3.ι2>>^·Η(0(0 <n y

X (ä15151- λ; MV X

μ __________ 0 <0 a •r-ι 3 (0

I I en tn '“I

'3 -Η -H — CO 0) ·,Η, to ι 3 -h w e u ai to -p rl it) -H CO 0 ·Η ο tO -Η :0 • 10 (8 +J +J -H -H -rl -H ! C -rl O O CO '•—•H ·· » • 1 (N rilj +J +J 3 1rl ’rl [0 1r| rl rl I Ό rl Ή C 0 ‘rl 1r| 1rl "rl 1H 1 · dP £ • 3W Οΰ W03OWOO'r|-r|rH-r|-r|-r|-rl 0) (0 td SI C ΰ 3 3 <1> I Λθ

.·· o 3 ·Η 33 OOOOPPHCO>iE-rlc:.aOOO>i<DO EH I (0 O (0 H

• 1£ M dl Ρω ·Ηθθμ»Ο·Η·Η>ιΟ>ι(0Η·ΗΟΟΟΟΗΦ·Η -H LO W rH to

1 3 -h h «μ^ΛίΕΐΰΛ^Λμωίο-ΗΗμΜΗαισμ c μ tn to . M

g (rt H 333 0>!33Ε3μμ3α)0'αΗΗΗ32^:03 3:03··3” ,ί |S .J O a) μ 00Η1ι(ΐ)ιι)0ΐ1)Η«11ι:0ι3(1)«ϋ3ϋϋ(1) > ft > H > -h 3 .5 m & c ω ΛΗ cn+i μ E to E en to 3 >11 w E ϋ J) u 3 O to ε w O tn u Ξ1

MC m 3 Ή -Η Ή 3 I I I 1 I I I I H £ tl) I I 3 lH =3 rH 1 3:3 3333 S

™ « j» K g μ hDIQQJQQÖQZOieOOQIIHJ+OKa ϋΗϋΖϋΖ $ 10 110612

Koska tämän keksinnön mukaiset basillikannat ovat selvästi erotettavissa tunnetuista alkalofiilisistä basilleista B. pasteurii, B. alcalophilus, B. alcalophilus alalaji halodurans ja alkalofiilisten basillien nimeämättö-5 mistä jäsenistä, on tarkoituksenmukaista perustaa uusi laji tarkasteltavana olevaa mikro-organismia varten. Niinpä kutsumme tätä uutta bakteerilajia nimellä Bacillus pro-teolyticus.

Tämän keksinnön mukaisia aikalisiä proteaaseja ei 10 voida ainoastaan tuottaa tässä kuvattujen Bacillus proteo-lyticus -isolaattien avulla vaan myös niiden luonnollisten tai keinotekoisten mutanttien ja/tai muiden johdannaisten avulla.

Tämä keksintö koskee myös sellaista menetelmää kek-15 sinnön mukaisen alkalisen proteaasin tuottamiseksi, jossa viljellään uusia mikro-organismeja tai niiden johdannaista sopivassa elatusaineessa aerobisissa olosuhteissa ja sitten otetaan alkalinen proteaasi talteen siitä.

Tämän keksinnön mukaan tuotettuja aikalisiä pro-20 teaaseja voidaan valmistaa kasvattamalla lajin B. proteo- lytlcus tai sen johdannaisen bakteeriviljelmää ja eristämällä ja puhdistamalla tulokseksi saatu tuote käyttäen sinänsä tunnettuja menetelmiä alkalisten proteaasien tuot-. tamiseksi.

25 Kysymyksessä olevien kantojen viljelyyn on mahdol lista käyttää kiinteää tai nestemäistä kasvualustaa, tällaisen kasvualustan täytyy sisältää alkalista puskuriai-netta sekä komponentteja, jotka ovat välttämättömiä bakteerien kasvua varten, so. hiililähde, typpilähde ja epä-30 orgaanisia suoloja.

Puskuriaineen tulisi pitää elatusaineen pH-arvo tasolla 7 - 12 ja edullisesti välillä 8-11.

Sopivia hiililähteitä ovat glukoosi, mannoosi, ... fruktoosi, mannitoli, maltoosi, sellobioosi, sakkaroosi, 35 dekstriini, tärkkelys, hydrolysoitu tärkkelys, melassi, 110612 niiden seokset tai yhdistelmä, jossa on kahta tai useampaa näistä hiililähteistä. Hiililähteinä on edullista käyttää glukoosia ja/tai hydrolysoitua tärkkelystä. Parhaat tulokset saadaan hydrolysoidulla tärkkelyksellä.

5 Typpilähteitä, joita voidaan käyttää, ovat soija jauho, hydrolysoitu soijajauho, kaseiini, maissinliotus-liuos, puuvillansiemenjauho, perunajauho, ohrajauho, entsyymien tuottamat saatavilla olevien proteiinien hydro-lysaatit, rasvattoman kuivamaidon kiinteät aineet, kuivat-10 tu hiiva, hiivauute, niiden seokset tai yhdistelmä, jossa on kahta tai useampaa näistä typpilähteistä. Typpilähteitä, joita on edullista käyttää, ovat soijajauho, hydrolysoitu soijajauho, puuvillansiemenjauho, entsyymien tuottamat proteiinihydrolysaatit, rasvattoman kuivamaidon kiin-15 teät aineet, hiivauute ja yhdistelmä, jossa on kahta tai useampaa näistä aineista. Edullisemmin typpilähteitä ovat soijajauho, hydrolysoitu soijajauho, puuvillansiemenjauho, hiivauute ja yhdistelmä, jossa on kahta tai kolmea näistä aineista. Parhaat tulokset saadaan käyttäen hydrolysoitua ·· 20 soijajauhoa.

Kaliumfosfaatti, kalsiumkloridi, kalsiumklorididi-hydraatti, natriumsulfaatti, natriumsitraattidihydraatti, ' magnesiumsulfaatti ja niiden seokset edustavat sopivia epäorgaanisia suoloja.

V 25 Esimerkkejä sopivista aikalisistä puskuriaineista ovat dinatriumvetyfosfaatti, dikaliumvetyfosfaatti, natriumkarbonaatti, kaliumkarbonaatti, natriumbikarbonaatti, natriumfosfaatti, natriumtetraboraatti ja yhdistelmä, jossa on kahta tai useampaa näistä puskuriaineista. Edulli- ’· * 30 sesti käytetään aikalisinä puskuriaineina dinatriumvety- fosfaattia, dikaliumvetyfosfaattia, natriumkarbonaattia, • · ··. natriumbikarbonaattia, natriumfosf aattia tai yhdistelmää, .... jossa on kahta tai useampaa näistä puskuriaineista.

* * Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää automaattista * • * 35 pH-arvon kontrollointitapaa lisäämällä erilaisia emäksisiä 12 110612 reagoivia aineita. Haluttaessa voidaan lisätä muita orgaanisia tai epäorgaanisia aineita, jotka ovat tarpeellisia bakteerikantojen kasvua tai entsyymien tuottamista varten.

5 Elatusaineet, jotka sisältävät yllä olevat kom ponentit, steriloidaan tavanomaisesti ja niihin istutetaan yhtä tämän keksinnön mukaisista kannoista. Viljelyä voidaan suorittaa aerobisesti ravistaen tai käyttäen ilmastaen ravistamista edullisesti 30 - 40 °C:ssa 30 - 120 tunnin 10 ajan kasvuliemen saamiseksi.

Sen jälkeen kun biomassa on poistettu käyttäen tunnettuja menetelmiä, kuten mikrosuodatusta, sentrifu-gointia, ultrasuodatusta, höytysaostusta ja höytysaostus-ta, jota seuraa ultrasuodatus tai sentrifugointi, superna-15 tantille suoritetaan yksi tai useampia sellaisia menettelyjä kuin tavanomainen suolaus irti liuoksesta, saostami-nen lisäämällä orgaanista liuotinta, ultrasuodatus, tiivistäminen alennetussa paineessa, ioninvaihto tai gee-. . lisuodatus raakojen tai puhdistettujen entsyymien kokoami- |··# 20 seksi jauheen tai väkevöidyn nesteen muodossa. Kaikki täs- * · :·ί sä kuvatut kannat tuottavat kolmen sellaisen alkalisen « ·. * proteaasin yhdistelmää, joiden isoelektriset pisteet ovat ·.*· väliltä 10 - 11,5 (määritettynä kromatofokusoinnin avul- :'** la) .

* ♦ :Y 25 Tärkein proteaasientsyymi voidaan puhdistaa seuraavasti: Bakteerin viljelyn jälkeen kasvuliemi sentrifu- goidaan supernatantin saamiseksi. Tähän supernatanttiin lisätään höytelöivää ainetta, kuten tuotetta, jota myydään ; tavaramerkkinä CYNCAL, vettä ja suodatuksen apuainetta, * · 30 kuten seosta, joka sisältää dikalsiumsilikaattia ja dikal- > ’·; ^ siumaluminaattia, tai seosta, jota myydään tavaramerkkinä ··· CELITE, ja sekoitetaan perusteellisesti.

·;· Tulokseksi saatu liete suodatetaan. Proteaasit sa- V ostetaan tulokseksi saadusta kirkkaasta suodoksesta tavan- 35 omaisen liuoksesta irti suolauksen avulla, jossa lisätään kiinteää natriumsulfaattia ja sekoitetaan. Seosta, 13 110612 joka sisältää dikalsiumsilikaattia ja dikalsiumaluminaat-tia, lisätään sitten ja suodatetaan käyttäen esipäällys-tettyä suodatinta. Suodattimelle jääneet kiinteät aineet kuivataan sitten alennetussa paineessa. Kuivaa jauhetta 5 uutetaan sitten puskuriliuoksella. Liukenematon aine poistetaan hitaan sentrifugoinnin avulla ja tulokseksi saatu supernatantti kirkastetaan suodattamalla. Liuos diasuoda-tetaan sitten vettä vastaan käyttäen ultrasuodatinta suolojen poistamiseksi. Tulokseksi saatu liuos lisätään sit-10 ten ioninvaihtopylvääseen kuten DEAE-selluloosa (Whatman) -ioninvaihtopylvääseen, joka on aikaisemmin tasapainotettu puskuriliuoksella kuten 0,01 M natriumfosfaattipuskuriliu-oksella (pH 6,5), ja eluoidaan samalla puskuriliuoksella. Proteaasi ei sitoudu pylvääseen ja eluoituu välisijatila-15 vuudessa. Tämä lisätään sitten pylvääseen, joka sisältää agaroosia, johon on sidottu sininen väriaine affiniteettiligandi. Proteaasi sitoutuu agaroosipylvääseen ja eluoidaan. Viimeksi mainitusta pylväästä saatu eluaatti diasuodatetaan suolojen poistamiseksi ja retentaatti lyö- * · ··· 20 filisoidaan, mikä johtaa puhdistettuun proteaasivalmistee- M seen.

·,’· Tämä keksintö koskee myös pesuainekoostumuksia, : jotka sisältävät vähintään keksinnön mukaista alkalista proteaasia.

25 Tämä keksintö koskee myös pesukoostumuksia, jotka sisältävät tehokkaan määrän keksinnön mukaista alkalista proteaasia.

Entsyymi voidaan formuloida pesukoostumuksiksi ta- , vanomaisesti ja entsyymiä sisältävät pesukoostumukset muo- 30 dostavat keksinnön vielä yhden puolen. Keksinnön mukaista >· entsyymiä sisältävät pesukoostumukset sisältävät lisäksi » >· vähintään pesuainetta. Pesuaineet, jotka ovat hyödyllisiä näissä pesukoostumuksissa ja sopivat yhteen lisätyn ent-syymin kanssa, ovat yleensä ionoitumattomia ja anio-35 nisiä pinta-aktiivisia yhdisteitä, kuten vesiliukoisia 14 110612 saippuoita, anionisia, ionoitumattomia, amfolyyttisiä ja kahtaisionipesuaineita.

Esimerkki yleisesti käytetystä pesuaineesta on natriumdodekyylibentseenisulfonaatti, vaihtoehtoisesti 5 natrium- lineaarinen alkyyli -bentseenisulfonaatti ja primaarinen alkyylisulfaatti. Edullisesti se on natriumdode-kyylibentseenisulfonaatti.

Esimerkki ionoitumattomasta pesuaineesta on suunnilleen Ci3-i5-primaarisen alkoholin etoksylaatti, jossa on 10 7 etoksylaattijäännöstä moolia kohti, tai seos, jossa on tätä ja vastaavaa alkoholia, joka on etoksyloitu käsittämään 3 jäännöstä moolia kohti.

Yllä olevat pesukoostumukset voivat sisältää li-säyhdisteitä, joita tavallisesti käytetään proteolyyttistä 15 aktiivisuutta sisältävissä pesuainekoostumuksissa. Ne voivat sisältää kompleksisia fosfaatteja, kuten alkalimetal-litripolyfosfaattia, kuten natriumtripolyfosfaattia, tai alkalimetallipyrofosfaattia. Lisäksi tai vaihtoehtoisesti , , voidaan liittää mukaan sellaisia yhdisteitä kuin alkalime- * » 1 2 3 4 5 6 tallisyaanitriasetaatti ja alkalimetallisitraatti. Niiden » > 2 h! vaikutus pesukoostumuksissa on moninainen, mutta niiden 3 » • « 4 ’ tärkein vaikutus on veden pehmentäjinä.

: · Muita yhdisteitä, joita tavallisesti liitetään mu 5 kaan, ovat tehoaine (structurant) , esimerkiksi alkalime- 6 tallisilikaatti ja edullisesti natriumsilikaatti, heikosti alkaliset yhdisteet, kuten alkalimetallibikarbonaatti, täyteaineet, kuten alkalimetallisulfaatti ja edullisesti natriumsulfaatti, ja eräät muut yhdisteet, kuten karboksi-. metvyliselluloosa, natriumkarboksimetyvliselluloosa, ha- ;ti 30 justeet ja optiset kirkastajat.

’·> Vielä eräs tavallisesti mukaan liitetty yhdiste on ··* perboraatti-valkaisuaineen edeltäjä, kuten alkalimetalli- .. perboraatti ja edullisesti natriumperboraatti.

Formuloitaessa entsyymi edullisesti sekoitetaan 35 yhden komponenteista, kuten esimerkikisi täyteaineen, t i > 15 110612 kanssa tunnetun entsyymiaktiivisuuden omaavan tiivisteen valmistamiseksi, joka tiiviste voidaan sitten sekoittaa muiden haluttujen komponenttien kanssa.

Pesukoostumukset voivat myös sisältää emäksen ha-5 luttuun pH-arvoon säätämiseksi ja neutraalia epäorgaanista suolaa kuten natriumsulfaattia.

Pesukoostumukset voivat myös sisältää akryylipoly-meeriä, kuten polyakryylihappoa, vaihtoehtoisesti akryyli /malei inise kapolymeeriä .

10 Pesukoostumukset voivat myös sisältää aminoryhmiä sisältävää valkaisuaineen aktivaattoria, kuten tetra-asetyylieteenidiamiinia.

Pesukoostumukset voivat myös sisältää tseoliittia tehoaineena, kuten tyyppiä A ZEOLITE.

15 Keksinnön mukainen pesukoostumus voi sisältää mui ta entsyymejä kuin tässä yllä määritellyn mukaisen alkali-sen proteaasin. Se voi sisältää neutraalin proteaasin, al-kalisen proteaasin, proteaasin, joka on peräisin lajista Bacillus subtilis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefa-: : : 20 ciens, Bacillus licheniformis tai B. alcalophilus, amylaa- : : sin, sellulaasin, lipaasin tai yhdistelmän, jossa on kaksi '. * * * tai useampia näistä muista entsyymeistä.

·. Esimerkki pesukoostumuksesta voi sisältää keksin- ·’. nön mukaisen entsyymin ja pesuaineen, vedenpehmennysai- 25 neen, alkalimetallisilikaatin, heikosti alkalisen bikar-bonaatin ja valinnaisesti alkalimetalliboraatin.

Esimerkki keksinnön mukaisesta vesipitoisesta nestemäisestä pesuaineesta formuloidaan sisältämään dodekyy-libentseenisulfonihappoa, C12-1 ^-lineaarista alkoholia, jo-'· ’· 30 ka on kondensoitu 7 moolin eteenioksidia/mooli kanssa, mo- noetanoliamiinia, sitruunahppoa, natriumksyleenisulfonaat-... ‘ tia, natriumhydroksidia, keksinnön mukaista proteaasia ja vettä.

• Tämä keksintö koskee myös pesuainekoostumusta, jo- 35 ka sisältää pesuaineena aktiivisen koostumuksen ja tehok- 16 110612 kaan määrän tässä yllä määritellyn mukaista alkalista pro-teaasia.

Tämä keksintö koskee myös rakeista pesuainekoostu-musta, joka sisältää pesuaineena aktiivisen koostumuksen 5 ja tehokkaan määrän tässä yllä määritellyn mukaista alkalista proteaasia ja sisältää myös vähintään yhtä aineista tehosteaine, vaalenne tai valkaisuaine.

Monia sellaisia tehoste-, valkaisu- tai vaalenne-aineita tunnetaan alalla.

10 Tämä keksintö koskee myös nestemäistä pesu- ainekoostumusta, joka sisältää pesuaineena aktiivisen koostumuksen ja tehokkaan määrän tässä yllä määritellyn mukaista alkalista proteaasia ja lisäksi sisältää vähintään yhtä aineista vaalenne tai valkaisuaine.

15 Tämä keksintö koskee myös nestemäistä pesu- ainekoostumusta, joka sisältää tässä yllä määritellyn mukaisen alkalisen proteaasin. Tämä nestemäinen pesu-ainekoostumus voi olla vesi- tai ei-vesikoostumus. Usein tämä nestemäinen pesuainekoostumus sisältää entsyyminsta-·>’< 20 bilointiaineen varastoinninkestävyyden parantamiseksi. Μου; nia sellaisia entsyyminstabilointiaineita tunnetaan alal- la, esim. polyoli, kuten propeeniglykoli. Keksintö koskee :erikoisesti homogeenistä nestemäistä pesuainetiivistettä.

Tämä keksintö koskee myös rakeista pesuainekoostu- 25 musta, joka sisältää tässä yllä määritellyn mukaisen alkalisen proteaasin.

Tämä keksintö koskee myös menetelmää proteiinitah-rojen poistamiseksi kankaasta, joka menetelmä käsittää mainitun kankaan pesemisen tässä yllä määritellyn mukai-’ 30 sella pesuainekoostumuksella.

Tätä keksintöä valaistaan lisäksi seuraavien esi-'· merkkien avulla.

110612

Esimerkki 1

Seulontamenetelmä, jota käytetään keksinnön mukaisten kantojen eristämiseksi normaalilta pellolta, suoritetaan seuraavasti: 5 1) Alkalofiilisten bakteerien eristäminen

Noin 1 g multaa tutkittavista näytekohdista suspen-doidaan 9 ml:aan suolaliuosta (0,8 % NaCl). Osa tästä suspensiosta (0,1 - 1,0 ml) levitetään sellaisen agarlevyn pinnalle, joka sisältää seuraavaa elatusainetta: 0,8 % 10 (paino/tilavuus) hydrolysoitua soijajauhoa, jota myydään tavaramerkkinä HY SOY (Sheffield Products), 0,044 % (paino/tilavuus) kalsiumkloridia, 2,1 % (paino/tilavuus) hydrolysoitua tärkkelystä, jota myydään tavaramerkkinä MALTRIN 100 (Grain Processing), 2 % (paino/tilavuus) ras-15 vattoman kuivamaidon kiinteitä aineita, 0,84 % (paino/tilavuus) natriumbikarbonaattia ja 0,1 % dinatriumvetyfos-faattia. Tämä jähmetetään käyttäen 1,5 % agaria. Maljoja inkuboidaan 32 °C:ssa 3 päivän ajan alkalofiilisten basillien saamiseksi.

20 2) Alkalista proteaasia tuottavien bakteerien eris täminen

Yllä olevassa menetelmässä 1) saadut alkalofiiliset , bakteerit lisäpuhdistetaan samaa kasvualustaa sisältävillä maljoilla ja inkuboidaan 32 °C:ssa 2 päivän ajan, sitten ,·,* 25 sellaisia, jotka ovat muodostaneet kirkastuneen kehän, • ’ kootaan alkalista proteaasia tuottavina bakteereina.

3) Korkea lämpötila -seulonta

Kaikkia yllä olevassa menetelmässä 2) valittuja bakteereja uudelleensivellään samalle kasvualustalle ja 30 tutkitaan kasvu 57 °C:ssa 48 tunnin inkubaation jälkeen.

4) Stabiilin alkalisen proteaasin tuottajien valin-ta

Kaikkia yllä menetelmässä 3) valittuja bakteereja kasvatetaan nestemäisessä elatusaineessa, joka sisältää 35 0,5 % proteiinihydrolysaattia, jota myydään tavaramerkkinä 18 110612 TRYPTONE (Difco Labs), 0,5 % hiivauutetta, 1,0 % glukoosia, 0,42 % natriumbikarbonaattia, 0,53 % natriumkarbonaattia, 0,1 % dikaliumvetyfosfaattia. Näitä inkuboidaan 37 °C:ssa ravistaen nopeudella 200 kierrosta minuutissa 5 yön ajan. Tämä siirretään sitten toiseen erään samaa ela-tusainetta käyttäen 5 % (tilavuus/tilavuus) istutemäärää ja inkuboidaan ravistaen 37 °C:ssa 5 tunnin ajan. 5 % istute siirretään sitten proteaasintuottoelatusaineeseen, joka sisältää 2,4 % soijajauhoa, 4,8 % hydrolysoitua tärk-10 kelystä, jota myydään tavaramerkkinä MALTRIN 100 (Grain Processing), 0,9 % dinatriumvetyfosfaattia ja 1,0 % natriumbikarbonaattia, pH 9,5, ja inkuboidaan 37 °C:ssa 40 tunnin ajan ravistaen voimakkaasti (300 kierrosta minuutissa). Biomassa poistetaan hitaan sentrifugoinnin avulla 15 ja proteaasin stabiilius pH-arvossa 9,5 55 °C:ssa tutkitaan seuraavalla tavalla. 50 μΐ alkalisen proteaasin sisältävää supernatanttia lisätään 12,7 mm:n tyhjille paperisille bakteerinvastainen testi -kiekoille sellaisten agarmaljojen pinnalla, jotka sisältävät yllä menetelmässä 20 1) kuvatun koostumuksen. Kirkastuvien proteaasiakttivisuu- den vyöhykkeiden kokoa tarkkaillaan 10 tunnin aikana inku-boiden 55 °C:ssa. Vyöhykkeen koon jatkuvan laajenemisen • : katsotaan merkitsevän lisääntynyttä stabiiliutta.

: Kaikki valitut bakteerit tutkitaan, karakterisoi- 25 daan ja luokitellaan julkaisujen R. E. Gordon (1973) ja Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, voi. 2 (1986) mukaan. Lisäksi tutkitaan hapon tuottaminen hiilihydraateista käyttäen muunnelmaa pienoismallia olevasta koejärjestelmästä API rapid CH (DMS Laboratories, Inc., NJ). 30 Tässä ohjeessa organismeja pannaan aikalisille ravinto-agarlevyille, jotka on valmistettu lisäämällä 1,0 % natriumbikarbonaattia ja 0,9 % dinatriumvetyfosfaattia kasvualustaan NUTRIENT AGAR (Difco), ja inkuboidaan 35 °C:ssa 48 - 72 tunnin ajan. 5 maljan kasvu organismia kohti 35 uudelleensuspendoidaan 25 ml:aan tymolisininen-liuosta ► 5 * 19 110612 (joka sisältää 0,5 % TRYPTONE (Difco), 0,5 % hiivauutetta, 0,5 % natriumsulfaattia ja 0,015 % tymolisinistä (Fisher Scientific Co. NJ) säädettynä pH-arvoon 9,2 10 N NaOH:n avulla. Tämä lisätään sitten mikrokoetarvikkeiden ampul-5 leihin ja mikä tahansa värin muutos sinisestä lähtötilanteesta merkitään muistiin 48 tunnin aikana. Stabiileimman alkalisen proteaasin tuottajat aikaansaavat kaikki tunnusomaisen hapontuottotuloksen hiilihydraateista, toisin sanoen erilaisen kuin saadaan miltään muulta alkalofiilisel-10 tä Bacillus-lajilta, ja tämä oikeuttaa siten uuden Bacil-lus-laj in perustamisen: Bacillus proteolyticus. Tämä bak teerien ryhmä, joka on eristetty luonnon lähteistä, käsittää B. proteolyticus -kannat 11-12, 11-13 ja 21-23. Nämä

Bacillus proteolyticus -bakteerit on talletettu kokoelmaan 15 the Agricultural Research Culture Collection (Peoria, Illinois, USA) Budapestin sopimuksen mukaan. Talletusnumerot ovat seuraavat: Bacillus proteolyticus -kanta 11-12: NRRL

B-18964, Bacillus proteolyticus -kanta 11-13: NRRL B- 18963, Bacillus proteolyticus -kanta 21-23: NRRL B-18965. 20 Esimerkki 2 - Kantojen viljely : i Bacillus proteolyticus -kannan 21-23 (NRRL B- 18965) jäädytettyä käyttöviljelmää (säilytetty 10-%:isessa glyserolissa) käytetään istuttamiseen siemenelatusainee-seen, joka sisältää 0,5 % TRYPTONEA (Difco), 0,5 % hiiva-• 25 uutetta (Difco) ja 1,0 % glukoosia deionoidussa vedessä.

Se sisältää myös 0,9 % dinatriumvetyfosfaattia ja 1,0 % natriumbikarbonaattia. Tämä puskuriliuos valmistetaan kon-sentraattina, säädetään pH-arvoon 9,5 NaOH:n avulla, steriloidaan erikseen ja lisätään jäähtyneenä siemenkolviin. ’.'· 30 Viljelmää inkuboidaan ravistaen 34 °C:ssa, kunnes viljel- mä saavuttaa solutiheyden, joka vastaa Klett-arvoa 400 ... · yksikköä mitattuna Klett-Sommerson-fotometrin avulla (Klett Manufacturing Co., NY, USA). Tätä viljelmää .. istutetaan sitten (käyttäen 5 % istutemäärää) 10 l:aan 35 samaa elatusainetta, joka on 10 l:n fermentorissa, 20 1106 1 2 mitä viljellään sitten ilmastaen (0,5 vvm) ja sekoittaen (500 kierrosta minuutissa) 34 °C:ssa, kunnes viljelmä jälleen saavuttaa solutiheyden, joka vastaa 400 Klett-yksikköä. Tästä istutetaan 100 l:n tuotantofermentoriin 5 käyttäen 5 % istutemäärää. Tämä fermentori sisältää 0,33 % natriumsitraattidihydraattia, 0,26 % kalsiumklorididi-hydraattia, 1,87 % hydrolysoitua soijajauhoa, jota myydään tavaramerkkinä HY SOY (Sheffield), 2,93 % puuvillansiemen-jauhoa, jota myydään tavaramerkkinä PHARMAMEDIA (Traders 10 Protein), 10,93 % hydrolysoitua tärkkelystä, jota myydään tavaramerkkinä MALTRIN M-50 (Grain Processing), 0,2 % vaahdonestoainetta, jota myydään tavaramerkkinä MAZUR P-2000 -vaahdonestoaine (Mazur Chemical Co.) pehmennetyn veden kanssa. Puskuriliuos sisältää 0,9 % dinatriumvetyfos-15 faattia ja 1,0 % natriumbikarbonaattia deionoidussa vedessä (7,0 %:a lopullisesta tilavuudesta). Se säädetään pH-arvoon 9,7 NaOH:n avulla ja steriloidaan erikseen. Täydellisen elatusaineen lopulliseksi pH-arvoksi säädetään 9,7 NaoH:n avulla. Tätä viljellään sitten 34 °C:ssa 78 tunnin ·.· 20 ajan ilmastaen (0,5 vvm) ja sekoittaen (400 kierrosta mi- : : nuutissa) käyttäen vastapainetta, joka on suuruudeltaan 10 :*·.· psi. 78 tunnin viljelyn jälkeen alkalisen proteaasin saan- to on 37 APU (alkalisen proteaasin yksikköä) /ml superna-*.· tanttia.

·· 25 Esimerkki 3 - Alkalisen proteaasin puhdistus Tärkein proteaasientsyymi puhdistetaan B. proteo-lyticus -kannasta 21-23 (NRRL B-18965) seuraavasti. Bakteerin viljelyn jälkeen kasvulientä sentrifugoidaan nopeudella 1 300 kierrosta minuutissa (27 300 g) 60 minuutin ·.’· 30 ajan supernatantin saamiseksi. 4 1: aan supernatanttia li sätään 50 g höytelöivää ainetta, jota myydään tavaramerkkinä CYNCAL (50 paino/paino-%) , 150 ml vettä ja 200 g seosta, joka sisältää dikalsiumsilikaattia ja dikalsiuma-.. luminaattia ja jota myydään tavaramerkkinä CELITE 512, ja 35 sekoitetaan perusteellisesti. Tulokseksi saatu liete suo- 110612 21 datetaan käyttäen suodatinta, joka on ennalta päällystety tuotteella, jota myydään tavaramerkkinä CELITE 512. Pro-teaasit saostetaan tulokseksi saadusta kirkkaasta suodok-sesta tavanomaisen liuoksesta irti suolauksen avulla, jos-5 sa lisätään kiinteää natriumsulfaattia lopulliseksi pitoisuudeksi 29 % (paino/tilavuus) ja sekoitetaan 1 tunnin ajan. Noin 50 g tuotetta, jota myydään tavaramerkkinä CELITE 512, lisätään sitten ja suodatetaan käyttäen CELITE 512:11a ennalta päällystettyä suodatinta. Suodattimelle 10 jääneitä kiinteitä aineita kuivataan sitten alennetussa paineessa 0 °C:ssa 48 tunnin ajan. Kuivaa jauhetta uutetaan sitten 0,1 M natriumfosfaattipuskuriliuoksella (pH 6,5). Liukenematon aine poistetaan hitaan sentrifugoinnin avulla ja tulokseksi saatu supernatantti kirkastetaan suo-15 dattamalla 0,45 mikronin suodattimen läpi. Liuos diasuoda-tetaan sitten vettä vastaan käyttäen rajamolekyylipainon 10 000 omaavaa ultrasuodatuskalvoa suolojen poistamiseksi. Tulokseksi saatu liuos lisätään sitten DEAE-selluloosa (Whatman) -ioninvaihtopylvääseen, joka on ennalta tasapai-20 notettu 0,01 M natriumfosfaattipuskuriliuoksella (pH 6,5), ja eluoidaan Saimalla puskuriliuoksella. Proteaasi ei sitoudu kantajaan ja eluoituu välisijatilavuudessa. Tämä : lisätään sitten pylvääseen, joka sisältää agaroosia, johon on sidottu sininen väriaine -aaffiniteettiligandi. Ligan-25 dia on saatavana kaupallisesti toiminimeltä Pierce Chemicals nimellä CIBACRON BLUE F3GA. Proteaasi sitoutuu CIBACRON BLUE -agaroosipylvääseen ja eluoidaan liuoksella, jossa on 0,5 M NaCl 0,01 M natriumfosfaattipuskuriliuok-sessa (pH 6,5). Viimeksi mainitusta pylväästä saatu 30 eluaatti diasuodatetaan kuten on kuvattu aikaisemmin suo-lojen poistamiseksi ja retentaatti lyofilisoidaan, jolloin ; saadaan tulokseksi puhdistettu proteaasivalmiste.

22 110612

Esimerkki 4 - Alkalisen proteaasin ominaisuuksia

Siten saadun tärkeimmän uuden alkalisen proteaasin, jonka on tuottanut B. proteolyticus -kanta 21-23, fysi-kaaliskemialliset ominaisuudet ovat seuraavat: 5 i) Ominaisaktiivisuus

Kannasta 21-23 saadun puhdistetun uuden alkalisen proteaasin ominaisaktiivisuuden lasketaan olevaan 26,5 APU/mg proteiinia.

Analyysiohjeita: Alkalisen proteaasin määritys pe-10 rustuu kaseiinisubstraatin (pitoisuutena 0,67 paino/tila-vuus-%) hydrolyysiin 40 °C:ssa puskuroituna pH-arvoon 8,5 0,06 M boraattipuskuriliuoksella (pH 8,5). Hydrolysoimaton substraatti saostetaan lisäämällä 18 % (paino/tilavuus) trikloorietikkahappoa ja poistetaan sentrifugoimalla 15 (1 800 g 15 minuutin ajan). Liuenneet kaseeinin peptidit mitataan käyttäen absorbanssia allonpituudella 275 nm. Yksi alkalisen proteaasin yksikkö (APU) on se aktiivisuus, joka vapauttaa neljää mikromoolia tyrosiinia vastaavan määrän minuutissa kokeen olosuhteissa. Proteiinipitoisuus 20 määritetään käyttäen BRADFORD-proteiinireagenssia (saadaan toiminimeltä Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) valmistajan suosittelemissa olosuhteissa.

ii) Isoelektrinen piste

Alkalisen proteaasin isoelektrinen piste on 11,1 k 25 arvioituna kromatofokusoinnin avulla. Tämän vahvistaa myös ! isolelektrinen fokusointi käyttäen PHARMACIA-amofolyytti- järjestelmää (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ.).

iii) Molekyylipaino

Puhdistetun alkalisen proteaasin molekyylipaino 30 määritetään käyttäen polyakryyliamidigeelielektroforeesia natriumdodekyylisulfaatin läsnä ollessa. Molekyylipainon : todetaan olevan 28 kilodaltonia.

iv) Aminohapposekvenssin analyysi

Lyofilisoitu puhdistettu alkalinen proteaasi sek-, . 35 venssoidaan osittain aminopäätteestä käyttäen APPLIED

23 1 10612 BIOSYSTEMS (Foster City, CA. ) 477A Pulsed Liquid Phase

Protein Sequencer -laitetta valmistajan ohjeiden mukaan. Aminopäätteen 20 ensimmäisen aminohapon järjestys (SEQ ID nro 1) on annettu alla käyttäen aminohappojen 3 kirjaimen 5 standardikoodia.

Ala-Gln-Ser-Val-Pro-Trp-Gly-Ile-Ser-Arg-

Val-Gln-Ala-Pro-Ala-Ala-His-Asn-Arg-Gly v) Stabiilius pesuainekoostumuksissa Kaupallinen nestemäinen suurtehopesuaine titrataan 10 joko pH-arvoon 8 tai 9,6 ja lisätään joko näyte uutta pro-teaasia tai näyte alkalista proteaasia, jonka on tuottanut B. lichenlformis (entsyymi A), vertailua varten, lisäten kumpaakin proteaasia pitoisuudeksi noin 2,0 APU/g pesuainetta. Näytteitä inkuboidaan 43 °C:ssa ja tutkitaan aktii-15 visuuden suhteen ilmoitettuina päivinä ja jäljellä oleva aktiivisuus mitataan. Arvot ilmaistaan suhteellisena ak tiivisuutena ajankohtana päivä 0 mitatun aktiivisuuden (100) perusteella. Ensimmäinen luku seuraavassa taulukossa 3 viittaa jäljellä olevaan aktiivisuuteen pH-arvon 8 kä-20 sittelyn tapauksessa ja suluissa oleva luku viittaa jäljellä olevaan aktiivisuuteen, kun on pidetty pH-arvossa 9,6.

Taulukko 3 25 * Entsyymi Jäljellä oleva aktiivisuus päivänä O 4 7 11 uusi pro- B. proteolyti- teaasi cus 100 (100) 80 (71) 68 (54) 74 (55) 30 entsyymi A B. lichenifor- rois 100 (100) 34 (25) 24 (18) 21 (15) vi) Aktiivisuuden optimaalinen pH-alue

Uuden proteaasin suhteelliset aktiivisuudet verrat-..· 35 tuna lajista B. licheniformis saatuun entsyymi A:hän mää ritetään käyttäen monia erilaisia puskuriliuoksia pH-- alueella 6,5 - 11,5. pH-arvossa 8,5 saatu aktiivisuus mer- 24 110612 kitään mielivaltaisesti 100:ksi. Tulokset on annettu seu-raavassa taulukossa 4. Tämä taulukko 4 osoittaa, että lajista B. proteolyticus saadulla uudella proteaasilla on suurempi aktiivisuus pH-arvon 8,5 yläpuolella kuin lajista 5 B. licheniformis saadulla proteaasilla ja tämä ero on huomattavin erittäin aikalisissä olosuhteissa.

Taulukko 4

Entsyymi Lähde Jäljellä oleva aktiivisuus pH-arvossa 10 6.5 7.5 8.5 9.5 10,5 11.5 uusi pro- B. proteolyti- teaasi cus 50 82 100 107 105 110 entsyymi A B. lichenifor- mis 66 89 100 97 97 64 15 B. proteolyticus -kannan 21-23 tuottaman alkalisen proteaasin ominaisuuksia verrataan muihin tunnettuihin aikalisiin proteaaseihin ja kuten voidaan nähdä taulukosta 5, kannasta 21-23 saadulla proteaasilla on ainutlaatuinen 20 molekyylipaino ja isolelektrinen piste, ja se tunnustetaan siten uudeksi alkaliseksi proteaasiksi.

Taulukko 5 , · 25 — — — Orga- 21-23 Bacillus sp.Y B. licheniformis B. sp.221 NKS-21 . nismi

Viite a b cd erit- l/a 1/b Carlsberg API-21 ’ syymi Uusi prote- subtilisin aasi 30 Mol. 28 000 21 000 40 000 27 300 30 000 22 000 paino : \ · IsoeL 11,1 10,1 5,1 9,4 10,0 7,4 piste . 35 a: EP-patenttihakemus 0 204 342 l/a: alkalinen proteaasi Ya, joka on peräisin lajista

:. Bacillus sp. Y

25 1106 1 2 1/b: alkalinen proteaasi Yb, joka on peräisin lajista

Bacillus sp. Y

b: Markland, Jr.F.S. & Smith, E.L. (1971), Subtilisins: primary structure, chemical and physical properties. The 5 Enzymes (3. painos), voi. 3, s. 561 - 608, Academic Press, New York ja Lontoo, c: US-patentti 4 052 262 d: US-patentti 4 480 037 Mol. paino = molekyylipaino 10 Isoel. piste = isoelektrinen piste

Esimerkki 5 - Uusien alkalisten proteaasien käyttö pesuaineissa

Suoritetaan pesutestejä seuraavalla tavalla koekan-15 gaspaloilla: EMPA-117 tai EMPA-116 tahrattuna verellä, maidolla ja tussilla tai EMPA-112 tahrattuna kaakaolla, maidolla ja sokerilla (hankittu toiminimeltä Eidgenossiche Material Prufungs und Versuchanstalt fur Industrie, Bauwesen und Gewerbe, Skt Gallen, Sveitsi) käyttäen kau-20 pallista, runsaasti karbonaattia sisältävää anionista pe- • · . suainetta, jolloin alku-pH-arvo pesuvedessä on 10,7. Esi- I,· ; merkissä 3 saatua alkalista proteaasia lisätään käyttömää- ’·.· räksi 20 APU/1. Laitetta Terg-o-tometer (US-Testing Co.) ‘ käytetään pesukoneena. Neljä kangasta lisätään 1,0 litraan 25 pesuvettä ja pestään käyttäen 100 kierrosta minuutissa, 38 °C 10 minuutin ajan. Huuhtelua suoritetaan 10 litralla vettä 5 minuutin ajan. Prosenttinen tahrojen poisto lasketaan käyttäen seuraavaa kaavaa.

30 Prosenttinen tahrojen poisto = (RW - RS)/(RO - RS) x 100 jossa RO = tahraamattoman kankaan heijastuskyky ... RS = tahratun kankaan heijastuskyky RW = pestyn kankaan heijastuskyky 35

Tulokset on esitetty taulukossa 6.

110612 26

Taulukko 6

Prosenttinen tahrojen poisto, tahrattu kangas 5 Näyte Lähde EMPA 116 EMPA 117 EMPA 112 pelkkä pesuaine - 4 19 4 entsyymi A B. licheniformis 22 56 17 uusi prote- B. proteolyticus 10 aasi 28 60 22

Entsyymi A = lajista B. licheniformis saatu Carlsberg-subtilisiini, joka on kuvattu taulukossa 5 (viite b).

15 Taulukko 6 osoittaa, että kokeen olosuhteissa keksin nön mukaisella entsyymillä on parempi pesuvaikutus kuin kaupallisesti saatavissa olevalla entsyymillä, joka on peräisin lajista B. licheniformis.

» • * < • > 110612 27 i I 0 0 i L.

Sekvenssilista: (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: (A) NAME: SOLVAY ENZYMES, Inc.

(B) STREET: 1003 Industrial Parkway

(C) CITY: ELKHART

(D) STATE: INDIANA

(E) COUNTRY: United States (F) POSTAL CODE (ZIP): 46516 (ii) TITLE OF INVENTION: Alkaline Proteases, Bacteria Producing Them, Process For The Production Of These Alkaline Proteases,

Uses of These Alkaline Proteases And Detergent Compositions Containing Them (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 1 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (vi) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 884,184 (B) FILING DATE: 18-MAY-1992 ' (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single : (D) TOPOLOGY: linear • (ii) MOLECULE TYPE: protein (v) FRAGMENT TYPE: N-terminal (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Bacillus :'v (B) STRAIN: Bacillus proteolyticus (C) INDIVIDUAL ISOLATE: Strain 21-23 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:

Ala Gin Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gin Ala Pro Ala Ala V 1 5 10 15 . His Asn Arg Gly ' · ·' 20

Claims

28 110612
1. Alkaliset proteaasit, tunnetut siitä, että ne ovat peräisin Bacillus-lajista, niiden molekyylipai- 5 no on 28 kilodaltonia ja niillä on isolelektrinen piste välillä 10 - 11,5 ja että proteaaseilla lisäksi on proteolyyttisen aktiivisuuden optimaalinen pH pH-arvossa, joka on väliltä 8,5 - 11,5 ja 10 että ne ovat saatavissa Bacillus proteolyticus -bakteerikannasta NRRL B-18963, NRRL B-18964 tai NRRL B-18965.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset alkaliset proteaasit, tunnetut siitä, että ensimmäisen 20 aminoha- 15 pon järjestys (SEQ ID nro 1) aminopäätteestä lähdettäessä on aikalisillä proteaaseilla seuraavanlainen: Ala-Gln-Ser-Val-Pro-Trp-Gly-Ile-Ser-Arg- Val-Gln-Ala-Pro-Ala-Ala-His-Asn-Arg-Gly-
3. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset alkaliset proteaa-20 sit, tunnetut siitä, että proteaasit ovat peräisin V lajin Bacillus proteolyticus -bakteerista.
4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukaiset alkaliset proteaasit, tunnetu t siitä, että proteaaseilla on lisäksi jäljellä vähintään 70 % niiden alkuperäisestä aktii-25 visuudesta sen jälkeen, kun niitä on pidetty pH-arvossa 8,0 ' · lämpötilassa 43 °C 11 päivän ajan.
5. Kannan Bacillus proteolyticus NRRL B-18964, Bacillus proteolyticus NRRL B-18963 tai Bacillus proteolyticus NRRL B-18965 bakteerit. . . ; 30 6. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen alkali- ... sen proteaasin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että . viljellään lajin Bacillus proteolyticus -bakteeria tai tämän bakteerin johdannaista sopivassa elatusaineessa aerobisissa olosuhteissa ja sitten otetaan alkalinen proteaasi talteen V 35 siitä. 29 110612
7. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää vähintään patenttivaatimuksen 1 mukaista alkalista proteaasia.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen pesuainekoostumus, 5 tunnettu siitä, että se sisältää pesuaineena aktiivisen koostumuksen ja tehokkaan määrän patenttivaatimuksen 1 mukaista alkalista proteaasia.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että mainittu pesuainekoostumus on 10 rakeinen ja sisältää vähintään yhtä aineista tehosteaine, valkaisuaine tai vaalenne.
10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen pesuainekoostu mus, tunnettu siitä, että mainittu pesuainekoostumus on nestemäinen ja sisältää vähintään yhtä aineista val- 15 kaisuaine tai vaalenne.
11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen pesuainekoostu mus, tunnettu siitä, että se on nestemäinen.
12. Patenttivaatimuksen 7 mukainen pesuainekoostu mus, tunnettu siitä, että se on rakeinen.
13. Pesukoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää tehokkaan määrän patenttivaatimuksen 1 mukaista alkalista proteaasia.
14. Menetelmä proteiinitahrojen poistamiseksi kankaasta, tunnettu siitä, että pestään mainittu 25 kangas pesuainekoostumuksella, joka sisältää pesuaineena aktiivisen koostumuksen ja tehokkaan määrän patenttivaatimuksen 1 mukaista alkalista proteaasia. 1 · 3o 110612