FI107879B - Menetelmä hepatiitti C:n hoitamiseen tarkoitetun koostumuksen valmistamiseksi - Google Patents

Description

107879

Menetelmä hepatiitti C:n hoitamiseen tarkoitetun koostumuksen valmistamiseksi - Förfarande för framställning av för skötsel av hepatit C avsedd samman-sättning 5 Tämä keksinnön kohteena on menetelmä hepatiitti C -viruksella infektoidun nisäkkään hoitamiseksi tarkoitetun koostumuksen valmistamiseksi.

Tekniikan tason kuvaus 10 Hepatiitti C -virus (HCV), oletettu aine pääosassa verensiirron jälkeen saaduista hepatiiteista, on määritelty hiljattain uudella serologisella määrityksellä. Kuo, G., et ai., Science. 244:362-4 (1989). Huolimatta verenluovutuspoolin laadun paranemisesta ja viimeaikaisesta luovutusveren testauksen toteuttamisesta nykyinen akuutin infektion arvioitu esiintymistaajuus verensiirtoja saavien henkilöiden 15 joukossa on 5 - 10 %. Alter, H.J., teoksessa Zuckerman, A.J., toimittaja, Viral Heptitis and Liver Disease. Allen K. Liss, New York, 1988, s. 537*42. Krooninen hepatiitti kehittyy ainakin puolella potilaista, joilla on akuutti HCV-infektio (edustaen noin 90 % potilaista, joilla on non-A, non-B -hepatiitti (NANB)), ja kirroosi kehittyy ainakin 20 %:lla tästä ryhmästä. Siten noin 3 miljoonasta henkilöstä, 20 jotka saavat vuosittain verensiirtoja USA:ssa, noin 150 000:lla kehittyy akuutti hepatiitti C. Krooninen hepatiitti C kehittyy ainakin 75 OOO.IIa näistä, ja näistä . . kirroosi kehittyy yli 15 OOO.IIa. Potilaista, joilla on verensiirron jälkeinen hepatiitti, • · 1' noin 90 %:iin asti on positiivisia HCV-vasta-aineen suhteen. Davis, G.L., et ai., * ’. New England Journal of Medicine. 321:1501-6 (1989). Potilailla, joilla on spora- • · 25 dinen NANB-hepatiitti (ei erityisiä riskitekijöitä), on hyvin todennäköisesti myös • · ... anti-HCV-vasta-ainetta. Kuo, et ai. (1989) edellä. Vaikka useimmilla potilaista, "jl. jotka saavat hepatiitti C:n, on subkliininen tai lievä tauti, noin 50 % etenee kroo- • · · niseen taudintilaan, jolle on tunnusomaista epävakaat seerumin transaminaasi- „ ..... epänormaalisuudet ja tulehdusvauriot maksabiopsiassa. Joidenkin arvioiden • · ..... 30 mukaan kirroosi kehittyy noin 20 %:iin asti tästä ryhmästä. Koretz, R.L., et ai., • Gastroenterology. 88:1251-4 (1985).

• · · • · · ·»» · • · · • · ’·;·* Viime vuosina on arvioitu erilaisia lääkkeitä tarkoituksena HCV-sukuisten tautien • · · · etenemisen pysäyttäminen tai hidastaminen. Sekä asikioviiri että kortikosteroidit • · · • · • t ·· · 2 107879 (joista on etua autoimmuunihepatiitissa) ovat tehottomia. Pappas, S.C., J. Med. Virol., 15:1-9 (1985); Stokes, P., et ai., Gastroenterology. 92:1783 tiivistelmä (1987).

5 Tähän mennessä α-interferoni (IFA) vaikuttaa lupaavimmalta ehdokkaalta, vaikkakaan se ei välttämättä ole lopullinen vastaus. Hoofnagle, J.H., et ai., symposiumissa Viral Hepatitis: 1981 International Symposium. Philadelphia, Franklin Institute Press, 1982, s. 573-83; Hoofnagle, J.H., et ai., New Encland Journal of Medicine. 315:1575-8 (1986); Thomson, J., Lancet. 1:539-41 (1987); Kiyosawa, 10 K., et ai., teoksessa Zuckerman, A., toimittaja, Viral Hepatitis and Liver Disease.

Allen K. Liss, New York, 1983, s. 895-7. Hoofnagle, J.H., et al., Sem. Liver Pis.. 9:259-263 (1985). Interferonit ovat isäntäproteiineja, joita muodostuu vasteena virusinfektioille samoin kuin muille antigeeniärsykkeille. Ne luokitellaan alkuperä-solunsa samoin kuin antigeenisyydensä mukaan, α-interferonia muodostavat 15 lymfoblastisolut, β-interferonia fibroblastisolut, ja gamma-interferonia T-solut. Kunkin ryhmän alatyypit perustuvat antigeenisyys/rakenne-ominaispiirteisiin. Kustakin ryhmästä on kehitetty yhdistelmä-DNA-muotoja, ja ne ovat kaupallisesti saatavia. Hoofnagle et ai. raportoi vuonna 1986 pilottutkimuksen, jossa käytettiin IFA:aa 10 potilaalla, joilla oli hyvin karakterisoitu verensiirron jälkeinen NANB-20 hepatiitti (Hoofnagle, J.H., et ai., New England Journal of Medicine. 315:1575-8 (1986)). Tässä tutkimuksessa kahdeksalla potilaalla kymmenestä seerumin ala-niinitransaminaasi(ALT)-tasot paranivat yhden kuukauden sisällä hoidon alkami-sesta. IFA-terapia koostui potilaista seitsemällä 5 miljoonasta yksiköstä (MU) • · [aaj. päivittäin, ja kolmella potilaalla yhdestä MU:sta päivittäin. Kaikilla kohteilla annos • · aaaa. 25 vähennettiin asteittain tasolle 1 MU päivittäin ja vaihdettiin sitten lopulta vuoro-• · päivinä tai joka kolmas päivä tapahtuvaan antoon. Kolmella potilaalla, joista otettiin hoidon jälkeiset maksabiopsiat, näyte osoitti merkittävän parannuksen • · · maksanportin tulehdusasteessa ja parenkyymin hepatosyyttisen nekroosin kato- aaa>; amisen. Sivuvaikutukset olivat yleisiä annoksella 5 MU/päivä ja käytännöllisesti • · .···. 30 katsoen puuttuivat tasolla 1 MU/päivä.

* • · · • · • · * ;;ja: Ihmisen yhdistelmä-DNA-a-interferonin vaikutukset prospektiivisessa, satunnai- « · *♦;·* sessa, plasebokontrolloidussa kaksoissokkokokeessa potilailla, joilla on hyvin • · · * dokumentoitu krooninen HCV-infektio, on suoritettu aikaisemmin. Di Bisceglie, • · · • · • ♦ ·· · 3 107879 A.M., et ai., New England Journal of Medicine. 321:1506-10 (1989). Kokeeseen osallistui 41 potilasta, joista 37:llä havaittiin myöhemmin olevan HCV-vasta-ainetta. Kaksikymmentäyksi potilasta sai a-interferonia (2 MU) ihonalaisesti kolmesti viikossa 6 kuukauden ajan, ja 20 sai plaseboa. Seerumin keskimääräi-5 nen ALT ja maksan histologiset ominaispiirteet paranivat merkittävästi potilailla, joita hoidettiin interferonilla, mutteivät potilailla, joille annettiin plaseboa. Interferonilla hoidetuista potilaista kymmenellä (48 %) oli täydellinen vaste määritettynä seerumin keskimääräisen ALT.n alenemisena normaalille alueelle hoidon aikana; kolmella muulla oli keskimääräisen ALT:n aleneminen yli 50 %:lla. Hoidon 10 päätyttyä seerumin ALT palasi kuitenkin yleensä hoitoa edeltäville tasoille; 6-12 kuukautta interferonihoidon keskeyttämisen jälkeen vain 2 potilaalla (10 %) oli yhä normaalit arvot. Kirjoittajat vetivät johtopäätöksen, että α-interferonihoito on eduksi kroonisessa hepatiitti C:ssä taudin aktiivisuuden alentamiseksi; usein edulliset vasteet ovat kuitenkin ohimeneviä, ja tiedetään, että sivuvaikutuksia 15 esiintyy.

Eräässä toisessa, laajemmassa tutkimuksessa hoidettiin kroonista hepatiitti C:tä (NANB-hepatiittia) 166 potilaassa joko 3 MU:lla tai 1 MU:lla ihmisen yhdistelmä- DNA-a-IFA:ta kolmesti viikossa 24 viikon ajan tai oltiin hoitamatta. Seerumin 20 ALT-taso palautui täysin normaaliksi 22 potilaalla 26:sta (85 %), joilla oli vastetta hoidolle 3 MU:lia interferonia, ja 9 potilaalla 16:sta (56 %) oli vastetta hoidolle 1 . . MU.IIa. Potilailla, jotka saivat 3 MU interferonia, oli histologinen paraneminen • · ; lobulaarisen ja periportaalisen tulehduksen regressiosta johtuen. Kuuden kuu- • · ' ' . kauden kuluessa hoidon loppuun saattamisen jälkeen 51 %:lla potilaista, joita oli • · 25 hoidettu 3 MU:lia interferonia ja 44 %:lla niistä, joita oli hoidettu 1 MUilla, tapah- • · a.a tui kuitenkin taudin uusiutuminen. Davis, G.L., et ai., New England Journal of

Medicine. 321:1501-06 (1989). Nämä kirjoittavat vetivät johtopäätöksen, että • · · 24-viikkoinen interferonihoitokuuri on tehokas taudin aktiivisuuden kontrolloinnis- „ aa. sa useilla potilailla, joilla on hepatiitti C, vaikkakin taudin uusiutuminen hoidon » · a...a 30 päätyttyä on yleistä.

• * · » · • · ··· · Hiljattain on raportoitu monikeskuksinen sattumanvaraistettu ihmisen yhdistelmä- • ♦ *·;·* DNA-a-IFN:n kontrollikoe potilailla, joilla on krooninen NANB-hepatiitti. Marcellin, :T: P., et ai., Hepatology. 13:393-97 (1991). Potilaat määrättiin sattumanvaraisesti • ·· » · • · *» · 4 107879 hoidottomiksi tai 1 - 3 MU:lle α-interferonia, joka annettiin kolmesti viikossa 24 viikon ajan. Potilaista 45 (75 %) oli HCV-vasta-aineen suhteen positiivisia. 24 viikon hoitoajanjakson aikana keskimääräiset seerumin ALT-tasot alenivat molemmissa hoitoryhmissä, mutta aleneminen oli tilastollisesti merkittävää vain 3-5 MU ryhmässä. 24 viikon kohdalla normaalit ALT-tasot omaavien potilaiden osuus oli samanlainen 3-MU ryhmässä (39 %) ja 1-MU ryhmässä (45 %), ja molemmat olivat merkittävästi korkeampia kuin kontrolleissa (0 %). Toistomaksabiopsia-näytteet osoittivat suuremman annoksen ryhmässä histologisten muutosten vakavuuden merkittävän vähenemisen, mutteivät pienemmän annoksen ryhmäs-10 sä tai kontrolleissa. Hoidon jälkeen keskimääriset ALT-tasot kohosivat kuitenkin molemmissa hoidetuissa ryhmissä. Normaalit ALT-tasot omaavien potilaiden osuus viikolla 48 oli 28 % 3-MU ryhmässä ja 20 % 1-MU ryhmässä. Kirjoittajat vetävät johtopäätöksen, että annos 3 MU oli ylivoimainen seerumin ALT-tasojen paranemisen indusoinnissa ja histologisissa maksan tutkimisissa verrattuna 15 määrään 1 MU α-interferonia annettuna kolmesti viikossa 24 viikon ajan. Taudin aktiivisuuden uusiutuminen tapahtui kuitenkin noin puolella vastetta omaavista potilaista, kun interferoni jätettiin pois. Vaste o-interferonille ei korreloinut infek-tiolähteen, tai anti-HCV-vasta-ainetiitterien potilasseerumeissa läsnäolon tai puuttumisen kanssa.

20

Sen vuoksi on selvää, että vaikka α-interferonilla on edullinen vaikutus HCV- . . infektion kulkuun, tämä vaikutus on usein vain ohimenevä. Sen vuoksi uudet • · • · ! modaliteetit ovat välttämättömiä hepatiitti C-viruksen vaikutusten poistamiseksi • · [ \ potilaalta pysyvästi.

• · 25 • · ... Erään toisen polypeptidi-immuunimodifioijien luokan, joka on peräisin kateenkor- ]*.]!. vasta, tymosiinien, on osoitettu laukaisevan imusoluissa kypsymistapahtumia, • · · lisäävän T-solutoimintaa ja edistävän immuunipuutteiden rekonstituutiota. Low, ...... T.L.K., et ai., Thymosins: # · ..... 30 Structure, Function and Therapeutic Application", Thvmus. 6:27-42 (1984).

• · · • · • · ·

Tymosiinifraktion viisi (TF-5), jonka on alunperin kuvannut Goldstein et ai. (Proc.

’·:** Nat'l Acad. Sci. (USA), 69:1800-1803 (1972)), on naudan kateenkorvan osaksi • · · *.· * puhdistettua uutetta, joka sisältää ainakin 40 peptidikomponenttia, joista 20 on • · · • · • * • · « 5 107879 puhdistettu homogeeniseksi tai lähes homogeeniseksi; se sisältää noin 0,6 % α-1-tymosiinia (THNa.,). Low, 1984, edellä.

THNa.,, joka on alunperin eristetty TF-5:stä, on sekvensöity ja kemiallisesti syn-5 tetisoitu. Wetzel, R., et ai., Biochemistry. 19:6096-6104 (1980). Sen sekvenssi on hyvin homologinen hiirillä, vasikoilla ja ihmisillä. THNa1 on 28 aminohappoa sisältävä polypeptidi, jonka molekyylimassa on 3100, ja jolla on osoitettu olevan immuunijärjestelmän moduloinnissa aktiivisuutta, joka on kvalitatiivisesti samanlaista kuin TF-5:n. Low, T.L.K., et ai., J. Biol. Chem.. 254:981-6 (1979). ΤΗΝα,-.llä 10 on voimakasta immunologista aktiivisuutta, mukaan luettuna a- ja y-interferonin tuotannon stimuloinnin, makrofagin migraatiota estävän tekijän tuotannon lisäämisen, T-solumarkkerien, mukaan lukien IL-2-redeptorien ekspression indusoinnin, ja T-soluauttajasoluaktiivisuuden parantamisen. Schulof, R.S., et ai., teoksessa The Lymphocyte. Allen J. Liss Inc., New York, 1981, s. 191-215; Low, T.L.K., et 15 ai., teoksessa "Thymosins: Structure, Function and Therapeutic Applications", Thvmus. 6:27-43 (1984); Koutab, N.M., et al., Immunopharm.. 16:97-105 (1988). Tutkimukset hiirillä ovat osoittaneet ΤΗΝα^η ja interferonin synergistisen vaikutuksen luonnolliseen tappajasoluaktiivisuuteen immunosuppressoiduilla hiirillä. Favilli, C., et ai., Cancer Immunol. Immunother.. 20:189-92 (1985). TF-5 ja THNa., 20 voivat vaikuttaa immuniteettia säätelevään T-solutoimintaan, edistää a-interfero-nin, gamma-interferonin ja inter!eukiini-2:n tuotantoa ihmisen imusoluilla ja lisätä . . interleukiini-2-reseptorin ekspressiota. Marshall, G.D., et ai., J. Immunol..

• · I. : 126:741-4 (1981); Mutchnick, M.G., et ai., Clin. Immunol. Immunopathol..

; \ 23:626-33 (1982); Sztein, M.B., et ai., Proc. Nat’l Acad. Sei. OJSAL 83:6107-6111 25 (1986); Serrate, S.A., et ai., J. Immunol.. 1939:2338-43 (1987); Baxevanis, C.N., • · et ai., Immunopharm.. 13:133-41 (1987); ja Svedersky, L.P., Eur. J. Immunol..

*::: 12:244-7(1982).

• » · ' • · · . Kliiniset kokeet TF-5:llä ja THNa^llä primäärisenä - tai oheishoitona immuuni- • · 30 vajavaisuus- tai syöpäpotilailla osoittavat, rttä nämä aineet lisäävät immuunivas-. T tetta ja lisäävät spesifisiä imusolutoimintoja. TF-5:llä ja puhdistetulla THNa.,:llä : on suoritettu kliinisiä kokeita useiden vuosien ajan. Varhaiset kokeet syöpä- tai • · · Σ···: immuunivajavaisuustiloja omaavilla potilailla olivat rohkaisevia vaikkakaan eivät :T: varmoja. Goldstein, A.L., et ai., Transp. Proc.. 9:1141 (1977); Barrett, D.J., et «·· • · • · ·♦ · 6 107879 ai., J. Pediatr.. 97:61 (1980); ja Cohen, M.H., et ai., J. Amer. Med. Assoc.. 241:1813-6 (1979). ΤΗΝα^η käyttö on kuvattu sattumanvaraisissa kokeissa potilailla, joilla on "nonsmall cell"-keuhkosyöpä. Potilaat käsiteltiin THNa^llä annoksella 900 pg/m2 ihonalaisesti kahdesti viikossa tai päivittäin kahden viikon 5 ajan ja sitten kahdesti viikossa radioterapiakuurin loppuun suorittamisen jälkeen. THNa^n ainoa sivuvaikutus oli lievä poltto injektiopaikassa kolmella potilaalla. Tämä johtui lääke-erästä ja on saattanut johtua väliaineen valmistuksesta. Eloonjäänti ilman taudin uusiutumista ja kokonaiseloonjäänti olivat suuremmat molemmissa THNa1-käsittelyryhmissä kuin plaseboryhmässä; havaittiin myös 10 jonkin verran säteilytyksen vähentämän immuunitoiminnan palautumista. Tähän ei liittynyt T-solujen lukumäärän kasvua. Schulof, R.S., et ai. J. Biol. Response Modifiers. 4:147-58 (1985).

Viimeaikaiset satunnaistetut kaksoissokkokokeet tymosiineilla on suoritettu van-15 hemmilla miehillä tarkoituksena lisätä vastetta influenssarokotteelle. Gravenstein, S., et ai., JAGS. 37:1-8 (1989). Potilaat saivat synteettistä THNoc^tä ihonalaisesti kahdesti viikossa alkaen ajankohtana, jolloin influenssarokote annettiin. Ajankohdalla kuusi viikkoa rokotuksen jälkeen niillä potilailla, jotka oli valittu satunnaisesti saamaan lääkkeen, oli korkeammat influenssa-vasta-ainetasot kuin kontrolleilla. 20 Tämä erotus korostui hyvin vanhoilla potilailla (iät 77 - 99 vuotta). Lääkkeen vastaanottajilla ei havaittu kliinistä tai biokemiallista toksisuutta.

♦ ♦ • « • ·

On alustavia raportteja siitä, että tymosiinit voivat olla tehokkaita muiden hepa- • · [ \ tiittivirusten kuin HCV:n aiheuttamia infektioita vastaan. Virushepatiitin eläinmal- • · " a. 25 lissa metsämurmelin hepatiittiviruksella infektoidussa metsämurmelissa THNa1 • · ... esti viraalista DNA-replikaatiota, muttei tuottanut kliinisten parametrien parane- *111' mistä. Korba, B.E., et ai., Hepatology. 12: tiivistelmä 880 (1990). Kliinisessä • · · pilottikokeessa potilailla, joilla oli hepatiitti B-viruksen (HBV) aiheuttama krooni- ...... nen aktiivinen hepatiitti B potilailla, joita käsiteltiin vuosi THNa/.llä (5 potilasta) • · ..... 30 tai TF-5:llä (2 potilasta), nähtiin seerumi-ALT:n selvä aleneminen; 6 potilaalla *** 7:stä nähtiin myös alentuneet seerumi-HBV-DNA-tasot, ja 5 potilasta 6:sta, jotka • ♦ · :y : olivat alunperin positiivisia seerumi-hepatiitti B-pinta-antigeenin (HBsAg) suh- • · *···* teen, puhdistui tästä antigeenistä. Mutchnick, M.C., et ai., Hepatology. 10: tiivis- ··* • · · • · · ··· • · • · ··* 7 107879 telmä 575 (1989). Näissä tiivistelmissä ei ehdotettu, että tymosiinit olisivat tehokkaita mitään muita hepatiittiviruksia vastaan.

Sen vuoksi tekniikan tasolla on yhä tärkeää tarvetta uutta modaliteettia kohtaan 5 HCV-infektioiden hoitamiseksi nisäkkäissä; tämä modaliteetti kuvataan alla.

Keksinnön kuvaus

On keksitty menetelmä valmistaa uusi koostumus HCV-infektioiden hoitamiseksi 10 nisäkkäillä, jolle menetelmälle on tunnusomaista se, että yhdistetään farmaseuttisen annosyksikön, joka sisältää immuunijäijestelmää tehostavan määrän tymosiinia ja/tai immuunijärjestelmää tehostavia tymosiinifragmentteja, farmaseuttisesti hyväksyttävän väliaineen kanssa farmaseuttiseksi annosyksiköksi.

15 Käsitteellä "tymosiinit" tarkoitetaan mitä hyvänsä tai kaikkia immuunijärjestelmää tehostavista polypeptideistä, joita luonnollisesti esiintyy kateenkorvassa, tai jotka on tuotettu kemiallisesti tai yhdistelmä-DNA-tekniikalla, tai fragmentteja, jotka on johdettu mistä hyvänsä näistä polypeptideistä. Käsitteellä "nisäkkäät" tarkoitetaan mitä hyvänsä nisäkäskohdetta, mukaan lukien ihmis- ja eläinpotilaita, jotka 20 vaativat hoitoa hepatiitti C-infektion vuoksi.

Käsitteitä "nisäkäs" ja "kohde" käytetään keskenään vaihdettavasi.

• · • · i HCV-infektioiden käsittelyyn sopivia tymosiinivalmisteita ovat mm. TF-5, THNc^ • · · 1 \ ja näiden fragmentit, esimerkiksi, C-terminaaliset 4-28- ja 15-28-, ja N-terminaa- [ 25 liset 1-8-, 1-14- ja 1-20-fragmentit. Nämä voidaan saada yhtiöstä Alpha-1 Bio- medicals Inc., Foster City, Kalifornia.

··· • · · · ··· • · · ‘‘ 1 Kohteet, esimerkiksi ihmispotilaat, voivat saada tymosiinin ihonalaisella injektiol- . la tai infuusiolla, sopivilla aikaväleillä sopivan ajanjakson. Tymosiinia annetaan 30 hepatiitti C -viruksella infektoiduille nisäkkäille määriä, jotka helpottavat tai edis- *:2 tävät hepatiitti C -viruksen inaktivaatiota in yivo. Tymosiinin kuten TF-5:n • · : immuunijärjestelmää tehostavan määrän farmaseuttinen annosteluyksikkö voi • · « olla noin 900 -1200 mg/m2 kehon pinta-alaa farmaseuttisesti hyväksyttävässä :T: väliaineessa. Tymosiinin kuten ΤΗΝα,ιη tai sen immuunijärjestelmää tehosta- • ·· m · • · ··« 2 8 107879 van fragmentin immuunijärjestelmää tehostavan määrän farmaseuttinen annos-teluyksikkö voi olla noin 900 -1200 pg/m2 kehon pinta-alaa farmaseuttisesti hyväksyttävässä väliaineessa. Tymisiinien tai fragmenttien lyofilisoidut valmisteet, jotka sisältävät mannitolia ja fosfaattia, liuotetaan laimennusaineeseen 5 ennen jakelua. Laimennusaineessa olevien tymosiinien pitäisi pysyä jääkaapissa varastoitaessa stabiileina ainakin 6 kuukauden ajan. On mukavaa valmistaa tymosiiniliuokset 1-ml annospulloihin. Jotkin potilaat voivat vaatia noin 8 pulloa/-kuukausi.

10 Tyypillisellä ihmispotilaalla on mukana anto-ohje kahdesti viikossa (esimerkiksi maanantaina ja torstaina) ihonalaisella injektiolla, jossa on noin 1500 -1700 pg THNa^tä tai sen fragmentteja. Hoitoannokset ja hoidon pituus voivat olla joustavia, ja ne voidaan määrittää kohteen kliinisellä vasteella tymosiineja kohtaan.

15 Taudin kulkua ja sen vastetta lääkehoidoille voidaan seurata kliinisellä tutkimuksella ja laboratoriotuloksilla. Koska kontrolloimattomassa hepatiitti C:ssä tiedetään esiintyvän kohonnutta seerumin alaniiniaminotransferaasia (ALT) ja aspar-taattiaminotransferaasia (AST), ja koska täydellinen vaste käsittelylle määritellään yleensä näiden seerumientsyymien, erityisesti ALT:n normalisoitumisena 20 (Davis, G.L., et ai., New England Journal of Medicine. 321:1501-6 (1989)), tymosiineilla hoidon etenemistä seurataan mukavasti tällä tekniikan tasolla hyväksytyllä testillä, joka suoritetaan esimerkiksi sekventiaalisella multippeli- • · analysaattorilla.

• · • · • · ..... 25 Eräs toinen tapa arvioida kohteita, joilla on HCV-vasta-aineita (kaikilla henkilöit- • · ... lä, joilla on hepatiitti C, ei ole havaittavaa HCV-vasta-ainetta - Weiner, A.J., et ai., Lancet. 335:1-3 (1990)) on testata kohteiden seerumit aika-ajoin näiden • · · vasta-aineiden tiitterin suhteen. Anti-HCV-vasta-aineet voidaan testata nykyisin ..... saatavissa olevalla C 100-3-testillä (Kuo, G., et ai., Science. 244:362-4 (1989)), • · ..... 30 Elisa-testillä (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, N.J.) tai yhdistelmä-DNA-mää- rityksellä (RIBA-1 ja RIBA-2, Chiron Corporation, Emeryville, CA). Voidaan • · · :;j.; käyttää mitä hyvänsä sopivaa testiä.

• · • · • · · ··· • · · • · · 1 2 3 · · • · 2 • » 3 9 107879 HCV-replikaation etenemisen seuraamiseksi kohteissa vasteena lääkehoidolle HCV-RNA voidaan mitata seeruminäytteistä esimerkiksi "nested"-polymeraasi-ketjureaktiomäärityksellä, jossa käytetään kahta alukkeiden sarjaa, jotka ovat peräisin HCV-genomin ei-rakenteellisilta NS3-ja NS4-geenialueilta. Farci, P., et 5 ai., New England Journal of Medicine. 325:98-104 (1991); Ulrich, P.P., et ai., J. Clin. Invest.. 86:1609-14 (1990).

Muita sopivia laboratoriotestejä hoidon etenemisen seuraamiseksi luetellaan esimerkissä 1 alla.

10

Tymosiiniterapiaa voidaan myös käyttää yhdistelmänä interferoniterapian kanssa, yhdistäen siten tymosiinien immuunijärjestelmää tehostavat vaikutukset interferonien antiviraalisten vaikutusten kanssa. Parantunut vastemäärä nykyisin käytetyillä interferoniannoksilla olisi edullista, erityisesti annosta rajoittavien 15 sivuvaikutusten valossa näiden proteiinien suuremmilla annoksilla. Eräs tämän konseptin versio on kyky saavuttaa verrattavissa oleva tehokkuus interferonilla plus tymosiinilla alhaisemmilla annoksilla kuin vaadittaisiin interferonilla yksinään.

20 Tässä yhdistelmäterapiahoito-ohjeessa yhtä tai useaa interferonia (esimerkiksi, yhdistelmä-DNA-a-2b-interferonia, Intron-A, Schering-Plough, Kenilworth, New . . Jersey) annetaan kohteille, esimerkiksi ihmispotilaille, ihonalaisesti annoksilla • · välillä noin 1 MU ja 3 MU yhdessä tai peräkkäin yhden tai usean tymosiinin • · · * \ kanssa, joihin edullisesti kuuluu THNcxj, annoksella noin 900 -1200 pg/m2 ke- • · . 25 hon pinta-alaa.

• · ···

Vaikka edellä olevassa esimerkissä puhutaan yhdistelmä-DNA-a-2b-interfero- • · · nista, voidaan tämän keksinnön mukaisesti edullisesti käyttää muita anti-HCV-Η"Λ. tehokkaita interferoneja kuten α-, β- ja gamma-interferonit, jotka ovat joko • m 30 yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistettuja tai luonnollisesti esiintyviä.

m «·· • · : Tämä yhdistelmäannoshoito-ohje on joustava ja riippuu kohteen kliinisestä • · · *···: tilasta. Kun kohteet eivät parane edullisilla annostelutasoilla, näitä voidaan lisätä :T: ei-toivottujen sivuvaikutusten sanelemissa rajoissa. Tyypillisesti injektioita anne- • · · * · ♦ · ··· 10 107879 taan viidesti viikossa ja jatketaan kunnes kohteella havaitaan hyväksyttävä vaste.

Testit yhdistelmäterapian tehokkuuden määrittämiseksi voivat olla samoja kuin 5 edellä yksinään tymiinillä suoritettavalle hoidolle kuvatut. Lisäksi voidaan käyttää maksabiopsianäytteiden histologista tutkimista arvioinnin toisena pääkriteerinä.

Knodell, R.G., et ai., Hepatology. 1:431-5 (1981), jonka histologinen aktiivisuus-indeksi (portaalinen tulehdus, "piecemeal"- tai "bridging"-nekroosi, lobulaarinen vaurio ja fibroosi) antavat käyttöön pisteytysmenetelmän taudin aktiivisuudelle.

10

Seuraavat esimerkit esitetään ainoastaan keksinnön kuvaamiseksi, eikä niitä ole ajateltu millään tavalla selityksessä ja patenttivaatimuksessa esitetyn keksinnön suoja-alaa rajoittaviksi.

15 Esimerkki 1

Iniisoitavan formulaation valmistus

Alla taulukossa 1 esitetyistä valmistusaineista valmistetaan farmaseuttisia an-20 nosyksiköitä, jotka ovat kukin tilavuudeltaan 1 ml.

TAULUKKO 1 • · I. :* Aktiivinen valmistusaine Määrä ml:ssa • · · * \ Thymosin α-1 0,0016 g • · 25 • · . Ei-aktiiviset valmistusaineet • · · ~~ ·::: mannitoli, U.S.P. 0,050 g • · « • · · natriumfosfaatti kaksiemäksinen, 30 heptahydraatti, U.S.P. 0,002 g ·«· • „ • · i·: · natriumfosfaatti yksiemäksinen, ··· :···: monohydraatti, U.S.P. 0,0005 g ··· • · · • · # ··· • 9 • 9 ··· 11 107879 natriumfosfaatti kaksiemäksinen, 2-mg/ml liuos natriumfosfaatti yksiemäksinen, 5 0,5-mg/ml liuos injektioon tarkoitettua vettä, U.S.P.

10 Esimerkki 2

Hepatiitti C -infektioiden käsittely ihmispotilailla tvmosiineilla ja interferoneilla

Aikuiset potilaat, joilla on krooninen aktiivinen hepatiitti C (CAHC), jaetaan sattu-15 manvaraisesti yhteen neljästä tutkimusryhmästä, jotka koostuvat noin 40 poti-laasta/ryhmä. Valintakriteereitä ovat mm.: (1) potilaat ovat aikuisia (iältään ainakin 18 vuotta); (2) seerumin ALT on ollut kohonneena ainakin 6 kuukauden ajan ennen hoitoa, jolloin ainakin yksi arvo on suurempi kuin kaksinkertaisesti normaalin yläraja suoritettaessa testauksen laboratoriossa; (3) potilaat on testattu 20 HCV-vasta-aineen suhteen positiivisiksi kahdessa tilanteessa ja varmistustestis-sä; ja (4) maksabiopsiassa kolmen kuukauden sisällä hoidosta on kroonisen . . akuutin hepatiitin kanssa yhdenmukainen patologia.

• · • · • · ·· · • · · : \ Poisjättökriteereitä ovat mm.: (1) hiljattain tapahtunut muun antiviraalisen tai ! 25 immuniteettia vähentävän lääkinnän käyttö; (2) hemofilia, raskaus tai HlV-infek- tio, tai muu vakava sairaus, joka voisi estää hoidon kulun loppuunsaattamisen; ··· *::! (3) muiden maksasairauden muotojen, mukaan lukien hepatiitti A:n tai B:n, a-1- • · · * antitrypsiinivajavuuden, Wilsonin taudin, ja hemokromatoosin on puututtava; (4) autoimmuunimarkkerien (ANA, ASMA, AMA, anti-LKMI) on puututtava, tai mikäli 30 niitä on, tiitterien pitäisi olla < 1:40; (5) valkosolujen puuttuminen (<3 000); (6) . *!* alhainen absoluuttinen neutrofiililuku (<1 000); (7) alhaiset verihiutaleet (<75 • « : 000); (8) alhainen Hb (<11 g/dl); (9) korkea bilirubiini (>4 mg/dl); ja (10) alhainen :···: seerumialbumiini (3 g/dl).

··· • · · • · · ··· • · • · ··· 12 107879

Ensimmäinen neljästä sattumanvaraisesti valitusta ryhmästä saa interferonia, edullisesti a-2b-interferonia, annoksella 3 miljoonaa yksikköä (MU) ihonalaisesti (SQ) maanantaisin, keskiviikkoisin ja perjantaisin, ja saa plaseboja tiistaisin ja lauantaisin. Toinen ryhmä saa saman interferoni-annos/kaavion plus tymosiinia, 5 edullisesti THNa^ta, annoksella 900 pg/m2 SQ tiistaisin ja lauantaisin. Kolmas ryhmä saa saman annoksen/kaavion pelkästään tymosiinia. Neljäs ryhmä saa aluksi plasebohoitoa, mutta voidaan siirtää tämän jälkeen sattumanvaraisesti kolmeen käsittelyryhmään. Interferonit ja tymosiinit voivat olla yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistettuja.

10

Potilaiden hoito alkaa heidän ollessa sairaalahoidossa noin viikon ajan, minkä ajanjakson aikana seurataan sivuvaikutuksia.

Ulkopotilaiden seuraaminen tapahtuu aluksi viikon välein kahden viikon ajan, 15 sitten kahden viikon välein kahden kuukauden ajan, ja sitten kuukausittain hoito-ajanjakson loppuosan. Kullakin vierailukerralla suoritetaan seuraavat testit: CBC, verihiutaleiden lasku, differentiaali ja ESR, ALT, AST, GGT, alkalinen fosfataasi, bilirubiini, kokonais-bilirubiini/albumiini ja HCV-vasta-aine. Kuukauden välein määritetään seerumin gamma-globuliini, TSH, ANA ja ASMA.

20 Lääkkeen toksisuutta tarkkaillaan jatkuvalta pohjalta käyttäen sekä kliinisiä - että . . laboratorioparametrejä.

• · • · ·· » « i »

Yhden kuukauden sisällä alustavien kuuden kuukauden hoidon loppuun saatta- . 25 misesta potilailta otetaan maksabiopsia tutkittavaksi patologisesti tavalla, jonka • · . on kuvannut Knodell et ai. edellä. Tämä järjestelmä antaa käyttöön numeerisen pisteytysjärjestelmän histologista aktiivisuutta varten potilailla, joilla on oireeton • · · CAH.

• · ,...a 30 Tässä pisteessä kontrollipotilaat jaetaan sattumanvaraisesti kolmeen ryhmään saamaan yhtä kolmesta hoitomodaliteetista, olettaen että heillä edelleen on • · «· J CAH seurausmaksabiopsiassa, ja että tutkimuksen yhdellä haaralla ei nähdä *···* hyvin merkittäviä positiivisia tai negatiivisia tuloksia analyysissä kuuden kuukau- den kohdalla.

• · · • · • · ··· 13 107879

Hoitoryhmissä olevia potilaita seurataan taudin uudelleen pahenemisen arvioimiseksi, josta uudelleenpahenemisesta on todisteena ALT-tasojen kohoaminen. Potilaat, joilla nähtiin vastetta alustavan kuuden kuukauden hoitoajanjakson aikana, mutta joilla on tämän jälkeen taudin uudelleen pahenemista, saavat 5 lisähoitoa.

Muita seerumin tai kudoksen testejä suoritetaan mikäli mahdollista: interferonien ja tymoosien vasta-aineiden arviointi, hepatiitti C-genomisegmenttien polyme-raasiketjureaktioamplifikaatio maksabiopsianäytteissä, ja anti-hepatiitti C-seeru-10 mitiitterien kvantitatiivinen arviointi.

Esimerkki 3

Hoitoprotokolla on kuten esimerkissä 2 paitsi, että interferonia käytetään tasolla 15 2 MU, ja tymosiinia tasolla 1050 pg/m2.

Esimerkki 4

Hoitoprotokolla on kuten esimerkissä 3 paitsi, että käytetään 1 MU interferonia 20 ja 1200 pg/m2 tymosiinia.

. . Esimerkki 5 • « • · • · • · · « · · ; *.* Tietojen analyysi • « 25 . On kaksi tärkeää kriteeriä hoidon vasteelle - ALT-tasojen normalisoituminen "!! hoitoajanjakson lopulla (osittainen vaste voidaan määritellä alkuperäisen ALT:n • ♦ ♦ * aleneminen ainakin 50 %:lla), ja histologinen parannus määritettynä histologisel- „ . la aktiivisuusindeksillä (HAI), jonka on kuvannut Knodell et ai. edellä.

30 • * -*!* Tämä analyysi antaa käyttöön karkean pisteytyksen alueella 1-22 näytettä « * i.i : kohden. Parillisia arvoja voidaan analysoida parillisten näytteiden Wilcoxon- ··· testiä käyttäen. Lisäksi näytteet voidaan luokitella lieväksi, kohtuulliseksi tai ··· • · ♦ • · · « ··· • · • · ·· · 14 107879 käänteiseksi CAH:ksi, ja parantuminen voidaan määritellä neliötilastollista Chi-analyysiä käyttäen.

"Life-table"-analyysiä käytetään remissio- ja uusiutumatilan arviointiin ALT-taso-5 jen normalisoitumisena. Muita jatkuvia muuttujia analysoidaan Studentin t-testiä käyttäen. Dikotomiset arvot alistetaan CHi'n neliölliselle tai Fisherin eksaktille testille, sopivuuden mukaan.

Suoritettiin tehoanalyysi määrittämään potilaiden lukumäärän kussakin testi-10 ryhmässä ennustettujen erojen osoittamiseksi. Tehoanalyysiä sovellettuna ANOVA:an käyttäen tehoa 0,80 jolloin a = 0,05, yhdistettynä aikaisempiin tutkimuksiin keskimääräisistä ALT-tasoista ja niiden variansseista, arvioi, että 21 potilaalla 52:sta on kussakin ryhmässä oltava keskimääräinen ALT-ero 15 IU/I. Päädyttiin 40 potilaaseen/ryhmä, koska 3-5 %:n potilaista odotetaan putoavan 15 testistä pois ja vaikuttavan kontrolliryhmän hoitoon kuuden kuukauden jälkeen.

Esimerkki 6 α-1-tymosiinin tehokkuus hepatiitti C:n hoidossa osoitettiin kahdella hepatiitti 20 C-potilaalia, joilla ei aikaisemmin ollut vastetta α-interferonille. Nämä kaksi potilasta käsiteltiin α-1-tymosiinilla injisoimalla sitä ihonalaisesti 1 mg kahdesti v viikossa, antaen kolmesti viikossa 2 MU a-IFN:ää. Kun α-1-tymosiinilla oli hoi- • · I.,!, dettu 6 kuukauden ajan, molemmilla potilailla nähtiin 50-% seerumin alaniini- transaminaasi(ALT)-tason aleneminen, mikä osoittaa α-1-tymosiinin tehokkuu- • · 25 den. Kuudella muulla hepatiitti C-potilaalla, joita hoidettiin edellä kuvatulla • « ... tavalla, nähtiin "täydellinen vaste" hoidolle 6 kuukauden jälkeen, seerumin [·!·1. ALT-tasojen alennettua normaaliksi. Kolmella muulla hepatiitti C-potilaalla, • · · jotka käsiteltiin kuten edellä, seerumin ALT-tasot alenivat 50 % 6 kuukauden ..... kuluttua. Kuudella muulla hepatiitti C-potilaalla, jotka käsiteltiin kuten edellä, ei • · ..... 30 ollut riittävää vastetta seerumin ALT:n 50-% alenemiskynnyksen saavuttami- * *·’ seksi 6 kuukauden kuluttua.

♦ · • · · » · · ··♦ · ·♦· • · • · «· · ··· * i · • » · · • · • 1«

Claims (10)

107879

1. Menetelmä hepatiitti C -viruksella infektoidun nisäkkään hoitamiseksi tarkoitetun koostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdistetään farma- 5 seuttisen annosyksikön, joka sisältää immuunijärjestelmää tehostavan määrän tymosiinia ja/tai immuunijärjestelmää tehostavia tymosiinifragmentteja, farmaseuttisesti hyväksyttävän väliaineen kanssa farmaseuttiseksi annosyksiköksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu 10 tymosiini on tymosiinifraktio viittä tai a-1 -tymosiinia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää antiviraalisesti tehokkaan määrän ainakin yhtä interferonia.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu interferoni on a-, B- tai y-interferonia.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu α-interferoni on a-2b-interferonia. 20

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu v. interferoni on yhdistelmä-DNA-interferonia. • ·* ·· · • » » • «

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu • · 25 tymosiini on tymosiinifraktio -5:tä, immuunijärjestelmää tehostava määrä on ihmisen immuunijärjestelmää tehostava määrä, ja mainittu farmaseuttinen • •99 annosyksikkö on noin 900 -1200 mg/m2 mainitun ihmisen kehon pinta-alaa. o-...: 8. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ·“*. 30 interferoni on a-interferonia ja mainittu määrä on välillä noin 106 ja 3 x 106 tn j yksikköä mainittua interferonia. t * · ··· · ··· • ♦ • · ·· > ··· 9 9 9 9 · 9 1 • 9 • 9 ·« · 107879

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu tymosiini on α-1-tymosiinia, mainittu immuunijärjestelmää tehostava määrä on ihmisen immuunijärjestelmää tehostava määrä, ja mainittu farmaseuttinen annosyksikkö on noin 900 -1200 pg/m2 mainitun ihmisen kehon pinta-alaa. 5

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu tymosiini on α-1-tymosiinia ja mainittu farmaseuttinen annosyksikkö sisältää noin 1500 -1700 pg α-1-tymosiinia. • · * · • · • 1 • · · • · · • · • · • · * · • · · • · · · • · · • · · ♦ · 1 • · • · · • · • · · • 2 3 • · • · · • · · • · · · ··· • · • · • · · *·· • · · • · · · · 2 • · • · 3 107879