JP6903415B2

JP6903415B2 - アルカリプロテアーゼの製造方法

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Publication number: JP6903415B2
Application number: JP2016207662A
Authority: JP
Inventors: 木村　俊介; 俊介木村; 健一四方
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2016-10-24
Filing date: 2016-10-24
Publication date: 2021-07-14
Anticipated expiration: 2036-10-24
Also published as: JP2018068120A

Description

本発明は、アルカリプロテアーゼの製造方法に関する。

衣料用の洗浄剤や漂白剤には、その洗浄力を高めるために各種の酵素が配合されている。最も工業的に大量に生産されている衣料用酵素はアルカリプロテアーゼ等のプロテーゼであり、通常、これらはプロテアーゼ生産性微生物の培養を伴う発酵法により生産されている。大量且つ廉価にプロテアーゼを得るには発酵生産性の向上が不可欠であり、現在までにプロテアーゼの高生産性化を図る技術が種々検討されている（例えば、特許文献１）。

発酵法は、バッチ培養法と連続培養法とに大別される。バッチ培養法は、培養開始時に基質を添加して培養終了時に培養液を回収する方法で、一般的に酵素生産に伴う菌体生育等により酵素生産速度が低下しやすい。他方、連続培養法によれば、バッチ培養法と比較して高い酵素生産速度が得られる利点がある。
連続培養法による酵素生産の例として、例えば、タンパク質の分泌生産能力を有する微生物の発酵培養液を、目詰まりが生じにくい多孔性分離膜で濾過し、濾液から生産物であるタンパク質を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その微生物の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵により高い酵素生産速度を得、長時間にわたり安定してα−アミラーゼ等のタンパク質を高生産する方法が報告されている（特許文献２）。

特開２０１４−１６１２８４号公報特開２００９−３９０７４号公報

しかしながら、本発明者が発酵工程での物資収支を検討したところ、特許文献２の連続培養法では、培地に添加した炭素源の多くが酵素生産以外に消費されてしまい、バッチ培養法に比べて炭素源から酵素への変換率は低く、かえって酵素の生産効率は低下することが判明した。
したがって、本発明は、酵素生産速度の向上と培地中の炭素源の酵素生産への効率的な利用を図れる新たな方法を提供しようとするものである。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、先ずアルカリプロテアーゼ生産性微生物であるバチルス属細菌をバッチ培養した後、これを一部又は全部植え継ぎ、次いで、所定の菌体濃度以上で、従来よりも高い温度で再度バッチ培養することで、短時間にアルカリプロテアーゼを高生産でき、且つ、培地中の炭素源をアルカリプロテアーゼ生産へ効率的に利用させることができることを見出した。

すなわち、本発明は、次の工程（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）第１の培地でアルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属細菌をバッチ培養する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）の後、第１の培地から得た菌体の一部又は全部を、第２の培地で再度バッチ培養する工程
を含み、工程（Ｂ）における培養温度が３２〜４４℃であり、且つ、第２の培地中の初期菌体濃度が乾燥質量基準で５ｇ／Ｌ以上である、アルカリプロテアーゼの製造方法を提供するものである。

本発明によれば、アルカリプロテアーゼの生産速度向上と培地に添加した炭素源のアルカリプロテアーゼ生産への効率的な利用を図ることができ、アルカリプロテアーゼをより効率良く高生産することができる。

本発明のアルカリプロテアーゼの製造方法は、（Ａ）第１の培地でアルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属細菌をバッチ培養する工程と、（Ｂ）工程（Ａ）の後、第１の培地から得た菌体の一部又は全部を、第２の培地で再度バッチ培養する工程とを含み、工程（Ｂ）における培養温度が３２〜４４℃であり、且つ、第２の培地中の初期菌体濃度が乾燥質量基準で５ｇ／Ｌ以上である、製造方法である。

〔工程（Ａ）〕
本工程は、第１の培地でアルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属細菌をバッチ培養する工程である。
アルカリプロテアーゼは、アルカリ性領域に至適ｐＨを有するプロテアーゼである。バチルス属細菌は、アルカリプロテアーゼ生産能を有し、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するものであれば特に限定されない。尚、本明細書において、アルカリプロテアーゼ生産能を有するバチルス属細菌を、以下単に「バチルス属細菌」ともいう。
バチルス属細菌としては、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・アンシラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ））、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）等を挙げることができる。なかでも、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましい。具体的には、バチルスエスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭＰ−１０４８２）、バチルスクラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭＫ−１６株（ＦＥＲＭＢＰ−３３７６）、バチルスエスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭＢＰ−６５３２）、バチルスエスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＫＳＭ―ＫＰ９８６０株（ＦＥＲＭＢＰ−６５３４）、バチルスＮｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭＰ−１５９２）（プロテアーゼＥ−１）、バチルスエスピーＹ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２９）、バチルスＳＤ５２１（ＦＥＲＭＰ−１１１６２）、バチルスエスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭＰ−１８５６６）、ＮＣＩＢ１２２８９株、ＮＣＩＢ１２５１３株等が挙げられる。
バチルス属細菌は、野生株、又は各種遺伝子操作によって、塩基配列の挿入、置換、欠失等の変異が生じた変異株のいずれでもよく、また、公知の人為的な改変を付すことにより所望のアルカリプロテアーゼ生産能を付与したものであってもよい。

本発明で用いられる第１の培地は、合成培地、天然培地、或いは合成培地に天然成分を添加した半合成培地のいずれであってもよい。
第１の培地には、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要な栄養源等を含有することができる。
炭素源としては、例えば、糖類が挙げられる。糖類としては、グルコース、フルクトース、キシロース等の単糖類、スクロース、ラクトース、マルトース等のニ糖類が挙げられる。糖類は無水物又は水和物であってもよい。また、糖類を含有する糖液、例えば、でんぷんから得られる糖液や糖蜜（廃糖蜜）、セルロース系バイオマスから得られる糖液等を使用することもできる。なかでも、微生物の増殖の点から、グルコース、マルトースが好ましい。
第１の培地中の炭素源の濃度は、好ましくは５〜２５％（ｗ／ｖ）である。

窒素源としては、酵母エキス、肉エキス、魚肉エキス等のエキス類、アンモニア、尿素、無機・有機アンモニウム塩、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等の含窒素化合物、コーングルテンミール、大豆粉、ポリペプトン、トリプトン、ペプトン、各種アミノ酸、ソイビーンミール等が挙げられる。これらの窒素源は、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。
第１の培地中の窒素濃度は、菌体増殖および生産性の点から、好ましくは２０００〜１５０００ｐｐｍ（質量百万分率）、より好ましくは３０００〜１００００ｐｐｍ、より更に好ましくは４０００〜８０００ｐｐｍである。
また、第１の培地中のエキス類の濃度は、菌体増殖及び生産性の点から、好ましくは乾燥固形分として０．１〜２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１〜２％（ｗ／ｖ）である。

無機塩類としては、例えば、硫酸塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、リン酸塩等が挙げられる。硫酸塩の例としては、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられる。マグネシウム塩の例としては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。亜鉛塩の例としては、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、塩化亜鉛等が挙げられる。リン酸塩の例としては、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸二水素カリウム等が挙げられる。
第１の培地中の無機塩類の濃度は、好ましくは０．５〜１％（ｗ／ｖ）である。
また、培地中には、抗生物質や微量成分を適宜必要に応じて添加しても良い。

第１の培地のｐＨ（２５℃、以下同じ）は、好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８である。培地のｐＨは、適宜緩衝剤を用いて調整することができる。
本明細書において、培地中の炭素源の濃度、窒素濃度、無機塩類の濃度、ｐＨ等は、特段断らない限り初発（培地調製時又は培養開始時）の値である。

バチルス属細菌のバッチ培養は、通常の培養条件に従えばよい。
培養温度は、微生物の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、好ましくは２０〜４８℃であり、より好ましくは２５〜４５℃である。

第１の培地に対するバチルス属細菌の接種量は、好ましくは０．１〜５％（ｖ／ｖ）である。

培養期間は、微生物の増殖に応じて１０時間〜７日、更に１２時間〜４日、更には２４時間〜３日が好ましい。

培養終了後の菌体の濃度（ＯＤ６００値）は、好ましくは４０〜１００である。このＯＤ６００値は、後掲の実施例に記載の方法によって測定することができる。
また、培養終了後、第１の培地から菌体を取得する方法は、特に制限されず、適当な分離手段、例えば、傾斜法、遠心分離、濾過等が挙げられる。

〔工程（Ｂ）〕
本工程は、工程（Ａ）の後、第１の培地から得た菌体の一部又は全部を、第２の培地で再度バッチ培養する工程であり、本工程における培養温度は３２〜４４℃、且つ、第２の培地中の初期菌体濃度は乾燥質量基準で５ｇ／Ｌ以上である。通常、アルカリプロテアーゼ生産にあたってのバチルス属細菌の培養温度は３０℃程度であり（特許文献１）、本発明では通常より高い温度範囲で、且つ、所定の濃度以上のバチルス属細菌をバッチ培養することで菌体活性の向上により短い時間でアルカリプロテアーゼを高生産でき、酵素生産速度を向上させることができる。また、第２の培地中の炭素源が菌体生育や菌体の維持代謝のためのエネルギー源等のアルカリプロテアーゼ生産以外に消費されてしまうのを抑え、炭素源からアルカリプロテアーゼへの変換率を高くすることができる。

工程（Ｂ）における培養温度は、酵素生産速度の点から、３３℃以上が好ましく、３４℃以上がより好ましく、３５℃以上がより更に好ましく、３７℃以上がより更に好ましく、４０℃以上がより更に好ましい。一方で、炭素源変換率の点からは、３５℃以上が好ましく、３７℃以上がより好ましく、また、４２℃以下が好ましく、４１℃以下がより好ましい。

また、工程（Ｂ）における第２の培地中の初期菌体濃度は、酵素生産速度及び炭素源変換率の点から、乾燥質量基準で、好ましくは８ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１１ｇ／Ｌ以上である。また、菌体への十分な酸素供給量の確保の点から、乾燥質量基準で、好ましくは３０ｇ／Ｌ以下である。

第１の培地から得た菌体の一部又は全部を第２の培地で再度バッチ培養するには、前記菌体の一部又は全部を第２の培地に接種して行ってもよく、また、菌体の一部又は全部を培養槽に残し、これに第２の培地を加えて行うこともできる。生産効率の点から、好ましくは遠心分離等で分離した菌体を植え継ぐ方法である。
第１の培地から第２の培地に植え継ぐ菌体の量は、基質のアルカリプロテアーゼへの変換率向上の点、及びアルカリプロテアーゼの生産性の点から、以下の算出式で求められる菌体濃度（ＯＤ６００値）の比率についての百分率として６％以上であることが好ましく、１０％以上であることがより好ましく、２０％以上であることがより更に好ましい。
第２の培地と第１の培地の菌体濃度比（％）＝
[第２の培地への菌体植え継ぎ後の、第２の培地のＯＤ６００値]／[第１の培地での培養終了時点の、第１の培地のＯＤ６００値]×１００

第２の培地は、第１の培地と同様、炭素源の他、窒素源、無機塩類、その他必要な栄養源等を含有することができる。
第２の培地中の炭素源の濃度は、好ましくは５〜２５％（ｗ／ｖ）である。
第２の培地では、経済的な点から、エキス類の濃度を第１の培地中のエキス類の濃度よりも低くするのが好ましい。第２の培地中のエキス類濃度（乾燥固形分）は、第１の培地中のエキス類濃度（乾燥固形分）に対して質量比率で、好ましくは０．７５以下であり、より好ましくは０〜０．５、さらに好ましくは０．１５〜０．３である。

工程（Ｂ）におけるバチルス属細菌のバッチ培養は、工程（Ａ）における培養と同一の培養条件としてもよく、異なる培養条件としてもよい。
工程（Ｂ）において培養時間は、アルカリプロテアーゼ生産性の点から、好ましくは８０時間以内であり、より好ましくは６０時間以内である。ここで、工程（Ｂ）における培養時間は、培養開始時点から、培養中に排気される二酸化炭素濃度が急激に降下する時点までの時間である。培養中に排気される二酸化炭素濃度は、バチルス属細菌による第２の培地中の炭素源の消費が終了すると急激に下がるため、二酸化炭素濃度が急激に降下する時点を培養終了時とする。二酸化炭素濃度は、後掲の実施例に記載の方法によって測定することができる。

工程（Ｂ）では、培養にあたり、酸素移動速度（ＯＴＲ、単位：ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ）が所定範囲内となるように菌体への酸素供給を制御するのが、第２の培地中の炭素源がアルカリプロテアーゼ生産以外に消費されてしまうのを抑え、炭素源からアルカリプロテアーゼへの変換率を高くできる点から好ましい。酸素移動速度（ＯＴＲ）は、後掲の実施例に記載したように、排ガス分析法によって求めることができる。
工程（Ｂ）における第２の培地中の初期菌体濃度（ＯＤ６００値）に対する酸素移動速度（ＯＴＲ）［ＯＴＲ／初期菌体濃度（ＯＤ６００値）］は、酵素生産速度の点から、１［ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ６００］以上が好ましく、１．２［ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ６００］以上がより好ましく、１．５［ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ６００］以上がより更に好ましく、１．８［ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ６００］以上がより更に好ましく、また、３［ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ６００］以下が好ましい。一方で、炭素源変換率の点からは、１［ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ６００］以上が好ましく、また、２．６［ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ６００］以下が好ましく、１．７［ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ６００］以下がより好ましく、１．６［ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ６００］以下がより更に好ましい。

また、工程（Ｂ）における通気速度（通気量）は、アルカリプロテアーゼ生産性の点から、０．２〜１ｖｖｍが好ましい。撹拌回転数は、培地に供給された気体を分散する条件が好ましく、スケールに合わせて適宜調整することが出来る。圧力は、常圧から微加圧の条件が好ましく、加圧する場合の加圧条件としては０〜０．１ＭＰａの範囲が好ましい。

このような培養により、短い時間でアルカリプロテアーゼが高生産され、高い酵素生産速度が得られる。また、第２の培地中の炭素源が効率よくアルカリプロテアーゼ生産に利用されて、高い炭素源変換率が得られる。
本発明において、酵素生産速度は、好ましくは０．０７（ｇ／Ｌ）／ｈｒ以上である。酵素生産速度は、アルカリプロテアーゼ生産量（ｇ）を、培地量（Ｌ）と培養時間（ｈｒ）で除して求められる。酵素生産速度の算出方法の詳細は実施例に記載した。

また、本発明において、第２の培地中の炭素源からアルカリプロテアーゼへの炭素源変換率（％）は、好ましくは４．６％以上である。炭素源変換率は、アルカリプロテアーゼの炭素源濃度を、培養開始時の培地中の炭素源濃度で割った値である。炭素源変換率の算出方法の詳細は実施例に記載した。

本発明により得られた酵素液は、そのまま使用することもできるが、更に必要に応じて、公知の方法により精製、結晶化、或いは造粒化して使用することができる。
一方、培養液から分離したバチルス属細菌は、再度、酵素生産に再利用することができる。すなわち、工程（Ｂ）の後に、当該バチルス属細菌の一部又は全部を用いて、第２の培地で再度培養を１回以上、更に２回以上、更に３回以上繰り返す工程を行ってもよい。

［菌体濃度の測定法］
培養液の一部を分取したものを５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液を用いて１００倍に希釈混合した後、Ｕ−２０００形日立分光光度計（日立製作所）を用いて波長６００ｎｍにおける濁度を測定し、希釈率からＯＤ６００値を算出した。

［培養時間の測定法］
培養中に排気される二酸化炭素濃度を排ガス測定装置ＤＥＸ−１５６２Ａ（エイブル社製）を用いて連続的に測定した。培養開始時点から、二酸化炭素の濃度が急激に降下した時点までを培養時間とした。

［アルカリプロテアーゼ生産量の測定法］
培養液から菌体を除いた培養上清について、プロテインアッセイラピッドキットワコー（和光純薬工業社製）を使用してタンパク量を測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。吸光度の測定には、ＵＶ−２４５０分光光度計（島津製作所社製）を用いた。

［マルトース一水和物量の測定法］
培養液から菌体を除いた培養上清について、Ｆ−キット麦芽糖／ショ糖／Ｄ−グルコース（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用してマルトース一水和物量を測定した。吸光度の測定には、吸光分光光度計（ＢｅｎｃｈｍａｒｋＰｌｕｓマイクロプレートリーダー、バイオ・ラッド社製）を用いた。

［酵素生産速度の算出］
酵素生産速度は次式により算出した。
酵素生産速度（（ｇ／Ｌ）／ｈｒ）＝［アルカリプロテアーゼ生産量（ｇ／Ｌ）］／［培養時間（ｈｒ）］

［炭素源変換率の算出］
炭素源変換率は次式により算出した。
炭素源変換率（％）＝［アルカリプロテアーゼの炭素源濃度（ｇ／Ｌ）］／［投入マルトース一水和物量（ｇ／Ｌ）］×１００

［酸素移動速度（ＯＴＲ）の測定法］
培養槽と排ガス測定装置を接続し、培養時の酸素および二酸化炭素の濃度を分析した。本結果から、酸素収支を取ることで培養時のＯＴＲを算出した。
排ガス分析法におけるＯＴＲ算出式

ＯＴＲ：酸素移動速度（ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ）
Ｆ_ｉ：通気流量（Ｌ／ｈｒ）
Ｖ：培養液量（Ｌ）
Ｔ：培養温度（℃）
Ｘ_ｉ：通気酸素濃度（％）
Ｙ_ｉ：通気二酸化炭素濃度（％）
Ｘ_ｏ：排ガス酸素濃度（％）
Ｙ_ｏ：排ガス二酸化炭素濃度（％）

実施例１
（１）特開２０１４−１６１２８４号公報に示すように、アルカリプロテアーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＨＹ−ＳＰ６４−Ｅ−１を得た。
次いで、組換えプラスミドｐＨＹ−ＳＰ６４−Ｅ−１を、特開２０１４−１５８４３０号公報に示すように構築した枯草菌変異株であるｒｅｃＡ遺伝子欠失株（ｋａｏ１１９株）にプロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，ｖｏｌ．１６８，ｐ．１１１）によって導入し、形質転換体を得た。

前記で得た形質転換体を、ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトンペプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／ＬＮａＣｌ、１５ｐｐｍテトラサイクリン塩酸塩）３０ｍＬに接種し、５００ｍＬ容坂口フラスコで２０時間、３９℃で１２５ｒｐｍの振盪速度で培養し、種菌とした（シード培養）。

次いで、前記種菌を第１の培地（１０ｇ／Ｌ魚肉エキス、５ｇ／Ｌ酵母エキス、３６ｇ／Ｌアミノ酸混合物、０．７ｇ／Ｌ金属塩、４ｇ／Ｌアンモニウム塩、２ｇ／Ｌリン酸二カリウム、１６０ｇ／Ｌマルトース一水和物、０．０２ｇ／Ｌ消泡剤、１５ｐｐｍテトラサイクリン塩酸塩）１２００ｍＬに２％（ｖ／ｖ）接種し、３６℃、０．５ｖｖｍ、８００ｒ／ｍｉｎで通気撹拌培養を行った。培養３日後、無菌的に遠心分離（５℃、９０００ｒ／ｍｉｎ、１０分）を行い、菌体を回収した。培養３日後の菌体濃度（ＯＤ６００値）は６９であった。また、酵素生産速度は０．０６４（ｇ／Ｌ）／ｈｒであり、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は４．５％であった。

（２）前記（１）で回収した菌体を、第１の培地からエキス類（魚肉エキス及び酵母エキス）を除いた以外は同じ組成の第２の培地１２００ｍＬに対し、菌体植え継ぎ後の第２の培地のＯＤ６００値が４０（乾燥菌体質量：１２ｇ／Ｌ）となる量で接種し、３４℃、０．５ｖｖｍ、８００ｒ／ｍｉｎで通気撹拌培養を行った。培養時間は６５．３ｈｒ、酵素生産速度は０．１０８（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は５．６％であった。

実施例２
実施例１において、（２）における培養温度を３６℃に変更した以外は、実施例１と同様に培養を行った。
培養時間は５６．５ｈｒであった。また、酵素生産速度は０．１２６（ｇ／Ｌ）／ｈｒであり、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は５．９％であった。

実施例３
実施例１において、（２）における培養温度を３９℃に変更した以外は、実施例１と同様に培養を行った。培養時間は４７．２ｈｒ、酵素生産速度は０．１７４（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は６．８％であった。

実施例４
実施例１において、（２）における培養温度を４２℃に変更した以外は、実施例１と同様に培養を行った。培養時間は４２．１ｈｒ、酵素生産速度は０．１８４（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は６．４％であった。

実施例５
実施例１において、（２）における培養温度を３９℃に変更し、菌体植え継ぎ後の第２の培地のＯＤ６００値が２８（乾燥菌体質量：９ｇ／Ｌ）となる量で菌体を接種した以外は、実施例１と同様に培養を行った。培養時間は５７．２ｈｒ、酵素生産速度は０．１０４（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は４．６％であった。

実施例６
実施例１において、（２）における培養温度を３９℃に変更し、菌体植え継ぎ後の第２の培地のＯＤ６００値が３８（乾燥菌体質量：１２ｇ／Ｌ）となる量で菌体を接種し、撹拌速度を６５０ｒ／ｍｉｎに変更した以外は、実施例１と同様に培養を行った。培養時間は７５．０ｈｒ、酵素生産速度は０．０８５（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は５．３％であった。

実施例７
実施例１において、（２）における培養温度を３９℃に変更し、菌体植え継ぎ後の第２の培地のＯＤ６００値が５７（乾燥菌体質量：１７ｇ／Ｌ）となる量で菌体を接種した以外は、実施例１と同様に培養を行った。培養時間は５７．５ｈｒ、酵素生産速度は０．１４１（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は６．８％であった。

実施例８
実施例１において、（２）における培養温度を３９℃に変更し、菌体植え継ぎ後の第２の培地のＯＤ６００値が７５（乾燥菌体質量：２３ｇ／Ｌ）となる量で菌体を接種し、撹拌速度を９００ｒ／ｍｉｎに変更した以外は、実施例１と同様に培養を行った。培養時間は４８．５ｈｒ、酵素生産速度は０．１７６（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は７．２％であった。

比較例１
実施例１において、（２）における培養温度を３０℃に変更した以外は実施例１と同様に培養を行った。培養時間は８７．７ｈｒ、酵素生産速度は０．０５９（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は４．１％であった。

比較例２
実施例１において、（２）における培養温度を３９℃に変更し、菌体植え継ぎ後の第２の培地のＯＤ６００値が３（乾燥菌体質量：１ｇ／Ｌ）となる量で菌体を接種した以外は、実施例１と同様に培養を行った。培養時間は８１．３ｈｒ、酵素生産速度は０．０５７（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は３．６％であった。

上記実施例１〜８及び比較例１〜２における培養条件、酵素生産速度及び炭素源変換率を表１に示す。

実施例９
実施例１において、（２）における培養温度を３９℃に変更し、菌体植え継ぎ後の第２の培地のＯＤ６００値が５７（乾燥菌体質量：１８ｇ／Ｌ）となる量で菌体を接種し、撹拌速度を７００ｒ／ｍｉｎに変更した以外は、実施例１と同様に培養を行った。培養時間は７９．７ｈｒ、酵素生産速度は０．０９６（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は４．９％であった。

実施例１０
実施例１において、（２）における培養温度を３９℃に変更し、菌体植え継ぎ後の第２の培地のＯＤ６００値が５７（乾燥菌体質量：１８ｇ／Ｌ）となる量で菌体を接種した以外は、実施例１と同様に培養を行った。培養時間は７２．３ｈｒ、酵素生産速度は０．１３３（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は６．１％であった。

実施例１１
実施例１において、（２）における培養温度を３９℃に変更し、菌体植え継ぎ後の第２の培地のＯＤ６００値が５７（乾燥菌体質量：１８ｇ／Ｌ）となる量で菌体を接種し、撹拌速度を９００ｒ／ｍｉｎに変更した以外は、実施例１と同様に培養を行った。培養時間は６０．５ｈｒ、酵素生産速度は０．１６１（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は６．０％であった。

実施例１２
実施例１において、（２）における培養温度を３９℃に変更し、菌体植え継ぎ後の第２の培地のＯＤ６００値が５７（乾燥菌体質量：１８ｇ／Ｌ）となる量で菌体を接種し、撹拌速度を１０００ｒ／ｍｉｎに変更した以外は、実施例１と同様に培養を行った。培養時間は５３．２ｈｒ、酵素生産速度は０．１６９（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は５．６％であった。

実施例１３
実施例１において、（２）における培養温度を３９℃に変更し、菌体植え継ぎ後の第２の培地のＯＤ６００値が６０（乾燥菌体質量：１８ｇ／Ｌ）となる量で菌体を接種し、撹拌速度を１３００ｒ／ｍｉｎに変更した以外は、実施例１と同様に培養を行った。培養時間は４１．０ｈｒ、酵素生産速度は０．２０２（ｇ／Ｌ）／ｈｒ、アルカリプロテアーゼへの炭素源変換率は５．０％であった。

表１より、本発明の方法によれば、短い培養時間でアルカリプロテアーゼが多く生産されて、高い酵素生産速度が得られた。また、培地中の炭素源であるマルトース一水和物からアルカリプロテアーゼへの変換率が高いことが確認された。また、表２より、酸素移動速度が所定範囲内にすると炭素源変換率が高くなることが確認された。

Claims

次の工程（Ａ）及び（Ｂ）：
（Ａ）第１の培地でアルカリプロテアーゼ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子欠失株をバッチ培養する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）の後、第１の培地から得た菌体の一部又は全部を、第２の培地で再度バッチ培養する工程
を含み、工程（Ｂ）における培養温度が３５〜４４℃、第２の培地中の初期菌体濃度（ＯＤ６００値）に対する酸素移動速度（ＯＴＲ）［ＯＴＲ／初期菌体濃度（ＯＤ６００値）］が１〜３ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ６００であり、且つ、第２の培地中の初期菌体濃度が乾燥質量基準で９ｇ／Ｌ以上であり、第１の培地及び第２の培地中の炭素源の濃度が５〜２５％（ｗ／ｖ）、窒素濃度が２０００〜１５０００ｐｐｍである、アルカリプロテアーゼの製造方法。
第１の培地から第２の培地に植え継ぐ菌体の量が、以下の算出式で求められる菌体濃度（ＯＤ６００値）の比率についての百分率として６％以上である請求項１記載のアルカリプロテアーゼの製造方法。
（第２の培地と第１の培地の菌体濃度比（％）＝
［第２の培地への菌体植え継ぎ後の、第２の培地のＯＤ６００値］／［第１の培地での培養終了時点の、第１の培地のＯＤ６００値］×１００）