FI107537B - Makrolidien 2-aminosokerijohdannaiset - Google Patents

Description

107537

Makrolidien 2-aminosokerijohdannaiset Keksinnön tausta

Keksinnön kohteena on menetelmä uusien terapeut-5 tisesti käyttökelpoisten yhdisteiden valmistamiseksi. Erityisemmin kohteena on menetelmä kemiallisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on arvoa annettaessa nisäkkäille, erityisesti ihmiselle immuunivastetta heikentävinä aineina. Näitä keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja 10 uusia immuunivastetta heikentäviä aineita voidaan verrata makrolideihin, jotka tunnetaan nimillä FK-506:n ja FK-520:n, joita on kuvattu yksityiskohtaisemmin US-patentissa nro 4 894 366. Tämän keksinnön uudet yhdisteet ovat erityisen hyödyllisiä estettäessä tai hoidettaessa siirteen 15 hylkimistä, mikä seuraa iho- tai elinsiirreleikkausta ja estettäessä tai hoidettaessa autoimmuunisairauksia, kuten nivelreumaa ja psoriasista. Tämän mukaisesti nämä makroli-dijohdannaiset ovat hyödyllisiä sienen aiheuttamien tulehdussairauksien hoidossa tai ennalta ehkäisyssä.

20 Kudos- tai elin-siirteen hylkiminen, mikä seuraa elinsiirtoleikkausta, on tavallinen tapahtuma, joka aiheutuu siitä, että potilaan immuunijärjestelmä tunnistaa vieraat antigeenit. Ihmisen immuunivastejärjestelmä yrittää ,·. suojata itseään vieraalta kudokselta ja vapauttaa solu- ja • « · ! 25 elimistönestearsenaalin. Sekä aktivoidut lymfosyytit että • ... vasta-aineet hyökkäävät vierasta kudosta vastaan aiheut- taen komplikaatioita, jotka usein päättyvät mainitun ku- • · · ···1 doksen hylkimiseen.

...: Samalla tavalla immuunisääteiset epäsäännöllisyydet : 3 0 autoimmuunisissa ja kroonisissa tulehdussairauksissa ovat - tunnettuja. Riippumatta sairauden etiologiasta monia auto- ·;··· vasta-aineita ja itse-reaktiivisia lymfosyyttejä esiintyy usein vaikeuttaen tilannetta.

• · · ,· , Hoitomenetelmät, joiden kohteena on immuunisuojaus- • · · ’· 35 järjestelmä, johtavat usein järjestelmän täydelliseen sei- • 1 · • · • · t * « · « « 2 107537 sahtumiseen, mikä johtaa kehon kyvyn alentumiseen taistella infektiota vastaan. Tämä voi olla yhtä vaarallista kuin alkuperäinen tila, joka aiheutti seisahtumisen.

Tällä hetkellä johtava lääkeaine siirteen hylkimi-5 sen estämiseksi on syklosporiini A, jonka United States Food and Drug Administration on hyväksynyt 1983. Lääke toimii niin, että se inhiboi kehon immuunivastejärjestel-mää mobilisoimasta sen luonnollisten suoja-aineiden arsenaalia siirteen vieraan proteiinin hylkimiseksi. Vaikka 10 syklosporiini on tehokas taisteltaessa siirteen hylkimistä vastaan, sillä on haittoja, jotka voivat aiheuttaa maksavauriota, munuaisvauriota ja vatsahaavaa; jotka monissa tapauksissa voivat olla vakavia. On olemassa jatkuva tarve kehittää turvallisempia lääkkeitä, jotka ovat selektiivi-15 sempiä kykynsä suhteen vaikuttaa immuunivastejärjestelmään ja joilla on vähemmän sivuvaikutuksia.

US-patentti nro 4 894 366 kuvaa makrolideja FK-506:n ja FK-520:n inter alia immuunivastetta heikentävinä aineina mukaanlukien "hylkimisreaktion hoitaminen 20 elinsiirrossa" ja autoimmuunisairauksien ja tulehdussai rauksien hoitaminen. Kansainvälinen patenttijulkaisu nro WO 91/02736 kuvaa FK-506:n, FK-520:n johdannaisia ja vastaavia makrolideja. EP-patenttijulkaisu nro 428 365A1 kuvaa eräitä muita FK-506:n, FK-520:n johdannaisia ja vas-; 25 taavia makrolideja.

Keksinnön yhteenveto Tämän keksinnön kohteena on menetelmä yhdisteiden • · · ...* valmistamiseksi, joilla on kaava « *♦*· , :T 30 * Y-,

HjCO'^S f"3 VV* R3 T ΛΑ n 1 (I) σ höh / υπ3 35 h3cv>c0 ( : ; tv v~ch3 h3co och3 3 107537 jossa n on 1 tai 2; katkoviiva ei ole sidos; A ja B ovat erikseen ja A on H ja B on H tai -OH, tai A ja B ovat yhdessä =0;

5 R1 on ryhmä, jolla on kaava II

io ’ R8 (II) R2 on -OH; 15 R3 on ((^-03) alkyyli tai allyyli; R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R9, -C02H, -ch2oh, h, -ch3, -conh2, -conhr9, -conr29, -ch2ocor9, -CH20C02R9, -CH2OCONHR9, -CH2OCONR29 tai -CH2OR9; R5 ja R6 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti 20 (03-04) alkoksi, bentsyylioksi, -OH, -OCOR9, -0C02R9 tai -OSiR310; R7 ja R8 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti H, (Cj-CJ alkyyli, -COCH2R9, -COR9, -C02R9 tai -S02R9; .·, R9 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C^Cg) alkyyli, 25 (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, -CF3, pyridyyli, tienyyli, ... tienyylimetyleeni, furanyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka *··* on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, -OH ryhmillä tai • · « ···’ (03-04)alkoksiryhmillä, fenyyli tai fenyyli, joka on subs- tituoitu 1-5 halogeeniatomilla, -OH ryhmillä tai • .

v r 30 (03-04) alkoksiryhmillä; ja R10 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C^CJ alkyyli, *:**: fenyyli tai bentsyyli; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmis- . tamiseksi.

• · • · ♦ • · • · • · * • « 4 107537

Edullinen ryhmä tämän keksinnön yhdisteitä ovat kaavan (I) yhdisteet, joissa n on 2; A ja B ovat erikseen =0; R2 on -OH; R3 on etyyli; R1 on 5 R* R5 R<

I tai N

✓ V /v 10 R4 on -CH20H tai -CH2OCOCH3; Rs ja R6 ovat kumpikin riippumattomasti -OH tai -OCOCH3; ja R7 ja R8 ovat kumpikin riip-15 pumattomasti H, -COCH3 tai -COCF3.

Erityisen edullisia tässä ryhmässä ovat yhdisteet, joissa R1 on

^0ÖC JJH

HNflc HNflc

... 0Pc^0fic OH

:i:!25 ·...· HNBc HN«c • · « « * t · ♦ ·;·; ^.OPc oh 0c0^j=k- or HoSiZj^ · hnccf, hnccf,

B B

♦ · · • « • · 5 107537

Toinen tämän keksinnön yhdisteiden edullinen ryhmä on kaavan (I) yhdisteiden ryhmä, jossa n on 2; A ja B ovat erikseen ja ovat H; katkoviiva ei edusta mitään sidosta; R2 on -OH; ja R3 on etyyli.

5 Kaavan (I) yhdisteet ovat tehokkaita immuunivastet ta heikentäviä aineita. Tämä aktiivisuus tekee näistä yhdisteistä käyttökelpoisia hoidettaessa ja ennaltaehkäistäessä siirteen hylkimisreaktiota. Lisäksi tämä aktiivisuus tekee näistä yhdisteistä käyttökelpoisia ennaltaehkäistä-10 essä ja hoidettaessa autoimmuunisairauksia, kuten nivelreumaa ja psoriasista nisäkkäässä, erityisesti ihmisessä.

Yhdisteitä voidaan käyttää menetelmässä, jossa hoidetaan hylkimisreaktiota elinsiirrossa nisäkkäässä, joka tarvitsee tällaista hoitoa, jossa menetelmässä annetaan 15 mainitulle nisäkkäälle vaikuttava määrä kaavan {I) yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa.

Termi "elinsiirto" käytettäessä edellä ja tämän jälkeen viittaa henkilöön istutettuun siirteeseen, joka siirre on kudos tai elin, joka on otettu henkilön toisesta 20 kohdasta tai toiselta henkilöltä. Tavallisia elinsiirtoja ovat, näihin rajoittumatta, luuydin-, sydän-, munuais-, jänne- ja haima-pohjukaissuoli elinsiirrot.

Termi "siirre" käytettäessä edellä ja tämän jälkeen viittaa mihin tahansa kiinnittämättömään kudokseen tai ; 25 elimeen, jota käytetään elinsiirroissa. Tavallisia siirteitä ovat, näihin rajoittumatta, iho-, luu-, rasva- ja *···* hermosiirteet.

• · «

Lisäksi yhdisteitä voidaan käyttää menetelmässä au-toimmuunisairauden (kuten nivelreuman tai psoriasiksen) • « · V r 30 hoitamiseksi nisäkkäässä, joka tarvitsee tällaista hoitoa, jossa menetelmässä annetaan mainitulle nisäkkäälle vaikut-·:··· tava määrä kaavan (I) yhdistettä tai sen farmaseuttisesti .*··. hyväksyttävää suolaa.

Yhdisteitä voidaan käyttää farmaseuttisessa koos-*· ~ 35 tumuksessa, joka sisältää vaikuttavan määrän hylkimisreak- 6 107537 tiota elinsiirrossa hoitavaa kaavan (I) yhdistettä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantoainetta.

Vielä edelleen yhdisteitä voidaan käyttää farmaseuttisessa koostumuksessa, joka sisältää vaikuttavan mää-5 rän autoimmuunisairautta (kuten nivelreumaa tai psoriasista) parantavaa kaavan (I) yhdistettä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantoainetta.

Lisäksi kaavan (I) yhdisteillä on sieniä vastustavaa aktiivisuutta. Täten näitä yhdisteitä voidaan käyttää 10 sienistä aiheutuvien tulehdusten ennaltaehkäisyssä tai hoidossa nisäkkäissä.

Tämän mukaisesti yhdisteitä voidaan käyttää menetelmässä sienisairauksien hoitamiseksi nisäkkäässä, joka tarvitsee tällaista hoitoa, jossa menetelmässä annetaan 15 mainitulle nisäkkäälle vaikuttava määrä kaavan (I) yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa.

Yhdisteitä voidaan käyttää farmaseuttisessa koostumuksessa, joka sisältää vaikuttavan määrän sienitulehdus-sairautta hoitavaa kaavan (I) yhdistettä ja farmaseutti-20 sesti hyväksyttävää kantoainetta.

Yksityiskohtainen kuvaus Tämän keksinnön kaavan (I) yhdisteet valmistetaan helposti. Yleisimmin makrolidi, jolla on seuraava kaava (III) tai (IV)

« » I

III I

4 » ···

• I

• · « · ·

• 9 O

• « r » • « * ··· 4 t · • · • · • · · • · • · * · • · « · · • · » · 7 107537 ?H3 5 H3C(K ^ I,, VA0 “Λ ,¾°° A», 10 V»H / h3c. AC \ y±-cH3 L«X 23/ r5 h3co och3 15 (III) 20 aA, ?«>

H3C(T ^ f I

οπΛ^Α^ίί0 :·: :25 ^A-0 °H A‘r3

·:··: b 4n [j j17 R

^Al,0 0 X^ru • · rt/^ ^"v/ / l»n^

**: ϋ 2[ OH X

····* H3C\ \ ·: w *::: 1« A sa / v *3o h3co och3 !..* (iv) 8 107537 kytketään tarkoituksenmukaisen sokerihalidijohdannaisen kanssa, jolla on kaava U i <V) 10 jossa X on halogeeni, kuten bromi tai kloori. Kytketty (tai glykosyloitu) makrolidi modifioidaan sitten edelleen kuten tässä seuraavassa on kuvattu.

Kaavojen (III) ja (IV) makrolidien valmistus on 15 hyvin tunnettua kirjallisuudessa. Tavallisesti yleisin näiden makrolidien valmistusmenetelmä on mikro-organismien, jotka kuuluvat Streptomyces sukuun, biologinen fer-mentaatio. Kaavojen (III) ja (IV) yhdisteet, joissa R3 on allyyli, saadaan Streptomyces tsukubaensis nro 9993 (Ferm 20 BP-927) fermentaatiolla. Kaavan (III) yhdiste, jossa R3 on etyyli ja kaavan (III) yhdiste, jossa R3 on metyyli, saadaan Streptomyces hygroscopicus alalaji ascomyceticus ATCC 14891 fermentaatiolla.

Streptomyces hygroscopicuksen alalajin ascomyce- « · 25 ticuksen ATCC 14891 lyofilisoitu näyte on tallennettu Ame- ... rican Type Culture Collectioniin, 12301 Parklawn Drive, • · *···* Rockville, Maryland, 20852, USA, Budapest sopimuksen ehto- • · · • ••ί jen mukaisesti 13. tammikuuta 1992. Tälle vastatallenne- tulle viljelmälle on annettu uusi talletusnumero ATCC V‘-30 55276.

Streptomyces tsukubaensis nro 9993 (Ferm BP-927) on *:··· tällä hetkellä tallennettavana Fermentation Research

Institute, Agency of Industrial Science Technologyn toi-. .mesta (.nro 1-3, Higashi-1-chome, Yatabemachi, Tsukuba- ; /35 gun, Ibaraki Prefecture, Japani), Budapest sopimuksen mu- « · • · • · · 9 107537 kaisesti. Mikro-organismin tuore näyte tallennetaan American Type Culture Collectioniin Budapest sopimuksen ehtojen mukaisesti.

Edellä mainitut mikro-organismit, ollessaan erik-5 seen vesipitoisessa elatusnesteessä, muodostavat edellä mainitut kaavojen III ja IV yhdisteet. Mainittujen mikro-organismien fermentaatio näiden makrolidien muodostamiseksi toteutetaan pääosin kuten on kuvattu US-patentissa 4 894 366, joka täten on liitetty tähän viitteenä. Mitkä 10 tahansa muutokset kuvatussa menetelmässä on tehty sovellettuna käytetylle laitteistolle ja on kuvattu seuraavissa valmistusmenetelmissä 1 ja 2.

Kaavan (I) yhdisteen valmistamiseksi, jossa R° on H ja R1 on kaavan (II) sokerisubstituentti, kaavan (III) 15 tai (IV) makrolidi kytketään kaavan (V) sokerihalidin kanssa. Kaavan (V) sokerihalidin ja kaavan (III) tai (IV) makrolidin kytkentä (tai glykosylaatio) reaktio toteutetaan yksinkertaisesti käyttäen kemiallisia menetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle. Kytken-20 täreaktio toteutetaan tavallisesti käyttäen sokerin pera-setyloitua muotoa. N. 2 - 4 mooliekvivalenttia tarkoituksenmukaista kaavan (V) sokerihalidia sekoitetaan kaavan (III) tai (IV) makrolidin kanssa reaktioinertissä liuot-timessa. Tämänkaltaisen reaktion hyödyllisiä reaktio- • · < ]25 inerttejä liuottimia ovat klooratut liuottimet, kuten kloroformi, metyleenikloridi ja etyleenidikloridi; eetteri- • · *···' liuottimet, kuten dietyylieetteri, tetrahydrofuraani, di- • « · oksaani ja dimetoksietaani; aromaattiset liuottimet, kuten bentseeni, tolueeni ja ksyleeni; ja dipolaariset aproot- • 4 · V r30 tiset liuottimet, kuten N,N-dimetyyliformamidi, asetonit-riili ja N-metyylipyrrolidoni. Edullisia liuottimia ovat ....: klooratut liuottimet ja erityisen edullinen liuotin on .1··. metyleenikloridi. Tavallisesti on toivottavaa käyttää tar- • « · / ^ peeksi liuotinta niin, että reagoivat aineet liukenevat ♦ ♦ « *· 1:35 tai suspendoituvat liuottimeen. Tavallisesti käytetty • · • » · · « • ♦ ίο 107537 liuotinmäärä vaihtelee niin, että saadaan ΙΟ"1 - 10'3 molaa-rinen makrolidiliuos, josta 10'1 molaarinen liuos on edullinen. Olosuhteet pidetään kuivina läpi reaktion käyttäen vedettömiä liuottimia ja lisäämällä kuiva-ainetta reaktio-5 seokseen. Tätä tarkoitusta varten käytettyjä kuiva-aineita ovat molekyyliseulat, kalsiumsulfaatti ja magnesiumsulfaatti. Edullinen kuivausaine on 4 A molekyyliseulat.

Reagoivien aineiden sekoittaminen toteutetaan lämpötilassa n. -78 °C - n. 70 °C. Edullisia ovat lämpötilat 10 alueelta n. -78 °C - n. 0 °C. Valmistuksen helpottamiseksi erityisen edullinen on kylmähaude, joka pitää reaktioläm-pötilan -78 eC:ssa.

Kun edellä mainitut reagoivat aineet on sekoitettu ja lämpötila on tasoittunut -78 °C:seen, reaktioseosta 15 käsitellään sopivalla emäksellä, kuten elohopeakarbonaa-tilla, hopeakarbonaatilla, elohopeanitraatilla tai hopea-nitraatilla. Edullinen emäs tälle reaktiolle on hopeakar-bonaatti. Mainitun emäksen lisäyksen jälkeen reaktioseosta käsitellään katalyytillä. Tavallisia katalyyttejä tälle 20 reaktiolle ovat triflaatti-, perkloraatti- ja tetrafluori-boraattisuolat kationille, joka liittyy käytettyyn kyseiseen emäkseen. Edullinen katalyytti on hopeatriflaatti.

Kun kaikki reagoivat aineet ja reagenssit on lisätty, reaktioseos lämmitetään 0 °C:seen, sekoitetaan 0,5 - f · 4 '.25 24 tuntia 0 °C:ssa ja lämmitetään hitaasti huoneenlämpö- tilaan. Reaktioseosta sekoitetaan 0,5 - 24 lisätuntia huo- « « *···* neenlämpötilassa. Tavallisesti reaktioseosta sekoitetaan ·«· ·.·* 0 °C:ssa viisi tuntia ja annetaan lämmetä huoneenlämpöti- laan kolmen tunnin aikana, mitä seuraa 16 tunnin sekoit- • · 4 ·,· 30 taminen huoneenlämpötilassa. Sitten tuote eristetään reak-tioseoksesta käyttäen menetelmiä, jotka ovat tunnettuja ·:*·; alaan perehtyneille. Täten yksinkertainen suodattaminen suodattimen, kuten CelitenR läpi, mitä seuraa haihduttami- • « « / # nen, antaa jäännöksen, joka puhdistetaan pylväskromatogra- « · * ‘•*:35 fisesti. Alaan perehtynyt tietää, että pylväskromatogra-♦ ♦ · · « • * 9 4 « · 11 107537 fiässä käytetään kiinteää faasia kuten silikageeliä ja nestemäistä faasia, joka koostuu liuottimien edullisesta seoksesta, yhdisteiden erottamiseksi ja puhdistamiseksi seoksesta. Liuottimien poistaminen kromatografian jälkeen 5 antaa glykosyylimakrolidin.

Yleensä kytkentäreaktio tapahtuu ainoastaan yhdessä kolmesta alkoholikohdasta makrolidissa. Tämä kohta on C-4' ' funktionaalinen alkoholiryhmä (katso kaava III). Tämä selektiivisyys on mahdollista johtuen tämän aseman 10 hydroksyyliryhmän suuremmasta vastaanottavuudesta makroli- dien edullisessa konformaatiossa. Joskus kuitenkin erityisen reaktiivisilla sokerihalideilla muodostuu pieniä määriä diglykosyloitua ainetta (jossa R2 on 0R°). Tämä aine havaitaan seurattaessa reaktion etenemistä, mikä tavalli-15 sesti tehdään ohutkerroskromatografisesti standardikäytän- nön mukaisesti. Diglykosyloitu aine eristetään ja puhdistetaan kuten monoglykosyloitu aine, paitsi sillä huomattavalla poikkeuksella, että diglykosyloitu aine on tavallisesti ensimmäinen eristetty aine kromatografoinnissa, kun 20 taas monoglykosyloitu aine eristetään myöhemmistä jakeis ta. Lisättyjen sokerikloridiekvivalenttien käyttö tai muiden parametrien, kuten liuottimen, emäksen tai katalyytin muuttaminen voi vaikuttaa diglykosyloidun aineen saantoon.

Kaavan (I) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R1 |25 on H ja R on kaavan (II) sokerisubstituentti, kaavan (III) tai (IV) makrolidi suojataan ensin hydroksyylisuojaryhmäl- • · *···* lä C-4" asemassa. Hydroksyylisuojaryhmiä, jotka ovat sopi- * ...i via tällaista tarkoitusta varten ovat, näihin rajoittumat- ta, silyylieetterit, karboksyylieetterit ja karbonieste- • 4 * *30 rit. Suojaryhmät on liitetty alkoholiin käyttäen hyvin tunnettuja orgaanisen kemian menetelmiä. Silyylieetterit «···· ovat edullisia johtuen niiden selektiivisyydestä ja liit- .111. tämisen ja poistamisen helppoudesta. Tämän mukaisesti kaa- 4 a / _ van (III) tai (IV) raakrolidj liuotetaan reaktioinerttiin • · · ’· *·35 liuottimeen lämpötilassa n. 0 °C - n. 30 °C. Tämänkaltai- • · « · « > * 4 • · ‘ » «· * • · 12 107537 seen reaktioon sopivia reaktioinerttejä liuottimia ovat dipolaariset aproottiset liuottimet, kuten dimetyyliform-amidi, dimetyylisulfoksidi ja N-metyylipyrrolidoni; klooratut liuottimet, kuten kloroformi, dikloorimetaani ja 5 1,2-dikloorietaani; ja eetteriliuottimet, kuten dietyyli- eetteri, dioksaani ja tetrahydrofuraani. Valittu liuotin on usein dimetyyliformamidi. Silylointiainetta, tavallisesti silyylitrifluorimetaanisulfonaattia, kuten t-butyy-lidimetyylisilyylitrifluorimetaanisulfonaattia tai silyy-10 likloridia, kuten dimetyyli-t-butyylisilyylikloridia, tri-metyylikloorisilaania tai trifenyylikloorisilaania lisätään yhdessä orgaanisen amiinin, kuten trietyyliamiinin, trimetyyliamiinin, 4-dimetyyliaminopyridiinin tai imidat-solin kanssa. Tavallisesti edullinen emäs on imidatsoli. 15 Reaktioseosta sekoitetaan n. yksi tunti - 24 tuntia, tavallisesti huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen tuote eristetään reaktioliuoksesta tavalla, joka on hyvin tunnettua alaan perehtyneelle.

Makrolidi, nyt suojattu C-4" asemassa, voidaan kyt-20 keä kaavan (V) sokerihalidin kanssa, kuten tässä edellä on kuvattu. Tällaisen kytkentäreaktion tuote on kaavan (I) yhdisteen johdannainen, johon sokerijohdannainen on liittynyt hapen kautta C-14 asemaan ja C-4" asema on suojattu.

, C-4" aseman suojaus voidaan poistaa antamaan vapaa hydrok- • i < i ..,.:25 siyhdiste käyttäen orgaanisen kemian standardimenetelmiä, .···. jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle. Edullisen • « *** silyylieetterisuojaryhmän poistamiseksi C-4" silyylisuoja- ** ttu kaavan (I) yhdiste liuotetaan asetonitriiliin tai re- • · ”;· aktioinerttiin liuottimeen, kuten eetteriliuottimeen, ku- * · '·' 30 ten tetrahydrofuraaniin tai dietyylileetteriin lämpöti lassa n. 0 °C - n. 30 °C ja käsitellään fluoridilähteellä, kuten vetyfluoridilla tai tetra-N-butyyliammoniumfluori- • i i dilla. Reaktioseosta sekoitetaan n. 1 tunti - n. 24 tuntia .·[ ; ja sitten tuote eristetään käyttäen orgaanisen .kemian • « · • 1 1 • · • · • · · | « 13 107537 standardimenetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle.

Keksinnön mukaisten kaavan (I) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa A ja B ovat erikseen ja ovat kumpikin H 5 (yhdisteisiin viitataan tämän jälkeen C-2 desoksomakroli-deina), kaavan (I) yhdiste, jossa A ja B ovat yhdessä =0, pelkistetään käyttäen standardiolosuhteita a-ketoamidien pelkistykselle. Tämä pelkistysmenetelmä pelkistää selektiivisesti amidin viereisen karbonyylin vaikuttamatta mui-10 hin karbonyyleihin molekyylissä. Tavallisesti kaavan (I) makrolidi liuotetaan reaktioinerttiin liuottimeen tai liuottimien seokseen ja rikkivetykaasua kuplitetaan seokseen 6-24 tuntia huoneenlämpötilassa. Tavallisesti kaasua kuplitetaan reaktioseokseen yön yli. Sopivia reaktioinert-15 tejä liuottimia tälle reaktiolle ovat, näihin rajoittumatta, orgaaniset emäkset, kuten dietyyliamiini, trietyyli-amiini, dimetyyliamiini, trimetyyliamiini, piperidiini, morfOliini ja aniliini; dipolaariset aproottiset liuottimet, kuten N,N-dimetyyliformamidi, dimetyylisulfoksidi 20 ja N-metyylipyrrolidoni; ja alkoholiliuottimet, kuten me-tanoli, etanoli ja propanoli. Kahden tai useamman tällaisen liuottimen yhdistämistä käytetään joskus optimisaannon aikaansaamiseksi tai vaikuttamaan pelkistyksen kulkuun.

. Esimerkiksi makrolidi, jossa A on H ja B on OH, valmiste- ....:25 taan käyttäen metanolia liuottimena. Erityisen edullisessa .···. liuotinjärjestelmässä C-2 desoksomakrolidin valmistamisek- si on pyridiiniä ja N,N-dimetyyliformamidia yhtäläisiä määriä. Kun reaktio on täydellinen, tuote eristetään käyt- ♦ · · täen orgaanisen kemian standardimenetelmiä, kuten on il-*•1'30 meistä alaan perehtyneelle.

Vaihtoehtoisesti kaavan (III) tai (IV) yhdisteet *·”♦ voidaan pelkistää ennen glykosylaatiota käyttäen edeltävää ‘fM%'> menetelmää. Pelkistyksen jälkeen makrolidi voidaan glykoli : syloida kuten tässä edellä on kuvattu.

• · · • · • · · 14 107537

Keksinnön mukaisten kaavan (I) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa katkoviiva on sidos ja R2 on vety, kaavan (I) yhdiste, jossa R2 on -OH ja katkoviiva ei edusta mitään sidosta (joihin yhdisteisiin viitataan tämän jäl-5 keen β-hydroksiketonina) dehydrataan kuten EP-patenttiha-kemuksessa nro 323042 on kuvattu. Tavallisesti β-hydroksi-ketoni liuotetaan reaktioinerttiin liuottimeen, joka sisältää katalyyttisen määrän orgaanista happoa. Sopivia reaktioinerttejä liuottimia ovat aromaattiset liuottimet, 10 kuten bentseeni, tolueeni, ksyleeni ja vastaavat, joista tolueeni on edullinen. Orgaaninen happo valitaan tavallisesti sellaisista hapoista kuten tolueenisulfonihaposta, kamferisulfonihaposta ja vastaavista, joista tolueenisul-fonihappo on edullinen. Reaktioseosta kuumennetaan n. 15 50 °C:ssa - n. 120 °C:ssa n. viisi minuuttia - n. yksi tunti. Tavallisesti höyryhaudelämpötilat (n. 100 °C) ovat edullisia ja viisi minuuttia on yleensä riittävä aika reaktion loppuunviemiseksi. Reaktiotuote eristetään menetelmien avulla, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan pereh-20 tyneelle. Reaktio toteutetaan tavallisesti yhdisteille, jotka on jo glykosyloitu.

Kaavan (I) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R5 ja R6 ovat hydroksi ja R4 on hydroksimetyyli, kaavan (I) . yhdiste, jossa R5 ja R6 ovat asetoksi ja R4 on asetoksime- ....:25 tyyli, deasetyloidaan käyttäen standardiolosuhteita, jotka .1·1. ovat tunnettuja alaan perehtyneille, kuten seuraavassa on esitetty. Tämä selektiivinen deasetylointi ei vaikuta ami-deihin, joita on läsnä, ja toteutetaan helposti lisäämällä « *”! alkoksidiemästä liuokseen, jossa on deasetyloitavaa ainet aso ta alkoholipitoisessa liuottimessa 0 °C:ssa. Tavallisesti käytetään katalyyttistä määrää, kuten 0,01 ekvivalenttia • · emästä. Tavallisesti kyseisen alkoholipitoisen liuottimen '...: alkoksidiemäs on edullinen. Edullisin, johtuen sen helppo- .·. : käyttöisyydestä ja reaktiivisuudesta, on järjestelmä, jos- .•••.35 sa metanoli on liuotin ja natriummetoksidi on emäs. Tuot- · 15 107537 teen eristäminen toteutetaan standardimenetelmien avulla, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle.

Kaavan (V) sokerihalidijohdannaiset ovat helposti valmistettavissa, mikäli niitä ei ole helposti saatavissa, 5 helposti saatavasta kaavan (VI) 2-aminosokerista, jossa R11 on H, (Cj-C^ )alkyyli R5 Οφ^' R7 OR11 (VI) 15 tai (C2-C4)alkanoyyli, käyttäen standardi halogenointime-netelmiä, jotka ovat tunnettuja alaan perehtyneelle.

Bromaus on valittu menetelmä; kloorausta voidaan myös käyttää tietyissä tapauksissa. Bromaus toteutetaan 20 liuottamalla 1-hydroksi-, alkoksi- tai alkanoyylioksisoke-rijohdannainen, jolla on kaava (VI), orgaaniseen happo-liuottimeen, kuten etikkahappoon. Kun sokeri on 1-hydrok-si- tai 1-alkoksisokeri, lisätään tavallisesti 1-10 ekvivalenttia etikkahappoanhydridiä. Edullisia substraatteja

• · I

^25 ovat 1-asetoksisokerijohdannaiset. Reaktioseos jäähdyte-

• I

... tään niin, että lämpötila putoaa alueelle -20 eC - n.

• · ·"* 0 °C. Tavallisesti edullinen lämpötila on n. 0 eC. Jäähdy-

»CC

tettyä reaktioseosta käsitellään vetybromidihappoliuoksel- « · » la happoliuottimessa. Tavallisesti käytetään suurta yli-V *30 määrää, kuten 10 - 40 mooliekvivalenttia vetybromidihap-poa. Reaktioseos lämmitetään huoneenlämpötilaan ja sekoi-*:**: tetaan kunnes reaktio on täydellinen. Tavallisesti, yksin kertaisuuden vuoksi, reaktioseos jätetään sekoituksenalai-. sena seisomaan yön yli. Bromatun tuotteen eristäminen to- '..‘35 teutetaan yksinkertaisesti tavalla, joka on hyvin tunnettu 16 107537 alaan perehtyneelle. Yleensä tämä käsittää pelkästään liuottimen poistamisen tyhjössä. Joissakin tapauksissa liuottimen tehokkaampaa poistamista varten käytetään lisäliuo-tinta, kuten tolueenia, reaktioliuottimen haihduttamiseksi 5 atseotrooppisesti. Lisäpuhdistus toteutetaan joskus käyttäen pylväskromatografiaa.

Kaavan (VI) yhdisteen valmistamiseksi, jossa R7 ja R8 ovat kumpikin (Cx-C4)alkyyli, kaavan (VI) yhdiste, jossa R7 ja R8 ovat kumpikin H, saatetaan reagoimaan standar-10 di alkylointiolosuhteissa, jotka ovat tunnettuja alaan perehtyneelle. Samalla tavalla kaavan (VI) valmistamiseksi, jossa R7 on H, R8 on -COR9, -C02R9, -COCH2R9 tai -S02R9, kaavan (VI) yhdiste, jossa R7 ja R8 ovat kumpikin H, saatetaan reagoimaan käyttäen standardi amino-asylointi- tai 15 -sulfonointimenetelmiä. Täten kaavan (VI) yhdiste, jossa R7 ja R8 ovat kumpikin H, saatetaan reagoimaan ylimäärän kanssa asyloivaa tai sulfonoivaa ainetta, kuten, mutta näihin rajoittumatta, etikkahappoanhydridiä, trifluorietikkahap-poanhydridiä, (C^-C^alkanoyylikloridia, (C3-C6)sykloalkano-20 yylikloridia, bentsoyylikloridia, krotonyylikloridia, ni- kotinoyylikloridia, isonikotinoyylikloridia, pikolinoyyli-kloridia, tiofeenikarbonyylikloridia, furfuryylikloridia tai R9-substituoitua sulfonyylikloridia reaktioinertissä liuottimessa. Sopivia reaktioinerttejä liuottimia tämän-.,.,:25 kaltaiselle reaktiolle ovat klooratut liuottimet, kuten .···. kloroformi, metyleenikloridi ja etyleenidikloridi; aro- maattiset liuottimet, kuten bentseeni, tolueeni ja ksylee- *'*' ni; ja dipolaariset aproottiset liuottimet, kuten N,N-di- • · ·;” metyyliformamidi, dimetyylisulfoksidi ja N-metyylipyrroli- ’·* ‘30 doni. Edullisia ovat klooratut liuottimet ja erityisen edullinen on metyleenikloridi. Kun reaktio toteutetaan ’·*" käyttäen aminosokerin happoadditiosuolamuotoa, on tarpeen ' : lisätä emästä protonitalteenottajana. Tavallisesti on : riittävää käyttää .heikkoa emästä, kuten pyridiiniä tai .*..’35 orgaanista amiinia, kuten dietyyliamiinia, trietyyliamii- 17 107537 nia, trimetyyliamiinia tai piperidiiniä. Edullisin emäs tälle kyseiselle reaktiolle on pyridiini. Tuotteen eristä-minen, käyttäen standardimenetelmiä, jotka ovat tunnettuja alaan perehtyneelle, antaa aminosokerin asyylijohdannai-5 sen.

Kaavan (VI) aminosokerijohdannaisten valmistamiseksi, joissa R4 on -C02R9 tai -C02H, kaavan (VI) aminosokerin 1-hydroksiryhmä, jossa R7 ja R8 ovat kumpikin H, R4 on -CH20H ja R5 ja R6 ovat kumpikin -OH, suojataan käyttäen 10 standardi suojausmenetelmiä, jotka ovat tunnettuja alaan perehtyneelle. Tavallisesti bentsyyliryhmää tai vastaavaa käytetään suoj aryhmänä. Kaavan (VI) suoj attu aminosokeri, jossa R7 ja R8 ovat kumpikin H, N-alkyloidaan, N-asyloidaan tai N-sulfonoidaan sitten kuten tässä seuraavassa on ku-15 vattu. N-substituoitu 1-suojattu kaavan (VI) aminosokeri, jossa R4 on -CH2OH ja R5 ja R6 ovat kumpikin -OH, hapetetaan sitten käyttäen standardikemian sokerihapetusta, joka on tunnettu alaan perehtyneelle. Tavallisesti kaavan (VI) aminosokeri, jossa R5 ja R6 ovat kumpikin -OH; R4 on -CH2OH; 20 R7 on H; R8 on -COR9, -C02R9, -C02CH2R9 tai -S02R9; ja R10 on suojaryhmä, liuotetaan reaktioinerttiin liuottimeen, kuten bentseeniin, asetonitriiliin tai etyyliasetaattiin ja käsitellään katalyyttisellä määrällä platinaoksidia. Happi-. kaasua kuplitetaan reaktioseokseen n. kaksi tuntia - n. 24

• « · I

....:25 tuntia huoneenlämpötilassa. Uronihappojohdannainen eris- .···. tetään reaktioliuoksesta käyttäen standardi menetelmiä, » jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle.

Kaavan (VI) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R5 • · ja R6 ovat kumpikin -0C0R9 tai -0C02R9, kaavan (VI) yhdis- « · '·* 30 te, jossa R5 ja R6 ovat kumpikin -OH, saatetaan reagoimaan orgaanisen kemian standardi asylointiolosuhteissa. Taval-lisesti kaavan (VI) yhdiste, jossa R5 ja R6 ovat kumpikin 'tti: -OH, saatetaan reagoimaan sopivan asylointiaineen, kuten, : mutta tähän rajoittumatta, etikkahappoanhydridin kancsa .‘..[35 reaktioinertissä liuottimessa, kuten etikkahapossa n.

18 107537 O eC:ssa -n. 25 °C:ssa. Tuote eristetään käyttäen kemian standardi menetelmiä, jotka ovat tunnettuja alaan perehtyneelle.

Kaavan (VI) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R4 5 on -CH2OCOR9 tai -CH20C02R9 ja R5 ja R6 ovat kumpikin -OCOR9 tai -0C02R9, käytetään edeltävän kappaleen menetelmää lähtien kaavan (VI) yhdisteestä, jossa R4 on -CH2OH ja R5 ja R6 ovat kumpikin -OH.

Vaihtoehtoisesti kaavan (I) yhdisteet voidaan valio mistaa käyttäen kytkentä (glykosylaatio) reaktiota, jota on kuvattu tässä edellä, mutta korvaamalla kaavan (V) so-kerihalidi atsidosubstituoidulla sokerijohdannaisella, jolla on kaava 15 R5 <r 20 C1 <vm Tämän kaavan atsidoyhdisteet valmistetaan käyttäen mene- . telmää, jota Lemiuex et ai. ovat kuvanneet [Canadian Jour- • · · · ....:25 nai of Chemistry, 57, 1244-51 (1979)].

.···. Näin saatu makrolidi kytkennän jälkeen atsidosoke- rikloridin kanssa hydrataan ja asyloidaan in situ antamaan kaavan (I) makrolideja, joissa R4 on -CH2OCOR9 tai -CH20C02R9, R5 ja R6 ovat kumpikin -OCOR9 tai -0C02R9, R7 on ‘ 30 H ja R8 on -COR9 tai -C02R9.

Hydraus toteutetaan tavallisesti sekoittaen tai ravistaen hydrattavaa ainetta (substraattia) reaktioiner-tissä liuottimessa jalometallikatalyytin läsnäollessa.

.·. : Reaktio toteutetaan tavallisesti lämpötilassa n. 0 °C - *..*35 60 °C ja edullisesti n. 25 °C:ssa. Vetypaine pidetään ta- 19 107537 vallisesti alueella n. ilmakehän paine - n. 60 psi n. 20 -50 psi:n ollessa edullisempi. Edullisin paine on 50 psi. Reaktioinertti liuotin valitaan liuottimista dietyylieet-teri, tetrahydrofuraani, dioksaani, 1,2-dimetoksietaani, 5 dimetyyliformamidi, etanoli, metanoli, muurahaishappo, etikkahappo ja propionihappo. Erityisen edullinen liuotin tälle hydraukselle on etikkahappo. Edullinen jalometalli-katalyytti tälle reaktiolle on palladium, platina, rodium ja nikkeli. Erityisen edullinen, johtuen sen reaktiivisuu-10 desta, on palladium. Katalyyttikantoaineena käytetään edullisesti inerttiä väliainetta, kuten hiiltä ja katalyyttiä on tavallisesti läsnä määränä n. 0,01 paino-% -n. 25 paino-%. Erityisen edullinen on alue 0,1 paino-% -10 paino-%, perustuen atsidoyhdisteiden painoon. Reaktio 15 toteutetaan tavallisesti suljetussa pullossa, esim. Parr pullossa, joka on liitetty Parr sekoituslaitteistoon vedyn lisäystä varten ja pidetään halutussa paineessa. Kun reaktio toteutetaan näissä olosuhteissa, se on tavallisesti päättynyt muutamassa tunnissa, esim. 2 - n. 24 tunnissa. 20 Kun hydraus on täydellinen, reaktiopullo poistetaan

Parr sekoittimesta ja sen sisältöä käsitellään riittävän suurella määrällä etikkahappoanhydridiä täydellisen reaktion varmistamiseksi vastavalmistetun amiinin kanssa. Reaktioastiaa sekoitetaan muutama minuutti, esim. 3-30 ....:25 minuuttia, minkä jälkeen reaktioseos suodatetaan Celiten .···. ja hiilen läpi. Suodos puhdistetaan orgaanisen kemian 4 4 standardimenetelmillä antamaan haluttu makrolidianalogi.

e **'. Kun tämän keksinnön kaavan (I) yhdisteet ovat hap- pamia, kuten kun R4 on -C02H, keksintö käsittää myös mai- • · · *·* *30 nittujen kaavan (I) yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

« *:’*: Tavallisia farmaseuttisesti hyväksyttäviä kationi- • « « *φ '. suoloja tällaista käyttöä varten ovat alkalimetallisuolat .·*. : (esim. natrium ja kalium), maa-alkalimetallisuolat (esim.

• 4 4 .‘..*35 magnesium ja kalsium), alumiinisuolat, ammoniumsuolat ja 4 4 4 4 4*4 4 20 107537 suolat orgaanisten amiinien, kuten bentsatiinin (Ν,Ν'-di-bentsyylietyleenidiamiinin), koliinin, dietanoliamiinin, etyleenidiamiinin, meglumiinin (N-metyyliglukamiinin), benetamiinin (N-bentsyylifenetyyliamiinin), dietyyliamii-5 nin, piperatsiinin, trometamiinin (2-amino-2-hydroksime-tyyli-1,3-propaanidiolin) ja prokaiinin kanssa. Erityisen edullinen suola on natriumsuola.

Tämän keksinnön farmaseuttisesti hyväksyttävät kat-ionisuolat valmistetaan edullisesti saattamalla happomuo-10 dot reagoimaan tarkoituksenmukaisen emäksen tavallisesti yhden ekvivalentin kanssa, lisäliuottimessa. Tyypillisiä emäksiä ovat natriumhydroksidi, natriummetoksidi, magne-siumhydroksidi, kalsiumhydroksidi, bentsatiini, koliini, dietanoliamiini, piperatsiini ja trometamiini. Suola eris-15 tetään väkevöimällä kuiviin tai lisäämällä ei-liuotinta. Monissa tapauksissa suolat valmistetaan edullisesti sekoittamalla happoliuos liuoksen kanssa, jossa on eri kationi-suoloja (natrium- tai kaliumetyyliheksanoaatti, -magnesi-umoleaatti), käyttäen liuotinta (esim. etyyliasetaattia), 20 josta haluttu kationisuola saostuu tai voidaan muulla tavalla eristää väkevöimällä ja/tai lisäämällä ei-liuotinta.

Kun tämän keksinnön kaavan (I) yhdisteet ovat emäksisiä, kuten kun R7 ja R8 ovat kumpikin H tai (C^-C^alkyyli tai kun R7 on H ja R8 on (C^-C^alkyyli, keksintö käsittää :25 myös mainittujen kaavan (I) yhdisteiden farmaseuttisesti .···. hyväksyttävät happoadditiosuolat.

• ·

Tyypillisiä farmaseuttisesti hyväksyttäviä happo-*“i additiosuoloja ovat hydrokloridi, hydrobromidi, sulfaatti, • · c **" vetysulfaatti, fosfaatti, vetyfosfaatti, divetyfosfaatti, t » « ’•’'30 asetaatti, sukkinaatti, sitraatti, mesylaatti (metaani- sulfonaatti) ja tosylaatti (p-tolueenisulfonaatti). Nämä suolat valmistetaan helposti saattamalla emäsmuodot rea- ‘t- : goimaan tarkoituksenmukaisen hapon kanssa. Kun suola on .·. ; yksi emäksinen happo (esim. hydrokloridi, hydrobromidi, *..]35 p-tolueenisulfonaatti tai asetaatti), kaksiemäksisen hapon • · « 21 107537 vetymuoto (esim. vetysulfaatti tai sukkinaatti) tai kol-miemäksisen hapon divetymuoto (esim. divetyfosfaatti tai sitraatti), käytetään vähintäin yksi mooliekvivalentti ja tavallisesti mooliylimäärä happoa. Kuitenkin, kun halutaan 5 suoloja, kuten sulfaattia, hemisukkinaattia, vetyfosfaat-tia tai fosfaattia, käytetään tavallisesti tarkoituksenmukaisia ja tarkkoja kemiallisia ekvivalentteja. Vapaa emäs ja happo yhdistetään tavallisesti lisäliuottimeen, jossa haluttu suola saostuu tai voidaan muulla tavalla 10 eristää väkevöimällä ja/tai lisäämällä ei-liuotinta.

Ottaen huomioon tämän keksinnön kaavan (I) makroli-dit, on ymmärrettävä, että stereoisomeeriset muodot, kuten optiset ja geometriset isomeerit, johtuen niiden asymmetrisestä hiiliatomista tai hiiliatomeista ja kaksoissidok-15 sesta tai kaksoissidoksista, kuuluvat tämän keksinnön piiriin.

Täten valmistetut kaavan (I) yhdisteet ovat hyödyllisiä hylkimisreaktion hoitamiseksi elinsiirroissa ja autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman tai psoriasiksen 20 hoitamiseksi. Hylkimisreaktion hoitamiseksi elinsiirrossa kaavan (I) yhdistettä voidaan käyttää joko ennaltaehkäisevästi tai haitallista reaktiota vastaan, joka aiheutuu elin- tai kudossiirrosta ihmisessä. Käytettynä ennalta-, ehkäisevästi kaavan (I) yhdistettä annetaan potilaalle tai

<14 I

,.,,:25 kudos- tai elinsiirteeseen ennen elinsiirtoa. Ennaltaeh-

t I

.···. käisevä hoito voi myös käsittää lääkityksen antamisen • « **I elinsiirron jälkeen, mutta ennen kuin on havaittu mitään *’*! siirrosta aiheutuvia haitallisia reaktioita. Annettaessa « r· *“* haitallista reaktiota vastaan kaavan (I) yhdistettä anne- • * · *·' * 30 taan suoraan potilaalle mainitun hylkimisreaktion elinsiirrossa hoitamiseksi kun ulkoisia merkkejä vastustus- *·"· kyvystä on havaittu.

» » < 'itt! Käytettäessä hylkimisreaktion elinsiirrossa hoita- ; miseksi ja .autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman tai ♦ »t *..* 35 psoriasiksen hoidossa nisäkkäässä, mukaanlukien ihminen, • · « * « « · * » 22 107537 kaavan (I) yhdiste formuloidaan sopivaksi farmaseuttiseksi koostumukseksi, joka sisältää sairautta hoitavan vaikuttavan määrän. Riippuen annettavan kaavan (I) kyseisen yhdisteen tehokkuudesta n. 0,05 mg/kg elopaino/päivä - n.

5 30 mg/kg elopainoa/päivä annetaan yhtenä tai monena päi vittäisenä annoksena hoidettavalle nisäkkäälle. Edullisempi alue on 0,05 mg/kg elopainoa/päivä - n. 20 mg/kg elopainoa/päivä, vaikka tietyissä tapauksissa vastuussa olevan lääkärin harkintakyvyn mukaan voidaan tarvita annoksia 10 laajemmalta alueelta. Edullinen antoreitti on tavallisesti oraalinen, mutta ruoansulatuskanavan ulkopuolinen antomuo-to (esim. laskimonsisäinen, lihaksensisäinen, ihonalainen tai selkäytimensisäinen) on edullinen tietyissä tapauksissa, kuten silloin kun oraalinen antomuoto on sopimaton 15 kyseiselle kohteelle tai tapauksessa, jossa potilas ei kykene erinäisistä syistä sulattamaan lääkettä. Paikallista antomuotoa voidaan myös käyttää kun potilas kärsii ihotaudista, kuten psoriasiksesta, tai kudoksen tai elimen pinnalle, kun lääke soveltuu tähän parhaiten, kuten vas-20 taava lääkäri on määrittänyt.

Näin valmistetut kaavan (I) yhdisteet ovat hyödyllisiä myös sienten aiheuttamien tulehdusten hoidossa. Käyttöä varten mainittujen sienitulehdusten hoitamiseksi . nisäkkäässä, mukaanlukien ihminen, kaavan (I) yhdiste for- • 25 muloidaan farmaseuttiseksi koostumukseksi, joka sisältää .···. sairauden hoitamiseksi vaikuttavan määrän. Riippuen kysei- sen kaavan (I) yhdisteen tehokkuudesta, annetaan n. 0,05 '**[ mg/kg elopainoa/päivä - n. 30 mg/kg elopainoa/päivä yksit- *;;; täisenä tai monina päivittäisinä annoksina hoidettavalle « · ’·* 3 0 nisäkkäälle. Edullisempi alue on 0,05 mg/kg elopainoa/päi vä - n. 20 mg/kg elopainoa/päivä, vaikka tietyissä tapauk-*·**· sissa vastaavan lääkärin harkinnan mukaisesti annoksia tämän alueen ulkopuolelta voidaan tarvita. Edullinen anto-.·. : reitti on tavallisesti oraalinen.- mutta ..ruoansnlatuskana- #·..* 35 van ulkopuolinen antomuoto (esim. laskimonsisäinen, li-« « * · f • « 23 107537 haksensisäinen, ihonalainen tai selkäytimensisäinen) on edullinen erityisissä tapauksissa, kuten tapauksessa, jossa oraalinen antomuoto ei ole tarkoituksenmukainen kyseiselle kohteelle tai jos potilas ei kykene erinäisistä 5 syistä nauttimaan lääkettä. Paikallista antomuotoa voidaan myös käyttää mikäli lääke soveltuu parhaiten levitettäväksi kudoksen tai elimen pinnalle, kuten vastaava lääkäri on määrittänyt.

Tämä keksinnön yhdisteitä annetaan yleensä farma-10 seuttisen koostumuksen muodossa, joka sisältää vähintään yhtä kaavan (I) yhdistettä yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän apuaineen tai laimentimen kanssa. Tällaiset koostumukset formuloidaan tavallisesti tavalliseen tapaan käyttäen kiinteitä tai nestemäisiä apuaineita tai laimen-15 timia tarkoituksenmukaisesti kyseistä antomuotoa varten: oraalista antomuotoa varten tablettien, kovien tai pehmeiden gelatiinikapseleiden, suspensioiden, rakeiden, jauheiden ja vastaavien muodossa; ruoansulatuskanavan ulkopuolista antomuotoa varten injektoitavien liuosten tai sus-20 pensioiden ja vastaavien muodossa; ja paikallista anto-muotoa varten liuosten, salvojen, voiteiden ja vastaavien muodossa.

Tämän keksinnön yhdisteiden käyttö lääkeaineina <\ hylkimisreaktion elinsiirrossa, sienitulehdussairauksien ____: 25 ja autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman tai psori- asiksen hoidossa osoitetaan mainittujen yhdisteiden aktii- • i *'! visuudella seuraavassa kuvatuissa biologisissa pikakokeis- *'" sa. Mainittu biologinen pikakoe mahdollistaa myös vertai- • 4 « ·;*; lun kaavan (I) yhdisteiden aktiivisuuksien ja tunnettujen 4 ( .

V ’ 30 yhdisteiden aktiivisuuksien välillä. Näiden vertailujen tulokset ovat hyödyllisiä määritettäessä annostasoja ni- t säkkäille, mukaanlukien ihminen, hylkimisreaktion elin-·’**; siirrossa ja autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman ja . psoriasiksen hoidossa.

• · · « · « « • · « • · · « • · 24 107537

Ihmisen seka-imusolureaktiota (mixed lymphocyte reaction) (MLR) käytetään ei-spesifisen immuunireaktion selville saamiseksi, joka määritetään 3H-tymidiinin talteenotosta. Tässä pikakokeessa käytetään veren yksitumai-5 siä soluja modifioidussa kaksi-tie MLR:ssä (two-Way MLR). H LA tyyppi D antigeenien erilaisuuden ja täten maksimi-stimuloinnin varmistamiseksi ryhmää jäädytettyjä luovut-tajasoluja käytetään ärsykepopulaationa; vasta eristettyjä soluja käytetään vastepopulaationa.

10 Vastaotetut yksitumaiset solut suspendoidaan RPMI- 1640:aan, joka on rikastettu: 0,5 %:isella MEM ei-vält-tämättömien aminohappojen (lOOx) liuoksella, 1 %:isella L-glutamiinilla (200 mM), 1 %:silla MEM vitamiineilla (lOOx), 1 %:isella penisilliini-streptomysiiniliuoksella 15 (10 000 yksikköä/ml) ja 15 %:isella kuuma-inaktivoidulla ihmisen AB seerumilla (NABI). Solut lasketaan ja pitoisuus säädetään 5 x 105 solua/ml. Liuos siirretään sitten pyö-reäpohjäisille 96 kuopan levyille määrinä 100 μΐ/kuoppa. Nämä levyt sisältävät nyt vastesoluja.

20 Ärsykesolut valmistetaan yhdistämällä yksitumaiset solut, jotka on kerätty monilta eri henkilöiltä. Solut suspendoidaan 90 %:iseen ihmisen AB seerumiin ja 10 %:iseen DMS0:hon, niin että solumäärä on 2 x 107 , solua/ml. Soluja säilytetään nestemäisessä typessä. MLR:ää

t · f I

25 varten elinkelpoiset solut laimennetaan 5 x 105 solua/ml ja .···. 100 μΐ/kuoppa lisätään levyihin, jotka sisältävät vaste- • · soluja. Jokaiseen kuoppaan, joka sisältää vastesolujen ja ***. ärsykesolujen seosta, lisätään 50 μΐ yhdisteliuosta. Tri- ·· · plikaattikuoppia käytetään jokaiselle annokselle. Levyjä • / · * ’ ’ 30 inkuboidaan 37 °C:ssa 5 %:sessa C02 ilmakehässä ja kostutetaan viitenä päivänä. Jokaiseen kuoppaan lisätään 1 pCi * 3H-tymidiiniä ja inkubointia jatketaan 18 lisätuntia. Solut t t 1 'kerätään käyttäen LKB Beta levyjärjestelmää.

; Ärsykekontrollin prosentuaalinen inhibitio saadaan • ·« '"·[ 35 käyttäen seuraavaa yhtälöä: • 1 • · ♦ » ·« «Il · • · 25 107537 % inhibitio = Γ100-(keskitti, cpm lääkettä)xlOOl keskim. cpm ärsyke-kontrollia

Lyhenne cpm on määritetty lukema/min. RPMI-1640 on 5 kudosviljelyväliaine, jota saadaan Sigmasta.

Aktiivisuus edellä kuvatussa MLR pikakokeessa kuvaa aktiivisen yhdisteen käyttökelpoisuutta hylkimisreaktion ja autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman ja psoriasiksen hoidossa.

10 Tämän keksinnön makrolidien antimikrobiset aktiivi suudet eri sieniä vastaan määritetään agar sarjalaimennus-menetelmällä Sabouraud agarissa. Minimi-inhibitiopitoisuu-det (MIC) saadaan 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 30 °C:ssa.

Tätä keksintöä kuvaavat seuraavat esimerkit. Kui-15 tenkin tulisi ymmärtää, että keksintö ei rajoitu näiden esimerkkien spesifisiin yksityiskohtiin. Kaikki reaktiot toteutetaan inertissä ilmakehässä, kuten argonin ilmakehässä, jollei toisin mainita. Lyhennykset THF, DMSO, DAST, DMAP ja Ac, missä käytetään, viittaavat tetrahydrofuraa-20 niin, dimetyylisulfoksidiin, dimetyyliaminorikkitrifluori-diin, 4-dimetyyliaminopyridiiniin ja asetyyliin, vastaavasti. Sokerihalogenidit hankittiin luotettavalta myyjältä, kuten Sigmalta tai Aldrichilta, kuten myös sokerit, mikäli muuta ei ole spesifisesti ilmoitettu. Käytettiin 25 vedettömiä liuottimia, joista vedetön määritetään niin,

• I

’·' ' että se on pääosin vapaa vedestä.

***** Ilmaisu "reaktioinertti liuotin" edellä käytettynä • · · viittaa mihin tahansa liuottimeen, joka ei reagoi lähtöai-neiden, reagenssien, välituotteiden tai tuotteiden kanssa 30 siten, että halutun tuotteen saanto heikkenee.

• ·« ♦ .’i\ Valmistusmenetelmissä 1 ja 2 esiintyviä termejä tai lyhenteitä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavassa.

____. PYEA agar valmistetaan liuottamalla Difco maltoosia (10 g), Difco hiivauutetta (4 g), dekstroosia (4 g), Difco '1' 35 agaria (15 g) ja tuoretta kookosmaxtoa (50 ml) tarpeeksi

deionisoituun veteen antamaan 1 1 liuosta; ja liuoksen pH

;’1‘: säädetään arvoon 7,3 IN NaOH:lla.

» I · » • 1 26 107537 ATCC 172 elatusneste valmistetaan liuottamalla glukoosia (10 g), liukoista tärkkelystä (20 g), hiivauutetta (5 g) , NZ-amiinia A (Difco, 5 g) ja kalsiumkarbonaattia (1 g) tarpeeksi deionisoituun veteen antamaan 1 1 liuosta; 5 ja liuoksen pH säädetään arvoon 7,0 IN KOH:lla.

JDYTT väliaine valmistetaan liuottamalla sereloosia (10 g) , maissitärkkelystä (5 g) , maissin liotusnestettä (5 g), NZ-amiini YTT:tä (5 g), kobolttikloridia (0,002 g) ja kalsiumkarbonaattia (3 g) tarpeeksi deionisoituun ve-10 teen yhden litran liuokseksi; ja liuoksen pH säädetään arvoon 7,2 IN NaOH:lla.

NZ-amiini A ja NA-amiini YTT ovat saatavissa Dif-costa, kuten useimmat edellä olevista aineosista.

Edeltävässä MLR kokeessa RPMI-1640 on standardi 15 elatusneste MLR tutkimuksissa; MEM on määritetty "minimi elatusneste" (minimum essential media) ja NABI on toimittaja.

Esimerkki 1 17-etyyli-l, 14-dihydroksi-12- [2 ' - (4 1 ' - (2 ' 1 1 -deoksi-20 2' ' '-trifluoriasetamido-3''1,4''',6'''-tri-O-ase- tyyli-fi-D-glukopyranosyylioksi)-3''-metoksisyklo-heksyyli)-1'-metyylivinyyli]-23,25-dimetoksi- 13,19,21,27-tetrametyyli-ll,28-dioksa-4-atsatrisyk-lo [22.3.1. O4,9] oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni ; :25 Sekoituksenalaiseen lietteeseen, jossa oli valmis- *:··; tusmenetelmän 1 otsikkoyhdistettä (2,4 8 g), valmistusmen- etelmän 3 otsikkoyhdistettä (2,9 g) ja 4 Ä molekyyliseulo- • · « ja (murskattuja, 5,0 g) metyleenikloridissa (vedetön, ir 150 ml), -78 °C:ssa, lisättiin hopeakarbonaattia (5,15 g), 30 mitä seurasi hopeatriflaatti (0,83 g). Reaktioseoksen an- • ♦ I» * nettiin lämmetä huoneenlämpötilaan kahdeksan tunnin aikana ja sitten sitä sekoitettiin viisi lisätuntia. Saatu nahan- ‘ ’ ruskea liete suodatettiin CelitenR läpi ja suodos haihdu- '...· tettiin tyhjössä. Jäännös puhdistettiin silikageelillä .1.: 35 eluoiden heksaani/etyyliasetaatilla (2/l) antamaan tuote .···! (0,93 g, 85 %) .

· 27 107537 13C NMR (300 MHz, CDC13) (päärotameeri): δ 213,36, 197,1, 192,82, 170,94, 170,77, 169,44, 169,03, 164,92 ja 138,85. Massaspektri (FAB): 1197,2 (molekyyli-ioni + Na+). Esimerkit 2 ja 3 5 Käyttäen pääosin samaa esimerkissä 1 kuvattua mene telmää, mutta korvaamalla valmistusmenetelmään 3 otsikko-yhdiste yhdellä mooliekvivalentilla tarkoituksenmukaista sokerihalidia, valmistettiin seuraavat yhdisteet.

2. 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2'-(41*-(2'*'-de- 10 oksi-2''·-asetamido-3" ', 41 " , 6 " 1-tri-O-asetyyli- β-D-glukopyranosyylioksi ) -3 ' ’ -metoksisyklohek-syyli) -1' -metyylivinyyli] -23,25-dimetoksi-13,19,- 21,27-tetrametyyli-ll,28-dioksa-4-atsatrisyklo-[22.3.1.04'9] oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni 15 13C NMR (500 MHz, CD3COCD3) (päärotameeri): δ 211,94, 197,93, 170,75, 170,478, 170,21, 170,013, 169,80, 166,1, 138,88, 132,80 ja 132,21. Massaspektri (FAB): 1143,5 (molekyyli-ioni + Na*).

3. 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2'-(4’'-(2’·’-de- 20 oksi-2 ' ’ ' -atsido-3 ",,4,",6"· -tri-O-asetyyli-B- D-galaktopyranosyylioksi) -3 " -metoksisykloheksyy-li) -1' -metyylivinyyli]-23,25-dimetoksi-13,19,21,27-tetrametyyli-ll ,28-dioksa-4-atsatrisyklo[22.3.1.- 04,9]oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni :25 Massaspektri (FAB): 1127 (molekyyli-ioni + Na).

·;··: Esimerkki 4 17-etyyli-l, 14-dihydroksi-12-[2 '-(4 ' '-(2' ’ '-deoksi-. 2 " ’ -asetamido-3 " ' , 4 " 1,6 " 1 -tri-O-asetyyli-B-D- j. galaktopyranosyylioksi)-3f’-metoksisykloheksyyli)- 30 1'-metyylivinyyli]-23,25-dimetoksi-13,19,21,27-tet rametyyli-ll, 28-dioksa-4-atsatrisyklo [ 22.3.1.04'9] -oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni Esimerkin 3 otsikkoyhdiste (1 g) ja 5 %:ista palla-dium./hiiltä (100 mg) .laimennettiin etikkahapoll.a (JO ml) : 35 ja reaktioseosta hydrattiin 50 psirssä vedyn paineessa • · 28 107537 huoneenlämpötilassa 16 tuntia. Reaktioseosta käsiteltiin 2 ml :11a etikkahappoanhydridiä ja sekoitettiin viisi minuuttia. Reaktioseos suodatettiin Celiten ja hiilen läpi, väkevöitiin tyhjössä ja kromatografoitiin silikageelillä 5 [eluoiden ensin etyyliasetaatti/heksaanilla (1/1) ja sitten etyyliasetaatti/heksaanilla (2/1)] antamaan tämän esimerkin otsikkoyhdistettä.

Massaspektri (FAB) : 1143,3 (molekyyli-ioni + Na+) . Esimerkki 5 10 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2'-(41'-(2'''-deoksi- 21 ' '-asetamido-31 1 ' , 4''',6' ''-tri-O-asetyyli-fi-D-glukopyranosyylioksi)-3''-metoksisykloheksyyli)-1'-metyylivinyyli]-23,25-dimetoksi-13,19,21,27-tetra-metyyli-11,28-dioksa-4-atsatrisyklo [22.3.1.04,9] ok-15 takos-18-eeni-3,10,16-trioni

Esimerkin 2 otsikkoyhdistettä (1,0 g) liuotettiin DMF:ään (15 ml) ja pyridiiniin (15 ml) ja rikkivetykaasua (H2S) kuplitettiin reaktioseokseen yön yli huoneenlämpötilassa. Ylimäärää H2S estettiin poistumasta ilmakehään Chlo-20 rox lukon avulla. 16 tunnin kuluttua reaktioseos laimennettiin tolueenilla (50 ml) ja pestiin suolaliuoksella (50 ml). Liuotin kuivattiin MgS04:lla ja liuotin poistettiin tyhjössä. Jäännöksen annettiin kulkea silikageelikerroksen läpi ja eluoitiin etyyliasetaatti/heksaanilla (2/1) anta- .::25 maan 490 mg (50 %) tämän esimerkin otsikkoyhdistettä.

·:··: 13C NMR (300 MHz, CD2C12) (päärotameeri) : δ 215,14, 174,08, 171,74, 170,48, 170,39, 169,93, 169,36, 169,137, ... 140,76, 132,04, 128,45 ja 122,23. Massaspektri (FAB): 1129,7 (molekyyli-ioni + Na+) .

·< »· • *. · • · · • · r 29 107537

Esimerkki 6 17-etyyli-l, 14-dihydroksi-12-[21 - (4' '-(2' ’ '-deoksi-2’''-trifluoriasetamido-8-D-glukopyranosyylioksi)-3' »-metoksisykloheksyyli) -1 ’ - metyyli vinyyli ] -23,25-5 dimetoksi-13,19,21,27-tetrametyyli-ll,28-dioksa- 4 atsatrisyklo [22.3.1.04'9] oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni

Esimerkin 1 otsikkoyhdistettä (1,0 g) liuotettiin 10 metanoliin (100 ml) ja käsiteltiin natriummetoksidilla (20 mg). Reaktioseosta sekoitettiin 0 °C:ssa kahdeksan tuntia ja käsiteltiin sitten yhdellä tipalla etikkahappoa kertakäyttöpipetistä. Liuotin poistettiin tyhjössä ja jäännös puhdistettiin silikageelillä eluoiden THF:llä an-15 tamaan 610 mg vaahtoa (66 %).

Esimerkit 7 ja 8 Käyttäen pääosin samaa menetelmää kuin esimerkissä 6, mutta korvaamalla esimerkin 1 tuote yhdellä mooliekvi-valentilla tuotetta esimerkeistä 2-5, valmistettiin seu-20 raavat yhdisteet.

7. 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2·-(4’’-(2” ’-de-oksi-2’1’-asetamido-8-D-glukopyranosyylioksi)-3''-metoksisykloheksyyli)-1'-metyy1ivinyy1i]-23,25-di-metoksi-13,19,21,27-tetrametyyli-ll,28-dioksa-4-, '25 atsatrisyklo[22.3.1.04'9]oktakos-18-eeni-2,3,10,16- *:2: tetraoni :1··· 13C NMR (300 MHz, CD3OD) (päärotameeri): δ 212,02, ··» ... 196,8, 172,26, 169,29 ja 166,08. Massaspektri (FAB): 1017,6 (molekyyli-ioni + Na+).

• · · • · · _ « ♦ · · · 2 • ♦ 30 107537 8. 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2’ - (4 1'-(2'''-de-oksi-2*11-asetamido-B-D-glukopyranosyylioksi)-31*-metoksisykloheksyyli)-1'-metyylivinyyli]-23,25-di-metoksi-13,19,21,27-tetrametyyli-ll,28-dioksa-4-5 atsatrisyklo[22.3.1.04*9] oktakos-18-eeni-3,10,16- trioni 13C NMR (300 MHz, CD2C12) (päärotameeri): 6 215,0, 174,1, 172,6, 169,5, 141,1.

Valmistusmenetelmä 1 10 17-etyyli-l, 14-dihydroksi-12-[2 ' -(41 ’ -hydroksi-3» *- metoksisykloheksyyli)-1'-metyylivinyyli]-23,25-di-metoksi-13,19,21,27-tetrametyyli-ll,28-dioksa-4-atsatrisyklo [22.3.1.04'9] oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni 15 Streptomyces hygroscopicus alalaji ascomyceticus

viljelmä ATCC 14891 toteutettiin PYEA agarlevyillä (10 g/1 Difco maltoosia, 4 g/1 Difco hiivauutetta, 4 g/1 dekstroo-sia, 15 g/1 Difco agaria ja 50 ml tuoretta kookosmaitoa, joka laimennettiin 1 l:ksi deionisoidulla vedellä, sitten 20 pH säädettiin arvoon 7,3 IN Na0H:lla). Valmistetta inku-boitiin 10 - 12 päivää 28 °C:ssa ja itiöt siirrettiin ste-riileihin 1x6 putkiin, jotka sisälsivät 10 ml ATCC 172 elatusnestettä (10 g/1 glukoosia, 20 g/1 liukoista tärkkelystä, 5 g/1 hiivauutetta, 5 g/1 NZ-amiinia A ja 1 g/1 . '25 kalsiumkarbonaattia. pH säädettiin arvoon 7,01 1 N

·:··: K0H:lla). Putkia inkuboitiin 28 °C:ssa ja ravisteltiin .***. rotaravistimessa n. 150 - 200 sykliä/minuutti. 4-5 päi-

Ml .. vän kuluttua liuos laimennettiin 40 %:seksi glyserolilla ja ATCC 172 elatusnesteellä ja siirrettiin sitten asepti- *!.* 30 sesti kryoputkiin. Jokainen putki panostettiin 1/2 ml:11a • · • · ( ' liuosta. Putket jäädytettiin -80 °C:seen varastoinnin ajaksi.

Näitä hyvin kylmiä putkia varastosta käytettiin siemenymppäykseen ymppäyspulloja varten, yksi putki/50 ml 35 JDYTT elatusnestettä 300 ml:n pullossa. JDYTT elatusnes- • 4 • · · • 4 • · • · · 31 107537 tekoostumus sisälsi 10 g/1 sereloosia, 5 g/1 NZ-amiini YTT, 0,002 g/1 kobolttikloridia ja 3 g/1 kalsiumkarbonaat-tia. JDYTT elatusnesteliuoksen pH säädettiin arvoon 7,2 1 N NaOH:lla. Pulloja ravisteltiin ja inkuboitiin rota-5 ravistimessa n. 150 - 200 sykliä/minuutti 28 °C:ssa.

2 ml 3 - 5 päivää sekoitetusta ymppäyspullosta käytettiin ymppäykseen toista ymppäyspulloa varten, jossa oli 80 ml JDYTT elatusnestettä 3 l:n fermentaatioastiassa. Fermentaatio elatusneste sisälsi 45 g/1 maissitärkkelystä, 10 10 g/1 maissin liotusnestettä, 10 g/1 meripihkaa tai Baker

kuivahiivaa, 3 g/1 kalsiumkarbonaattia ja 0,005 g/1 kobolttikloridia. pH säädettiin n. 6,4 - 6,8:aan 1 N

NaOH:lla. 1 ml vaahdonestoainetta P-2000 lisättiin fermen-taatioastiaan yhdessä 100 ml:n kanssa soijapapuöljyä. pH 15 säädettiin arvoon 6,4 - 6,8 1 N NaOH:lla ja ainetta sekoitettiin 1700 kierrosta minuutissa. Lämpötila pidettiin 28 °C:ssa ja steriilin ilman annettiin kuplia elatusnes-teeseen nopeudella yksi tilavuus/tilavuus/minuutti.

Ymppäyksen jälkeen steriiliä soijapapuöljyä käytet-20 tiin vaahtoamisen kontrolloimiseksi. Pitemmissä fermentaa- tioissa ja riippuen käytetystä elatusnesteestä sokeripitoisuutta voidaan seurata ja lisätä sokeria 40, 60 ja 90 tunnin kuluttua alenevan sokeritason ylläpitämiseksi 0,05 %:n yläpuolella. Fermentaatio kesti 46 tuntia.

.::25 Käyttäen standardi ohutkerroskromatografia- ja HPLC

·;··· menetelmiä fermentaatioliuos tutkittiin ja laskettiin suh- .1·1. teellinen tehokkuus.

« · ·

Tuotetta havaittiin pääosin rihmastossa, mutta koko liuoksen työstö on edullista. Täydellisen fermentaation **!. 30 jälkeen koko liuos uutettiin kahdesti kolmasosalla - puo-• · « lella liuoksen tilavuudesta metyyli-isobutyyliketonia (MIBK). Kerrokset erotettiin DeLaval erottimella tai Pod- bielnack uuttolaitteessa. Liuotinkerros kirkastettiin ja \ / väkevöitiin ensin tyhjössä ja .sitten .rotavaporissa.. Kon- .·. : 35 sentraatti altistettiin neljän putken vastavirtajakaantu- • · • · · > · «449« « « 32 107537 miselle 20 litran pulloissa käyttäen heptaani/asetonitrii-li-järjestelmää (10:1) 10 litran pintakerroksena ja yhden litran pohjakerroksena/pullo.. Aktiiviset pohjakerrokset kerättiin, yhdistettiin ja väkevöitiin. Ainetta puhdistet-5 tiin edelleen suodattamalla Florisiilin läpi (pestiin hek-saanilla, heksaani/metyleenikloridilla ja metyleeniklori-dilla peräkkäisesti, nostaen asteittain metyleenikloridin määrää). Suurin osa aktiivisuudesta havaittiin metyleeni-kloridijakeissa. Nämä yhdistettiin ja väkevöitiin. Toinen 10 suodatusvaihe toteutettiin, tällä kertaaa silikageelin läpi (pesten heptaanilla, metyleenikloridilla, metyleeni-kloridi/etyyliasetaatilla ja etyyliasetaatilla). Aktiivisuus oli pääosin jakeissa, jotka sisälsivät metyleeni-kloridi/etyyliasetaattiseosta ja jakeissa, jotka sisälsi-15 vät pelkästään etyyliasetaattia. Nämä yhdistettiin ja väkevöitiin, liuotettiin uudestaan metyleenikloridiin ja käsiteltiin DARC0 G60:llä. Näyte jaettiin sitten 12 - 15 g:n annoksiksi ja kukin näyte kromatografoitiin edelleen Prep 500 nestekromatografisesti käyttäen silikageelipyl-20 väitä ja eluoiden käyttäen lineaarista pitoisuusgradient-tia aloittaen 100 %:isesta metyleenikloridista ja päätyen 100 %:iseen etyyliasetaattiin. Aktiiviset jakeet yhdistettiin, väkevöitiin ja kromatografoitiin Prep 500:ssa käyttäen käänteisfaasi( 18C)silikageeliä ja eluoiden lineaari-. ; ;25 sella pitoisuusgradientilla aloittaen asetonilla ja pää- .·..: tyen 100 %:iin vettä. Puhdas tuote saatiin viimeisenä ai- .···. neosana, joka eristettiin pylväästä.

• · ♦

Aktiiviset jakeet edeltävässä fermentaatiomenetel- mässä määritettiin käyttäen seuraavaa biologista koetta.

*?!.’ 30 12,5 mm:n kiekko pantiin suoraan agarin pinnalle.

• · ** Candida albicans ATCC 14053, Saccharomyces pastorianus FD3737 ja Byssochlamys fuivan FM 10,300(S) ja FM 10,464(R) herkkää kantaa käytettiin. Candida ja Saccharomyces levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa 18 tuntia, sitten levyjen -aktiivi- .·. : 35 suus tutkittiin. Byssochlamys levyjä inkuboitiin 28 °C:ssa « · « • ♦ « i > « • « 33 107537 ja tutkittiin 18 tunnin kuluttua. Levyt, jotka sisälsivät ainoastaan FK506 ja FK520 (CP-105051), olivat aktiivisia Byssochlamys kantaa vastaan. Epäpuhtaat jakeet (jotka sisälsivät nigerisiiniä) olivat aktiivisia myös muita kanto-5 ja vastaan.

HPLC menetelmää käytettiin myös jakeiden puhtauden määrittämiseksi. Kyseisessä menetelmässä käytettiin Dupont Zorbax CN pylvästä (4,6 mm x 25 cm) ja isokraattista liuo-tinjärjestelmää, jossa oli 55/45 vesi/asetonitriiliä ja 10 virtausnopeus oli 1 ml/min. Havainnot tehtiin 214 nm:ssä. Liuosnäyte (20 ml) sekoitettiin MIBK:n kanssa (20 ml) ja ravisteltiin n. 4 - 5 minuuttia. Kerrokset erotettiin ja liuotin väkevöitiin lähes kuiviin. Jäännös otettiin talteen 1 ml:aan puhdasta asetonitriiliä ja 5 μ1:η näyte in-15 jektoitiin HPLC:hen. FK520:n retentioaika oli n. 12,7 minuuttia näissä olosuhteissa.

Valmistusmenetelmä 2 17-allyyli-l,14-dihydroksi-12-[2'-(4'’-hydroksi-3' 1 -metoksisykloheksyyli ) -11 -metyylivinyyli] -23,25-20 dimetoksi-13,19,21,27-tetrametyyli-ll,28-dioksa-4- atsatrisyklo [22.3.1.04*9] oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni

Streptomycestsukubaensis nro 9993 FERM BP-927 aikaansaatiin PYEA agarlevyillä (10 g/1 Difco maltoosia, . :’>25 4 g/1 Difco hiivauutetta, 4 g/1 dekstroosia, 15 g/1 Difco • · . · agaria ja 50 ml tuoretta kookosmaitoa, joka laimennettiin .···. 1 l:ksi deionisoidulla vedellä, sitten pH säädettiin ar- « ,voon 7,3 1 N NaOHrlla). Valmistetta inkuboitiin 10 - 12 I päivää 28 °C:ssa ja itiöt siirrettiin steriileihin 1x6 *ΓI. 30 putkiin, jotka sisälsivät 10 ml ATCC 172 elatusnestettä • · · '·* 1 (10 g/1 glukoosia, 20 g/1 liukoista tärkkelystä, 5 g/1 hiivauutetta, 5 g/1 NZ-amiinia A ja 1 g/1 kalsiumkarbo-naattia. pH säädettiin arvoon 7,01 1 N KOHrlla). Putkia inkuboitiin 28 °.C;ssa ja ravisteltiin rotaravistiraessa n. .·. : 35 150 - 200 sykliä/minuutti. 4-5 päivän kuluttua liuos • aa • a • · • · · « • < · ·» 34 107537 laimennettiin 40 %:seksi glyserolilla ja ATCC 172 elatus-nesteellä ja siirrettiin sitten aseptisesti kryoputkiin. Jokainen putki panostettiin 1/2 ml:11a liuosta. Putket jäädytettiin -80 °C:seen varastoinnin ajaksi.

5 Näitä hyvin kylmiä putkia varastosta käytettiin siemenymppäykseen ymppäyspulloja varten, yksi putki/50 ml steriiliä JDYTT elatusnestettä 300 ml:n pullossa. JDYTT elatusnestekoostumus sisälsi 10 g/1 sereloosia, 5 g/1 NZ-amiini YTT, 0,002 g/1 kobolttikloridia ja 3 g/1 kallo siumkarbonaattia. JDYTT elatusnesteliuoksen pH säädettiin arvoon 7,2 IN Na0H:lla. Pulloja ravisteltiin ja inkuboi-tiin rotaravistimessa n. 150 - 200 sykliä/minuutti 28 °C:ssa.

2 ml 3 - 5 päivää sekoitetusta ymppäyspullosta käy-15 tettiin ymppäykseen toista ymppäyspulloa varten, jossa oli 80 ml JDYTT elatusnestettä 3 l:n fermentaatioastiassa. Fermentaatio elatusneste sisälsi 45 g/1 maissitärkkelystä, 10 g/1 maissin liotusnestettä, 10 g/1 meripihkaa tai Baker kuivahiivaa, 3 g/1 kalsiumkarbonaattia ja 0,005 g/1 ko-20 bolttikloridia. pH säädettiin n. 6,4 - 6,8:aan 1 N NaOH:lla. 1 ml vaahdonestoainetta P-2000 lisättiin fermen-taatioastiaan yhdessä 100 ml:n kanssa soijapapuöljyä. pH säädettiin arvoon 6,4 - 6,8 1 N Na0H:lla ja ainetta sekoitettiin 1700 kierrosta minuutissa. Lämpötila pidettiin ,·' 25 28 °C:ssa ja steriilin ilman annettiin kuplia elatusnes- ....: teeseen nopeudella yksi tilavuus/tilavuus/minuutti.

,·♦< Ymppäyksen jälkeen steriiliä soijapapuöljyä käytet- • · tiin vaahtoamisen kontrolloimiseksi. Pitemmissä fermen- • · » ; taatioissa ja riippuen käytetystä elatusnesteestä sokeri- 30 pitoisuutta voidaan seurata ja lisätä sokeria 40, 60 ja 90 ♦ · · *·' ' tunnin kuluttua alenevan sokeritason ylläpitämiseksi 0,05 %:n yläpuolella. Fermentaatio kesti 46 tuntia.

Käyttäen ohutkerroskromatografian ja HPLC:n stan-dardimenetelmiä iermentaatioliuosta tutkittiin ja suhteel- t ,·. ; 35 linen tehokkuus laskettiin.

» « • · · « « * » « • i i · • · 35 107537

Fermentaattori pysäytettiin ja uutettiin kahdesti puolella liuoksen tilavuudesta metyyli-isobutyyliketonia (MIBK). Liuotinkerros erotettiin imulla ja väkevöimällä tyhjössä viskoosiseksi öljyksi. Öljy trituroitiin heksaa-5 nilla, dietyylieetterillä ja metyleenikloridilla ja aktiiviset jakeet (dietyylieetterijakeet) kromatografoitiin Florisililla. Florisil eluoitiin peräkkäisesti dietyylieetterillä, metyleenikloridilla, etyyliasetaatilla ja asetonilla. Eluaatti väkevöitiin ja käsiteltiin aktiivihii-10 lellä. Konsentraatti suodatettiin ja liuotettiin etyyliasetaattiin. Heksaania lisättiin tuotteen kiteyttämiseksi.

Liemen ja myöhempien talteenotettujen virtausten bioaktiivisuutta seurattiin käyttäen Byssochlamys fulvan kantaa. Aineosat ja talteenotettujen virtausten aineosat 15 visualisoitiin kromatografisesti Analtech silikageeli GF

(tavaramerkki) levyillä käyttäen puhdasta etyyliasetaattia eluenttina. Kehitetyt levyt suihkutettiin vanilliinirea-genssilla (3 g vanilliinia 75 ml:ssa etanolia ja 25 ml:ssa 85 %:ista fosforihappoa) ja kuumennettiin 80 eC:seen. Tuo-20 te ilmeni lilanvärisinä täplinä.

Valmistusmenetelmä 3 3,4,6-tri-0-asetyyli-2-deoksi-2-trif luoriasetamido- a-D-glukosyylibromidi

Valmistettu Wolfrom et ai:in menetelmän mukaisesti ' 25 julkaisusta Journal of Organic Chemistry, 32, 1821-23 (1967).

• t ,···. Valmistusmenetelmä 4 • v 2-atsido-3,4,6-tri-0-asetyyli-2-deoksi-a-D-galakto- ‘ '1 syylikloridi ··· 30 Valmistettu Lemieux et ai:in menetelmän mukaisesti ·1 • · « *·' julkaisusta Canadian Journal of Chemistry, 57, 1244-51 (1979).

• i « 4 4 <

• I

• « • · · · · « ♦ « / · « • >

Claims (20)

107537

1. Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava 5 r1°n/N H3C0'^v/S |-H3 io <cf*a>n—I lf° R2|| r3 di Λ* 0 JL °ί|'5θΗ h=cA<o <_ 15 kA J~CHl h3co och3 jossa 20. on 1 tai 2; A ja B ovat erikseen ja A on H ja B on H tai -OH, tai A ja B ovat yhdessä =0; R1 on ryhmä, jolla on kaava II

25 R5 . n& I o4 , .... k di) s:? rYy° 30 r8 ·? •«· R2 on -OH; R3 on (Ci-Q,) alkyyli tai allyyli; R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -ro2p9. -C02H, ...:35 -CH2OH, H, -CH3, - CONH2, - CONHR9, -CONR29, -CH2OCOR9, 107537 -CH20C02R9, -CH2OCONHR9, -CH2OCONR29 tai -CH2OR9; R5 ja R6 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti - alkoksi, bentsyylioksi, -OH, -OCOR9, -0C02R9 tai -OSiR310; R7 ja R8 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti H, 5 (C1-C4)alkyyli, -COCH2R9, -COR9, -C02R9 tai -S02R9; R9 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C^-Cg) alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, -CF3, pyridyyli, tienyyli, tienyylimetyleeni, furanyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai 10 (Cl-CJ alkoksiryhmillä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C-l-C^) -alkoksiryhmillä; ja R10 on kussakin tapauksessa riippumattomasti alkyyli, fenyyli tai bentsyyli; 15 ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava Ia Rl°'v^

20 Jl JL ru H3CcV^V| I 3 «ch2>wη T I f Vy° R2f^R3 ,Ia) 25 °i:S'00H CH3 ..... T | )— ch3 V VV h3co och3 '·* 30 « · · ···* jossa n on 1 tai 2; • · · -7 # • · · *·* * R1 on ryhmä, jolla on kaava II; R2 on -OH; * R3 on (Ci-C4) alkyyli tai allyyli; R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R9, -C02H, • » • · · • * * · • « »·· • · · · 107537 H, -ch3, -conh2, -conhr9, -conr29, -ch2ocor9, -ch2oco2r9, -ch2- OCONHR9, -CH2OCONR29 tai -CH2OR9; R5 ja R6 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti (C^-CJ alkoksi, bentsyylioksi, -OCOR9, -0C02R9 tai -OSiR310;

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa n on 2; A ja B ovat yhdessä =0; ja R2 on H.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, t u n-5 n e t t u siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R3 on metyyli, etyyli tai allyyli.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R3 on etyyli.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R1 on R4 R5 R4 tai j N N / \ p / \ 8

20 R7 R8 R7 R8

5 R3 on (Ci-Cj alkyyli tai allyyli; R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R9, -C02H, -ch2oh, h, -ch3, -conh2, -conhr9, -conr29, -ch2oco2r9, -ch2o- CONHR9, -CH2OCONR29 tai -CH2OR9; R5 ja R6 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti (C^CJ -10 alkoksi, bentsyylioksi, -OH, -0C02R9 tai -OSiR310; R7 ja R8 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti H, (C^CJ alkyyli, -COCH2R9, -COR9, -C02R9 tai -S02R9; R9 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (Ci-Cg) alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, -CF3, pyridyyli, tienyyli, 15 tienyylimetyleeni, furanyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (Ci-Cj alkoksiryhmillä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C-l-OJ -alkoksiryhmillä; ja

20 R10 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C^-C,,) alkyyli, fenyyli tai bentsyyli; saatetaan yhdiste, jolla on kaava Ia jossa n on 1 tai 2; R1 on ryhmä, jolla on kaava II;

25 R2 on -OH; # R3 on (Cx-C4) alkyyli tai allyyli; R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R9, -C02H, « · H, -ch3, -conh2, -conhr9, -conr29, -ch2ocor9, -ch2oco2r9, -CH20C0NHR9, -CH20C0NR29 tai -CH2OR9; '*** 30 R5 ja R6 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti « · · ···* (C^Q,) alkoksi, bentsyylioksi, -OCOR9, -0C02R9 tai -OSiR310; ♦ ♦ · *.* ’ R7 ja R ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti H, (Ci-Cg) alkyyli, -COCH2R9, -COR9, -C02R9 tai -S02R9; R9 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C.-C)alkyyli, 35 (C3-C6)sykloalkyyli, allyyli, -CF3, pyridyyli, tienyyli, • · · • · • · • · · » · · · 107537 tienyylimetyleeni, furanyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (Ci-Ct)alkoksiryhmillä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai {C^C^) -5 alkoksiryhmillä; ja R10 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C-l-C4) alkyyli, fenyyli tai bentsyyli; reagoimaan katalyyttisen määrän kanssa alkoksi-diemästä alkoholiliuottimessa 0 °C:ssa, 10 c) yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava I, jossa R4 on -CH2OCOR9 tai CH20C02R9, R5 ja R6 ovat kumpikin OCOR9 tai -0C020R9, R7 on H ja R8 on -COR9 tai -C02R9, saatetaan yhdiste, jolla on kaava lila, reagoimaan atsidoyhdisteen kanssa, jolla on kaava VII 15 R5 20 Νίγ° Cl (VII) 25 ja näin saatu yhdiste hydrataan ja asyloidaan in situ, tai d) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, • · « « joissa A ja B ovat erikseen ja A on H ja B on H tai -OH, • · vastaava kaavan I mukainen yhdiste, jossa A ja B ovat yhdessä =0, pelkistetään käyttäen standardiolosuhteita alfa-'**' 30 ketoamidien pelkistykselle, ja c · · ···· haluttaessa saatu kaavan I mukainen yhdiste otetaan • · · • · · V * talteen farmaseuttisesti hyväksyttävänä suolana. * * « • · • « « • «« t « φ • · • · i»»· « · 107537

5 R7 ja R8 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti H, (Ci-C^alkyyli, -COCH2R9, -COR9, -C02R9 tai -S02R9; R9 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C^-Cg)alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, -CF3/ pyridyyli, tienyyli, tienyylimetyleeni, furanyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka 10 on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C-l-CJ alkoksiryhmillä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (03-04) alkoksiryhmillä; ja R10 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (03-04) alkyyli, 15 fenyyli tai bentsyyli; saatetaan yhdiste, jolla on kaava lila

20 H3C0"Xv^S ChJL A IJr3 rJ^OO JL „ Loh / lh3 H3Cy^Cq / · M H H3C0 0CH3 ·*·; 3 0 • ·« ··;; jossa R3 on (03-03) alkyyli ja n on 1 tai 2, reagoimaan 2 -4 • · · *·* * mooliekvivalentin kanssa yhdistettä, jolla on kaava V • · · « « · « « 4 4 4 ♦ 4 4 4 4 4 « 4 4 4 4 4 4 4 107537 R5 »yO1' tv» Tr ϋ· χ jossa X on halogeeni; R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R9, -C02H,

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R4 on -CH2OH tai -CH2OCOCH3; R5 ja R6 ovat kum- 25 pikin riippumattomasti -OH tai -OCOCH3; R7 on H ja R8 on H, .·. -COCH, tai -COCFj. • · · ·

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, t u n- • · n e t t u siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yh-diste, jossa R1 on 30 r4 * 35 n 4 \8 Rv R8 107537

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R4 on -CH2OCOCH3/ R5 ja R6 ovat kumpikin -OCOCH3, R7 on H ja R8 on -COCH3.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R4 on -CH2OCOCH3, R5 ja R6 ovat kumpikin -OCOCH3, R7 on H ja R8 on -COCF3.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R4 on -CH2OH, R5 ja R6 ovat kumpikin -OH, R7 on H ja R8 on -C0CH3.

10 H, -ch3, -conh2, -conhr9, -con29, -ch2ocor9, -ch2oco2r9, -ch2o-CONHR9, -CH2OCONR29 tai -CH2OR9; R5 ja R6 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti (Cl-C2) -alkoksi, bentsyylioksi, -OCOR9, -0C02R9 tai -OSiR310; R7 ja R8 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti H, 15 (C1-C4)alkyyli, -COCH2R9, -COR9, -C02R9 tai -S02R9; R9 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C^-Cg)alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, -CF3/ pyridyyli, tienyyli, tienyylimetyleeni, furanyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai 20 (C3 —C4) alkoksiryhmillä/ fenyyli tai fenyyli, joka on sub stituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C-l-C^) -alkoksiryhmillä; ja R10 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C-l-CJ alkyyli, fenyyli tai bentsyyli, 25 kuivausaineen läsnäollessa valittuna ryhmästä molekyy- .:’1 liseulat, kalsiumsulfaatti, magnesiumsulfaatti; emäksen • · · I läsnäollessa valittuna ryhmästä elohopeakarbonaatti, ho-peakarbonaatti, elohopeanitraatti ja hopeanitraatti; • · ja katalyytin läsnäollessa valittuna ryhmästä hopeatri- * 2’ 30 flaatti, hopeaperkloraatti, hopeatetrafluoriboraatti, elo-• ' · ·*** hopeatrif laatti, elohopeaperkloraatti ja elohopeatetra- • · 1 *·’ ‘ f luoriboraatti, reaktioinertissä liuottimessa n. -78 - n. -70 °C:ssa lämmittäen n. 0 °C:seen n. 0,5 - 24 tunnik-si ja tämän jälkeen sekoittaen huoneenlämpötilassa n. 0,5 :35 - 24 tuntia, • ♦ « • · · · 2 • ·« 107537 b) yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava Ia jossa n on 1 tai 2; R1 on ryhmä, jolla on kaava II; R2 on -OH;

11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen 15 yhdiste, jossa R4 on -CH2OH, R5 ja R6 ovat kumpikin -OH, R7 on H ja R8 on -COCF3.

12. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R1 on 20 R5 R4 a 25 n / V

• · **; 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, • · « ···· 30 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen ...! yhdiste, jossa R4 on -CH2OCOCH3, R5 ja R6 ovat kumpikin •V : -OCOCH3, R7 on H ja R8 on -C0CH3.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, ·:··: tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen ·’*; 35 yhdiste, jossa R4 on -CH20H, R5 ja R6 ovat kumpikin -OH, R7 • · · ,· , on H ja R8 on -COCH3. • · » • 1 » • · • · I e ( • Il • • I I « · · · 107537

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa n on 2; A ja B ovat kumpikin H; R2 on -OH ja R3 on etyyli. 5 « • · • « « • « · · • * « « « • « • · · i < i • · · « • · * • · · · • · · • · · « • · · < I 107537