JP2017079646A - タンパク質又はポリペプチドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】目的の蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で繰り返し培養することを含む、蛋白質又はポリペプチドの製造方法。目的の蛋白質又はポリペプチドが加水分解酵素であることが好ましく、特にアルカリセルラーゼ又はアルカリプロテアーゼであることが好ましい蛋白質又はポリペプチドの製造方法。宿主微生物が枯草菌であることが好ましい蛋白質又はポリペプチドの製造方法。
【選択図】なし
Description
遺伝子組換え体微生物の作製には主に目的遺伝子を組み込んだプラスミドベクターが利用され、宿主内でのプラスミドの保持安定性は目的の有用物質を高生産する上で極めて重要であるが、宿主の複製システム等の問題から、プラスミドは培養の過程で一定の確率で脱落することが知られている。特に、長期培養の過程でプラスミドは脱落し易い。
したがって、本発明は、宿主内でのプラスミドの保持安定性を高め、目的の有用物質を効率よく高生産する新たな方法を提供しようとするものである。
また、本発明は、目的遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で培養し、さらに固体培地の表面で継代培養を繰り返す、該プラスミドの安定化方法を提供するものである。
また、本発明のプラスミドの安定化方法は、目的遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で培養し、さらに固体培地の表面で継代培養を繰り返す、ものである。
例えば、適当なプラスミドベクターを制限酵素で切断し、そこに制限酵素切断配列を端部に有するように構築した目的遺伝子のDNAを添加することによって、該遺伝子DNAをベクターに挿入することができる。
目的遺伝子は、目的遺伝子産物をコードする遺伝子であり、微生物が生来有する遺伝子であってもよいが、好ましくは微生物が生来的に有さない異種遺伝子であり、なかでもタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子が好ましい。
利用可能なプラスミドベクターとしては、特に制限されず、例えば、pHY300PLK(タカラバイオ(株))等が挙げられる。
酵素としては、酸化還元酵素(オキシドレダクターゼ)、転移酵素(トランスフェラーゼ)、加水分解酵素(ヒドロラーゼ)、脱離酵素(リアーゼ)、異性化酵素(イソメラーゼ)、合成酵素(リガーゼ/シンセターゼ)等が含まれる。
なかでも、加水分解酵素が好ましく、更にセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼが好ましく、更にセルラーゼ、プロテアーゼが好ましい。セルラーゼ、プロテアーゼは、アルカリセルラーゼ、アルカリプロテアーゼが好ましい。アルカリセルラーゼ、アルカリプロテアーゼは、アルカリ性領域に至適pHを有するセルラーゼ、プロテアーゼである。
本発明において、微生物としては、ブドウ球菌(Staphylococcus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、リステリア(Listeria)属、バチルス(Bacillus)属、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)に属する微生物等が挙げられる。なかでも、バチルス(Bacillus)属細菌が好ましく、枯草菌(Bacillus subtilis)がより好ましい。
微生物は、各種遺伝子操作によって、塩基配列の挿入、置換、欠失等の変異が生じた変異微生物であってもよい。
ここで、「繰り返し培養する」とは、微生物を所定の稠密状態になるまで培養し、その後培養物を新たな培養培地に移し換えて培養する操作を繰り返し行うことをいう。初代培養から1回目の継代培養、1回目から2回目以降の継代培養はそれぞれ同一の培養条件としてもよく、異なる培養条件としてもよい。
培養は、生産性の点から、世代数にして45代以上、更に70代以上、こと更80代以上にわたって行うことが好ましい。
また、継代培養の間隔は、24時間以内、更には12時間以内が好ましい。
寒天培地の場合、培地中の寒天は、0.5〜5質量%添加することが好ましい。
他の炭素源としては、例えば、糖類(グルコース、アラビノース、キシロース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、イノシット、グリセリン、可溶性澱粉、廃糖蜜、転化糖等)、酢酸等の資化しうる有機酸、エタノール等の低級アルコール類等が挙げられる。なかでも、増殖の点から、糖類を含有するのが好ましい。
窒素源としては、例えば、アンモニア、無機・有機アンモニウム塩、尿素、コーングルテンミール、大豆粉、酵母エキス、肉エキス、魚肉エキス、ポリペプトン、トリプトン、ペプトン、各種アミノ酸、ソイビーンミール等が挙げられる。
無機塩類としては、例えば、硫酸塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。
培地中の寒天以外の炭素源は、増殖の点から、0〜20質量%添加することが好ましい。また、窒素源は、上記を適宜混合した後に添加することが好ましい。これら培地成分は、必要に応じて培地中に追添することもできる。
また、LB寒天培地等の市販の固体培地を用いてもよい。
固体培地の形状は、特に制限されず、平板、斜面、高層培地等として用いることができる。これら培地中には、抗生物質や微量成分を適宜必要に応じて添加しても良い。
培養温度は、微生物の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、20〜48℃が好ましく、25〜45℃がより好ましく、更に28〜39℃が好ましい。
本発明において、プラスミドの保持率は、1培養あたり0.9以上、好ましくは0.95以上である。
培養終了後、適当な分離・精製手段により培地から目的遺伝子産物、例えば目的のタンパク質又はポリペプチドを採取することができる。
また、プラスミドが安定に保持された微生物を目的遺伝子産物生産用の培地に供して目的遺伝子産物を高生産させてもよい。
特開2014−161284に示すように、アルカリプロテアーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドpHY−SP64−E−1を得た。
次いで、組換えプラスミドpHY−SP64−E−1を、特開2014−158430に示すように構築した枯草菌変異株であるrecA遺伝子欠失株(kao119株)にプロトプラスト形質転換法(Mol.Gen.Genet.,1979,vol.168,p.111)によって導入し、形質転換体を得た。
特開2014−158430に示すように、アルカリセルラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドpHY−S237を作製した。
次いで、組換えプラスミドpHY−S237を、上記と同様の特開2014−158430に示すように構築したrecA遺伝子欠失株(kao119株)にプロトプラスト形質転換法(Mol.Gen.Genet.,1979,vol.168,p.111)によって導入し、形質転換体を得た。
製造例1で得た形質転換体を適宜希釈・懸濁した後、15mLのLB−Tc−Sm寒天培地(1質量%トリプトン、0.5質量%酵母エキス、1質量%NaCl、10ppmテトラサイクリン、1質量%スキムミルク、1.5質量%寒天)の表面に100μLを塗布し、培養温度32℃で2日又は3日で植え継いで繰り返し固体培養を行った。
製造例2で得た形質転換体を適宜希釈・懸濁した後、15mLのLB−Tc−Tb寒天培地(1質量%トリプトン、0.5質量%酵母エキス、1質量%NaCl、10ppmテトラサイクリン、1質量%CMC、0.04質量%トリパンブルー、1.5質量%寒天)の表面に100μL塗布し、培養温度32℃で2日で植え継いで繰り返し固体培養を行った。
製造例1で得た形質転換体を、20mLのLB−Tc培地(1質量%トリプトン、0.5質量%酵母エキス、1質量%NaCl、10ppmテトラサイクリン)に1%(v/v)接種し、培養温度32℃、200r/minで2日で植え継いで繰り返し振盪培養を行った。
培養温度を25℃とし、3日で植え継いだ以外は比較例1と同様に繰り返し振盪培養を行った。
製造例2で得た形質転換体を、20mLのLB−Tc−Tb培地(1質量%トリプトン、0.5質量%酵母エキス、1質量%NaCl、10ppmテトラサイクリン、1質量%CMC、0.04質量%トリパンブルー)に1%(v/v)接種し、培養温度32℃、200r/minで2日で植え継いで繰り返し振盪培養を行った。
上記実施例1〜3、比較例1〜3で得た培養物に対して、コロニーカウント法により、下記式に従ってプラスミド保持率の算出を行った。プラスミドを保持しているかどうかは目視により判別を行った。
〔プラスミド保持率の算出〕
プラスミド保持率=(プラスミドを保持したコロニー数)/(全コロニー数)
培養条件及びプラスミド保持率の結果を表1に示す。
実施例1、比較例1で得られた各世代の形質転換体を、タンパク生産性評価用培地(1.0質量%酵母エキス、1.0質量%魚肉エキス、0.24質量%金属塩、16質量%マルトース、3.6質量%アミノ酸混合物、0.4質量%アンモニウム塩、0.2質量%リン酸二カリウム、10ppmテトラサイクリン)に接種し、それぞれ36℃で3日間培養した。
培養後、菌体を除いた培養上清のアルカリプロテアーゼ活性を下記の手順にて測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。
1/15Mリン酸緩衝液(pH7.4)0.9mL、40mM Glt−Ala−Ala−Pro−Leu−p−ニトロアニリド/ジメチルスルホキシド溶液0.05mLを試験管に採り、30℃で5分間保温した。これに酵素液(培養上清)0.05mLを加えて30℃で10分間反応を行った後、5%(w/v)クエン酸水溶液2.0mLを加えて反応を停止し、分光光度計を用いて420nmにおける吸光度を測定した。吸光度の変化に基づいてサンプル中のアルカリプロテアーゼ量を定量した。1分間に1μmolのp−ニトロアニリンを生成する酵素活性を1Uとし、比活性よりアルカリプロテアーゼ生産量を算出した。
結果を表2に示す。
実施例3、比較例3で得られた各世代の形質転換体を、上記と同じタンパク生産性評価用培地に接種し、それぞれ36℃で3日間培養した。
培養後、菌体を除いた培養上清のアルカリセルラーゼ活性を下記の手順にて測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
1/7.5Mリン酸緩衝液(pH7.4、和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p−nitrophenyl−β−D−cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp−ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとし、比活性よりセルラーゼ生産量は比活性よりアルカリセルラーゼ生産量を算出した。
結果を表3に示す。
Claims (6)
- 目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で繰り返し培養することを含む、タンパク質又はポリペプチドの製造方法。
- 微生物を45世代以上にわたって培養する、請求項1記載のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
- 目的のタンパク質又はポリペプチドが加水分解酵素である請求項1又は2記載のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
- 加水分解酵素がアルカリセルラーゼ又はアルカリプロテアーゼである請求項3記載のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
- 微生物が枯草菌(Bacillus subtilis)である請求項1〜4のいずれか1項記載のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
- 目的遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で培養し、さらに固体培地の表面で継代培養を繰り返す、該プラスミドの安定化方法。
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