FI107535B - Makrolidien sokerijohdannaiset - Google Patents

Description

x 107535

Makrolidien sokerijohdannaiset

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on 5 arvoa lääketieteen kentässä. Erityisemmin kohteena on menetelmä uusien kemiallisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on arvoa annettaessa nisäkkäille, erityisesti ihmiselle immuunivastetta heikentävinä aineina. Näitä uusia immuunivastetta heikentäviä aineita voidaan verrata makro-10 lideihin, jotka tunnetaan nimillä FK-506 ja FK-520, joita on kuvattu yksityiskohtaisemmin US-patentissa nro 4 894 366. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut uudet yhdisteet ovat erityisen hyödyllisiä estettäessä tai hoidettaessa siirteen hylkimistä, mikä seuraa iho- tai 15 elinsiirreleikkausta ja estettäessä tai hoidettaessa autoimmuunisairauksia, kuten nivelreumaa ja psoriasista. Tämän mukaisesti nämä makrolidijohdannaiset ovat hyödyllisiä sienen aiheuttamien tulehdussairauksien hoidossa tai ennalta ehkäisyssä.

20 Kudos- tai elin-siirteen hylkiminen, mikä seuraa elinsiirtoleikkausta, on tavallinen tapahtuma, joka aiheutuu siitä, että potilaan immuunijärjestelmä tunnistaa vie-«, raat antigeenit. Ihmisen immuunivastejärjestelmä yrittää suojata itseään vieraalta kudokselta ja vapauttaa solu- ja lit 25 elimistönestearsenaalin. Sekä aktivoidut lymfosyytit että *···* vasta-aineet hyökkäävät vierasta kudosta vastaan aiheut- • · · taen komplikaatioita, jotka usein päättyvät mainitun ku-doksen hylkimiseen.

: Samalla tavalla immuunisääteiset epäsäännöllisyydet 30 autoimmuunisissa ja kroonisissa tulehdussairauksissa ovat • ;«.j tunnettuja. Riippumatta, sairauden etiologiasta monia auto- .'··, vasta-aineita ja itse-reaktiivisia lymfosyyttejä esiintyy • · * usein vaikeuttaen tilannetta.

* I

'· " Hoitomenetelmät, joiden kohteena on immuunisuojaus- ·...· 35 järjestelmä, johtavat usein järjestelmän täydelliseen sei-• « » ♦ ♦ · · · 107535 2 sahturaiseen, mikä johtaa kehon kyvyn alentumiseen taistella infektiota vastaan. Tämä voi olla yhtä vaarallista kuin alkuperäinen tila, joka aiheutti seisahtumisen.

Tällä hetkellä johtava lääkeaine siirteen hylkimi-5 sen estämiseksi on syklosporiini A, jonka United States Food and Drug Administration on hyväksynyt 1983. Lääke toimii niin, että se inhiboi kehon immuunivastejärjestel-mää mobilisoimasta sen luonnollisten suoja-aineiden arsenaalia siirteen vieraan proteiinin hylkimiseksi. Vaikka 10 syklosporiini on tehokas taisteltaessa siirteen hylkimistä vastaan, sillä on haittoja, jotka voivat aiheuttaa maksavauriota, munuaisvauriota ja vatsahaavaa; jotka monissa tapauksissa voivat olla vakavia. On olemassa jatkuva tarve kehittää turvallisempia lääkkeitä, jotka ovat selektiivi-15 sempiä kykynsä suhteen vaikuttaa immuunivastejärjestelmään ja joilla on vähemmän sivuvaikutuksia.

US-patentti nro 4 894 366 kuvaa makrolideja FK-506 ja FK-520 inter alia immuunivastetta heikentävinä aineina mukaan lukien "hylkimisreaktion hoitaminen elinsiirrossa" 20 ja autoimmuunisairauksien ja tulehdussairauksien hoitami nen. WO-patenttijulkaisu nro 91/02 736 kuvaa FK-506:n, FK-520:n johdannaisia ja vastaavia makrolideja. EP-patent-tijulkaisu nro 428 365A1 kuvaa eräitä muita FK-506:n, • « « FK-520:n johdannaisia ja vastaavia makrolideja.

25 Keksinnön yhteenveto *···* Tämän keksinnön kohteena on menetelmä uusien terä- * · « ····* peuttisesti käyttökelpoisten yhdisteiden valmistamiseksi, ...V joilla on kaava

30 I I

* ’ H3CCT^ j| I 3 ····; CH3VSsXy^N{^0 yy r i r3 35 <Λ+β°0Η ....: Yj? V-ch3 h3co och3 3 107535 jossa n on 1 tai 2; katkoviiva ei ole sidos; A ja B ovat erikseen ja A on H ja B on H tai -OH, tai A ja B ovat yhdessä =0; 5 R2 on (C2-C5) alkanoyylioksi tai -OR°; jossa R° on H tai ryhmä, jolla on kaava II tai III; :ψ·- '-pr. · (ID <IIl) 15 R3 on (0χ-03) alkyyli tai allyyli; R1 on ryhmä, jolla on kaava II tai III; R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R8, -C02H, -CH2OH, H, -CH3, -C0NH2, -CONHR8, -CONR28, -CH2OCOR8, -ch2oco2r8, -ch2oconhr8, -ch2oconr28 tai -CH2OR8; 20 R5, R6 ja R7 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti (Οχ — C4) alkoksi, bent syy lioksi, -OH, -0C0R8, -0C02R8 tai -OSi (R9) 3,* «. R8 on (Cx-Cg) alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, pyridyy- . li, tienyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu 1 < 4 ... 25 - 5 halogeeniatomilla, -OH ryhmillä tai (0χ-04) alkoksiryh- *··;* millä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1 -5 ha- • · · ··♦· logeeniatomilla, -OH ryhmillä tai (0χ-04) alkoksiryhmillä; « · · j a • · · · R9 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (0χ-04) alkyyli, 30 fenyyli tai bentsyyli; ·:··· ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmis- .*·*. tamiseksi.

• · · .· . Tämän keksinnön edullinen ryhmä on kaavan (I) yh-

I I

' disteiden ryhmä, jossa R2 on -OH.

φ · * · • · · · • · · « « • · 4 107535 Tämän keksinnön edullisempi ryhmä yhdisteitä yhdisteiden edullisesta ryhmästä ovat ne yhdisteet, joissa n on 2; A ja B ovat yhdessä =0; R2 on -OH; R3 on etyyli; R1 on 5 R5 R4 i7 .

4 R5 r7r r5 J—r? - för

f F

: . R4 on -CH2OH, -CH3, -CH2OCOCH3, -CH2OCOCH2C6H5 tai -C02CH3; ja 25 R5, R6 ja R7 ovat kukin riippumattomasti -OH, -OCOCH3 tai :···: -OCOCH2C6H5.

• · «

Erityisen edullisia tässä ryhmässä ovat yhdisteet, joissa R1 on < i* • « · 30 OAc ORc n H,c Λ ficO J-l<r /\\ ’

r\ 35 RcO flco CH3 ficO

♦ ♦ « · • · 5 107535

OH

= ' HO CH3

Toinen tämän keksinnön yhdisteiden edullinen ryhmä on kaavan (I) yhdisteiden ryhmä, jossa n on 2; A ja B ovat 10 erikseen ja ovat H; R2 on -OH; ja R3 on etyyli.

Kaavan (I) yhdisteet ovat tehokkaita immuunivastetta heikentäviä aineita. Tämä aktiivisuus tekee näistä yhdisteistä käyttökelpoisia hoidettaessa ja ennalta ehkäistäessä siirteen hylkimisreaktiota. Lisäksi tämä aktiivi-15 suus tekee näistä yhdisteistä käyttökelpoisia ennalta ehkäistäessä ja hoidettaessa autoimmuunisairauksia, kuten nivelreumaa ja psoriasista nisäkkäässä, erityisesti ihmisessä .

Tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää 20 menetelmässä, jossa hoidetaan hylkimisreaktiota elinsiirrossa nisäkkäässä, joka tarvitsee tällaista hoitoa, jossa menetelmässä annetaan mainitulle nisäkkäälle vaikuttava ·. määrä kaavan (I) yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hy- I I ( ' . väksyttävää suolaa.

• I

25 Termi "elinsiirto" käytettäessä edellä ja tämän ♦ < jälkeen viittaa henkilöön istutettuun siirteeseen, joka • t · •••ϊ siirre on kudos tai elin, joka on otettu henkilön toisesta ..li1 kohdasta tai toiselta henkilöltä. Tavallisia elinsiirtoja • · « V ♦ ovat, näihin rajoittumatta, luuydin-, sydän-, munuais-, 30 jänne- ja haima-pohjukaissuoli elinsiirrot.

·;··{ Termi "siirre" käytettäessä edellä ja tämän jälkeen .1··. viittaa mihin tahansa kiinnittämättömään kudokseen tai #· ♦ / > elimeen, jota käytetään elinsiirroissa. Tavallisia siir- it1 *· teitä ovat, näihin rajoittumatta, iho-, luu-, rasva- ja • · · » · '·<’ 35 hermosiirteet.

• · · · · 6 107535

Lisäksi tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää menetelmässä autoimmuunisairauden (kuten nivelreuman tai psoriasiksen) hoitamiseksi nisäkkäässä, joka tarvitsee tällaista hoitoa, jossa menetelmässä annetaan 5 mainitulle nisäkkäälle vaikuttava määrä kaavan (I) yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa.

Tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan edelleen käyttää farmaseuttisessa koostumuksessa, joka sisältää vaikuttavan määrän hylkimisreaktiota elinsiirrossa 10 hoitavaa kaavan (I) yhdistettä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantoainetta.

Vielä edelleen tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää farmaseuttisessa koostumuksessa, joka sisältää vaikuttavan määrän autoimmuunisairautta (kuten ni-15 velreumaa tai psoriasista) parantavaa kaavan (I) yhdistettä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantoainetta.

Lisäksi tämän keksinnön kaavan (I) yhdisteillä on sieniä vastustavaa aktiivisuutta. Täten näitä yhdisteitä voidaan käyttää sienistä aiheutuvien tulehdusten ennalta 20 ehkäisyssä tai hoidossa nisäkkäissä.

Tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan siis käyttää myös menetelmässä sienisairauksien hoitamiseksi nisäkkäässä, joka tarvitsee tällaista hoitoa, jossa mene- I I « telmässä annetaan mainitulle nisäkkäälle vaikuttava määrä

I I i I I

♦ i 25 kaavan (I) yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttä- 4 « ·1·1 vää suolaa.

» · 1 Tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää « lisäksi farmaseuttisessa koostumuksessa, joka sisältää • « · V ‘ vaikuttavan määrän sienitulehdussairautta hoitavaa kaavan 30 (I) yhdistettä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kanto- ·;·1: ainetta.

• Il • I • ·· · f « « · » 1

• M

• 4

4 · I

• 4 1 1 I > , 4

»IMI

• | 107535 7

Yksityiskohtainen kuvaus Tämän keksinnön kaavan (I) yhdisteet valmistetaan helposti. Yleisimmin makrolidi, jolla on seuraava kaava (IV) tai (V) 5 13"?« il" h3co^ |2 | 3 ζγ 1" X M. Λ».

H3C.' JfC < 15 ί«1 gjy^”3 |25 h3co och3 ( IV) 20 h-?, li1

XsXXs. CH, : ·· H3C0^ ^)2 3 1’ .···.25 f& η jf k OH Ai? 3 4N j- |ji7 ^?3 *:· A o'o X CH3 2[ OH X 3 h3c. jx X 1261^13 \20 %« I Γ~€Η 3 ·:··: ‘-iVA22/ J24 V""^ *:1’ h3co och3 • · ♦ (V) « · • · » • · · «♦m « 8 107535 kytketään tarkoituksenmukaisen sokerihalidijohdannaisen kanssa, jolla on kaava R5 r7"T ° tai ’ x 10 (VI) (VII> jossa X on halogeeni, kuten bromi tai kloori. Kytketty (tai glykosyloitu) makrolidi modifioidaan sitten edelleen kuten tässä seuraavassa on kuvattu.

15 Kaavojen (IV) ja (V) makrolidien valmistus on hyvin tunnettua kirjallisuudessa. Tavallisesti yleisin näiden makrolidien valmistusmenetelmä on mikro-organismien, jotka kuuluvat Streptomyces sukuun, biologinen fermentaatio. Kaavojen (IV) ja (V) yhdisteet, joissa R3 on allyyli, saa-20 daan Streptomyces tsukubaensis nro 9 993 (Ferm BP-927) fermentaatiolla. Kaavan (IV) yhdiste, jossa R3 on etyyli ja kaavan (IV) yhdiste, jossa R3 on metyyli, saadaan Strepto-myces hygroscopicus alalaji ascomyceticus ATCC 14891 fer-mentaatiolla.

4 « .•• 25 Streptomyces hygroscopicuksen alalajin ascomyceti- cuksen ATCC 14891 lyofilisoitu näyte on tallennettu Ameri-can Type Culture Collectioniin, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, USA, Budapest sopimuksen ehto- « ♦

jen mukaisesti 13. tammikuuta 1992. Tälle vastatallenne-30 tulle viljelmälle on annettu uusi talletusnumero ATCC

55276.

• · ·

Streptomyces tsukubaensis nro 9993 (Ferm BP-927) on ; tällä hetkellä tallennettavana Fermentation Research * · · .··.* Institute, Agency of Industrial Science Technologyn toi- 35 mesta (nro 1-3, Higashi-1-chome, Yatabemachi, Tsukuba- 9 107535 gun, Ibaraki Prefecture, Japani), Budapest sopimuksen mukaisesti. Mikro-organismin tuore näyte tallennetaan American Type Culture Collectioniin Budapest sopimuksen ehtojen mukaisesti.

5 Edellä mainitut mikro-organismit, ollessaan erik seen vesipitoisessa elatusnesteessä, muodostavat edellä mainitut kaavojen IV ja V yhdisteet. Mainittujen mikro-organismien fermentaatio näiden makrolidien muodostamiseksi toteutetaan pääosin kuten on kuvattu US-patentissa 10 4 894 366, joka täten on liitetty tähän viitteenä. Mitkä tahansa muutokset kuvatussa menetelmässä on tehty sovellettuna käytetylle laitteistolle ja on kuvattu seuraavissa valmistusmenetelmissä 1 ja 2.

Kaavan (I) yhdisteen valmistamiseksi, jossa R° on H 15 ja R1 on kaavan (II) tai kaavan (III) sokerisubstituentti, kaavan (IV) tai (V) makrolidi kytketään kaavan (VI) tai (VII) sokerihalidin kanssa.

Kaavan (VI) tai (VII) sokerihalidien ja kaavan (IV) tai (V) makrolidin kytkentä- (tai glykosylaatio-) reaktio 20 toteutetaan yksinkertaisesti käyttäen kemiallisia menetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle. Kyt-kentäreaktio toteutetaan tavallisesti käyttäen sokerin ,'.f perasetyloitua muotoa. N. 2 -4 mooliekvivalenttia tarkoi- t tuksenmukaista kaavan (VI) tai (VII) sokerihalidia sekoi-25 tetaan kaavan (IV) tai (V) makrolidin kanssa reaktioiner- ' i tissä liuottimessa. Tämänkaltaisen reaktion hyödyllisiä «·· ***; reaktioinerttejä liuottimia ovat klooratut liuottimet, * « « ·;·; kuten kloroformi, metyleenikloridi ja etyleenidikloridi; • « · '·* eetteriliuottimet, kuten dietyylieetteri, tetrahydrofuraa- 3 0 ni, dioksaani ja dimetoksietaani,· aromaattiset liuottimet, *•"'5 kuten bentseeni, tolueeni ja ksyleeni; ja dipolaariset ·[**: aproottiset liuottimet, kuten Ν,Ν-dimetyyliformamidi, ase- ' . tonitriili ja N-metyylipyrrolidoni. Edullisia liuottimia * 4 « ovat klooratut liuottimet ja erityisen edullinen liuotin ·;·’ 35 on metyleenikloridi. Tavallisesti on toivottavaa käyttää * « « • · · · 107535 10 tarpeeksi liuotinta niin, että reagoivat aineet liukenevat tai suspendoituvat liuottimeen. Tavallisesti käytetty liuotinmäärä vaihtelee niin, että saadaan 10-1 - 10"3 molaa-rinen makrolidiliuos, josta 10'1 molaarinen liuos on edul-5 linen. Olosuhteet pidetään kuivina läpi reaktion käyttäen vedettömiä liuottimia ja lisäämällä kuiva-ainetta reaktio-seokseen. Tätä tarkoitusta varten käytettyjä kuiva-aineita ovat molekyyliseulat, kalsiumsulfaatti ja magnesiumsulfaatti. Edullinen kuivausaine on 4 Ä -molekyyliseulat. 10 Reagoivien aineiden sekoittaminen toteutetaan lämpötilassa n. -78 °C - n. 70 °C. Edullisia ovat lämpötilat alueelta n. -78 °C - n. 0 °C. Valmistuksen helpottamiseksi erityisen edullinen on kylmähaude, joka pitää reaktiolämpötilan -78 °C:ssa.

15 Kun edellä mainitut reagoivat aineet on sekoitettu ja lämpötila on tasoittunut -78 °C:seen, reaktioseosta käsitellään sopivalla emäksellä, kuten elohopeakarbonaa-tilla, hopeakarbonaatilla, elohopeanitraatilla tai hopea-nitraatilla. Edullinen emäs tälle reaktiolle on hopeakar-20 bonaatti. Mainitun emäksen lisäyksen jälkeen reaktioseosta käsitellään katalyytillä. Tavallisia katalyyttejä tälle reaktiolle ovat triflaatti-, perkloraatti- ja tetrafluori-boraattisuolat kationille, joka liittyy käytettyyn kysei- ·;· seen emäkseen. Edullinen katalyytti on hopeatriflaatti.

."‘,25 Kun kaikki reagoivat aineet ja reagenssit on lisät- ty, reaktioseos lämmitetään 0 °C:seen, sekoitetaan 0,5 -[I 24 tuntia 0 °C:ssa ja lämmitetään hitaasti huoneeniämpöti- laan. Reaktioseosta sekoitetaan 0,5 - 24 lisätuntia huo- • ' · neenlämpötilassa. Tavallisesti reaktioseosta sekoitetaan 30 0 °C:ssa viisi tuntia ja annetaan lämmetä huoneenlämpöti-

Htf, * * laan kolmen tunnin aikana, mitä seuraa 16 tunnin sekoitta- • · « minen huoneenlämpötilassa. Sitten tuote eristetään reak- : tioseoksesta käyttäen menetelmiä, jotka ovat tunnettuja • · ,···, alaan perehtyneille. Täten yksinkertainen suodattaminen ·’ 35 suodattimen, kuten CelitenR läpi, mitä seuraa haihduttami- 107535 11 nen, antaa jäännöksen, joka puhdistetaan pylväskromatogra-fisesti. Alaan perehtynyt tietää, että pylväskromatogra-fiässä käytetään kiinteää faasia kuten silikageeliä ja nestemäistä faasia, joka koostuu liuottimien edullisesta 5 seoksesta, yhdisteiden erottamiseksi ja puhdistamiseksi seoksesta. Liuottimien poistaminen kromatografian jälkeen antaa fluoriglykosyylimakrolidin.

Yleensä kytkentäreaktio tapahtuu ainoastaan yhdessä kolmesta alkoholikohdasta makrolidissa. Tämä kohta on 10 C-4'' funktionaalinen alkoholiryhmä (katso kaava IV). Tämä selektiivisyys on mahdollista johtuen tämän aseman hydrok-syyliryhmän suuremmasta vastaanottavuudesta makrolidien edullisessa konformaatiossa. Joskus kuitenkin erityisen reaktiivisilla sokerihalideilla muodostuu pieniä määriä 15 diglykosyloitua ainetta (jossa R2 on 0R°). Tämä aine havaitaan seurattaessa reaktion etenemistä, mikä tavallisesti tehdään ohutkerroskromatografisesti standardikäytännön mukaisesti. Diglykosyloitu aine eristetään ja puhdistetaan kuten monoglykosyloitu aine, paitsi sillä huomattavalla 20 poikkeuksella, että diglykosyloitu aine on tavallisesti ensimmäinen eristetty aine kromatografoinnissa, kun taas monoglykosyloitu aine eristetään myöhemmistä jakeista.

; Lisättyjen sokerikloridiekvivalenttien käyttö tai muiden ....: parametrien, kuten liuottimen, emäksen tai katalyytin ;*".25 muuttaminen voi vaikuttaa diglykosyloidun aineen saantoon.

ui .:. Kaavan (I) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R1 • · · · Λ on H ja R on kaavan (III) sokerisubstituentti, kaavan (IV) tai (V) makrolidi suojataan ensin hydroksyylisuojaryhmällä C-4"-asemassa. Hydroksyylisuojaryhmiä, jotka ovat sopivia 30 tällaista tarkoitusta varten ovat, näihin rajoittumatta, ···««.

] ‘ silyylieetterit, karboksyylieetterit ja karboniesterit.

• * t ...· Suojaryhmät on liitetty alkoholiin käyttäen hyvin tunnet tuja orgaanisen kemian menetelmiä. Silyylieetterit ovat edullisia johtuen niiden selektiivisyydestä ja liittämisen 4 I | 35 ja poistamisen helppoudesta. Tämän mukaisesti kaavan (IV) • · * « * « 107535 12 tai (V) makrolidi liuotetaan reaktioinerttiin liuottimeen lämpötilassa n. 0 °C - n. 30 °C. Tämänkaltaiseen reaktioon sopivia reaktioinerttejä liuottimia ovat dipolaariset ap-roottiset liuottimet, kuten dimetyyliformamidi, asetonit-5 riili ja N-metyylipyrrolidoni; klooratut liuottimet, kuten kloroformi, dikloorimetaani ja 1,2-dikloorietaani; ja eetteri liuottimet, kuten dietyylieetteri, dioksaani ja tetra-hydrofuraani. Valittu liuotin on usein dimetyyliformamidi. Silyylitrifluorimetaanisulfonaattia, kuten t-butyylidime-10 tyylisilyylitrifluorimetaanisulfonaattia tai silyyliklori- dia, kuten dimetyyli-t-butyylisilyylikloridia, trimetyyli-kloorisilaania tai trifenyylikloorisilaania lisätään yhdessä orgaanisen amiinin, kuten trietyyliamiinin, trimet-yyliamiinin tai imidatsolin kanssa. Tavallisesti edullinen 15 emäs on imidatsoli. Reaktioseosta sekoitetaan n. yksi tunti - 24 tuntia, tavallisesti huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen tuote eristetään reaktioliuoksesta tavalla, joka on hyvin tunnettua alaan perehtyneelle.

Makrolidi, nyt suojattu C-4"-asemassa, voidaan kyt-20 keä kaavan (VI) tai (VII) sokerihalidin kanssa, kuten tässä edellä on kuvattu. Tällaisen kytkentäreaktion tuote on kaavan (I) yhdisteen johdannainen, johon sokerijohdannainen on liittynyt hapen kautta C-14-asemaan ja C-4"-asema ; " on suojattu. C-4"-aseman suojaus voidaan poistaa antamaan 25 vapaa hydroksiyhdiste käyttäen orgaanisen kemian standar-dimenetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehty- • · · * neelle. Edullisen silyylieetterisuojaryhmän poistamiseksi C-4"-silyylisuojattu kaavan (I) yhdiste liuotetaan reak- t e· tioinerttiin liuottimeen, kuten asetonitriiliin tai eet-30 teriliuottimeen, kuten tetrahydrofuraaniin tai dietyyli- • · * o « eetteriin lämpötilassa n. 0 °C - n. 30 °C ja käsitellään • · · ·..* fluoridilähteellä, kuten fluorivedyllä tai tetra-N-butyy- : liammoniumfluoridilla. Reaktioseosta sekoitetaan n. 1 tun- • ♦ * .···. ti - n. 24 tuntia ja sitten tuote eristetään käyttäen or- 13 107535 gaanisen kemian standardimenetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle.

Keksinnön mukaisten kaavan (I) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa A ja B ovat erikseen ja ovat kumpikin H 5 (yhdisteisiin viitataan tämän jälkeen C-2 desoksomakroli-deina), kaavan (I) yhdiste, jossa A ja B ovat yhdessä =0, pelkistetään käyttäen standardiolosuhteita a-ketoamidien pelkistykselle. Tämä pelkistysmenetelmä pelkistää selektiivisesti amidin viereisen karbonyylin vaikuttamatta mui-10 hin karbonyyleihin molekyylissä. Tavallisesti kaavan (I) makrolidi liuotetaan reaktioinerttiin liuottimeen tai liuottimien seokseen ja rikkivetykaasua kuplitetaan seokseen 6-24 tuntia huoneenlämpötilassa. Tavallisesti kaasua kuplitetaan reaktioseokseen yön yli. Sopivia reaktio-15 inerttejä liuottimia tälle reaktiolle ovat, näihin rajoittumatta, orgaaniset emäkset, kuten dietyyliamiini, tri-etyyliamiini, dimetyyliamiini, trimetyyliamiini ja ani-liini; dipolaariset aproottiset liuottimet, kuten N,N-di-metyyliformamidi, dimetyylisulfoksidi ja N-metyylipyrro-20 lidoni; ja alkoholiliuottimet, kuten metanoli, etanoli ja propanoli. Kahden tai useamman tällaisen liuottimen yhdistämistä käytetään joskus optimisaannon aikaansaamiseksi tai vaikuttamaan pelkistyksen kulkuun. Esimerkiksi makro-lidi, jossa A on H ja B on OH, valmistetaan käyttäen me- .‘".25 tanolia liuottimena. Erityisen edullisessa liuotinjärjes- * t 1 telmässä C-2 desoksomakrolidin valmistamiseksi on pyridii- t ‘I niä ja Ν,Ν-dimetyyliformamidia yhtäläisiä määriä. Kun reaktio on täydellinen, tuote eristetään käyttäen orgaani- • · » ‘ sen kemian standardimenetelmiä, kuten on ilmeistä alaan 3 0 perehtyneel1e.

Vaihtoehtoisesti kaavan (IV) tai (V) yhdisteet voi- • ♦ c ’...· daan pelkistää ennen glykosylaatiota käyttäen edeltävää menetelmää. Pelkistyksen jälkeen makrolidi voidaan glyko-syloida kuten tässä edellä on kuvattu.

I 1 · •Mj 107535 14

Keksinnön mukaisten kaavan (I) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa katkoviiva on sidos ja R2 on vety, kaavan (I) yhdiste, jossa R2 on -OH ja katkoviiva ei edusta mitään sidosta (joihin yhdisteisiin viitataan tämän jäl-5 keen β-hydroksiketonina) dehydrataan kuten EP-patenttiha-kemuksessa nro 323 042 on kuvattu. Tavallisesti β-hydrok-siketoni liuotetaan reaktioinerttiin liuottimeen, joka sisältää katalyyttisen määrän orgaanista happoa. Sopivia reaktioinerttejä liuottimia ovat aromaattiset liuottimet, 10 kuten bentseeni, tolueeni, ksyleeni ja vastaavat, joista tolueeni on edullinen. Orgaaninen happo valitaan tavallisesti sellaisista hapoista kuten tolueenisulfonihaposta, kamferisulfonihaposta ja vastaavista, joista tolueenisul-fonihappo on edullinen. Reaktioseosta kuumennetaan n. 15 50 °C:ssa - n. 120 °C:ssa n. viisi minuuttia - n. yksi tunti. Tavallisesti höyryhaudelämpötilat (n. 100 °C) ovat edullisia ja viisi minuuttia on yleensä riittävä aika reaktion loppuunviemiseksi. Reaktiotuote eristetään menetelmien avulla, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehty-20 neelle. Reaktio toteutetaan tavallisesti yhdisteille, jotka on jo glykosyloitu.

Kaavan (I) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R5, . R6 ja R7 ovat hydroksi ja R4 on hydroksimetyyli, kaavan (I) ·;··,' yhdiste, jossa R5, R6 ja R7 ovat asetoksi ja R4 on asetoksi- ;"\25 metyyli, deasetyloidaan käyttäen standardiolosuhteita, » « t jotka ovat tunnettuja alaan perehtyneille, kuten seuraa-vassa on esitetty. Tämä selektiivinen deasetylointi ei vaikuta amideihin, joita on läsnä, ja toteutetaan helposti * · ’ lisäämällä alkoksidiemästä liuokseen, jossa on deasetyloi- 30 tavaa ainetta alkoholipitoisessa liuottimessa 0 °C:ssa.

* “ Tavallisesti käytetään katalyyttistä määrää, kuten 0,01 • » · *...· ekvivalenttia emästä. Tavallisesti kyseisen alkoholipitoi- sen liuottimen alkoksidiemäs on edullinen. Edullisin, joh- • · .··, tuen sen helppokäyttöisyydestä ja reaktiivisuudesta, on * » ·” 35 järjestelmä, jossa metanoli on liuotin ja natriummetoksidi « « » · * l » · • · 107535 15 on emäs. Tuotteen eristäminen toteutetaan standardimenetelmien avulla, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle.

Kaavojen (VI) ja (VII) sokerihalidijohdannaiset 5 valmistetaan edullisesti kaavojen (VIII) ja (IX) sokereista, joissa R10 on H, (Ci-C^alkyyli tai (C2-C4 )alkanoyyli, käyttäen halogenoinnin standardimenetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle.

p5 10 | ~V M· 15 ÖR1·0 (Vili) <lX>

Bromaus on valittu menetelmä? kloorausta voidaan myös käyttää tietyissä tapauksissa. Bromaus toteutetaan 20 liuottamalla 1-hydroksi-, alkoksi- tai alkanoyylioksifluo- risokerijohdannainen orgaaniseen happoliuottimeen, kuten etikkahappoon. Kun sokeri on 1-hydroksi- tai 1-alkoksiso- keri, lisätään tavallisesti 1-10 ekvivalenttia etikkahap- poanhydridiä. Edullisia substraatteja ovat 1-asetoksisoke- ·:·· 25 rijohdannaiset. Reaktioseos jäähdytetään niin, että lämpö- ;***. tila putoaa alueelle -20 °C - n. 0 °C. Tavallisesti edul- • · · linen lämpötila on n. 0 °C. Jäähdytettyä reaktioseosta käsitellään vetybromidihappoliuoksella happoliuottimessa. Tavallisesti käytetään suurta ylimäärää, kuten 10 - 40 • « « * 1 30 mooliekvivalenttia vetybromidihappoa. Reaktioseos lämmite tään huoneenlämpötilaan ja sekoitetaan, kunnes reaktio on * 1 täydellinen. Tavallisesti, yksinkertaisuuden vuoksi, reak tioseos jätetään sekoituksenalaisena seisomaan yön yli. Bromatun tuotteen eristäminen toteutetaan yksinkertaisesti 35 tavalla, joka on hyvin tunnettu alaan perehtyneelle.

« • » i · « 107535 16

Yleensä tämä käsittää pelkästään liuottimen poistamisen tyhjössä. Joissakin tapauksissa liuottimen tehokkaampaa poistamista varten käytetään lisäliuotinta, kuten toluee-nia, reaktioliuottimen haihduttamiseksi atseotrooppisesti.

5 Lisäpuhdistus toteutetaan joskus käyttäen pylväskromato-grafiaa.

Kaavojen (VIII) ja (IX) yhdisteiden valmistamiseksi, joissa R4 on -CH2OCOR8, R5, R6 ja R7 ovat -OCOR8; ja R10 on -COR8, kaavan (VIII) tai (IX) yhdistettä, jossa R4 on 10 -CH2OH; R5, R6 ja R7 ovat -OH ja R10 on H, käytetään substraattina standardiasylointireaktiossa. Tavallisesti mainittu substraatti saatetaan reagoimaan sopivan asylointi-aineen, kuten, mutta tähän rajoittumatta, etikkahappoan-hydridin kanssa sopivassa liuottimessa, kuten etikkaha-15 possa n. 0 °C:ssa - n. 25 °C:ssa. Tuote eristetään käyttäen orgaanisen kemian standardimenetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle.

Kaavojen (VIII) ja (IX) sokerijohdannaisia on yleensä helposti saatavissa koska ne ovat suurilta osin 20 tavallisesti esiintyviä sokereita.

Kaavojen (VIII) ja (IX) sokerijohdannaisia, joissa R4 on -C00H, on helposti saatavissa, koska ne ovat luonnollisesti esiintyviä vastaavien sokereiden uronihappojoh-: '·' dannaisia. Kaavan (Vili) ja (IX) sokeri johdannaiset, jois- '.'"i 25 sa R4 on -C0NH2, -CONHR8, -C0NR82 tai -C02R8, mikäli eivät : ole helposti saatavissa, voidaan helposti valmistaa hyvin •f· tunnetuilla esteröinti- tai amidoimismenetelmillä, jotka • · · · ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle.

• < < i ,·;· Kaavan (I) yhdisteen valmistamiseksi, jossa R4 on • < · 30 -C00H, kaavan (VI) tai (VII) sokerihalidi kytketään kaavan (IV) tai (V) makrolidiin, kuten tässä seuraavassa on ku-... vattu. Kytkennän jälkeen -R8 ryhmä poistetaan käyttäen or- ·;' gaanisen kemian standardi de-esteröintimenetelmiä, jotka : *.: ovat hyvin tunnettuja alaan perehtyneelle, edellyttäen, 35 että halutaan kaavan (I) yhdiste, jossa R4 on -COOH.

107535 17

Kun tämän keksinnön kaavan (I) yhdisteet ovat happamia, kuten tapauksessa, jossa R4 on -COzH, keksintö käsittää myös mainittujen kaavan (I) yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

5 Tavallisia farmaseuttisesti hyväksyttäviä kationi- suoloja tällaista käyttöä varten ovat alkalimetallisuolat (esim. natrium ja kalium), maa-alkalimetallisuolat (esim. magnesium ja kalsium), alumiinisuolat, ammoniumsuolat ja suolat orgaanisten amiinien, kuten bentsatiinin (Ν,Ν'-di-10 bentsyylietyleenidiamiinin), koliinin, dietanoliamiinin, etyleenidiamiinin, meglumiinin (N-metyyliglukamiinin), benetamiinin (N-bentsyylifenetyyliamiinin), dietyyliamii-nin, piperatsiinin, trometamiinin (2-amino-2-hydroksime-tyyli-l,3-propaanidiolin) ja prokaiinin kanssa. Erityisen 15 edullinen suola on natriumsuola.

Tämän keksinnön farmaseuttisesti hyväksyttävät ka-tionisuolat valmistetaan edullisesti saattamalla happomuo-dot reagoimaan tarkoituksenmukaisen emäksen tavallisesti yhden ekvivalentin kanssa, lisäliuottimessa. Tyypillisiä 20 emäksiä ovat natriumhydroksidi, natriummetoksidi, magne- siumhydroksidi, kalsiumhydroksidi, bentsatiini, koliini, dietanoliamiini, piperatsiini ja trometamiini. Suola eristetään väkevöimällä kuiviin tai lisäämällä ei-liuotinta.

: '< Monissa tapauksissa suolat valmistetaan edullisesti se- 25 koittamalla happoliuos liuoksen kanssa, jossa on eri ka- tionisuoloja (natrium- tai kaliumetyyliheksanoaatti, -mag-nesiumoleaatti), käyttäen liuotinta (esim. etyyliasetaat- • · ♦ · tia), josta haluttu kationisuola saostuu tai voidaan muul-la tavalla eristää väkevöimällä ja/tai lisäämällä ei-liuo-30 tinta.

Ottaen huomioon tämän keksinnön kaavan (I) makro-]lidit, on ymmärrettävä, että stereoisomeeriset muodot, kuten optiset ja geometriset isomeerit, johtuen niiden : ,· asymmetrisestä hiiliatomista tai hiiliatomeista ja kak- « • » * · · « « 107535 18 soissidoksesta tai kaksoissidoksista, kuuluvat tämän keksinnön piiriin.

Täten valmistetut kaavan (I) yhdisteet ovat hyödyllisiä hylkimisreaktion hoitamiseksi elinsiirroissa ja au-5 toimmuunisairauksien, kuten nivelreuman tai psoriasiksen hoitamiseksi. Hylkimisreaktion hoitamiseksi elinsiirrossa kaavan (I) yhdistettä voidaan käyttää joko ennalta ehkäisevästi tai haitallista reaktiota vastaan, joka aiheutuu elin- tai kudossiirrosta ihmisessä. Käytettynä ennalta eh-10 käisevästi kaavan (I) yhdistettä annetaan potilaalle tai kudos- tai elinsiirteeseen ennen elinsiirtoa. Ennalta ehkäisevä hoito voi myös käsittää lääkityksen antamisen elinsiirron jälkeen, mutta ennen kuin on havaittu mitään siirrosta aiheutuvia haitallisia reaktioita. Annettaessa 15 haitallista reaktiota vastaan kaavan (I) yhdistettä annetaan suoraan potilaalle mainitun hylkimisreaktion elinsiirrossa hoitamiseksi kun ulkoisia merkkejä vastustuskyvystä on havaittu.

Käytettäessä hylkimisreaktion elinsiirrossa hoita-20 miseksi ja autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman tai psoriasiksen hoidossa nisäkkäässä, mukaan lukien ihminen, kaavan (I) yhdiste formuloidaan sopivaksi farmaseuttiseksi koostumukseksi, joka sisältää sairautta hoitavan vaikutta-; '·· van määrän. Riippuen annettavan kaavan (I) kyseisen yhdis- 25 teen tehokkuudesta n. 0,05 mg/kg elopaino/päivä - n. :***: 30 mg/kg elopainoa/päivä annetaan yhtenä tai monena päi- •ί. vittäisenä annoksena hoidettavalle nisäkkäälle. Edullisem- ··»« .. pi alue on 0,05 mg/kg elopainoa/päivä - n. 20 mg/kg elo- .·;· painoa/päivä, vaikka tietyissä tapauksissa vastuussa ole- • · 30 van lääkärin harkintakyvyn mukaan voidaan tarvita annoksia laajemmalta alueelta. Edullinen antoreitti on tavallisesti ‘ ’ oraalinen, mutta ruoansulatuskanavan ulkopuolinen antomuo- • f to (esim. laskimonsisäinen, lihaksensisäinen, ihonalainen tai selkäytimensisäinen) on edullinen tietyissä tapauksis-35 sa, kuten silloin kun oraalinen antomuoto on sopimaton 107535 19 kyseiselle kohteelle tai tapauksessa, jossa potilas ei kykene erinäisistä syistä sulattamaan lääkettä. Paikallista antomuotoa voidaan myös käyttää kun potilas kärsii ihotaudista, kuten psoriasiksesta, tai kudoksen tai elimen 5 pinnalle, kun lääke soveltuu tähän parhaiten, kuten vastaava lääkäri on määrittänyt.

Näin valmistetut kaavan (I) yhdisteet ovat hyödyllisiä myös sienten aiheuttamien tulehdusten hoidossa. Käyttöä varten mainittujen sienitulehdusten hoitamiseksi 10 nisäkkäässä, mukaan lukien ihminen, kaavan (I) yhdiste formuloidaan farmaseuttiseksi koostumukseksi, joka sisältää sairauden hoitamiseksi vaikuttavan määrän. Riippuen kyseisen kaavan (I) yhdisteen tehokkuudesta, annetaan n. 0,05 mg/kg elopainoa/päivä - n. 30 mg/kg elopainoa/päivä 15 yksittäisenä tai monina päivittäisinä annoksina hoidettavalle nisäkkäälle. Edullisempi alue on 0,05 mg/kg elopainoa/päivä - n. 20 mg/kg elopainoa/päivä, vaikka tietyissä tapauksissa vastaavan lääkärin harkinnan mukaisesti annoksia tämän alueen ulkopuolelta voidaan tarvita. Edullinen 20 antoreitti on tavallisesti oraalinen, mutta ruoansulatuskanavan ulkopuolinen antomuoto (esim. laskimonsisäinen, lihaksensisäinen, ihonalainen tai selkäytimensisäinen) on edullinen erityisissä tapauksissa, kuten tapauksessa, jos-; sa oraalinen antomuoto ei ole tarkoituksenmukainen kysei- 25 selle kohteelle tai jos potilas ei kykene erinäisistä :***; syistä nauttimaan lääkettä. Paikallista antomuotoa voidaan • « · myös käyttää mikäli lääke soveltuu parhaiten levitettä-väksi kudoksen tai elimen pinnalle, kuten vastaava lääkäri on määrittänyt.

30 Tämä keksinnön yhdisteitä annetaan yleensä farma seuttisen koostumuksen muodossa, joka sisältää vähintäin yhtä kaavan (I) yhdistettä yhdessä farmaseuttisesti hyväk- • 1 · syttävän apuaineen tai laimentimen kanssa. Tällaiset koos-tumukset formuloidaan tavallisesti tavalliseen tapaan .·1·. 35 käyttäen kiinteitä tai nestemäisiä apuaineita tai laimen- · · • « 107535 20 timia -tarkoituksenmukaisesti kyseistä anatomuotoa varten: oraalista antomuotoa varten tablettien, kovien tai pehmeiden gelatiinikapseleiden, suspensioiden, rakeiden, jauheiden ja vastaavien muodossa; ruoansulatuskanavan ulkopuo-5 lista antomuotoa varten injektoitavien liuosten tai suspensioiden ja vastaavien muodossa; ja paikallista antomuotoa varten liuosten, salvojen, voiteiden ja vastaavien muodossa.

Tämän keksinnön yhdisteiden käyttö lääkeaineina 10 hylkimisreaktion elinsiirrossa, sienitulehdussairauksien ja autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman tai psoriasiksen hoidossa osoitetaan mainittujen yhdisteiden aktiivisuudella seuraavassa kuvatuissa biologisissa pikakokeis-sa. Mainittu biologinen pikakoe mahdollistaaa myös vertai-15 lun kaavan (I) yhdisteiden aktiivisuuksien ja tunnettujen yhdisteiden aktiivisuuksien välillä. Näiden vertailujen tulokset ovat hyödyllisiä määritettäessä annostasoja nisäkkäille, mukaan lukien ihminen, hylkimisreaktion elinsiirrossa ja autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman ja 20 psoriasiksen hoidossa.

Ihmisen seka-imusolureaktiota (mixed lymphocyte reaction) (MLR) käytetään ei-spesifisen immuunireaktion selville saamiseksi, joka määritetään 3H-tymidiinin tal- ; teenotosta. Tässä pikakokeessa käytetään veren yksitumai- 25 siä soluja modifioidussa kaksi-tie MLR:ssä (two-Way MLR).

:***; HLA tyyppi D antigeenien erilaisuuden ja täten maksimi- •i. stimuloinnin varmistamiseksi ryhmää jäädytettyjä luovut- • •«o tajasoluja käytetään ärsykepopulaationa; vasta eristettyjä ,·? soluja käytetään vastepopulaationa.

• · 30 Vastaotetut yksitumaiset solut suspendoidaan RPMI- . 1640:aan, joka on rikastettu: 0,5-%:isella MEM ei-välttä- mättömien aminohappojen (lOOx) liuoksella, l-%:isella L-glutamiinilla (200 mM), l-%:silla MEM vitamiineilla (lOOx), l-%:isella penisilliini-streptomysiiniliuoksella 35 (10 000 yksikköä/ml) ja 15-%:isella kuuma-inaktivoidulla 107535 21 ihmisen AB seerumilla (NABI). Solut lasketaan ja pitoisuus säädetään 5 x 105 solua/ml. Liuos siirretään sitten pyö-reäpohjäisille 96 kuopan levyille määrinä 100 μΐ/kuoppa. Nämä levyt sisältävät nyt vastesoluja.

5 Ärsykesolut valmistetaan yhdistämällä yksitumaiset solut, jotka on kerätty monilta eri henkilöiltä. Solut suspendoidaan 90-%:iseen ihmisen AB seerumiin ja 10-%:iseen DMSOrhon, niin että solumäärä on 2 x 107 solua/ml. Soluja säilytetään nestemäisessä typessä. MLR:ää 10 varten elinkelpoiset solut laimennetaan 5 x 105 solua/ml ja 100 μΐ/kuoppa lisätään levyihin, jotka sisältävät vastesoluja. Jokaiseen kuoppaan, joka sisältää vastesolujen ja ärsykesolujen seosta, lisätään 50 μΐ yhdisteliuosta. Trip-likaattikuoppia käytetään jokaiselle annokselle. Levyjä 15 inkuboidaan 37 °C:ssa 5-%:isessa C02 ilmakehässä ja kostutetaan viitenä päivänä. Jokaiseen kuoppaan lisätään 1 pCi 3H-tymidiiniä ja inkubointia jatketaan 18 lisätuntia. Solut kerätään käyttäen LKB Beta -levyjärjestelmää.

Ärsykekontrollin prosentuaalinen inhibitio saadaan 20 käyttäen seuraavaa yhtälöä: % inhibitio = ri00-(keskim. cpm lääkettä)xl001 keskim. cpm ärsyke-kontrollia : ’-'25 Lyhenne cpm on määritetty lukema/min. RPMI-1640 on kudosviljelyväliaine, jota saadaan Sigmasta.

:***; Aktiivisuus edellä kuvatussa MLR pikakokeessa kuvaa • · « •i, aktiivisen yhdisteen käyttökelpoisuutta hylkimisreaktion • · 4 · ja autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman ja psoriasik-,·· .30 sen hoidossa.

i « Tämän keksinnön makrolidien antimikrobiset aktiivisuudet eri sieniä vastaan määritetään agar sarjalaimennus-] / menetelmällä Sabouraud agarissa. Minimi-inhibitiopitoisuu- det (MIC) saadaan 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 30 °C:ssa. /.35 Tätä keksintöä kuvaavat seuraavat esimerkit. Kui- .**·. tenkin tulisi ymmärtää, että keksintö ei rajoitu näiden » * * * · • · 107535 22 esimerkkien spesifisiin yksityiskohtiin. Kaikki reaktiot toiteutetaan inertissä ilmakehässä, kuten argonin ilmakehässä, jollei toisin mainita. Lyhennykset THF, DMSO, DAST, DMAP ja Ac, missä käytetään, viittaavat tetrahydrofuraa-5 niin, dimetyylisulfoksidiin, dimetyyliaminorikkitrifluori- diin, 4-dimetyyliaminopyridiiniin ja asetyyliin, vastaavasti. Sokerihalogenidit hankittiin luotettavalta myyjältä, kuten Sigmalta tai Aldrichilta, kuten myös sokerit, mikäli muuta ei ole spesifisesti ilmoitettu. Käytettiin 10 vedettömiä liuottimia, joista vedetön määritetään niin, että se on pääosin vapaa vedestä.

Ilmaisu "reaktioinertti liuotin" edellä käytettynä viittaa mihin tahansa liuottimeen, joka ei reagoi lähtöaineiden, reagenssien, välituotteiden tai tuotteiden kanssa 15 siten, että halutun tuotteen saanto heikkenee.

Valmistusmenetelmissä 1 ja 2 esiintyviä termejä tai lyhenteitä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavassa.

PYEA-agar valmistetaan liuottamalla Difco-maltoosia (10 g), Difco-hiivauutetta (4 g), dekstroosia (4 g), Dif-20 co-agaria (15 g) ja tuoretta kookosmaitoa (50 ml) tarpeeksi deionisoituun veteen antamaan 1 1 liuosta; ja liuoksen pH säädetään arvoon 7,3 1 N NaOH:lla.

ATCC 172 -elatusneste valmistetaan liuottamalla : glukoosia (10 g), liukoista tärkkelystä (20 g), hiivauu- ’:": 25 tetta (5 g), NZ-amiinia A (Difco, 5 g) ja kalsiumkarbo- naattia (1 g) tarpeeksi deionisoituun veteen antamaan 1 1 • · · liuosta; ja liuoksen pH säädetään arvoon 7,0 1 N K0H:lla.

• 1 · · . JDYTT-väliaine valmistetaan liuottamalla sereloosia • c r .«;·. (10 g), maissitärkkelystä (5 g), maissin liotusnestettä 30 (5 g), NZ-amiini YTT;tä (5 g), kobolttikloridia (0,002 g) ja kalsiumkarbonaattia (3 g) tarpeeksi deionisoituun ve-teen yhden litran liuokseksi; ja liuoksen pH säädetään arvoon 7,2 1 N NaOH:lla.

; ·,I NZ-amiini A ja NA-amiini YTT ovat saatavissa Dif-

I I

35 costa, kuten useimmat edellä olevista aineosista.

« · · • t · • · · · 23 107535

Edeltävässä MLR kokeessa RPMI-1640 on standardi elatusneste MLR tutkimuksissa; MEM on määritetty "minimi elatusnesteenä" (minimum essential media) ja NABI on toimittaja.

5 Esimerkki 1 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2’-(4'’-(2*»’,3’' 4’ ’' -tri-O-asetyyli-a-D-glukopyranosyylioksi) -3 ’ ’-metoksi-sykloheksyyli)-1’-metyylivinyyli]-23,25-dimetoksi-13,19,- 21,27-tetrametyyli-11,28-dioksa-4-atsatrisyklo[22.3.1.04,9] -10 oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni

Sekoituksenalaiseen lietteeseen, jossa oli valmistusmenetelmän 1 otsikkoyhdistettä (6,41 g, 0,0081 mmol), α-L-asetokloorifukoosia (Sigma, 5,0 g, 0,16 mmol) ja 4 A molekyyliseuloja (murskattuja, 5,0 g) metyleenikloridissa 15 (vedetön, 150 ml) -7,8 °C:ssa, lisättiin hopeakarbonaattia (13,36 g, 0,0324 mmol), mitä seurasi hopeatriflaatti (0,83 g, 0,0032 mmol). Reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan kahdeksan tuntia ja sekoitettiin sitten viisi lisätuntia. Saatu nahanruskea liete suodatettiin 20 piimään läpi ja suodos haihdutettiin tyhjössä. Jäännös puhdistettiin silikageelillä eluoiden heksaani/etyyliasetaatilla (2/1) antamaan tuote anomeerien seoksena (9,0 g, 52 %).

; ’·. Esimerkit 2-11 ’:·’:25 Esimerkin 1 menetelmällä, mutta korvaamalla a-L- :***: asetokloorifukoosin jokainen mooliekvivalentti yhdellä • · · mooliekvivalentilla tarkoituksenmukaista sokerikloridia, • r • · · · valmistettiin seuraavat yhdisteet.

« tl(,' Φ ( * Din _

I » R

* 30 if 1 ch3 ....i H3C0 1 1^/0 * 0 I ^oh / : : 35 h3c( TI )—CHi ':*· h3co och3 ' 107535 24

I Rl Hl Saanto B

2, Massaspektri (FAB); H

BnO . nH m/z = 1216,7 (molekyyli- g

Ioni + Na+) ,3C-NMR: δ 0 θ/\ 169,0, 164,7, 138,7, 138,4, 138,3, 137,8, 132,5, 123,0

Massaspektri (FAB); 3. *OH m/z = 1086,7 (molekyyli- 00c Loni + Na+) ,3C-NMR: δ 213,4, 196,2, 170,8, 170,2, U0'° . _ PcOficO CH3 15

Massaspektri (FAB); .

-OH m/z = 1144,7 (molekyyli- 20 4 · Loni + Na+) 13C-NMR: δ .one 213,2, 196,3, 171,4 170,5, nc0 μ 170,1,170,0,165,1

PeCK-^-—t— one : '* 25 t« « • t • » «il

• I ... ....... Ill - I I ......... ..... I l> l> » - I .... 1..1....11 I -I·» · II· — I -...... ill " I III.....Il·" IIIIH III

·· « ···· Massaspektri (FAB); ·;* g -OH m/z = 1086,7 (molekyyli-

’ ioni+ Na+) 13C-NMR: δ I

:·1 ‘ o0 neo ch3 213,5, 196,2, 170,7,170,2, ||o 169,4, 168,9 ·..< r nC(S^=2--- .···. ORe ' (Il 35 ___ II» « I ·

* > 1 I I

I El Bi Saanto I

25 107535

Massaspektri (FAB); I

. -OH m/z = 1130,7 (molekyyli- 0 ioni 4. Na*) ,3C-NMR: δ fl

cOjCHj 213,4, 196,2, 169,4, 169,2, I

flcQ , U° 167,3 I

Iflc0~-^£j—£— I

Oflc I

ju \j

Massaspektri (FAB)? , -OH m/z = 1144,7 (molekyyli- ioni + Na+) ,3C-NMR: δ | flcO /onc 213,2,196,1,171,5,171,2, 15 L_Lo 170,8, 170,0, 163,1 —-L— önc 20 -------

Massaspektri (FAB); -OH m/z = 1144,7 (molekyyli- 8. ioni Na+) ,3C-NMR: δ 1 0flc 213,4, 196,2, 170,8, 170,2,

Ac? S 169,9,169,2

,\.25 flcC

• · • · · • · • t ♦ < c • • < « · — - I— -—I . I .II... I . . II.. II — .11 .— M.—.. I II.»I »I I I ! — · ' — 1 ” 1 " — • « · *· _Qi_l Massaspektri (FAB); ; i * m/z = 1072,7 (molekyy- li-ioni + Na*)

ficO

Oflc

R1 fi! Saanto I

26 107535

Massaspektri (FAB) ; ' ” m/z = 1072,7 (molekyy li-ioni + Na*)

BcO

00c 10

Esimerkki 12

Sekoituksenalaiseen liuokseen, jossa oli esimerkin 15 1 otsikkoyhdistettä (1,0 g, mmol) metanolissa (100 ml), lisättiin natriummetoksidia (20 mg, mmol). Reaktioseosta sekoitettiin 0 °C:ssa kahdeksan tuntia ja käsiteltiin sitten yhdellä tipalla etikkahappoa. Liuotin poistettiin tyhjössä ja jäännös puhdistettiin silikageelillä eluoiden 20 THFrllä antamaan 610 mg vaahtoa (72 %). Massaspektri (FAB): m/z = 960,6 (molekyyli-ioni + Na+).

Esimerkit 13 - 21

Esimerkin 12 menetelmällä, mutta korvaamalla esimerkin 1 otsikkoyhdisteen jokainen mooliekvivalentti yh-; · 25 dellä mooliekvivalentilla tarkoituksenmukaista esimerkkien *:··· 2-11 otsikkoyhdistettä, valmistettiin seuraavat yhdis- :***: teet.

• 4« *·« • - · « « · · • • * · *·* * • « • · • « ♦ J ) * • · 27 107535 ch3 H3C<r |l I n cxiXC·”· 0 /^CH3 σ T^0H / I 1 /CHa 10 h3co och3 • · II» • · * * ,> • · <, » € ♦ « · u « 4 « 107535 28 fr " " ----------------------------- 1 ............................

R1 R* Saanto

Massaspektri (FAB): m/Z = 976,6 (mo-13. nH lekyyii-ioni + Na+) ,3C-NMR: δ 212,0, R „ 196,8,169,3,166,1,139,1,138,5,132,4, b 131,8, 123,5 H0^j=^

10 I

Massaspektri (FAB): m/z = 976/6 (mo- | -OH lekyyl i-ioni + Na+) ,3C-NMR: ¢213,4, I 14 · 198,5, 170,6, 167,5, 140,5, 139,8, 133,4, OH 125'° 15 OH [ »oztzibk- 20 _QI_I Massaspektri (FAB)·; m/z = 960,6 (molekyyli-ioni + Na*)

OH fH3 I

: ·· 25 Ih ····· • · • » ·

• I

• * • · · • · « R1 R} Saanto 29 107535

Massaspektri (FAB): m/z = 976,6 (mo- I 16. -OH lekyyli-ioni + Na*) 15C-NMR: δ 212,1, 5 nu 197,0, 169,2, 166,0, 139,1, 138,5, 132,2, OH S 131,8, 131,0, 123,5 HO-

10 I I

I Massaspektri (FAB): m/z = 960,6 (mo- 17 · -OH kyyli-ioni + Na+) ,3C-NMR: δ 212,0, 197,0, 169,3, 166,7, 166,0,138,4,132,0, fl 15 OH 131,6,123,5 20

Massaspektri (FAB): m/z = 1004,6 (mo- | i-OH lekyyli-ioni + Na+) ’’C-NMR: δ 213,4, 18. 197,1,169,8,168,4,166,1 | C0gCH3

HO

iT

• · 4 • ( C ft < · · l‘ *'.30 • · 107535 30 I Bl β- Saanto

Massaspektri (FAB): m/z = 946.6 (mo- I 19. -OH lekyyli-iöni + Na+) ,3C-NMR: δ 213,4, 5 196,2, 169,0, 164,7, 138,7, 137,8,132,4

OH

101 H -OH Massaspektri (FAB): m/z = 946,5 (mo- 2 0. lekyyli-ioni + Na*) ,3C-NMR: δ 213,2, 196,0, 168,8, 165,0, 138,5, 137,8, 133,1

OH

15 H0^W- 1 I _;_ 20

Esimerkki 21 17-etyyli-l,14-dihydroksi-12-[2,-(4”-(2,,,,3"',-4''’-tri-0-asetyyli-a-D-ramonopyranosyylioksi)-3''-metok-sisykloheksyyli) -11 -metyylivinyyli]-23,25-dimetoksi-13,-25 19,21,27-tetrametyyli-11,28-dioksa-4-atsatrisyklo- *:**: [22.3.1.04'9]oktakos-18-eeni-3,10,16-trioni :***: Esimerkin 3 otsikkoyhdistettä (1,0 g) liuotettiin DMF:ään (15 ml) ja pyridiiniin (15 ml) ja rikkivetykaasua kuplitettiin reaktioseokseen 16 tuntia huoneenlämpötilas-30 sa. Ylimäärä rikkivetyä estettiin poistumasta ilmakehään • · ·

Chlorox lukon avulla. 16 tunnin kuluttua reaktioseos lai-. mennettiin tolueenilla (50 ml) ja pestiin suolaliuoksella (50 ml). Liuotin kuivattiin MgS04:llä ja liuotin poistettiin tyhjössä. Jäännöksen annettiin kulkea silikageeliker-. ,: 35 roksen läpi ja eluoitiin etyyliasetaatti/heksaanilla (2/1) « · · « 107535 31 antamaan otsikkoyhdiste. Massaspektri (FAB): m/z = 1072,7 (molekyyli-ioni + Na+). 13C-NMR: 6 215,3, 174,0, 170,3, 170,1, 169,4, 141,1 ja 132,6.

Valmistusmenetelmä 1 5 17-etyyli-l, 14-dihydroksi-12-[2 ' - (41 '-hydroksi-31 ’ - metoksisykloheksyyli)-1’-metyylivinyyli]-23,25-dimetoksi- 13,19,21,27-tetrametyyli-11,28-dioksa-4-atsatrisyklo-[22.3.1.04'9] oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni

Streptomyces hygroscopicus alalaji ascomyceticus 10 viljelmä ATCC 14891 toteutettiin PYEA-agarlevyillä (10 g/1 Difco-maltoosia, 4 g/1 Difco-hiivauutetta, 4 g/1 dekstroo-sia, 15 g/1 Difco-agaria ja 50 ml tuoretta kookosmaitoa, joka laimennettiin 1 l:ksi deionisoidulla vedellä, sitten pH säädettiin arvoon 7,3 IN NaOH:lla). Valmistetta inku-15 boitiin 10 - 12 päivää 28 °C:ssa ja itiöt siirrettiin ste-riileihin 1x6 putkiin, jotka sisälsivät 10 ml ATCC 172 -elatusnestettä (10 g/1 glukoosia, 20 g/1 liukoista tärkkelystä, 5 g/1 hiivauutetta, 5 g/1 NZ-amiinia A ja 1 g/1 kalsiumkarbonaattia. pH säädettiin arvoon 7,01 1 N

20 K0H:lla). Putkia inkuboitiin 28 °C:ssa ja ravisteltiin rotaravistimessa n. 150 - 200 sykliä/minuutti. 4-5 päivän kuluttua liuos laimennettiin 40-%:iseksi glyserolilla ja ATCC 172 -elatusnesteellä ja siirrettiin sitten aseptisesti kryoputkiin. Jokainen putki panostettiin 1/2 ml:11a ' 25 liuosta. Putket jäädytettiin -80 °C:seen varastoinnin ***** ajaksi.

• · Näitä hyvin kylmiä putkia varastosta käytettiin siemenymppäykseen ymppäyspulloja varten, yksi putki/50 ml ·:· JDYTT-elatusnestettä 300 ml:n pullossa. JDYTT-elatusneste- * · · .1· . 30 koostumus sisälsi 10 g/1 sereloosia, 5 g/1 NZ-amiini YTT, 0,002 g/1 kobolttikloridia ja 3 g/1 kalsiumkarbonaattia. JDYTT-elatusnesteliuoksen pH säädettiin arvoon 7,2 IN NaOH:lla. Pulloja ravisteltiin ja inkuboitiin rotaravisti-messa n. 150 - 200 sykliä/minuutti 28 °C:ssa.

• « · * · ·

• I

• · » > « » · 32 107535 2 ml 3 - 5 päivää sekoitetusta ymppäyspullosta käytettiin ymppäykseen toista ymppäyspulloa varten, jossa oli 80 ml JDYTT-elatusnestettä 3 l:n fermentaatioastiassa. Fermentaatio-elatusneste sisälsi 45 g/1 maissitärkkelystä, 5 10 g/1 maissin liotusnestettä, 10 g/1 meripihkaa tai

Baker-kuivahiivaa, 3 g/1 kalsiumkarbonaattia ja 0,005 g/1 kobolttikloridia. pH säädettiin n. 6,4 - 6,8:aan 1 N

NaOH:lla. 1 ml vaahdonestoainetta P-2000 lisättiin fermen-taatioastiaan yhdessä 100 ml:n kanssa soijapapuöljyä. pH 10 säädettiin arvoon 6,4 - 6,8 1 N NaOH:lla ja ainetta sekoitettiin 1 700 kierrosta minuutissa. Lämpötila pidettiin 28 °C:ssa ja steriilin ilman annettiin kuplia elatusnes-teeseen nopeudella yksi tilavuus/tilavuus/minuutti.

Ymppäyksen jälkeen steriiliä soijapapuöljyä käytet-15 tiin vaahtoamisen kontrolloimiseksi. Pitemmissä fermentaa-tioissa ja riippuen käytetystä elatusnesteestä sokeripitoisuutta voidaan seurata ja lisätä sokeria 40, 60 ja 90 tunnin kuluttua alenevan sokeritason ylläpitämiseksi 0,05 %:n yläpuolella. Fermentaatio kesti 46 tuntia.

20 Käyttäen standardiohutkerroskromatografia- ja HPLC- menetelmiä fermentaatioliuos tutkittiin ja laskettiin suhteellinen tehokkuus.

Tuotetta havaittiin pääosin rihmastossa, mutta koko liuoksen työstö on edullista. Täydellisen fermentaation ' "25 jälkeen koko liuos uutettiin kahdesti kolmasosalla - puo- ’·**· lella liuoksen tilavuudesta metyyli-isobutyyliketonia •tif' (MIBK). Kerrokset erotettiin DeLaval erottimella tai

Podbielnack uuttolaitteessa. Liuotinkerros kirkastettiin • 1 · · I · I « · ja väkevöitiin ensin tyhjössä ja sitten rotavaporissa.

« 1 1 · .‘1^30 Konsentraatti altistettiin neljän putken vastavirtajakaan-tumiselle 20 litran pulloissa käyttäen heptaani/asetonit-riili-järjestelmää (10:1) 10 litran pintakerroksena ja yhden litran pohjakerroksena/pullo.. Aktiiviset pohjakerrokset kerättiin, yhdistettiin ja väkevöitiin. Ainetta 35 puhdistettiin edelleen suodattamalla Florisiilin läpi 107535 33 (pestiin heksaanilla, heksaani/metyleenikloridilla ja me-tyleenikloridilla peräkkäisesti, nostaen asteittain mety-leenikloridin määrää). Suurin osa aktiivisuudesta havaittiin metyleenikloridijakeissa. Nämä yhdistettiin ja väke-5 vöitiin. Toinen suodatusvaihe toteutettiin, tällä kertaaa silikageelin läpi (pesten heptaanilla, metyleenikloridil-la, metyleenikloridi/etyyliasetaatilla ja etyyliasetaatilla). Aktiivisuus oli pääosin jakeissa, jotka sisälsivät metyleenikloridi/etyyliasetaattiseosta ja jakeissa, jotka 10 sisälsivät pelkästään etyyliasetaattia. Nämä yhdistettiin ja väkevöitiin, liuotettiin uudestaan metyleenikloridiin ja käsiteltiin DARCO G60:llä. Näyte jaettiin sitten 12 -15 g:n annoksiksi ja kukin näyte kromatografoitiin edelleen Prep 500 nestekromatografisesti käyttäen silikageeli-15 pylväitä ja eluoiden käyttäen lineaarista pitoisuusgra-dienttia aloittaen 100-%:isesta metyleenikloridista ja päätyen 100-%:iseen etyyliasetaattiin. Aktiiviset jakeet yhdistettiin, väkevöitiin ja kromatografoitiin Prep 500:ssa käyttäen käänteisfaasi( 18C)silikageeliä ja eluoiden 20 lineaarisella pitoisuusgradientilla aloittaen asetonilla ja päätyen 100 %:iin vettä. Puhdas tuote saatiin viimeisenä aineosana, joka eristettiin pylväästä.

Aktiiviset jakeet edeltävässä fermentaatiomenetel- mässä määritettiin käyttäen seuraavaa biologista koetta.

: 25 12,5 mm:n kiekko pantiin suoraan agarin pinnalle.

*”*: Candida albicans ATCC 14053, Saccharomyces pastorianus :***,· FD3737 ja Byssochlamys fulvan FM 10,300(S) ja FM 10,464(R) « « · >' herkkää kantaa käytettiin. Candida- ja Saccharomyces-le- .:. vyjä inkuboitiin 37 °C:ssa 18 tuntia, sitten levyjen ak- • · · · ,·· . 30 tiivisuus tutkittiin. Byssochlamys-levyjä inkuboitiin • » · 28 °C:ssa ja tutkittiin 18 tunnin kuluttua. Levyt, jotka . sisälsivät ainoastaan FK506 ja FK520 (CP-105051), olivat aktiivisia Byssochlamys-kantaa vastaan. Epäpuhtaat jakeet ·;’ (jotka sisälsivät nigerisiiniä) olivat aktiivisia myös 35 muita kantoja vastaan.

• · • · • · ·> . · • · 34 107535 HPLC-menetelmää käytettiin myös jakeiden puhtauden määrittämiseksi. Kyseisessä menetelmässä käytettiin Dupont Zorbax CN -pylvästä (4,6 mm x 25 cm) ja isokraattista liuotinjärjestelmää, jossa oli 55/45 vesi/asetonitriiliä 5 ja virtausnopeus oli 1 ml/min. Havainnot tehtiin 214 nm:ssä. Liuosnäyte (20 ml) sekoitettiin MIBK:n kanssa (20 ml) ja ravisteltiin n. 4 - 5 minuuttia. Kerrokset erotettiin ja liuotin väkevöitiin lähes kuiviin. Jäännös otettiin talteen 1 mitään puhdasta asetonitriiliä ja 10 5 μ1:η näyte injektoitiin HPLCthen. FK520:n retentioaika oli n. 12,7 minuuttia näissä olosuhteissa.

Valmistusmenetelmä 2 17-allyyli-l,14-dihydroksi-12-[2'- (4 "-hydroksi-31 ' -metoksisykloheksyyli) -1' -me tyyli vinyyli] -23,25-dime-15 toksi-13,19,21,27-tetrametyyli-ll,28-dioksa-4-atsatrisyk-lo[22.3.1.04·9] oktakos-18-eeni-2,3,10,16-tetraoni

Streptomycestsukubaensis nro 9 993 FERM BP-927 aikaansaatiin PYEA-agarlevyillä (10 g/1 Difco-maltoosia, 4 g/1 Difco-hiivauutetta, 4 g/1 dekstroosia, 15 g/1 Dif-20 co-agaria ja 50 ml tuoretta kookosmaitoa, joka laimennettiin 1 ltksi deionisoidulla vedellä, sitten pH säädettiin arvoon 7,3 IN NaOHtlla). Valmistetta inkuboitiin 10 - 12 päivää 28 °C:ssa ja itiöt siirrettiin steriileihin 1x6 putkiin, jotka sisälsivät 10 ml ATCC 172 -elatusnestettä : ' 25 (10 g/1 glukoosia, 20 g/1 liukoista tärkkelystä, 5 g/1 ***** hiivauutetta, 5 g/1 NZ-amiinia A ja 1 g/1 kalsiumkarbo- • · « il naattia. pH säädettiin arvoon 7,01 1 N KOHrlla). Putkia ’’ inkuboitiin 28 °C:ssa ja ravisteltiin rotaravistimessa n.

♦ ·* * ·· 150 - 200 sykliä/minuutti. 4-5 päivän kuluttua liuos • · .·; 30 laimennettiin 40-%:iseksi glyserolilla ja ATCC 172 -ela- tusnesteellä ja siirrettiin sitten aseptisesti kryoput- . kiin. Jokainen putki panostettiin 1/2 ml:lla liuosta. Put- ,,, ket jäädytettiin -80 °C:seen varastoinnin ajaksi.

·;· Näitä hyvin kylmiä putkia varastosta käytettiin • · 35 siemenymppäykseen ymppäyspulloja varten, yksi putki/50 ml • · « • * I · steriiliä JDYTT-elatusnestettä 300 ml:n pullossa. JDYTT- elatusnestekoostumus sisälsi 10 g/1 sereloosia, 5 g/1 35 107535 NZ-amiini YTT, 0,002 g/1 kobolttikloridia ja 3 g/1 kal-siumkarbonaattia. JDYTT-elatusnesteliuoksen pH säädettiin 5 arvoon 7,2 IN NaOHtlla. Pulloja ravisteltiin ja inkuboi-tiin rotaravistimessa n. 150 - 200 sykliä/minuutti 28 °C:ssa.

2 ml 3 - 5 päivää sekoitetusta ymppäyspullosta käytettiin ymppäykseen toista ymppäyspulloa varten, jossa oli 10 80 ml JDYTT-elatusnestettä 3 l:n fermentaatioastiassa.

Fermentaatio-elatusneste sisälsi 45 g/1 maissitärkkelystä, 10 g/1 maissin liotusnestettä, 10 g/1 meripihkaa tai Baker-kuivahiivaa, 3 g/1 kalsiumkarbonaattia ja 0,005 g/1 kobolttikloridia. pH säädettiin n. 6,4 - 6,8:aan 1 N 15 NaOHrlla. 1 ml vaahdonestoainetta P-2000 lisättiin fermen-taatioastiaan yhdessä 100 ml:n kanssa soijapapuöljyä. pH säädettiin arvoon 6,4 - 6,8 1 N NaOH:lla ja ainetta sekoitettiin 1 700 kierrosta minuutissa. Lämpötila pidettiin 28 °C:ssa ja steriilin ilman annettiin kuplia elatusnes-20 teeseen nopeudella yksi tilavuus/tilavuus/minuutti.

Ymppäyksen jälkeen steriiliä soijapapuöljyä käytettiin vaahtoamisen kontrolloimiseksi. Pitemmissä fermentaa-tioissa ja riippuen käytetystä elatusnesteestä sokeripitoisuutta voidaan seurata ja lisätä sokeria 40, 60 ja 90 « i 25 tunnin kuluttua alenevan sokeritason ylläpitämiseksi *·**· 0,05 %:n yläpuolella. Fermentaatio kesti 46 tuntia.

• * · Käyttäen ohutkerroskromatografian ja HPLCzn stan- *f dardimenetelmiä fermentaatioliuosta tutkittiin ja suhteel- • · · > ··· linen tehokkuus laskettiin.

« ♦ · ,v . 30 Fermentaattori pysäytettiin ja uutettiin kahdesti ♦ puolella liuoksen tilavuudesta metyyli-isobutyyliketonia (MIBK). Liuotinkerros erotettiin imulla ja väkevöimällä tyhjössä viskoosiseksi öljyksi. Öljy trituroitiin heksaa-nilla, dietyylieetterillä ja metyleenikloridilla ja aktii-j 35 viset jakeet (dietyylieetterijakeet) kromatografoitiin 4 I 4 4 4 4 4« • * • * « t I I « 4 4 4 107535 36

Florisililla. Florisil eluoitiin peräkkäisesti dietyyli-eetterillä, metyleenikloridilla, etyyliasetaatilla ja asetonilla. Eluaatti väkevöitiin ja käsiteltiin aktiivihiilellä. Konsentraatti suodatettiin ja liuotettiin etyyli-5 asetaattiin. Heksaania lisättiin tuotteen kiteyttämiseksi.

Liemen ja myöhempien talteenotettujen virtausten bioaktiivisuutta seurattiin käyttäen Byssochlamys fulvan kantaa. Aineosat ja talteenotettujen virtausten aineosat visualisoitiin kromatografisesti Analtech silikageeli GF

10 (tavaramerkki) levyillä käyttäen puhdasta etyyliasetaattia eluenttina. Kehitetyt levyt suihkutettiin vanilliinirea-genssilla (3 g vanilliinia 75 ml:ssa etanolia ja 25 mlrssa 85-%:ista fosforihappoa) ja kuumennettiin 80 °C:seen. Tuote ilmeni lilanvärisinä täplinä.

15 Valmistusmenetelmä 3 2.3.5- tri-0-bentsyyli-B-arabinofuranosyylibromidi 2.3.5- tri-0-bentsyyli-l-0-p-nitrobentsoyyli-B-ara-binofuranosidiä (Sigma, 5,69 g, 10 mmol) liuotettiin mety-leenikloridiin (25 ml) 0 °C:ssa ja käsiteltiin 33-%:isella 20 HBr:llä etikkahapossa (Fluka, 25 ml). Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa kaksi tuntia. Liuotin poistettiin tyhjössä ja jäännös tislattiin atseotrooppisesti tolueenilla antamaan ruskea öljy. 98 %:n saanto käytettiin sellaisenaan.

: 1 25 Valmistusmenetelmät 4-6 *·**ϊ Käyttäen Karthan, K. P. R. ja H. J. Jenningsin ku- • * · ! ϊ vaamia menetelmiä julkaisussa Journal of Carbohydrate •r Chemistry, 9, 777 - 781 (1990), valmistettiin seuraavat • »t •i. yhdisteet.

• · » 30 4. 2,3,4-tri-0-asetyyli-B-arabinosyylibromidi 5. 2,3,4-tri-0-asetyyli-a-arabinosyylibromidi . 6. 2,3,4-tri-0-asetyyli-B-ramnosyylibromidi

I

I ( i » < i i I I I s « < I •

* < t I

t l » < · • ·

Claims (22)

107535

1. Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava I β10γ^ CH3kA^° <ch2>„—i J y y γ yV Y·· , °^i3oh y' 3

15 XX V-CH3 H3C0 och3 jossa n on 1 tai 2;

20 R1 on ryhmä, jolla on kaava II tai III; .'Ψ'-"ίί' (il) (in) • · · • · ’···* A ja B ovat erikseen ja A on H ja B on H tai -OH, tai A ja « ...I B ovat yhdessä =0; R2 on -OH, t,;*· 30 R3 on (Cx-C2) alkyyli tai allyyli; R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R8, -C02H, -CH2OH, H, -CH3, -CONH2, -CONHR8, -CONR28, -CH20C0R8, -CH20C02R8, -CH2OCONHR8, -CH2OCONR28 tai -CH2OR8; • « · • · * • 4 « · • · 107535 R5, R6 ja R7 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti (C-l-Qj) alkoksi, bent syy 1 ioks i, -OH, -OCOR8, -0C02R8 tai -OSi (R9) 3 ; R8 on (02-06) alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, pyridyy-5 li, tienyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (Cx-C4) alkoksi -ryhmillä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1 -5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C^C^) alkoksiryhmillä; ja R9 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C^-C^)alkyy-10 li, fenyyli tai bentsyyli; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava Ia 15 ch3 H3C0 iin (CJVrCI I Ύ- a„ "n f (Ia» σ x T ? V-ch3 :'·;25 h3co och3 • · · I « * « ... jossa n on 1 tai 2; • · ’···1 R1 on ryhmä, jolla on kaava II tai III; ·’?1 R2 on -OH; ..1: R3 on (C1-C3) alkyyli tai allyyli; V ' 30 R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R8, -C02H, H, -CH3, -CONH2, -CONHR8, -CH2OCOR8, -ch2oco2r8, -CH2OCONR28 ·:··: tai -ch2or8; R5, R6 ja R7 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti • ( (0Χ-04) alkoksi, bent syy 1 ioks i, -OCOR8, -OC02R8 tai -OSi(R9)3; < « « • ♦ « · · 1 · « 107535 R8 on (Cx-Cg) alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, pyridyy-li, tienyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (Cj-C^alkoksi-ryhmillä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1-5 5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C-l-C^)alkoksiryhmillä; ja R9 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (Cj-Qj) alkyy-li, fenyyli tai bentsyyli; saatetaan yhdiste, jolla on kaava IV

10 H°V^I CH3 ' n3C0 11 n CHjkA/V0 is VV °HPR3 (IV) T 1 rCH1

20 H3C0 och3 jossa R3 on ((^-03) alkyyli tai -allyyli ja n on 1 tai 2, reagoimaan 2-4 mooliekvivalentin kanssa yhdistettä, jol-: " 25 la on kaava VI tai VII • · · · · φ 1 ... Yr O 30 I R5 R1 (VI) (VII) f t joissa X on halogeeni; • · • · · • · · « I « « · · 107535 R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R8, -C02H, H, -CH3, -CONH2, -CONHR8, -conr82, -CH2OCOR8, -ch2oco2r8, -CH2OCONHR8, -CH2OCONR28 tai -CH20R8; R5, R6 ja R7 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti 5 (Ci-Cj alkoksi, bentsyylioksi, -OCOR8, -0C02R8 tai -OSi(R9)3; R8 on (Ci-Cg) alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, pyridyy-li, tienyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C^-Cg) alkoksi-ryhmillä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1-5 10 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C^-OJ alkoksiryhmillä; ja R9 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C^-C^) alkyyli, fenyyli tai bentsyyli; kuivausaineen läsnäollessa valittuna ryhmästä molekyy-liseulat, kalsiumsulfaatti, magnesiumsulfaatti; emäksen 15 läsnäollessa valittuna ryhmästä elohopeakarbonaatti, ho-peakarbonaatti, elohopeanitraatti ja hopeanitraatti; ja katalyytin läsnäollessa valittuna ryhmästä hopeatriflaat-ti, hopeaperkloraatti, hopeatetrafluoriboraatti, eloho-peatriflaatti, elohopeaperkloraatti ja elohopeatetra-20 fluoriboraatti, reaktioinertissä liuottimessa n. -78 - n. -70 °C:ssa lämmittäen n. 0 °C:seen noin 0,5 - noin 24 tunniksi ja tämän jälkeen sekoittaen huoneenlämpötilassa n. 0,5 - 24 tuntia, , b) yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava Ia, ' 25 jossa n on 1 tai 2; ... R1 on ryhmä, jolla on kaava II tai III; *··;1 R2 on -OH; * · · **'1 R3 on (C^-Cj) alkyyli tai allyyli; . R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R8, -C02H, ? 3 0 -CH2OH, H, -CH3, -CONH2, -CONR28, -CH2OCOR8, -CH2OCONHR\ -CH2OCONR28, tai -CH2OR8; ·:··· R5, R6 ja R7 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti (0^^-04) alkoksi, bentsyylioksi, -OH, -0C02R8 tai -OSi(R9)3; , R8 on (C-3-Cg) alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, pyridyy- ’; ]· 35 li, tienyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu « « 1 1 107535 1-5 halogeeniatorailla, OH-ryhmillä tai (C-l-C^) alkoksi-ryhmillä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1 -5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C^-C^)alkoksiryhmillä; ja R9 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (Ql-Q) alkyy-5 li, fenyyli tai bentsyyli; saatetaan yhdiste, jolla on kaava Ia jossa n on 1 tai 2; R1 on ryhmä, jolla on kaava II tai III; R2 on -OH;

10 R3 on (03^-03) alkyyli tai allyyli; R4 on kussakin tapauksessa riippumattomasti -C02R8, -C02H, H, -CH3, -CONH2, -CONHR8, -CH2OCOR8, -ch2oco2r8, -CH20C0NR28 tai -CH2OR8; R5, R6 ja R7 ovat kussakin tapauksessa riippumattomasti 15 (¢3-04) alkoksi, bent syy lioksi, -OCOR8, -OCOCH2R8 tai OCONR28, -OSi (R8) 3 ; R8 on (03-C6) alkyyli, (C3-C6) sykloalkyyli, allyyli, pyridyy-li, tienyyli, bentsyyli, bentsyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C-l-Oj) alkoksiryh-20 millä, fenyyli tai fenyyli, joka on substituoitu 1-5 halogeeniatomilla, OH-ryhmillä tai (C^-CJalkoksiryhmillä; ja R9 on kussakin tapauksessa riippumattomasti (C^-Qj) alkyyli, fenyyli tai bentsyyli; ·, reagoimaan katalyyttisen määrän kanssa alkoksidi- 25 emästä alkoholiliuottimessa 0 °C:ssa, tai ... c) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, *···* joissa A ja B ovat erikseen ja ovat kumpikin H, vastaava • -> · < - kaavan I mukainen yhdiste, jossa A ja B ovat yhdessä =0, pelkistetään käyttäen standardiolosuhteita a-ketoamidien ; 30 pelkistykselle, ja haluttaessa saatu kaavan I mukainen yhdiste otetaan ·;··· talteen farmaseuttisesti hyväksyttävänä suolana.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, « « .· . tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukai- 1 '·' 35 nen yhdiste, jossa R2 on -OH. • · • · 107535

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa n on 2 ja A ja B ovat yhdessä =0.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R3 on metyyli, etyyli tai allyyli.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R3 on etyyli.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R1 on R4 R5 R4 15 _ 5 Λ .0 R ; R — R7 20 7 n4 R5 r7r4 **&=, y=rL-, ''".25 ll47R< « I | , *·· r?r4 R4 ^ 1 R6 ks • ·

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, t u n- ·' : i n e t t u siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yh- • « < 35 diste, jossa R4 on -CH20H, -CH3, -CH2OCOCH3, -CH2OCOCH2C6H5 • « • « « « · • I · « • 1 · · 107535 tai -C02CH3; ja R5, R6 ja R7 ovat kukin riippumattomasti -OH, -OCOCH3 tai -OCOCH2C6H5.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yh- 5 diste, jossa R1 on R5

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R4 on -CH3, R5 on -OCOCH3, R6 on -OCOCH3 ja R7 15 on -OCOCH3.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R4 on -CH3, R5 on -OH, R6 on -OH ja R7 on -OH.

11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R1 on R5 R4 25 r6 ·-: r7 • · · %

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukai-·;··: nen yhdiste, jossa R4 on -CH2OCOCH3 ja R5, R6 ja R7 ovat ku kin -ococh3. , 13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, '; _ [ * 3 5 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukai- « · « « « « » 107535 nen yhdiste, jossa R4 on -CH2OCOCH3 ja R5, R6 ja R7 ovat kukin -OH.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukai- 5 nen yhdiste, jossa n on 2; A ja B ovat erikseen ja ovat kumpikin H; R2 on -OH ja R3 on etyyli.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R1 on 10 ORc fkr 1S fic 0 Ofic”3

16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa n on 2; A ja B ovat yhdessä =0; R2 on -OH; R3 on etyyli ja R1 on 20 R5

25 RV • ·» • · ♦ < • * · « « ; • · · • · * * Λ r * « « t f < f I I · I I « « • I tl· f «(tl » t t « 107535