FI107536B - Makrolidien fluorisokerijohdannaiset - Google Patents

Description

107536

Makrolxdlen fluorisokerijohdannaiset

Keksinnön tausta

Keksinnön kohteena on menetelmä uusien terapeut-5 tisesti käyttökelpoisten yhdisteiden valmistamiseksi. Erityisemmin kohteena on menetelmä uusien kemiallisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on arvoa annettaessa nisäkkäille, erityisesti ihmiselle, immuunivastetta heikentävinä aineina. Näitä uusia immuunivastetta heikentäviä 10 aineita voidaan verrata makrolideihin, jotka tunnetaan nimillä FK-506 ja FK-520, joita on kuvattu yksityiskohtaisemmin US-patentissa nro 4 894 366. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut uudet yhdisteet ovat erityisen hyödyllisiä estettäessä tai hoidettaessa siirteen 15 hylkimistä, mikä seuraa iho- tai elinsiirreleikkausta ja estettäessä tai hoidettaessa autoimmuunisairauksia, kuten nivelreumaa ja psoriasista. Tämän mukaisesti nämä makroli-dijohdannaiset ovat hyödyllisiä sienen aiheuttamien tulehdussairauksien hoidossa tai ennalta ehkäisyssä.

20 Kudos- tai elinsiirteen hylkiminen, mikä seuraa elinsiirtoleikkausta, on tavallinen tapahtuma, joka aiheutuu siitä, että potilaan immuunijärjestelmä tunnistaa vieraat antigeenit. Ihmisen immuunivastejärjestelmä yrittää suojata itseään vieraalta kudokselta ja vapauttaa solu- ja ' '25 elimistönestearsenaalin. Sekä aktivoidut lymfosyytit että vasta-aineet hyökkäävät vierasta kudosta vastaan aiheuttaen komplikaatioita, jotka usein päättyvät mainitun kudoksen hylkimiseen.

Samalla tavalla immuunisääteiset epäsäännöllisyydet 30 autoimmuunisissa ja kroonisissa tulehdussairauksissa ovat tunnettuja. Riippumatta sairauden etiologiasta monia autovasta-aineita ja itsereaktiivisia lymfosyyttejä esiintyy usein vaikeuttaen tilannetta.

Hoitomenetelmät, joiden kohteena on immuunisuojaus-35 järjestelmä, johtavat usein järjestelmän täydelliseen sei- 2 107536 sahtumiseen, mikä johtaa kehon kyvyn alentumiseen taistella infektiota vastaan. Tämä voi olla yhtä vaarallista kuin alkuperäinen tila, joka aiheutti seisahtumisen.

Tällä hetkellä johtava lääkeaine siirteen hylkimi-5 sen estämiseksi on syklosporiini A, jonka United States Food and Drug Administration on hyväksynyt 1983. Lääke toimii niin, että se inhiboi kehon immuunivastejärjestel-mää mobilisoimasta sen luonnollisten suoja-aineiden arsenaalia siirteen vieraan proteiinin hylkimiseksi. Vaikka 10 syklosporiini on tehokas taisteltaessa siirteen hylkimistä vastaan, sillä on haittoja, jotka voivat aiheuttaa maksavauriota, munuaisvauriota ja vatsahaavaa; jotka monissa tapauksissa voivat olla vakavia. On olemassa jatkuva tarve kehittää turvallisempia lääkkeitä, jotka ovat selektiivi-15 sempiä kykynsä suhteen vaikuttaa immuunivastej ärj estelmään ja joilla on vähemmän sivuvaikutuksia.

US-patentti nro 4 894 366 kuvaa makrolideja FK-506 ja FK-520 inter alia immuunivastetta heikentävinä aineina mukaan lukien "hylkimisreaktion hoitaminen elinsiirrossa" 20 ja autoimmuunisairauksien ja tulehdussairauksien hoitaminen. Kansainvälinen patenttijulkaisu nro WO 91/02 736 kuvaa FK-506:n, FK-520:n johdannaisia ja‘vastaavia makrolideja. EP-patenttijulkaisu nro 428 365A1 kuvaa eräitä muita FK-506:n, FK-520:n johdannaisia ja vastaavia makrolideja.

• 25 Keksinnön yhteenveto Tämän keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava 30 • · ' 35 3 107536

r1°n^N

9H3 5 ‘Τ^ί”3 Tr^0 νγ y*3

r^kfo JL

°i|j*OH //^'ch3 ! H,C J<„ / 10 X^k_y CH3 H3C0 OCH, 15 jossa n on 1 tai 2;

R1 on ryhmä, jolla on kaava II tai III

(F). 4 20 <R5>l"^X" tSi II ,n katkoviiva ei ole sidos; 25 A ja B ovat yhdessä =0; R2 on -OH; R3 on (Ci-Cj) alkyyli tai allyyli; R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R8, -C02H, -CH20H, H, -ch3, -ch2f, -chf2, -CF3, -CONH2, -CONHR8, 30 -CON(R8)2/ -CH2OCOR8, -CH20C02R8, -CH2OCONR28 tai -CH2OR8; R5 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C-l-Oj) alkoksi,

» · I

bentsyylioksi, -OH, -OCOR8, -OCOCH2R8, -0C02R8 tai -OSi(R8)3; t on 1, 2 tai 3; m on 0 tai 1; ja 35 R8 on (C-L-Cg) alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, pyridyy- 4 107536 li, tienyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu 1 - 5 halogeeniatomilla, -OH-ryhmillä tai (C-l-CJ alkoksiryh-millä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1 -5 halogeeniatomilla, -OH-ryhmillä tai (C^-C1) alkoksiryhmillä; 5 edellyttäen, että kun m on 0, silloin R4 on -CH2F, -CHF2 tai CF3; ja että kaavoissa (II) ja (III) kunkin rengashiilen on sisällettävä vähintään yksi vetyatomi, ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi .

10 Tämän keksinnön yhdisteiden edullinen ryhmä on kaa van (I) yhdisteiden ryhmä, jossa n on 2; R1 on R‘ Λ R» R« · R5 Γ R4 p5 20 tai F-J=k ; R’ „5 R2 on -OH; R3 on etyyli; R4 on H, -CH2OH, -CH2F, -CH2OCOCH3 • 25 tai -CH2OCH2C6H5; ja R5 on -OH, -OCOCH2C6H5 tai -OCOCH3.

Erityisen edullisia tässä ryhmässä ovat kaavan (I) yhdisteet, joissa R1 on 3 0 f· CHgOflc F CH?0H flc0 CHjOfic ~Jft-. -Jfk-. ,JLk-.

Oflc OH Oflc 35 5 107536 HO CHgOH BzO—I n · an au r

I I (/Λ. ficO CH»F

. wi. »cJLtf- tai 5 0H 2 OOc

HO CHgF

10 Η°-ϋρ£- ·

OH

Toinen tämän keksinnön yhdisteiden edullinen ryhmä on kaavan (I) yhdisteiden ryhmä, jossa n on 2; R2 on -OH; 15 ja R3 on etyyli.

Kaavan (I) yhdisteet ovat tehokkaita immuunivastetta heikentäviä aineita. Tämä aktiivisuus tekee näistä yhdisteistä käyttökelpoisia hoidettaessa ja ennaltaehkäistäessä siirteen hylkimisreaktiota. Lisäksi tämä aktiivi-20 suus tekee näistä yhdisteistä käyttökelpoisia ennaltaehkäistäessä ja hoidettaessa autoimmuunisairauksia, kuten nivelreumaa ja psoriasista nisäkkäässä, erityisesti ihmisessä .

Yhdisteitä voidaan käyttää menetelmässä, jossa hoi- • 25 detaan hylkimisreaktiota elinsiirrossa nisäkkäässä, joka tarvitsee tällaista hoitoa, jossa menetelmässä annetaan mainitulle nisäkkäälle vaikuttava määrä kaavan (I) yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa.

Termi "elinsiirto" käytettäessä edellä ja tämän 30 jälkeen viittaa henkilöön istutettuun siirteeseen, joka siirre on kudos tai elin, joka on otettu henkilön toisesta • · kohdasta tai toiselta henkilöltä. Tavallisia elinsiirtoja ovat, näihin rajoittumatta, luuydin-, sydän-, munuais-, jänne- ja haima-pohjukaissuolielinsiirrot. 1 35 c < 6 107536

Termi "siirre" käytettäessä edellä ja tämän jälkeen viittaa mihin tahansa kiinnittämättömään kudokseen tai elimeen, jota käytetään elinsiirroissa. Tavallisia siirteitä ovat, näihin rajoittumatta, iho-, luu-, rasva- ja 5 hermosiirteet.

Lisäksi yhdisteitä voidaan käyttää menetelmässä autoimmuunisairauden (kuten nivelreuman tai psoriasiksen) hoitamiseksi nisäkkäässä, joka tarvitsee tällaista hoitoa, jossa menetelmässä annetaan mainitulle nisäkkäälle vaikutit) tava määrä kaavan (I) yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa.

Yhdisteitä voidaan käyttää edelleen farmaseuttisessa koostumuksessa, joka sisältää vaikuttavan määrän hylkimisreaktiota elinsiirrossa hoitavaa kaavan (I) yhdistettä 15 ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantoainetta.

Vielä edelleen yhdisteitä voidaan käyttää farmaseuttisessa koostumuksessa, joka sisältää vaikuttavan määrän autoimmuunisairautta (kuten nivelreumaa tai psoriasista) parantavaa kaavan (I) yhdistettä ja farmaseuttisesti 20 hyväksyttävää kantoainetta.

Lisäksi kaavan (I) yhdisteillä on sieniä vastustavaa aktiivisuutta. Täten näitä yhdisteitä voidaan käyttää sienistä aiheutuvien tulehdusten ennaltaehkäisyssä tai hoidossa nisäkkäissä.

- 25 Tämän mukaisesti yhdisteitä voidaan käyttää mene telmässä sienisairauksien hoitamiseksi nisäkkäässä, joka tarvitsee tällaista hoitoa, jossa menetelmässä annetaan mainitulle nisäkkäälle vaikuttava määrä kaavan (I) yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa.

30 Yhdisteitä voidaan käyttää lisäksi farmaseuttisessa koostumuksessa, joka sisältää vaikuttavan määrän sienitu-lehdussairautta hoitavaa kaavan (I) yhdistettä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantoainetta.

7 107536

Yksityiskohtainen kuvaus Tämän keksinnön kaavan (I) yhdisteet ovat helposti valmistettavissa. Edullisimmin makrolidi, jolla on seuraa-va kaava (IV) tai (V), kytketään tarkoituksenmukaisen so-5 kerihalidin kanssa, jolla on kaava - “ä; x

VI VII

15 jossa X on halogeeni esim. kloori tai bromi. Kytketty (tai glykosyloitu) makrolidi modifioidaan sitten edelleen, kuten seuraavassa on kuvattu.

20 H3C0'^^V^j)2’ f”3 25 oh

♦f Π il8 R3 IV

A o'd I

J^0H CHa 3Cxi^i V*...

U6 JL 23 / ~CH3 30 ΓΊ— H3co och3 35 8 107536 Π"?- 111 ch3 h3cit il2 I 3

Ckv° L Ji‘ 3

4N |T ||17 R

A00 Ach3 V

2[ OH / 3 10 H’N?S \»CH3

LssA. zzj |24 h3co och3 15 Kaavojen (IV) ja (V) makrolidien valmistus on hyvin tunnettua kirjallisuudessa. Tavallisesti yleisin näiden makrolidien valmistusmenetelmä on mikro-organismien, jotka kuuluvat Streptomyces-sukuun, biologinen fermentaatio. Kaavojen (IV) ja (V) yhdisteet, joissa R3 on allyyli, saa-20 daan Streptomyces tsukubaensis nro 9993:n (Ferm BP-927) fermentaatiolla. Kaavan (IV) yhdiste, jossa R3 on etyyli ja kaavan (IV) yhdiste, jossa R3 on metyyli, saadaan Streptomyces hygroscopicuksen alalaji ascomyceticus ATCC 14891:n fermentaatiolla.

' 25 Streptomyces hygroscopicuksen alalajin ascomyce- ticuksen ATCC 14891 lyofilisoitu näyte on tallennettu American Type Culture Collectioniin, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, USA, Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti 13. tammikuuta 1992. Tälle vastatallen-30 netulle viljelmälle on annettu uusi talletusnumero ATCC 55276.

Streptomyces tsukubaensis nro 9993 (Ferm BP-927) on tällä hetkellä tallennettavana Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science Technologyn toi-35 mesta (nro 1-3, Higashi-1-chome, Yatabemachi, Tsukuba- • « 9 107536 gun, Ibaraki Prefecture, Japani) , Budapestin sopimuksen mukaisesti. Mikro-organismin tuore näyte tallennetaan American Type Culture Collectioniin Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti.

5 Edellä mainitut mikro-organismit, ollessaan erik seen vesipitoisessa elatusnesteessä, muodostavat edellä mainitut kaavojen IV ja V yhdisteet. Mainittujen mikro-organismien fermentaatio näiden makrolidien muodostamiseksi toteutetaan pääosin, kuten on kuvattu US-patentissa 10 4 894 366, joka täten on liitetty tähän viitteenä. Mitkä tahansa muutokset kuvatussa menetelmässä on tehty sovellettuna käytetylle laitteistolle ja on kuvattu seuraavissa valmistusmenetelmissä 1 ja 2.

Kaavan (I) yhdisteen valmistamiseksi, jossa R° on OH 15 ja R1 on kaavan (II) tai kaavan (III) sokerisubstituentti, kaavan (IV) tai (V) makrolidi kytketään kaavan (VI) tai (VII) sokerihalidin kanssa. Kaavan (VI) tai (VII) sokeri-halidien ja kaavan (IV) tai (V) makrolidin kytkentä (tai glykosylaatio) -reaktio toteutetaan yksinkertaisesti käyt-20 täen kemiallisia menetelmiä,' jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle. Kytkentäreaktio toteutetaan tavallisesti käyttäen fluorisokerin perasetyloitua muotoa. N. 2 -4 mooliekvivalenttia tarkoituksenmukaista kaavan (VI) tai (VII) sokerihalidia sekoitetaan kaavan (IV) tai (V) makro- • 25 lidin kanssa reaktioinertissä liuottimessa. Tämänkaltaisen reaktion hyödyllisiä reaktioinerttejä liuottimia ovat klooratut liuottimet, kuten kloroformi, metyleenikloridi ja etyleenidikloridi; eetteriliuottimet, kuten dietyyli-eetteri, tetrahydrofuraani, dioksaani ja dimetoksietaani; 30 aromaattiset liuottimet, kuten bentseeni, tolueeni ja ksy-' ^ leeni; ja dipolaariset aproottiset liuottimet, kuten N,N- dimetyyliformamidi, asetonitriili ja N-metyylipyrrolidoni. Edullisia liuottimia ovat klooratut liuottimet ja erityisen edullinen liuotin on metyleenikloridi. Tavallisesti on 35 toivottavaa käyttää tarpeeksi liuotinta niin, että reagoi- 1 · « 10 107536 vat aineet liukenevat tai suspendoituvat liuottimeen. Tavallisesti käytetty liuotinmäärä vaihtelee niin, että saadaan 10"1 - 10"3 molaarinen makrolidiliuos, josta 10'1 molaa-rinen liuos on edullinen. Olosuhteet pidetään kuivina läpi 5 reaktion käyttäen vedettömiä liuottimia ja lisäämällä kuiva-ainetta reaktioseokseen. Tätä tarkoitusta varten käytettyjä kuiva-aineita ovat molekyyliseulat, kalsiumsulfaatti ja magnesiumsulfaatti. Edullinen kuivausaine on 4 A:n molekyyliseulat.

10 Reagoivien aineiden sekoittaminen toteutetaan läm pötilassa n. -78 - n. 70 °C. Edullisia ovat lämpötilat alueelta n. -78 - n. 0 °C. Valmistuksen helpottamiseksi erityisen edullinen on kylmähaude, joka pitää reaktioläm-pötilan -78 °C:ssa.

15 Kun edellä mainitut reagoivat aineet on sekoitettu ja lämpötila on tasoittunut -78 °C:seen, reaktioseosta käsitellään sopivalla emäksellä, kuten elohopeakarbonaa-tilla, hopeakarbonaatilla, elohopeanitraatilla tai hopea-nitraatilla. Edullinen emäs tälle reaktiolle on hopeakar-20 bonaatti. Mainitun emäksen lisäyksen jälkeen reaktioseosta käsitellään katalyytillä. Tavallisia katalyyttejä tälle reaktiolle ovat triflaatti-, perkloraatti- ja tetrafluori-boraattisuolat kationille, joka liittyy käytettyyn kyseiseen emäkseen. Edullinen katalyytti on hopeatriflaatti.

* 25 Kun kaikki reagoivat aineet ja reagenssit on lisät ty, reaktioseos lämmitetään 0 °C:seen, sekoitetaan 0,5 -24 tuntia 0 °C:ssa ja lämmitetään hitaasti huoneenlämpötilaan. Reaktioseosta sekoitetaan 0,5 - 24 lisätuntia huoneenlämpötilassa. Tavallisesti reaktioseosta sekoitetaan 30 0 °C:ssa viisi tuntia ja annetaan lämmetä huoneenlämpöti laan kolmen tunnin aikana, mitä seuraa 16 tunnin sekoittaminen huoneenlämpötilassa. Sitten tuote eristetään reak-tioseoksesta käyttäen menetelmiä, jotka ovat tunnettuja alaan perehtyneille. Täten yksinkertainen suodattaminen 35 suodattimen, kuten CeliteR:n läpi, mitä seuraa haihduttami- φ * 11 107536 nen, antaa jäännöksen, joka puhdistetaan pylväskromatogra-fisesti. Alaan perehtynyt tietää, että pylväskromatogra-fiässä käytetään kiinteää faasia, kuten silikageeliä, ja nestemäistä faasia, joka koostuu liuottimien edullisesta 5 seoksesta, yhdisteiden erottamiseksi ja puhdistamiseksi seoksesta. Liuottimien poistaminen kromatografian jälkeen antaa fluoriglykosyylimakrolidin.

Yleensä kytkentäreaktio tapahtuu ainoastaan yhdessä kolmesta alkoholikohdasta makrolidissa. Tämä kohta on 10 C-4"-funktionaalinen alkoholiryhmä (katso kaava IV). Tämä selektiivisyys on mahdollista johtuen tämän aseman hydrok-syyliryhmän suuremmasta vastaanottavuudesta makrolidien edullisessa konformaatiossa. Joskus kuitenkin erityisen reaktiivisilla sokerihalideilla muodostuu pieniä määriä 15 diglykosyloitua ainetta (jossa R2 on 0R°). Tämä aine havaitaan seurattaessa reaktion etenemistä, mikä tavallisesti tehdään ohutkerroskromatografisesti standardikäytännön mukaisesti. Diglykosyloitu aine eristetään ja puhdistetaan, kuten monoglykosyloitu aine, paitsi sillä huomatta-20 valla poikkeuksella, että diglykosyloitu aine on tavallisesti ensimmäinen eristetty aine kromatografoinnissa, kun taas monoglykosyloitu aine eristetään myöhemmistä jakeista. Lisättyjen sokerikloridiekvivalenttien käyttö tai muiden parametrien, kuten liuottimen, emäksen tai katalyytin, * 25 muuttaminen voi vaikuttaa diglykosyloidun aineen saantoon.

Kaavan (I) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R1 on H ja R° on kaavan (III) sokerisubstituentti, kaavan (IV) tai (V) makrolidi suojataan ensin hydroksyylisuojaryhmällä C-4"-asemassa. Hydroksyylisuojaryhmiä, jotka ovat sopivia 30 tällaista tarkoitusta varten ovat, näihin rajoittumatta, silyylieetterit, karboksyylieetterit ja karboniesterit. Suojaryhmät on liitetty alkoholiin käyttäen hyvin tunnettuja orgaanisen kemian menetelmiä. Silyylieetterit ovat edullisia johtuen niiden selektiivisyydestä ja liittämisen 35 ja poistamisen helppoudesta. Tämän mukaisesti kaavan (IV) 12 107536 tai (V) makrolidi liuotetaan reaktioinerttiin liuottimeen lämpötilassa n. 0 - n. 30 °C. Tämänkaltaiseen reaktioon sopivia reaktioinerttejä liuottimia ovat dipolaariset ap-roottiset liuottimet, kuten dimetyyliformamidi, asetonit-5 riili ja N-metyylipyrrolidoni; klooratut liuottimet, kuten kloroformi, dikloorimetaani ja 1,2-dikloorietaani; ja eet-teriliuottimet, kuten dietyylieetteri, dioksaani ja tetra-hydrofuraani. Valittu liuotin on usein dimetyyliformamidi. Silylointiainetta, tavallisesti silyylikloridia, kuten di-10 metyyli-t-butyylisilyylikloridia, trimetyylikloorisilaania tai trifenyylikloorisilaania, lisätään yhdessä orgaanisen amiinin, kuten trietyyliamiinin, trimetyyliamiinin tai imidatsolin, kanssa. Tavallisesti edullinen emäs on imi-datsoli. Reaktioseosta sekoitetaan n. 1 - 24 tuntia, ta-15 vallisesti huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen tuote eris tetään reaktioliuoksesta tavalla,.joka on hyvin tunnettua alaan perehtyneelle.

Makrolidi, nyt suojattu C-4"-asemassa, voidaan kytkeä kaavan (VI) tai (VII) sokerihalidin kanssa, kuten täs-20 sä edellä on kuvattu. Tällaisen kytkentäreaktion tuote on kaavan (I) yhdisteen johdannainen, johon sokerijohdannainen on liittynyt hapen kautta C-14-asemaan ja C-4"-asema on suojattu. C-4"-aseman suojaus voidaan poistaa antamaan vapaa hydroksiyhdiste käyttäen orgaanisen kemian standar-* '25 dimenetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle. Edullisen silyylieetterisuojaryhmän poistamiseksi C-4"-silyylisuojattu kaavan (I) yhdiste liuotetaan eette-riliuottimeen, kuten tetrahydrofuraaniin tai dietyylieet-teriin, lämpötilassa n. 0 - n. 30 °C ja käsitellään fluo-30 ridilähteellä, kuten tetra-N-butyyliammoniumfluoridilla.

Reaktioseosta sekoitetaan n. 1 - n. 24 tuntia ja sitten tuote eristetään käyttäen orgaanisen kemian standardimenetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle.

Kaavan (I) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa A ja 35 B ovat erikseen ja ovat kumpikin H (yhdisteisiin viitataan * * · <· 13 107536 tämän jälkeen C-2-desoksomakrolideina), kaavan (I) yhdiste, jossa A ja B ovat yhdessä =0, pelkistetään käyttäen standardiolosuhteita α-ketoamidien pelkistykselle. Tämä pelkistysmenetelmä pelkistää selektiivisesti amidin vie-5 reisen karbonyylin vaikuttamatta muihin karbonyyleihin molekyylissä. Tavallisesti kaavan (I) makrolidi liuotetaan reaktioinerttiin liuottimeen tai liuottimien seokseen ja rikkivetykaasua kuplitetaan seokseen 6-24 tuntia huoneenlämpötilassa. Tavallisesti kaasua kuplitetaan reak-10 tioseokseen yön yli. Sopivia reaktioinerttejä liuottimia tälle reaktiolle ovat, näihin rajoittumatta, orgaaniset emäkset, kuten dietyyliamiini, trietyyliamiini, dimetyy-liamiini, trimetyyliamiini ja aniliini; dipolaariset ap-roottiset liuottimet, kuten Ν,Ν-dimetyyliformamidi, dime-15 tyylisulfoksidi ja N-metyylipyrrolidoni; ja alkoholiliuot- timet, kuten metanoli, etanoli ja propanoli. Kahden tai useamman tällaisen liuottimen yhdistämistä käytetään joskus optimisaannon aikaansaamiseksi tai vaikuttamaan pelkistyksen kulkuun. Esimerkiksi makrolidi, jossa A on H ja 20 B on OH, valmistetaan käyttäen metanolia liuottimena. Erityisen edullisessa liuotinjärjestelmässä C-2-desoksomakro-lidin valmistamiseksi on pyridiiniä ja Ν,Ν-dimetyyliforma-midia yhtäläisiä määriä. Kun reaktio on täydellinen, tuote eristetään käyttäen orgaanisen kemian standardimenetelmiä, '25 kuten on ilmeistä alaan perehtyneelle.

Vaihtoehtoisesti kaavan (IV) tai (V) yhdisteet voidaan pelkistää ennen glykosylaatiota käyttäen edeltävää menetelmää. Pelkistyksen jälkeen makrolidi voidaan glyko-syloida, kuten tässä edellä on kuvattu.

30 Kaavan (I) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa kat koviiva on sidos ja R2 on vety, kaavan (I) yhdiste, jossa R2 on -OH ja katkoviiva ei edusta mitään sidosta (joihin yhdisteisiin viitataan tämän jälkeen S-hydroksiketonina) dehydrataan, kuten EP-patenttihakemuksessa nro 323 042 on 35 14 107536 kuvattu. Tavallisesti β-hydroksiketoni liuotetaan reakti-oinerttiin liuottimeen, joka sisältää katalyyttisen määrän orgaanista happoa. Sopivia reaktioinerttejä liuottimia ovat aromaattiset liuottimet, kuten bentseeni, tolueeni, 5 ksyleeni ja vastaavat, joista tolueeni on edullinen. Orgaaninen happo valitaan tavallisesti sellaisista hapoista, kuten tolueenisulfonihaposta, kamferisulfonihaposta ja vastaavista, joista tolueenisulfonihappo on edullinen. Reaktioseosta kuumennetaan n. 50 -n. 120 °C:ssa n. viisi 10 minuuttia - n. yksi tunti. Tavallisesti höyryhaudelämpötilat (n. 100 °C) ovat edullisia ja viisi minuuttia on yleensä riittävä aika reaktion loppuunviemiseksi. Reaktiotuote eristetään menetelmien avulla, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle. Reaktio toteutetaan taval-15 lisesti yhdisteille, jotka on jo glykosyloitu.

Kaavan (I) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R5 on hydroksi ja R4 on hydroksimetyyli, kaavan (I) yhdiste, jossa R5 on asetoksi ja R4 on asetoksimetyyli, deasetyloidaan käyttäen standardiolosuhteita, jotka ovat tunnettuja alaan 20 perehtyneille, kuten seuraavassa on esitetty. Tämä selektiivinen deasetylointi ei vaikuta amideihin, joita on läsnä, ja toteutetaan helposti lisäämällä alkoksidiemästä liuokseen, jossa on deasetyloitavaa ainetta alkoholipitoisessa liuottimessa 0 °C:ssa. Tavallisesti käytetään kata- 25 lyyttistä määrää, kuten 0,01 ekvivalenttia emästä. Taval lisesti kyseisen alkoholipitoisen liuottimen alkoksidiemäs on edullinen. Edullisin, johtuen sen helppokäyttöisyydestä ja reaktiivisuudesta, on järjestelmä, jossa metanoli on liuotin ja natriummetoksidi on emäs. Tuotteen eristäminen 30 toteutetaan standardimenetelmien avulla, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle.

Kaavojen (VI) ja (VII) fluorisokerihalidijohdannaiset valmistetaan edullisesti kaavojen (VIII) ja (IX) fluo-risokerijohdannaisista, joissa R6 on H, (C-l-C^ alkyyli tai 35 > · ~ * 15 107536 (C2-C4 )alkanoyyl±, käyttäen halogenolnnln standardimenetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle.

• -Jr'· 0Re

VIII IX

10

Bromaus on valittu menetelmä; kloorausta voidaan myös käyttää tietyissä tapauksissa. Bromaus toteutetaan liuottamalla 1-hydroksi-, alkoksi- tai alkanoyylioksifluo-risokerijohdannainen orgaaniseen happoliuottimeen, kuten 15 etikkahappoon. Kun sokeri on 1-hydroksi- tai 1-alkoksiso-keri, lisätään tavallisesti 1-10 ekvivalenttia etikka-happoanhydridiä. Edullisia substraatteja ovat 1-asetoksi-sokerljohdannaiset. Reaktioseos jäähdytetään niin, että lämpötila putoaa alueelle -20 - n. 0 eC. Tavallisesti 20 edullinen lämpötila on n. 0 eC. Jäähdytettyä reaktioseosta käsitellään vetybromidihappoliuoksella happoliuottimessa. Tavallisesti käytetään suurta ylimäärää, kuten 10 - 40 mooliekvivalenttia vetybromidihappoa. Reaktioseos lämmitetään huoneenlämpötilaan ja sekoitetaan, kunnes reaktio on ’ '25 täydellinen. Tavallisesti, yksinkertaisuuden vuoksi, reaktioseos jätetään sekoituksenalaisena seisomaan yön yli. Bromatun tuotteen eristäminen toteutetaan yksinkertaisesti tavalla, joka on hyvin tunnettu alaan perehtyneelle. Yleensä tämä käsittää pelkästään liuottimen poistamisen 30 tyhjössä. Joissakin tapauksissa liuottimen tehokkaampaa poistamista varten käytetään lisäliuotinta, kuten toluee-nia, reaktioliuottimen haihduttamiseksi atseotrooppisesti. Lisäpuhdistus toteutetaan joskus käyttäen pylväskromato-grafiaa.

♦ « 16 107536

Kaavojen (VIII) ja (IX) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R4 on -CH2OCOR8, R5 on -OCOR8 ja R6 on -COR8, kaavan (VIII) tai (IX) yhdistettä, jossa R4 on -CH2OH, R5 on -OH ja R6 on H, käytetään substraattina standardiasylointi-5 reaktiossa. Tavallisesti mainittu substraatti saatetaan reagoimaan sopivan asylointiaineen, kuten, mutta tähän rajoittumatta, etikkahappoanhydridin, kanssa sopivassa liuottimessa, kuten etikkahapossa n. 0 - n. 25 °C:ssa. Tuote eristetään käyttäen orgaanisen kemian standardimene-10 telmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle.

Kaavojen (VIII) ja (IX) fluorisokeriyhdisteet voidaan valmistaa, kuten kirjallisuudessa on esitetty. (Katso esimerkiksi Kovac, P; Yeh, H.J.C. ja Glaudemans, C.P.J., Carbohydrate Research, 140, 277 (1985) ja Shärma, M. ja 15 Korytnyk, W., Tetrahedron Letters, 1977, 573.)

Kaavan (VIII) sokerijohdannaiset, joissa m on 1 ja fluoriatomi on liittynyt sokerimolekyylin 4-asemaan, voidaan valmistaa, kuten seuraavassa on kuvattu.

4-fluorisokerijohdannaisen valmistamiseksi (kaavan 20 (VII) yhdiste, jossa m on 1 ja fluoriatomi on liittynyt 4-asemaan) metyylipyranosidi (kuten metyyliglukopyranosidi tai metyyligalaktopyranosidi) asyloidaan regioselektiivi-sesti 2,3- ja 6-hydroksyyliryhmissä. Jäljellejäänyt hyd-roksyyliryhmä korvataan fluoridilla S„2-reaktiolla ja me-’ 25 toksiryhmä 1-asemassa korvataan asetoksiryhmällä antamaan tetra-asetyylifluoripyranosidi.

Täten alkyylipyranosidi (kuten metyyli-a-D-gluko-pyranosidi tai metyyli-a-D-galaktopyranosidi) aktivoidaan organometallisella aineella, kuten bis(tributyylitina)ok-30 sidilla. Reaktiota palautus jäähdytetään vesi-atseotrooppi-.. sessa liuottimessa, kuten tolueenissa, bentseenissä tai ksyleenissä. Tolueeni on edullisin liuotin. Noin 1 - n. 24 tunnin kuluttua ja tavallisesti n. kolmen tunnin kuluttua kaikki ei-estetyt hydroksyyliryhmät on aktivoitu. Reaktio-35 seosta käsitellään tarkalleen yhdellä ekvivalentilla ase- » · I, 107536 tyylikloridia jokaista aktivoitua hydroksyyliryhmää kohti. Tavallisesti kuuden hiilen sokeria varten vaaditaan kolmen ekvivalentin lisäys asetyylikloridia, jossa yksi hydrok-syyliryhmä on jo metyloitu. Reaktio on täydellinen n. 1 -5 n. 24 tunnin kuluttua. Yleensä reaktioseosta sekoitetaan n. 16 tuntia (yön yli). Reaktioseoksen väkevöinti, mitä seuraa puhdistus käyttäen standardikromatografiamenetel-miä, antaa halutun triasetyloidun pyranosidijohdannaisen.

Fluorin lisääminen mainittuun pyranosidijohdannai-10 seen toteutetaan, kuten seuraavassa on kuvattu. Pyranosidi liuotetaan reaktioinerttiin liuottimeen, kuten kloroformiin, metyleenikloridiin tai etyleenidikloridiin. Erityisen edullinen on metyleenikloridi. Reaktioseos jäähdytetään n. -78 - n. 0 °C:seen. Erityisen edullinen lämpötila 15 on -40 eC. Reaktioseosta käsitellään 4-DMAP:llä, mitä seuraa dimetyyliaminorikkitrifluoridi (DAST). Alaan perehtynyt ymmärtää, että n. yksi ekvivalentti kutakin 4-DMAP:tä ja DAST:tä olisi tavallisesti riittävä määrä reaktion lop-puunviemiseksi. Riippuen kuitenkin kyseisistä reaktio-olo-20 suhteista tai substraatin luonteesta voi olla tarpeen lisätä lisäekvivalentteja jompaakumpaa tai molempia näistä reagensseista. Reaktioseosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa n. 1-24 tuntia. Tavallisesti reaktioseosta sekoitetaan yön yli huoneenlämpötilassa. Reaktioseos tukahdute-’ 25 taan protonilähteellä, kuten (C^-C* )alkanolilla metanolin ollessa edullinen ja tuote eristetään tavalla, joka on tunnettu alaan perehtyneelle. SN2-korvausreaktio muuttaa glukopyranosidilähtöaineen galaktopyranosidiksi ja galak-topyranosidilähtöaineen glukopyranosidiksi. Näin saatu 30 alkyylipyranosidi voidaan halogenoida suoraan 1-asemassa, tai paremman jättävän ryhmän aikaansaamiseksi metoksiryhmä voidaan muuttaa asetoksiryhmäksi ennen bromausta, kuten valmistusmenetelmäosassa on kuvattu metyyli-2,3,6-tri-0-asetyyli-4-deoksi-4-fluori-a-D-galaktopyranosidille.

► · 18 107536

Kaavojen (VIII) ja (IX) yhdisteiden prekursoreiden valmistamiseksi, joissa R4 on -COOH tai -COOH:n johdannainen, kuten -C02R8, -CONH2, -CONHR8 tai -CONR28, vastaava kaavan (X) tai (XI) uronihappo 5

OH

HO^X/COOH Η00(^/°γ^0Η ίο H0 ° Hd”™ X Xl muutetaan edellä kuvatuiksi johdannaisiksi käyttäen mene-15 telmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle. Esimerkiksi yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R4 on -C02R8, kaavojen (X) tai (XI) yhdiste saatetaan reagoimaan orgaanisen kemian standardiesteröintimenetelmillä sopivan R8-0H johdannaisen kanssa. Yhdisteiden valmistamiseksi, 20 joissa R8 on -C0NH2, -CONHR8 tai -CONR28, kaavojen (X) tai (XI) yhdiste saatetaan reagoimaan orgaanisen kemian stan-dardiamidoimisolosuhteissa sopivan amiinin kanssa. Näin valmistetut sokerijohdannaiset voidaan fluorata käyttäen edellä kuvattuja menetelmiä ja liittää kaavojen (IV) ja * 25 (V) makrolideihin, kuten tässä seuraaavassa on kuvattu.

Yhdisteen saamiseksi, jossa R4 on -COOH, tarkoituksenmukainen yhdiste, jossa R4 on -C02R8, voidaan selektiivisesti de-esteröidä glykosyloinnin jälkeen käyttäen de-este-röintimenetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan pereh-30 tyneelle.

.. Kun tämän keksinnön kaavan (I) yhdisteet ovat hap pamia, kuten kun R4 on -C02H, keksintö käsittää myös mainittujen kaavan (I) yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyt- » tävät suolat.

> · « 19 107536

Tavallisia farmaseuttisesti hyväksyttäviä kationi-suoloja tällaista käyttöä varten ovat alkalimetallisuolat (esim. natrium ja kalium), maa-alkalimetallisuolat (esim. magnesium ja kalsium), alumiinisuolat, ammoniumsuolat ja 5 suolat orgaanisten amiinien, kuten bentsatiinin (Ν,Ν'-di-bentsyylietyleenidiamiinin), koliinin, dietanoliamiinin, etyleenidiamiinin, meglumiinin (N-metyyliglukamiinin), benetamiinin (N-bentsyylifenetyyliamiinin), dietyyliamii-nin, piperatsiinin, trometamiinin (2-amino-2-hydroksime-10 tyyli-1,3-propaanidiolin) ja prokaiinin kanssa. Erityisen edullinen suola on natriumsuola.

Tämän keksinnön farmaseuttisesti hyväksyttävät ka-tionisuolat valmistetaan edullisesti saattamalla happomuo-dot reagoimaan tarkoituksenmukaisen emäksen tavallisesti 15 yhden ekvivalentin kanssa lisäliuottimessa. Tyypillisiä emäksiä ovat natriumhydroksidi, natriummetoksidi, magne-siumhydroksidi, kalsiumhydroksidi, bentsatiini, koliini, dietanoliamiini, piperatsiini ja trometamiini. Suola eristetään väkevöimällä kuiviin tai lisäämällä ei-liuotinta. 20 Monissa tapauksissa suolat valmistetaan edullisesti sekoittamalla happoliuos liuoksen kanssa, jossa on eri ka-tionisuoloja (natrium- tai kaliumetyyliheksanoaatti, -mag-nesiumoleaatti), käyttäen liuotinta (esim. etyyliasetaattia), josta haluttu kationisuola saostuu tai voidaan muul-* 25 la tavalla eristää väkevöimällä ja/tai lisäämällä ei-liuo-tinta.

Ottaen huomioon tämän keksinnön kaavan (I) makro-lidit, on ymmärrettävä, että stereoisomeeriset muodot, kuten optiset ja geometriset isomeerit, johtuen niiden 30 asymmetrisestä hiiliatomista tai hiiliatomeista ja kak-... soissidoksesta tai kaksoissidoksista, kuuluvat tämän kek sinnön piiriin.

Täten valmistetut kaavan (I) yhdisteet ovat hyödyllisiä hylkimisreaktion hoitamiseksi elinsiirroissa ja au-35 toimmuunisairauksien, kuten nivelreuman tai psoriasiksen, > · 20 107536 hoitamiseksi. Hylkimisreaktion hoitamiseksi elinsiirrossa kaavan (I) yhdistettä voidaan käyttää joko ennaltaehkäisevästi tai haitallista reaktiota vastaan, joka aiheutuu elin- tai kudossiirrosta ihmisessä. Käytettynä ennaltaeh-5 käisevästi kaavan (I) yhdistettä annetaan potilaalle tai kudos- tai elinsiirteeseen ennen elinsiirtoa. Ennaltaehkäisevä hoito voi myös käsittää lääkityksen antamisen elinsiirron jälkeen, mutta ennen kuin on havaittu mitään siirrosta aiheutuvia haitallisia reaktioita. Annettaessa 10 haitallista reaktiota vastaan kaavan (I) yhdistettä annetaan suoraan potilaalle mainitun hylkimisreaktion elinsiirrossa hoitamiseksi, kun ulkoisia merkkejä vastustuskyvystä on havaittu.

Käytettäessä hylkimisreaktion elinsiirrossa hoita-15 miseksi ja autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman tai psoriasiksen hoidossa nisäkkäässä, mukaan lukien ihminen, kaavan (I) yhdiste formuloidaan sopivaksi farmaseuttiseksi koostumukseksi, joka sisältää sairautta hoitavan vaikuttavan määrän. Riippuen annettavan kaavan (I) kyseisen yhdis-20 teen tehokkuudesta n. 0,05 - n. 30 mg/kg elopainoa/päivä annetaan yhtenä tai monena päivittäisenä annoksena hoidettavalle nisäkkäälle. Edullisempi alue on 0,05 - n. 20 mg/ kg elopainoa/päivä, vaikka tietyissä tapauksissa vastuussa olevan lääkärin harkintakyvyn mukaan voidaan tarvita an-25 noksia laajemmalta alueelta. Edullinen antoreitti on tavallisesti oraalinen, mutta ruoansulatuskanavan ulkopuolinen antomuoto (esim. laskimonsisäinen, lihaksensisäinen, ihonalainen tai selkäytimensisäinen) on edullinen tietyissä tapauksissa, kuten silloin kun oraalinen antomuoto on 30 sopimaton kyseiselle kohteelle tai tapauksessa, jossa po-J#; tilas ei kykene erinäisistä syistä sulattamaan lääkettä.

Paikallista antomuotoa voidaan myös käyttää, kun potilas kärsii ihotaudista, kuten psoriasiksesta, tai kudoksen tai elimen pinnalle, kun lääke soveltuu tähän parhaiten, kuten 35 vastaava lääkäri on määrittänyt.

• 21 107536 Näin valmistetut kaavan (I) yhdisteet ovat hyödyllisiä myös sienten aiheuttamien tulehdusten hoidossa. Käyttöä varten mainittujen sienitulehdusten hoitamiseksi nisäkkäässä, mukaan lukien ihminen, kaavan (I) yhdiste 5 formuloidaan farmaseuttiseksi koostumukseksi, joka sisältää sairauden hoitamiseksi vaikuttavan määrän. Riippuen kyseisen kaavan (I) yhdisteen tehokkuudesta, annetaan n. 0,05 - n. 30 mg/kg elopainoa/päivä yksittäisenä tai monina päivittäisinä annoksina hoidettavalle nisäkkäälle. Edulli-10 sempi alue on 0,05 - n. 20 mg/kg elopainoa/päivä, vaikka tietyissä tapauksissa vastaavan lääkärin harkinnan mukaisesti annoksia tämän alueen ulkopuolelta voidaan tarvita. Edullinen antoreitti on tavallisesti oraalinen, mutta ruoansulatuskanavan ulkopuolinen antomuoto (esim. laski-15 monsisäinen, lihaksensisäinen, ihonalainen tai selkäyti-mensisäinen) on edullinen erityisissä tapauksissa, kuten tapauksessa, jossa oraalinen antomuoto ei ole tarkoituksenmukainen kyseiselle kohteelle tai jos potilas ei kykene erinäisistä syistä nauttimaan lääkettä. Paikallista anto-20 muotoa voidaan myös käyttää, mikäli lääke soveltuu parhaiten levitettäväksi kudoksen tai elimen pinnalle, kuten vastaava lääkäri on määrittänyt.

Yhdisteitä annetaan yleensä farmaseuttisen koostumuksen muodossa, joka sisältää vähintään yhtä kaavan (I) ..•25 yhdistettä yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän apuaineen tai laimentimen kanssa. Tällaiset koostumukset formuloidaan tavallisesti tavalliseen tapaan käyttäen kiinteitä tai nestemäisiä apuaineita tai laimentimia tarkoituksenmukaisesti kyseistä antomuotoa varten: oraalista 30 antomuotoa varten tablettien, kovien tai pehmeiden gela-tiinikapseleiden, suspensioiden, rakeiden, jauheiden ja vastaavien muodossa; ruoansulatuskanavan ulkopuolista antomuotoa varten injektoitavien liuosten tai suspensioiden ja vastaavien muodossa; ja paikallista antomuotoa varten 35 liuosten, salvojen, voiteiden ja vastaavien muodossa.

22 107536 Tämän keksinnön yhdisteiden käyttö lääkeaineina hylkimisreaktion elinsiirrossa, sienitulehdussairauksien ja autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman tai psoriasiksen, hoidossa osoitetaan mainittujen yhdisteiden aktii-5 visuudella seuraavassa kuvatuissa biologisissa pikakokeis-sa. Mainittu biologinen pikakoe mahdollistaa myös vertailun kaavan (I) yhdisteiden aktiivisuuksien ja tunnettujen yhdisteiden aktiivisuuksien välillä. Näiden vertailujen tulokset ovat hyödyllisiä määritettäessä annostasoja ni-10 säkkäille, mukaan lukien ihminen, hylkimisreaktion elinsiirrossa ja autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman ja psoriasiksen, hoidossa.

Ihmisen seka-imusolureaktiota (mixed lymphocyte reaction) (MLR) käytetään ei-spesifisen immuunireaktion 15 selville saamiseksi, joka määritetään 3H-tymidiinin talteenotosta. Tässä pikakokeessa käytetään veren yksitumaisia soluja modifioidussa kaksitie MLR:ssä (two-Way MLR). HLA tyyppi D antigeenien erilaisuuden ja täten maksimisti-muloinnin varmistamiseksi ryhmää jäädytettyjä luovuttaja-20 soluja käytetään ärsykepopulaationa; vasta eristettyjä soluja käytetään vastepopulaationa.

Vastaotetut yksitumaiset solut suspendoidaan RPMI-1640:een, joka on rikastettu: 0,5-%:isella MEM ei-välttä-mättömien aminohappojen (lOOx) liuoksella, l-%:isella ,,.. 25 L-glutamiinilla (200 mM) , l-%: silla MEM-vitamiineilla (lOOx), l-%:isella penisilliini-streptomysiiniliuoksella (10 000 yksikköä/ml) ja 15-%:isella kuuma-inaktivoidulla ihmisen AB-seerumilla (NABI). Solut lasketaan ja pitoisuus säädetään 5 x 105 soluun/ml. Liuos siirretään sitten pyö-30 reäpohjaisille 96 kuopan levyille määrinä 100 μΐ/kuoppa. .. Nämä levyt sisältävät nyt vastesoluja.

Ärsykesolut valmistetaan yhdistämällä yksitumaiset solut, jotka on kerätty monilta eri henkilöiltä. Solut suspendoidaan 90-%:iseen ihmisen AB-seerumiin ja 35 10-%:iseen DMS0:hon, niin että solumäärä on 2 x 107 solua/ 23 107536 ml. Soluja säilytetään nestemäisessä typessä. MLR:ää varten elinkelpoiset solut laimennetaan 5 x 10s soluun/ml ja 100 μΐ/kuoppa lisätään levyihin, jotka sisältävät vasteso-luja. Jokaiseen kuoppaan, joka sisältää vastesolujen ja 5 ärsykesolujen seosta, lisätään 50 μΐ yhdisteliuosta. Trip-likaattikuoppia käytetään jokaiselle annokselle. Levyjä inkuboidaan 37 °C:ssa 5-%:isessa C02-ilmakehässä ja kostutetaan viitenä päivänä. Jokaiseen kuoppaan lisätään 1 μΟ± 3H-tymidiiniä ja inkubointia jatketaan 18 lisätuntia. Solut 10 kerätään käyttäen LKB Beta -levyjärjestelmää.

Ärsykekontrollin prosentuaalinen inhibitio saadaan käyttäen seuraavaa yhtälöä: (keskim. cpm lääkettä) 15 % inhibitio = [100 - - x 100] keskim. cpm ärsykekontrollia

Lyhenne cpm on määritetty lukema/min. RPMI-1640 on kudos-viljelyväliaine, jota saadaan Sigmasta.

20 Aktiivisuus edellä kuvatussa MLR pikakokeessa kuvaa aktiivisen yhdisteen käyttökelpoisuutta hylkimisreaktion ja autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman ja psoriasiksen hoidossa.

Makrolidien antimikrobiset aktiivisuudet eri sieniä 25 vastaan määritetään agar sarjalaimennusmenetelmällä Sa-bouraud agarissa. Minimi-inhibitiopitoisuudet (MIC) saadaan 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 30 °C:ssa.

Tätä keksintöä kuvaavat seuraavat esimerkit. Kuitenkin tulisi ymmärtää, että keksintö ei rajoitu näiden 30 esimerkkien spesifisiin yksityiskohtiin. Kaikki reaktiot toteutetaan inertissä ilmakehässä, kuten argonin ilmake-*·. hässä, jollei toisin mainita. Lyhennykset THF, DMSO, DAST, DMAP ja Ac, missä käytetään, viittaavat tetrahydrofuraaniin, dimetyylisulfoksidiin, dimetyyliaminorikkitrifluori-35 diin, 4-dimetyyliaminopyridiiniin ja asetyyliin, vastaavasti. Käytettiin vedettömiä liuottimia, joista vedetön 24 107536 määritetään niin, että se on pääosin vapaa vedestä. Soke-rihalogenidit hankittiin luotettavalta myyjältä, kuten Sigmalta tai Aldrichilta, kuten myös sokerit, mikäli muuta ei ole spesifisesti ilmoitettu.

5 Ilmaisu "reaktioinertti liuotin" edellä käytettynä viittaa mihin tahansa liuottimeen, joka ei reagoi lähtöaineiden, reagenssien, välituotteiden tai tuotteiden kanssa siten, että halutun tuotteen saanto heikkenee.

Valmistusmenetelmissä 1 ja 2 esiintyviä termejä tai 10 lyhenteitä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavassa.

PYEA-agar valmistetaan liuottamalla Difco-maltoosia (10 g) , Difco-hiivauutetta (4 g) , dekstroosia (4 g) , Difco-agaria (15 g) ja tuoretta kookosmaitoa (50 ml) tarpeeksi deionisoituun veteen antamaan 1 1 liuosta; ja 15 liuoksen pH säädetään arvoon 7,3 IN NaOH:lla.

ATCC 172 -elatusneste valmistetaan liuottamalla glukoosia (10 g) , liukoista tärkkelystä (20 g) , hiivauu-tetta (5 g) , NZ-amiinia A (Difco, 5 g) ja kalsiumkarbo-naattia (1 g) tarpeeksi deionisoituun veteen antamaan 1 1 20 liuosta; ja liuoksen pH säädetään arvoon 7,0 1 N KOHrlla.

JDYTT-väliaine valmistetaan liuottamalla sereloosia (10 g) , maissitärkkelystä (5 g) , maissin liotusnestettä (5 g), NZ-amiini YTTrtä (5 g), kobolttikloridia (0,002 g) ja kalsiumkarbonaattia (3 g) tarpeeksi deionisoituun ve-.. 25 teen yhden litran liuokseksi; ja liuoksen pH säädetään arvoon 7,2 IN NaOH:lla.

NZ-amiini A ja NA-amiini YTT ovat saatavissa Difcosta, kuten useimmat edellä olevista aineosista.

Edeltävässä MLR-kokeessa RPMI-1640 on standardi 30 elatusneste MLR-tutkimuksissa; MEM on määritetty "minimi .. elatusneste" (minimum essential media) ja NABI on toimit taja.

107536 25

Esimerkki 1 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2'-(4' '-(2,,,,3'",-6' '1 -tri-O-asetyyli-4 ’ ' 1-deoksi-4' '' -fluori-a-D-galaktopy-ranosyylioksi) -3' '-metoksisykloheksyyli)-1'-metyylivinyy-5 li]-23,25-dimetoksi-13,19,21,27-tetrametyyli-ll,28-dioksa- 4-atsatrisyklo [22.3.1.04'9] oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetra-oni

Sekoituksenalaiseen lietteeseen, jossa oli FK520:tä (7,1 g, 8,9 mmol), valmistusmenetelmän 4 otsikkoyhdistettä 10 (3,3 g, 8,9 mmol) ja 4 A:n molekyyliseuloja (murskattuja, 3,3 g) metyleenikloridissa (90 ml) -78 °C:ssa, lisättiin hopeakarbonaattia (4,9 g, 17,8 mmol), mitä seurasi hopea-triflaatti (0,46 g, 1,8 mmol). Reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan 10 tunnin aikana ja sitten sitä 15 sekoitettiin kahdeksan lisätuntia. Saatu nahanruskea liete suodatettiin piimään läpi ja suodos haihdutettiin tyhjössä. Jäännös puhdistettiin silikageelillä eluoiden etyyli-asetaatti/heksaanilla (1/1) antamaan tuote yksittäisenä anomeerinä (2,94 g, 30 %). FAB Ms (M+ + Na+) 1104.

20 Esimerkit 2-4 Käyttäen pääosin samaa esimerkissä 1 kuvattua menetelmää mutta korvaamalla valmistusmenetelmän 4 otsikkoyh- diste yhdellä mooliekvivalentilla tarkoituksenmukaista sokerihalidia valmistettiin seuraavat yhdisteet.

...25 2. 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2,-[2,-(4,,- (2'’’,3*'*,4’11-tri-0-asetyyli-6'''-deoksi-6'''-£luori-a-D-galaktopyranosyylioksi) -3' ’ -metoksisykloheksyyli) -1 ’ -me-tyylivinyyli]-23,25-dimetoksi-13,19,21,27-tetrametyyli-11,28-dioksa-4-atsatrisyklo[ 22.3.1.04'9] oktakos-18-eeni-30 2,3,10,16-tetraoni

Massaspektri (FAB): 1104 (molekyyli-ioni + Na+).

26 107536 3. 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2'-(4''-(2'' ' ,-4' ' ' ,6'' * -tri-O-asetyyli-3 ' ' ' -deoksi-3 ' ' ' -fluori-a-D-ga-laktopyranosyylioksi) -3' '-metoksisykloheksyyli)-1'-metyy-livinyyli] -23,25-dimetoksi-13,19,21,27-tetrametyyli-ll, 28- 5 dioksa-4-atsatrisyklo[22.3.1.04'9]oktakos-18-eeni-2,3,10,16- tetraoni

Massaspektrl (FAB): 1104 (molekyyli-ioni + Na+).

4. 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2’-(41’-(3'’ 5 * *'-di-0-bentsoyyli-2'’’-deoksi-2f f’-fluori-a-D-arabino-10 furanosyylioksi) -3' ' -metoksisykloheksyyli) -1' -metyylivi- nyyli]-23,25-dimetoksi-13,19,21,27-tetrametyyli-ll,28-di-oksa-4-at satrisyklo [22.3.1.04'9] oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni

Massaspektri (FAB): 1156 (molekyyli-ioni + Na*).

15 Esimerkki 5 17-etyyli-l, 14-dihydroksi-12-[2*-(4’ '-(4" '-deoksi-4' ' '-f luori-galaktopyranosyylioksi)-3 * '-metoksisykloheksyyli)-! ' -metyylivinyyli] -23,25-dimetoksi-13,19,21,27-tetrametyyli-ll, 28-dioksa-4-atsatrisyklo [22.3.1.04·9] oktakos-20 18-eeni-2,3,10,16-tetraoni

Esimerkin 1 otsikkoyhdistettä (1,1 g) liuotettiin metanoliin (10 ml) ja käsiteltiin natriummetoksidilla (10 mg). Reaktioseosta sekoitettiin 48 tuntia 0 °C:ssa ja käsiteltiin sitten yhdellä tipalla etikkahappoa kertakäyt-../25 töpipetistä. Liuotin poistettiin tyhjössä ja jäännös puhdistettiin silikageelillä eluoiden metyleenikloridi/meta-nolilla (15/1) antamaan tämän esimerkin otsikkoyhdiste.

Esimerkit 6 ja 7 Käyttäen pääosin samaa esimerkissä 5 kuvattua mene-30 telmää mutta korvaamalla esimerkin 1 otsikkoyhdiste tar- ... koituksenmukaisella esimerkin 2 tai esimerkin 3 yhdisteel lä valmistettiin seuraavat yhdisteet.

27 107536 6. 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2,-(4’’-(6'’'-de-oksi-6'1'-fluori-a-D-galaktopyranosyylioksi)-3''-metoksi-sykloheksyyli)-1'-metyylivinyyli]-23,25-dimetoksi-13,19, - 21.27- tetrametyyli-11, 28-dioksa-4-atsatrisyklo [22.3.1.04,9] - 5 oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni 7. 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2,-(4'*-(3’''-de-oksi-3'’'-fluori-a-D-galaktopyranosyylioksi)-3’'-metoksi-sykloheksyyli)-1'-metyylivinyyli]-23,25-dimetoksi-13,19,- 21.27- tetrametyyli-11,28-dioksa-4-at satrisyklo [22.3.1.04,9] - 10 oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni

Esimerkki 8 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2’-(41'-(3''',4''»,-6' ’ '-tri-0-asetyyli-2'' ’-deoksi-2'1 1-f luori-a-D-galaktopy-ranosyylioksi)-3 *r-metoksisykloheksyyli)-1'-metyylivinyy-15 li]-23,25-dimetoksi-13,19,21,27-tetrametyyli-11,28-dioksa- 4-atsatrisyklo [22.3.1.04,9] oktakos-18 -eeni-2,3,10,16-tetraoni Käyttäen pääosin esimerkissä 1 kuvattua menetelmää mutta korvaamalla valmistusmenetelmän 4 otsikkoyhdiste 20 valmistusmenetelmän 11 otsikkoyhdisteellä valmistettiin esimerkin otsikkoyhdiste.

Masaspektri (LSIMS; FAB)-M'tHa = 1104,5, emäs = 291,1. Valmistusmenetelmä 1 17-etyyli-l, 14-dihydroksi-12-[2'-(41'-hydroksi-3''-... 25 metoksisykloheksyyli)-1'-metyylivinyyli] -23,25-dimetoksi- 13.19.21.27- tetrametyyli-11,28-dioksa-4-atsatrisyklo[22.- 3.1.04,9] oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni

Streptomyces hygroscopicukseb alalaji ascomyceticus viljelmä ATCC 14891 toteutettiin PYEA-agarlevyillä (10 g/1 30 Difco-maltoosia, 4 g/1 Difco-hiivauutetta, 4 g/1 dekstroo-·· siä, 15 g/1 Difco-agaria ja 50 ml tuoretta kookosmaitoa, joka laimennettiin 1 l:ksi deionisoidulla vedellä, sitten pH säädettiin arvoon 7,3 IN NaOH:lla). Valmistetta inku-boitiin 10 - 12 päivää 28 °C:ssa ja itiöt siirrettiin ste-35 riileihin 1x6 putkiin, jotka sisälsivät 10 ml ATCC 172 28 107536

-elatusnestettä (10 g/1 glukoosia, 20 g/1 liukoista tärkkelystä, 5 g/1 hiivauutetta, 5 g/1 NZ-amiinia A ja 1 g/1 kalsiumkarbonaattia. pH säädettiin arvoon 7,01 1 N

KOH:lla). Putkia inkuboitiin 28 °C:ssa ja ravisteltiin 5 rotaravistimessa n. 150 - 200 sykliä/minuutti. 4-5 päivän kuluttua liuos laimennettiin 40-%:iseksi glyserolilla ja ATCC 172 -elatusnesteellä ja siirrettiin sitten aseptisesti kryoputkiin. Jokainen putki panostettiin 1/2 ml:11a liuosta. Putket jäädytettiin -80 °C:seen varastoinnin 10 ajaksi.

Näitä hyvin kylmiä putkia varastosta käytettiin siemenymppäykseen ymppäyspulloja varten, yksi putki/50 ml JDYTT-elatusnestettä 300 ml:n pullossa. JDYTT-elatusneste-koostumus sisälsi 10 g/1 sereloosia, 5 g/1 NZ-amiini YTT, 15 0,002 g/1 kobolttikloridia ja 3 g/1 kalsiumkarbonaattia.

JDYTT-elatusnesteliuoksen pH säädettiin arvoon 7,2 IN NaOH:lla. Pulloja ravisteltiin ja inkuboitiin rotaravistimessa n. 150 - 200 sykliä/minuutti 28 °C:ssa.

2 ml 3 - 5 päivää sekoitetusta ymppäyspullosta käy-20 tettiin ymppäykseen toista ymppäyspulloa varten, jossa oli 80 ml JDYTT-elatusnestettä 3 l:n fermentaatioastiassa. Fermentaatio-elatusneste sisälsi 45 g/1 maissitärkkelystä, 10 g/1 maissin liotusnestettä, 10 g/1 meripihkaa tai

Baker-kuivahiivaa, 3 g/1 kalsiumkarbonaattia ja 0,005 g/1 ..'25 kobolttikloridia. pH säädettiin n. 6,4 - 6,8:aan 1 N

NaOHilla. 1 ml vaahdonestoainetta P-2000 lisättiin fermen-taatioastiaan yhdessä 100 ml:n kanssa soijapapuöljyä. pH säädettiin arvoon 6,4 - 6,8 1 N NaOH:lla ja ainetta sekoitettiin 1 700 kierrosta minuutissa. Lämpötila pidettiin 30 28 °C:ssa ja steriilin ilman annettiin kuplia elatusnes- *·, teeseen nopeudella yksi tilavuus/tilavuus/minuutti.

Ymppäyksen jälkeen steriiliä soijapapuöljyä käytettiin vaahtoamisen kontrolloimiseksi. Pitemmissä fermentaa-tioissa ja riippuen käytetystä elatusnesteestä sokeripi-35 toisuutta voidaan seurata ja lisätä sokeria 40, 60 ja 29 107536 90 tunnin kuluttua alenevan sokeritason ylläpitämiseksi 0,05 %:n yläpuolella. Fermentaatio kesti 46 tuntia.

Käyttäen standardiohutkerroskromatografia- ja HPLC-menetelmiä fermentaatioliuos tutkittiin ja laskettiin suh-5 teellinen tehokkuus.

Tuotetta havaittiin pääosin rihmastossa, mutta koko liuoksen työstö on edullista. Täydellisen fermentaation jälkeen koko liuos uutettiin kahdesti kolmasosalla - puolella liuoksen tilavuudesta metyyli-isobutyyliketonia 10 (MIBK). Kerrokset erotettiin DeLaval-erottimella tai Podbielnack-uuttolaitteessa. Liuotinkerros kirkastettiin ja väkevöitiin ensin tyhjössä ja sitten rotavaporissa. Konsentraatti altistettiin neljän putken vastavirtajakaan-tumiselle 20 litran pulloissa käyttäen heptaani/asetonit-15 rilli-järjestelmää (10:1) 10 litran pintakerroksena ja yhden litran pohjakerroksena/pullo. Aktiiviset pohjakerrokset kerättiin, yhdistettiin ja väkevöitiin. Ainetta puhdistettiin edelleen suodattamalla Florisiilin läpi (pestiin heksaanilla, heksaani/metyleenikloridilla ja me-20 tyleenikloridilla peräkkäisesti nostaen asteittain mety- leenikloridin määrää). Suurin osa aktiivisuudesta havaittiin metyleenikloridijakeissa. Nämä yhdistettiin ja väkevöitiin. Toinen suodatusvaihe toteutettiin, tällä kertaaa silikageelin läpi (pesten heptaanilla, metyleenikloridil-...25 la, metyleenikloridi/etyyliasetaatilla ja etyyliasetaatil la). Aktiivisuus oli pääosin jakeissa, jotka sisälsivät metyleenikloridi/etyyliasetaattiseosta ja jakeissa, jotka sisälsivät pelkästään etyyliasetaattia. Nämä yhdistettiin ja väkevöitiin, liuotettiin uudestaan metyleenikloridiin 30 ja käsiteltiin DARCO G60:llä. Näyte jaettiin sitten 12 - .. 15 g:n annoksiksi ja kukin näyte kromatografoitiin edel leen Prep 500 -nestekromatografisesti käyttäen silikagee-lipylväitä ja eluoiden käyttäen lineaarista pitoisuusgra-dienttia aloittaen 100-%:isesta metyleenikloridista ja 35 päätyen 100-%:iseen etyyliasetaattiin. Aktiiviset jakeet 30 107536 yhdistettiin, väkevöitiin ja kromatografoitiin Prep 500:ssa käyttäen käänteisfaasi(18C)silikageeliä ja eluoiden lineaarisella pitoisuusgradientilla aloittaen asetonilla ja päätyen 100 %:iin vettä. Puhdas tuote saatiin viimeise-5 nä aineosana, joka eristettiin pylväästä.

Aktiiviset jakeet edeltävässä fermentaatiomenetel-mässä määritettiin käyttäen seuraavaa biologista koetta.

12,5 mm:n kiekko pantiin suoraan agarin pinnalle. Candida albicans ATCC 14053:n, Saccharomyces pastorianus 10 FD3737:n ja Byssochlamys fuivan FM 10,300( S) ja FM

10,464(R) herkkää kantaa käytettiin. Candida- ja Saccharo-myces-levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa 18 tuntia, sitten levyjen aktiivisuus tutkittiin. Byssochlamys-levyjä inkuboitiin 28 °C:ssa ja tutkittiin 18 tunnin kuluttua. Levyt, 15 jotka sisälsivät ainoastaan FK506:ta ja FK520:tä (CP- 105051), olivat aktiivisia Byssochlamys-kantaa vastaan. Epäpuhtaat jakeet (jotka sisälsivät nigerisiiniä) olivat aktiivisia myös muita kantoja vastaan.

HPLC-menetelmää käytettiin myös jakeiden puhtauden 20 määrittämiseksi. Kyseisessä menetelmässä käytettiin Dupont Zorbax CN -pylvästä (4,6 mm x 25 cm) ja isokraattista liuotinjärjestelmää, jossa oli 55/45 vesi/asetonitriiliä ja virtausnopeus oli 1 ml/min. Havainnot tehtiin 214 nm:ssä. Liuosnäyte (20 ml) sekoitettiin MIBKrn kanssa ..25 (20 ml) ja ravisteltiin n. 4 - 5 minuuttia. Kerrokset ero tettiin ja liuotin väkevöitiin lähes kuiviin. Jäännös otettiin talteen 1 ml:aan puhdasta asetonitriiliä ja 5 pl:n näyte injektoitiin HPLC:hen. FK520:n retentioaika oli n. 12,7 minuuttia näissä olosuhteissa.

30 Valmistusmenetelmä 2 17-allyyli-l,14-dihydroksi-12-[2'-(4»'-hydroksi-3' 1 -metoksisykloheksyyli) -1' -metyylivinyyli] -23,25-dime-toksi-13,19,21,27-tetrametyyli-ll,28-dioksa-4-atsatrisyk-lo [22.3.1.04-9] oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni 35 Streptomycestsukubaensis nro 9993 FERM BP-927 aikaansaatiin PYEA-agarlevyillä (10 g/1 Difco-maltoosia, 31 107536 4 g/1 Di fco-hi ivauutetta, 4 g/1 dekstroosia, 15 g/1 Difco-agaria ja 50 ml tuoretta kookosmaitoa, joka laimennettiin 1 l:ksi deionisoidulla vedellä, sitten pH säädettiin arvoon 7,3 1 N NaOH:lla). Valmistetta inkuboitiin 10 - 12 5 päivää 28 eC:ssa ja itiöt siirrettiin steriileihin 1x6 putkiin, jotka sisälsivät 10 ml ATCC 172 -elatusnestettä (10 g/1 glukoosia, 20 g/1 liukoista tärkkelystä, 5 g/1 hiivauutetta, 5 g/1 NZ-amiinia A ja 1 g/1 kalsiumkarbo-naattia. pH säädettiin arvoon 7,01 1 N K0H:lla). Putkia 10 inkuboitiin 28 °C:ssa ja ravisteltiin rotaravistimessa n. 150 - 200 sykliä/minuutti. 4-5 päivän kuluttua liuos laimennettiin 40-%:iseksi glyserolilla ja ATCC 172 -ela-tusnesteellä ja siirrettiin sitten aseptisesti kryoput-kiin. Jokainen putki panostettiin 1/2 ml:11a liuosta. Put-15 ket jäädytettiin -80 °C:seen varastoinnin ajaksi.

Näitä hyvin kylmiä putkia varastosta käytettiin siemenymppäykseen ymppäyspulloja varten, yksi putki/50 ml steriiliä JDYTT-elatusnestettä 300 ml:n pullossa. JDYTT-elatusnestekoostumus sisälsi 10 g/1 sereloosia, 5 g/1 NZ-20 amiini YTT, 0,002 g/1 kobolttikloridia ja 3 g/1 kalsium-karbonaattia. JDYTT-elatusnesteliuoksen pH säädettiin arvoon 7,2 IN NaOH:lla. Pulloja ravisteltiin ja inkuboitiin rotaravistimessa n. 150 - 200 sykliä/min 28 °C:ssa.

2 ml 3 - 5 päivää sekoitetusta ymppäyspullosta käy-.,25 tettiin ymppäykseen toista ymppäyspulloa varten, jossa oli 80 ml JDYTT-elatusnestettä 3 l:n fermentaatioastiassa. Fermentaatioelatusneste sisälsi 45 g/1 maissitärkkelystä, 10 g/1 maissin liotusnestettä, 10 g/1 meripihkaa tai

Baker-kuivahiivaa, 3 g/1 kalsiumkarbonaattia ja 0,005 g/1 30 kobolttikloridia. pH säädettiin n. 6,4 - 6,8:aan 1 N

NaOHrlla. 1 ml vaahdonestoainetta P-2000 lisättiin fermen- < taatioastiaan yhdessä 100 ml:n kanssa soijapapuöljyä. pH säädettiin arvoon 6,4 - 6,8 1 N NaOH:lla ja ainetta sekoitettiin 1 700 kierrosta minuutissa. Lämpötila pidettiin 32 107536 28 °C:ssa ja steriilin ilman annettiin kuplia elatusnes-teeseen nopeudella yksi tilavuus/tilavuus/minuutti.

Ymppäyksen jälkeen steriiliä soijapapuöljyä käytettiin vaahtoamisen kontrolloimiseksi. Pitemmissä fermentaa-5 tioissa ja riippuen käytetystä elatusnesteestä sokeripitoisuutta voidaan seurata ja lisätä sokeria 40, 60 ja 90 tunnin kuluttua alenevan sokeritason ylläpitämiseksi 0,05 %:n yläpuolella. Fermentaatio kesti 46 tuntia.

Käyttäen ohutkerroskromatografian ja HPLC:n stan-10 dardimenetelmiä fermentaatioliuosta tutkittiin ja suhteellinen tehokkuus laskettiin.

Fermentaattori pysäytettiin ja uutettiin kahdesti puolella liuoksen tilavuudesta metyyli-isobutyyliketöniä (MIBK). Liuotinkerros erotettiin imulla ja väkevöimällä 15 tyhjössä viskoosiseksi öljyksi. Öljy trituroitiin heksaa-nilla, dietyylieetterillä ja metyleenikloridilla ja aktiiviset jakeet (dietyylieetterijakeet) kromatografoitiin Florisiililla. Florisiili eluoitiin peräkkäisesti dietyylieetterillä, metyleenikloridilla, etyyliasetaatilla ja 20 asetonilla. Eluaatti väkevöitiin ja käsiteltiin aktiivi-hiilellä. Konsentraatti suodatettiin ja liuotettiin etyyliasetaattiin. Heksaania lisättiin tuotteen kiteyttämi-seksi.

Liemen ja myöhempien talteenotettujen virtausten ...25 bioaktiivisuutta seurattiin käyttäen Byssochlamys fulvan -kantaa. Aineosat ja talteenotettujen virtausten aineosat visualisoitiin kromatografisesti Analtech silikageeli GF (tavaramerkki) -levyillä käyttäen puhdasta etyyliasetaattia eluenttina. Kehitetyt levyt suihkutettiin vanilliini-30 reagenssilla (3 g vanilliinia 75 ml:ssa etanolia ja 25 .. ml:ssa 85-%:ista fosforihappoa) ja kuumennettiin 80 °C:n lämpötilaan. Tuote ilmeni lilanvärisinä täplinä.

Valmistusmenetelmä 3

Metyyli-2,3,6-tri-0-asetyyli-a-D-glukopyranosidi 35 Metyyli-a-D-glukopyranosidia (Aldrich, 15,0 g, 77 mmol) tolueenissa (300 ml) käsiteltiin bis(tributyyli- 33 107536 tina)oksidilla (Aldric, 78 ml, 154 mmol) ja saatua seosta palautusjäähdytettiin Dean Stark -lukolla kolme tuntia. Seos jäähdytettiin 0 eC:seen ja sitten asetyylikloridia (17 ml, 231 mmol, 3 ekv.) lisättiin. Seosta sekoitettiin 5 yön yli, väkevöitiin sitten tyhjössä antamaan siirappi. Puhdistaminen silikageelillä [eluoiden etyyliasetaatti/ heksaanilla (3/2)]antoi öljyn (10,4 g, 42 %).

Valmistusmenetelmä 4

Metyyli - 2,3,6 - tr i-O-ase tyyl i - 4 - deoks i - 4 - f luor i-a-10 D-galaktopyranosidi

Valmistusmenetelmän 3 tuotetta (10,4 g, 32 mmol) sekoitettiin 4-dimetyyliaminopyridiinin (8,2 g, 67 mmol) kanssa metyleenikloridissa (100 ml) ja jäähdytettiin -40 °C:seen. Reaktioseosta käsiteltiin tipoittain DAST:llä 15 (8,6 ml, 65 mmol) ja annettiin sitten hitaasti lämmetä huoneenlämpötilaan. Sekoittamisen jälkeen huoneenlämpö-tilassa yön yli (16 tuntia) reaktioseos jäähdytettiin -40 °C:seen ja tukahdutettiin metanolilla (20 ml). Tukahdutettu seos laimennettiin etyyliasetaatilla (800 ml) ja 20 pestiin 1 N HCl:llä (2 x 80 ml), vedellä (1 x 80 ml), kyllästetyllä vesipitoisella natriumbikarbonaatilla (1 x 80 ml) ja suolaliuoksella (1 x 80 ml). Liuotin kuivattiin MgS04:llä ja liuotin poistettiin antamaan öljymäinen jäännös, joka puhdistettiin silikageelillä [eluoiden etyyli-..'25 asetaatti/heksaanilla (2/3)] antamaan 3,7 g (36 %) kiinteää ainetta, sp. 87 - 89 °C.

Valmistusmenetelmä 5 1,2,3,6-tetra-0-asetyyli-4-deoksi-4-fluori-a-D-ga-laktoosi 30 Valmistusmenetelmän otsikkoyhdistettä (100 mg, 0,31 mmol) sekoitettiin etikkahapon (1 ml), etikkahappoanhydri- i din (1 ml) ja rikkihapon (5 tippaa) kanssa ja sekoitettiin 18 tuntia. Reaktioseos laimennettiin etyyliasetaatilla (200 ml) ja pestiin kyllästetyllä vesipitoisella natrium-35 bikarbonaatilla (2 x 20 ml), vedellä (1 x 20 ml) ja suola- 34 107536 liuoksella (1 x 20 ml) ja käsiteltiin sitten MgS04:llä. Liuotin poistettiin tyhjössä antamaan öljymäinen jäännös, joka puhdistettiin silikageelillä [eluointi etyyliasetaat-ti/heksaanilla (2/3)] antamaan 90 mg (82 %) öljyä.

5 Valmistusmenetelmä 6 2.3.6- tri-0-asetyyli-4-deoksi-4-fluori-a-D-galakto-syylibromidi

Valmistusmenetelmän 5 otsikkoyhdistettä (3,4 g, 9,7 mmol) sekoitettiin 4,1 M liuoksen kanssa vetybromidihappoa 10 etikkahapossa (50 ml) ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa viisi tuntia. Seos väkevöitiin tyhjössä antamaan 5 g öljyä, joka puhdistettiin silikageelillä [eluointi etyyli-asetaatti/heksaanilla (2/3)] antamaan 3,3 g (92 %) öljyä. Analyysi laskettu C12H1607BrF: lie: 15 C, 38,83; H, 4,31.

Havaittu: C, 38,85; H, 4,48.

Valmistusmenetelmä 7 2.4.6- tri-0-asetyyli-3-deoksi-3-fluori-a-D-galakto-pyranosyylibromidi 20 Valmistettu kuten Kovac, P.; Yeh, H.J.C. ja

Glaudemans, C.P.J. ovat kuvanneet julkaisussa Carbohydrate Research, 140, 277 (1985).

Valmistusmenetelmä 8 3.5- di-0-bentsoyyli-2-deoksi-2-fluori-a-D-arabino- 25 furanosyylibromidi 1.3.5- tri-0-bentsoyyli-2-deoksi-2-f luori-a-D-ara- binofuranoosia (Pfanstiehl, 1000 mg, 2,2 mmol) liuotet-tiin/suspendoitiin etikkahappoon (10 ml) ja käsiteltiin liuoksella, jossa oli HBr/etikkahappoa (10 ml, 30 %) 30 0 °C:ssa kaksi tuntia. Liuotin poistettiin tyhjössä ja ·· jäännöshappo poistettiin atseotrooppisesti tolueenilla.

Bromidia käytettiin ilman jatkopuhdistusta. ’HNMR (osit tainen): 6 4,6 (3H), 5,18 (m, 1H), 5,34 (d, 1H) ja 6,45 (d, 1H).

35 107536

Valmistusmenetelmä 9 2,3,4-tri-0-asetyyli-6-deoksi-6-fluori-a-D-galakto-syylibromidi A. 1,2,3,4-tetra-asetyyli-6-deoksi-6-fluorigalakto-5 pyranosidi valmistettiin kuten Sharma, M. ja Korytnyk, W.

ovat kuvanneet (Tetrahedron Letters, 1977, 573).

B. 1,2,3,4-tetra-asetyyli-6-deoksi-6-fluori-galak-topyranosidia (100 mg) liuotettiin 30-%:iseen HBr-liuok-seen etikkahapossa (10 ml) ja sekoitettiin huoneeniämpöti- 10 lassa kaksi tuntia. Liuotin poistettiin tyhjössä ja jään-nöshappo poistettiin toistuvalla atseotrooppisella toluee-nitislauksella. Jäännös kromatografoitiin silikageelillä (eluointi etyyliasetaatti:heksaanilla; 30:70) antamaan valkoinen kiinteä aine? sp. 131 - 133 °C. Massaspektri: 15 m/z = 371 (M+), 373.

Valmistusmenetelmä 10 3.4.6- tri-0-asetyyli-2-deoksi-2-f luori-galaktopyra-nosyylifluoridi Tämän valmistusmenetelmän otsikkoyhdiste valmistet-20 tiin kuten Korytnyk, W. et ai. ovat kuvanneet julkaisussa Tetrahedron 38 (16), 2547 (1982).

Valmistusmenetelmä 11 3.4.6- tri-0-asetyyli-2-deoksi-2-f luori-galaktopyra-nosyylibromidi "'25 Tämän valmistusmenetelmän otsikkoyhdiste valmistet tiin pääosin kuten valmistusmenetelmässä 6 on kuvattu, mutta korvaamalla valmistusmenetelmän 5 otsikkoyhdiste valmistusmenetelmän 10 otsikkoyhdisteellä. (Massaspektri -M1 = 370,1).

• ·» 1 1 - · ·

Claims (20)

36 107536

1. T 1° r2(i r3 (Ia) r-Jk, o x"ch3 h3c < T ? V-ch3 h3co och3 jossa n on 1 tai 2;

20 R1 on ryhmä, jolla on kaava II tai III; <R5>rÖ>^ tai kk5 ”25 f (II) (III) R2 on -OH; R3 on (— C3) alkyyli tai allyyli;

30 R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R8, -C02H, -CH2OH, H, -ch3, -ch2f, -chf2, -CF3, -CONH2, -CONHR8, -CON(R8)2, -CH2OCOR\ -CH20C02R8, -CH2OCONR28 tai -CH2OR8; R5 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C^-OJ alkoksi, bentsyylioksi, -OH, -OCOR8, -OCOCH2R8, -0C02R8 tai -OSi(R8)3; 35 t on 1, 2 tai 3; 37 107536 m on O tai 1; ja R8 on (Cx-C6) alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, pyridyy-li, tienyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C^-C^) alkoksiryh-5 millä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C^-CJalkoksiryhmillä; edellyttäen, että kun m on 0, silloin R4 on -CH2F, -CHF2 tai -CF3; ja että kaavoissa (II) ja (III) kukin rengashiili sisältää vähintään yhden vetyatomin, 10 ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmis tamiseksi, tunnettu siitä, että a) yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava Ia, jossa n on 1 tai 2; R1 on ryhmä, jolla on kaava II tai III;

1. Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava Ia 5 Rl°V^ ch3 H3ccr^ί i CH3VVV0

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa n on 2.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa R3 on metyyli, etyyli tai allyyli.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yh- 2. diste, jossa R3 on etyyli ja R2 on -OH.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa R1 on - 25 R* Λ R5 R4 Λ3,, * JJ&. , R5 30 F R4 R5 r4 p. I_Lp /0 R 5^^/^ΖΖ_Χ— tai —V. - j 35 - R5 R5 41 107536 R4 on H, -CH2OH, -CH2F, -CH2OCOCH3 tai -CH2OCH2C6H5; ja R5 on -OH, -OCOCH2C6H5 tai -OCOCH3.

5 -CH2OCOR8, -CH20C02R8, -CH2OCONR28 tai -CH2OR8; ja R5 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (Ci-Cj -alkoksi, bentsyylioksi, -OCOR8, -OCOCH2R8, -0C02R8 tai -OSi(R8)3; reagoimaan katalyyttisen määrän kanssa alkoksidiemästä al-koholiliuottimessa 0 °C:ssa, 10 ja haluttaessa saatu kaavan I mukainen yhdiste ote taan talteen farmaseuttisesti hyväksyttävänä suolana.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yh-5 diste, jossa R1 on F R* R5 10 R5 R4 on H, -CH2OH tai -CH2OCOCH3; ja R5 on -OH tai -OCOCH3.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa R4 on -CH2OH ja R5 on -OH.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yh- 20 diste, jossa R4 on -CH2OCOCH3 ja R5 on -OCOCH3.

9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa R1 on R5 R* 25 > · « Rs 30 R4 on H, -CH2OH tai -CH2OCOCH3; ja R5 on -OH tai -OCOCH3. • ·

10 R5 . R5 F R4 r5' r4 15 tai jLJ^, R5 „5 20

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa R4 on -CH2OCOCH3 ja R5 on -0C0CH3. 35 42 107536

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa R4 on -CH2OH ja R5 on -OH.

12. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa R1 on R5 R< R5 R4 on -CH2F ja R5 on -OH tai -OCOCH3.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa Rs on -OCOCH3.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa R5 on -OH.

15. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa R1 on R4 on H, -CH2OH tai -CH2OCOR8; R5 on -OH tai -OCOR8; ja R8 on 30 bentsyyli.

15 R2 on -OH; R3 on (C1-C3) alkyyli tai allyyli; R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R8, -C02H, H, -CH3, -ch2f, -chf2, -CF3, -CONH2, -CONHR8, -CON(R8)2, -CH2OCOR8, -CH20C02R8, -CH2OCONR28 tai -CH2OR8;

20 R5 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (Cx-C4)alkoksi, bentsyylioksi, -OCOR8, -OCOCH2R8, -0C02R8 tai -OSi(R8)3; t on 1, 2 tai 3; m on 0 tai 1; ja R8 on (C-L-Cg) alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, pyridyy-25 li, tienyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C^-CJ alkoksiryhmillä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (03-04)alkoksiryhmillä; edellyttäen, että kun m on 0, silloin R4 on -CH2F, -CHF2 tai 30 -CF3; ja että kaavoissa (II) ja (III) kukin rengashiiliato- mi sisältää vähintään yhden vetyatomin, · · 38 107536 saatetaan yhdiste, jolla on kaava IVa 5 9H3 «^»1 (IVa) ^ιτγ0 0H|j^R3 Π¢^,00 Aru 10. l^oh ^**3 H3V<0 \ )—ich3 h3co 0CH3 15 jossa R3 on (C^-Cj) alkyyli tai -allyyli ja n on 1 tai 2, reagoimaan 2-4 mooliekvivalentin kanssa yhdistettä, jolla on kaava VI tai VII .-fx"... "?&. X 2. joissa X on halogeeni; R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R8, -C02H, H, -ch3, -ch2f, -chf2, -cf3, -conh2, -conhr8, -CON(R8)2, -CH2OCOR8, -CH20C02R8, -CH2OCONR28 tai -CH2OR8; R5 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C1-C4)alkoksi, 30 bentsyylioksi, -OCOR8, -OCOCH2R8, -0C02R8 tai -OSi(R8)3; ” t on 1, 2 tai 3; m on 0 tai 1; ja R8 on (C^-Cg) alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, pyri- dyyli, tienyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substitu-35 oitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C1-C4) alkok- 39 107536 siryhmillä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C-l-C*) alkoksiryh-millä, kuivausaineen läsnäollessa valittuna ryhmästä mole-5 kyyliseulat, kalsiumsulfaatti, magnesiumsulfaatti; emäksen läsnä ollessa valittuna ryhmästä elohopeakarbonaatti, ho-peakarbonaatti, elohopeanitraatti ja hopeanitraatti; ja katalyytin läsnä ollessa valittuna ryhmästä hopeatriflaat-ti, hopeaperkloraatti, hopeatetrafluoriboraatti, eloho-10 peatriflaatti, elohopeaperkloraatti ja elohopeatetra- fluoriboraatti, reaktioinertissä liuottimessa n. -78 n. -70 °C:ssa lämmittäen n. 0 °C:seen n. 0,5 - n. 24 tunniksi ja tämän jälkeen sekoittaen huoneenlämpötilassa n. 0,5 - 24 tuntia, tai 15 b) yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava Ia, jossa n on 1 tai 2; R1 on ryhmä, jolla on kaava II tai III; R2 on -OH; R3 on (C-l-C3) alkyyli tai allyyli;

20 R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R8, -C02H, -CH20H, H, -ch3, -ch2f, -chf2, -cf3, -CONH2, -CONHR8, -CON(R8)2/ -CH20C02R8, -CH2OCONR2b tai -CH2OR8 ; Rs on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C^C^) alkoksi, bentsyylioksi, -OH, -OCOCH2R8, -0C02R8 tai -OSi(R8)3; :25 t on 1, 2 tai 3; • · m on 0 tai 1; ja R8 on (02-06) alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, pyridyy- li, tienyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (Ci-Cj alkoksiryh-30 millä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C-l-Qj) alkoksiryhmillä; edellyttäen, että kun m on 0, silloin R4 on -CH2F, -CHF2 tai -CF3; ja että kaavoissa (II) ja (III) kukin rengashiiliato-mi sisältää vähintään yhden vetyatomin, 35 40 107536 saatetaan yhdiste, jolla on kaava Ia, jossa n, m, t, R°, R1, R2, R3 ja R8 merkitsevät samaa kuin edellä, R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R8, -C02H, H, -ch3, -ch2f, -chf2, -cf3, -conh2, -CONHR8, -CON(R8)2,

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa R4 on -CH2OCOR8 ja R5 on -OCOR8.

17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukai- 43 107536 nen yhdiste, jossa n on 2; R2 on -OH ja R3 on etyyli.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa R1 on R VH fR4 , RsJV- ,

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan Ia mukainen yhdiste, jossa R4 on -CH2OH, -CH2OCOCH3, -CH2OCOCH2C6H5 tai -CH2P; ja R5 on -OH, -OCOCH3 tai -OCOCH2C6H5.

20. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, j · · tunnettu siitä, että valmistetaan 17-etyyli-l,14- dihydroksi-12-[2'-(4' 1 - (3 1 1 1 , 4 ' 1 ' , 6' ' '-tri-O-asetyyli- 2' ' '-deoksi-2'1'-fluori-a-D-galaktopyranosyylioksi)-3''- metoksisykloheksyyli)-1'-metyylivinyyli]-23,25-dimet- 30 oksi-13,19,21,27-tetrametyyli-ll,28-dioksa-4-atsatrisyk- r lo [22.3.1. O4,9] oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni . • · 44 107536